Aus der Abteilung für Experimentelle Pneumologie der Klinik für Pneumologie
der Medizinischen Hochschule Hannover
Angefertigt im Rahmen der Strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed
Einfluss alveolarepithelialer TGF-β Sekretion auf die Abwehrfunktion von Alveolarmakrophagen gegenüber
Streptococcus pneumoniae
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Hannah Makait
aus Hamburg
Hannover 2015
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.05.2016
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich A. Maus Referent: Prof. Dr. med. Lars Knudsen
Korreferent: Prof. Dr. med. Franz-Christoph Bange
Tag der mündlichen Prüfung: 10.05.2016 Prüfungsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Thomas Andreas Werfel Prof. Dr. med. Heike Bantel
Prof. Dr. med. Torsten Witte
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... II
1 Einleitung ... 1
1.1 Fibrose ... 1
1.2 Modelle der Lungenfibrose ... 3
1.3 Angeborene Wirtsabwehr der gesunden Lunge ... 4
1.4 Angeborene Wirtsabwehr der chronisch kranken Lunge ... 5
1.5 Streptococcus pneumoniae ... 7
2 Material und Methoden ... 12
2.1 MH-S Zellen ... 12
2.2 MLE-12-Zellen ... 12
2.3 Bronchoalveoläre Lavage zur Gewinnung von residenten Alveolarmakrophagen ... 13
2.4 Isolation von Alveolarepithelzellen aus murinem Lungengewebe ... 13
2.5 Etablierung des adenoviralen Gentransfers von biologisch aktivem TGF-β1 in murinen Alveolarepithelzellen ... 15
2.6 Transfektion von primären Alveolarepithelzellen mit AdTGF-β1 ... 17
2.7 Kultur und Quantifizierung von Streptococcus pneumoniae ... 18
2.8 Etablierung eines Pneumokokken-Makrophagen-Phagozytose-Assays in vitro ... 18
2.9 Etablierung eines Pneumokokken-Killing-Assays in vitro ... 19
2.10 Untersuchung des Pneumokokkenwachstums unter dem Einfluss von TGF-β1 ... 20
2.11 Effekt von konditioniertem Medium bzw. rekombinantem TGF-β1 auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen ... 20
2.12 Effekt von konditioniertem Medium auf das Pneumokokken-Killing durch MH-S Zellen ... 21
2.13 Bestimmung der Zellvitalität ... 22
Inhaltsverzeichnis
2.14 Statistik ... 22
3 Ergebnisse ... 23
3.1 Effekt der Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 auf die TGF- β1-Sekretion ... 23
3.2 Effekt der Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 auf die Sekretion proinflammatorischer Zytokine ... 30
3.3 Effekt der Transfektion von primären Alveolarepithelzellen mit AdTGF- β1 auf die TGF-β1-Sekretion ... 31
3.4 Etablierung eines Pneumokkokken Phagozytose-Assays ... 32
3.5 Etablierung eines Makrophagen-Killing-Assays ... 33
3.6 Einfluss von rekombinantem TGF-β1 auf das Pneumokokkenwachstum ... 35
3.7 Effekt von TGF-β1 auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen ... 36
3.8 Effekt von TGF-β1 auf das bakterielle Killing von Pneumokokken durch MH-S Zellen ... 38
4 Diskussion ... 40
5 Zusammenfassung ... 47
6 Literaturverzeichnis ... 48
7 Anhang ... 53
7.1 Lösungen ... 53
7.2 Geräte und Herstellernachweis ... 54
7.3 Verbrauchsmaterialien ... 56
7.4 Curriculum Vitae ... 60
7.5 Eidesstattliche Erklärung ... 61
7.6 Danksagung ... 62
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AdTGF-β1 Adenoviraler Genvektor für transforming growth factor- beta 1
AT II Zellen Typ II Alveolarepithelzellen
BAL Bronchoalveoläre Lavage
CAP Community-acquired pneumonia
CAPNETZ Kompetenznetz ambulant erworbene Pneumonie
CFU Colony forming unit
CO2 Kohlendioxid
ChoP Phosphorylcholine
COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
FCS Fetal calf serum
FVC Forced vital capacity
FITC Fluoresceinisothiocyanat
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor HBSS Hank's Balanced Salt Solution
IL Interleukin
IPF Idiopathic pulmonary fibrosis, LAP Latency-associated peptides
LPS Lipopolysaccharid
MOI Multiplicity of infection
MyD88 Myeloid differentiation primary-response protein 88 NFκB Nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer'
NO Nitric oxide
Abkürzungsverzeichnis
NOD-Rezeptor Nucleotid-binding oligomerization domain receptors PAMP Pathogen-associated molecular pattern
PBS Phosphate-buffered saline
PDGF Platelet-derived growth factor Pen/Strep Penicillin/Streptomycin
PRR Pattern recognition receptor PspA Pneumococcal surface protein A
ROS Reactive oxygen species
rpm Rotation per minute
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SD Standard deviation
S. pn Streptococcus pneumoniae
SV-Virus Simian-Virus
TGF-β Transforming growth factor-beta Th-Zellen T-Helfer-Zellen
THB Todd-Hewitt Broth
TLR Toll-like-rezeptor
Einleitung
1 1 Einleitung
1.1 Fibrose
Die Lungenfibrose ist eine chronisch-interstitielle Lungenerkrankung mit hoher Letalität. Weltweit leiden über fünf Millionen Patienten an einer Lungenfibrose.
Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind weitgehend ungeklärt. Die Auslöser der Lungenfibrose sind vielfältig. Inhalative und nicht-inhalative Noxen, Allergene, Strahlung sowie Systemerkrankungen zählen zu den potenziellen Risikofaktoren für die Entstehung einer Lungenfibrose. Die Auslöser der schwersten Form der Lungenfibrose, der idiopathischen pulmonalen Fibrose (IPF), sind jedoch noch weitestgehend ungeklärt [1]. Das mittlere Überleben nach Diagnosestellung der idiopathischen Lungenfibrose liegt unter drei Jahren [2-4]. Die einzige derzeit verfügbare Therapieoption ist die Lungentransplantation.
Patienten mit chronisch-interstitiellen Lungenerkrankungen leiden vermehrt an bakteriellen und viralen Infektionen der Lunge. Jährlich sterben circa sechstausend Patienten in Deutschland an den Folgen einer progressiven Lungenfibrose, zumeist aufgrund respiratorischer Insuffizienz oder aber an der Entwicklung sekundärer Pneumonien und deren Komplikationen [3, 5]. Als Therapie der idiopathischen Lungenfibrose werden antientzündliche, antioxidative und antifibrotische Behandlungsansätze verfolgt.
Therapieversuche werden bisher mit Steroiden, Azathioprin und N-Acetylcystein in hoher Dosierung als „off-label-use“ eingesetzt [1]. Jedoch kann die Unterdrückung der Entzündungsreaktion das Fortschreiten und die fatalen Konsequenzen der Umbauprozesse des Lungengewebes das sogenannte
„pulmonale remodeling“ nicht verhindern. In den letzten Jahren sind zwei neue Medikamente zur Therapie der IPF in Deutschland zugelassen worden:
Pirfenidon und Nintedanib. Kürzlich konnte in einer Phase III Studie gezeigt werden, dass Pirfenidon den Abfall der FVC (forced vital capacity) von IPF- Patienten reduziert, die Gehstrecke im Sechs-Minuten-Gehtest und das progressionsfreie Überleben von IPF-Patienten verlängert [6]. Der Tyrosinkinase-Inhibitor Nintedanib, der insbesondere das VEGF-, FGF- und PDGF-Rezeptorsignaling hemmt, konnte in zwei Phase II Studien über einen
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Beobachtungszeitraum von circa einem Jahr die Abnahme der FVC von IPF- Patienten signifikant inhibieren.
1.1.1 Pathomechanismus der Lungenfibrose
Die Pathogenese der Lungenfibrose ist weitgehend ungeklärt. Der repetitiven Schädigung des Alveolarepithels wird eine besondere Bedeutung bei der Entstehung einer pulmonalen Fibrose zugeschrieben. Epithelverletzung auch ohne Entzündung kann zur Ausbildung einer Lungenfibrose führen [8, 9].
Insbesondere die sogenannte Epithel-Mesenchym-Transition (EMT), im Verlaufe derer es zur Umbildung von Alveolarepithel zu mesenchymalen Zellen, vor allem zu Myofibroblasten kommt, wird als mögliches pathogenetisches Prinizip der IPF diskutiert. Hierbei tragen subepithelial gelagerte, fibroblastäre Foci zur gesteigerten Kollagendeposition und damit zum pulmonalen Remodelling zur irreversibler Destruktion des Lungenparenchyms bei.
Allerdings diskutieren neuere Untersuchungen die Beteiligung der EMT an der Pathogenese der IPF sehr kontrovers. Studien von Chapman et al. sehen die seltenen, lineage-negativen, epithelialen Vorläuferzellen (LNEPs) der Lunge im
Fokus des Regenerationsprozesses nach schwerem
Lungenparenchymschaden zum Beispiel durch Bleomycin und Influenza. Diese Studie gibt erstmals Hinweise darauf, dass diese epithelialen Vorläuferzellen der Lunge möglicherweise zur Entwicklung einer Lungenfibrose über die inadäquaten Aktivierung der Notch-Signalwege beitragen können [10].
In fibrosierenden Lungen läuft die Heilung nach Epithellzellverletzung verzögert und inadäquat ab. Aktivierte Epithelzellen schütten profibrotische Zytokine aus, was zur gestörten pulmonalen Homöostase beiträgt [2, 9]. Es entsteht ein lokales profibrotisches Mikromilieu, das reich an inflammatorischen, proangiongenetischen und fibrogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren ist. Im profibrotischen Milieu der Lunge von IPF-Patienten finden sich erhöhte Konzentrationen von platelet-derived growth factor (PDGF), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin-13 (IL-13) sowie transforming-growth factor-β1 (TGF-β1) [2, 9].
1.1.2 Die Rolle von TGF-β1 in der Entstehung der Lungenfibrose
Der Wachstums- und Differenzierungsfaktor TGF-β1 spielt als profibrotisches Zytokin eine Schlüsselrolle bei der Entstehung der Lungenfibrose [9, 11]. Im Säugetier sind drei TGF-β-Isoformen bekannt, nämlich TGF-β1, -2 und -3. TGF-
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β1 ist die vorherrschende Isoform mit Relevanz für Lungenfibrose und die Regulation des Immunsystems [9]. Unter anderem können Epithelzellen, Makrophagen, T-Zellen, Eosinophile, Neutrophile und Fibroblasten TGF-β1 in der Lunge freisetzen. Biologisch aktives TGF-β1 stimuliert in der Lunge die Fibroblastenproliferation, Bildung von Extrazellularmatrix sowie die epithelial- mesenchymale Transition [12]. Bei Mäusen mit Bleomycin-induzierter Lungenfibrose, welche eine erhöhte TGF-β-Expression aufwiesen, zeigte sich unter der Gabe eines TGF-β-Antikörpers oder eines löslichen TGF-β1- Rezeptors ein Rückgang der Kollagendeposition sowie der Lungenfibrose [13, 14]. TGF-β1, das am meisten untersuchte Zytokin der Lungenfibroseforschung, fördert so auf vielfältige Weise die Entstehung einer Lungenfibrose [9, 12, 15, 16]. Neben seiner löslichen Form als sezerniertes Zytokin ist TGF-β1 insbesondere durch Anlagerung des latency-associated peptides (LAP) als inaktiver Precursor an extrazelluläre Matrix sowie auch an die Oberfläche von Entzündungszellen wie zum Beispiel Makrophagen gebunden. Seine Aktivierung erfolgt hierbei durch Abspaltung des LAP-Proteins unter Beteiligung von Endoproteasen, wie zum Beispiel Plasmin, jedoch auch durch Interaktion mit definierten Adhäsionsmolekülen [9].
1.2 Modelle der Lungenfibrose
Zur Untersuchung der Pathophysiologie der IPF wurden verschiedene Tiermodelle der Lungenfibrose entwickelt. Im Tiermodell konnten bereits zahlreiche Prozesse sowie Schlüsselzellen und -zytokine identifiziert werden, die in der Lungenfibrose eine Rolle spielen, identifiziert werden. Derzeit werden durch Bleomycin, Quarzstaub, FITC, Strahlung und viralem Gentransfer induzierte pulmonale Fibrosemodelle zur Erforschung der IPF eingesetzt [17-20].
Aktuell existieren im Wesentlichen zwei sehr gut charakterisierte tierexperimentelle Modelle der pulmonalen Fibrose in kleinen Nagern: das Bleomycin-Modell und das AdTGF-β1-Modell der pulmonalen Fibrose. Das Bleomycin-Modell der Lungenfibrose ist für Mäuse und Ratten etabliert und basiert auf der intratrachealen Instillation des Zytostatikums Bleomycin. Hierbei macht man sich die unerwünschte Nebenwirkung des Bleomycins zunutze, eine Lungenfibrose zu entwickeln [21, 22]. Das Modell des adenoviralen
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Gentransfers von biologisch aktivem TGF-β1 zur Induktion einer Lungenfibrose wurde erstmals von der Arbeitsgruppe Gauldie et al. eingesetzt. Der adenovirale Genvektor AdTGF-β1223-225 induziert die Sekretion von biologisch aktivem TGF-β1 [17]. Nach adenoviralem Gentransfer von biologisch aktivem TGF-β1 entwickeln Ratten eine irreversible und progrediente Lungenfibrose [17]. Die durch AdTGF-β1 induzierte pulmonale Fibrose der Ratte weist aufgrund der langsamen Progression und dem Fehlen der initialen Entzündung Ähnlichkeiten mit der idiopathischen Lungenfibrose des Menschen auf [17, 19, 20, 23].
1.3 Angeborene Wirtsabwehr der gesunden Lunge
Die Lunge als Grenzfläche zwischen Umwelt und Innerem des Körpers ist ständig inhalativen pathogenen und apathogenen Partikeln ausgesetzt. Ihre erste Verteidigungslinie, die sogenannte angeborene Immunantwort, ist entscheidend für die Abwehr inhalierter Partikel und damit für die Aufrechterhaltung der pulmonalen Homöostase. Zu den frühen Abwehrmechanismen der Lunge zählen physikalische (Epithelbarriere, mukoziliäre Clearance), biochemische (Immunglobuline, Defensine, Surfactant A und D) sowie zelluläre Abwehrmechanismen [24-26]. Vor allem professionelle Phagozyten wie Makrophagen und neutrophile Granulozyten spielen eine entscheidende Rolle in der initialen Immunantwort gegenüber Bakterien [24-26].
1.3.1 Rolle residenter Alveolarmakrophagen in der pulmonalen Infektabwehr der gesunden Lunge
Residente Alveolarmakrophagen der Lunge repräsentieren die erste Linie der zellulären Infektabwehr inhalierter Bakterien [26, 27]. Alveolarmakrophagen sind professionelle Phagozyten, die sich aus myeloiden Stammzellen entwickeln. Monozyten, die Vorläuferzellen der Makrophagen, migrieren aus dem Knochenmark über die Blutbahn ins Gewebe. Man unterscheidet zwei Subpopulationen peripherer Blutmonozyten: zum einen inflammatorische Monozyten, die während einer Entzündung rekrutiert werden und in der Lunge zu Exsudatmakrophagen differenzieren, sowie zum anderen nicht- inflammatorische Monozyten, die unter nicht-entzündlichen Bedingungen in die Lunge emigieren, wo sie zu residenten Alveolarmakrophagen beziehungsweise dendritischen Zellen ausdifferenzieren können [24, 28]. Residente
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Alveolarmakrophagen sowie insbesondere spät rekrutierte Exsudatmakrophagen sind neben ihrer Bedeutung für die Abwehr inhalierter Bakterien auch für die Wiederherstellung der Lungenhomöostase nach überwundener Infektion wichtig [24, 26, 29]. Für die erfolgreiche Elimination einer bakteriellen Infektion aus dem distalen Atemtrakt ist die volle Funktionalität von Alveolarmakrophagen erforderlich [26, 30]. Haben Erreger die epitheliale Barriere erreicht, beginnen gewebsständige residente Alveolarmakrophagen unmittelbar mit der Phagozytose und dem intrazellulären Abtöten des Pathogens durch Erzeugung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffintermediate sowie antimikrobieller Proteine [25, 30]. Diese Abwehrmechanismen spielen bei bakteriellen Infektionen der Lunge eine entscheidende Rolle für den Krankheitsverlauf [25, 30].
1.4 Angeborene Wirtsabwehr der chronisch kranken Lunge
Patienten mit chronisch interstitiellen Lungenerkrankungen leiden vermehrt an bakteriellen und viralen Infektionen der Lunge. Chronisch interstitielle Lungenerkrankungen attenuieren die immunologische Funktion der Lunge auf verschiedenen Ebenen [3, 5]. Die Pathomechanismen, die zur veränderten Abwehr der chronisch kranken Lunge führen, sind weitgehend ungeklärt [3, 5].
Laut Prasse et al. konnte in der bronchoalveolären Lavage (BAL) von Patienten mit IPF ein verändertes Mikromilieu mit erhöhten Konzentrationen der Zytokine PDGF, IL-4, lL-13 und TGF-β1 gemessen werden [31]. Hinweise deuten darauf hin, dass dieses veränderte Mikromilieu der fibrosierenden Lunge verantwortlich für die attenuierte immunologische Funktion der Lunge ist.
Makrophagen stehen seit langem im Fokus der Fibroseforschung.
Aktivierte Makrophagen werden nach ihren Funktionszuständen in M1- und M2- Makrophagen eingeteilt [32]. Diese Einteilung wurde erstmals 1992 von Stein et al. eingeführt [32]. Die klassischerweise durch Th1-Zytokine wie TNF-α und IFN-γ oder Endotoxine aktivierten Makrophagen werden als klassisch aktivierte oder M1-Makrophagen bezeichnet. Diese bilden überwiegend Stickstoffmonoxid (nitric oxide, NO) und reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen intermediates, ROI) [32]. Makrophagen, die durch die Th2-Zytokine IL-4, IL-10 und Il-13 aktiviert werden, zeigen den Phänotyp der alternativen Aktivierung (alternativ aktivierte Makrophage, AAM, M2-Makrophagen). In der BAL von IPF-
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Patienten konnten insbesondere alternativ aktivierte Makrophagen nachgewiesen werden. Diese Makrophagen produzieren Kollagen, TGF-β und PDGF und regen gleichzeitig Fibroblasten zur vermehrten Kollagenproduktion an [9, 32]. AAMs steigern zudem über verstärkte Expression von Arginase, dem Gegenspieler der iNOS, die Prolinsynthese, welches wiederum für die Kollagenproduktion benötigt wird. Alternativ aktivierte Makrophagen spielen somit aller Wahrscheinlichkeit nach in der Entstehung der Lungenfibrose eine besondere Rolle [9, 32].
1.4.1 Rolle von TGF-β in der Immunantwort der chronisch kranken Lunge Kerhl JH et al. beschrieben 1986 bereits die Rolle von TGF-β in der Immunantwort durch Regulation der T-Zellproliferation. Heute gilt die zentrale Rolle von TGF-β in der Regulation von vielfältigen Immunprozessen als gesichert. Dennoch bleibt vieles über die Rolle von TGF-β in der Immunmodulation der chronisch kranken Lunge ungeklärt. TGF-β beeinflusst unter anderem die Funktionalität von Lymphozyten, natürlichen Killer-Zellen, dendritischen Zellen, Granulozyten sowie Makrophagen. Die unterschiedliche und teilweise gegensätzliche Wirkung von TGF-β hängt vom Aktivierungsstatus der Zellen einerseits und kostimulatorischen Effekten andererseits ab.
Vorläuferzellen wie Monozyten werden von TGF-β vermehrt rekrutiert und zur inflammatorischen Zytokinsekretion stimuliert, während aktivierte Zellen wie Makrophagen in ihrer Abwehrfunktion wie Zytokinsekretion und Phagozytose, inhibiert werden [33]. Der Einfluss von TGF-β auf Rekrutierung, Aktivierung sowie die entscheidenden Abwehrmechanismen wie Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies und Phagozytose von Makrophagen ist in verschiedenen Studien beschrieben. In der frühen Phase der Inflammation fördert TGF-β die Rekrutierung und Transmigration von Monozyten aus dem Blut ins Gewebe und übt somit zunächst eine proinflammatorische Funktion aus, wohingegen TGF-β auf die Abwehrfunktion wie Phagozytose, Erzeugung von reaktiven Sauerstoffradikalen und Zytokinsekretion bereits differenzierter Makrophagen einen inihibierenden Effekt ausübt. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass TGF-β die H2O2-Sekretion und damit die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies durch Makrophagen in vitro hemmt [33]. Auch weisen Untersuchungen von Nathan et al. daraufhin, dass die
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Phagozytoseleistung durch TGF-β in vitro marginal reduziert und so die Abwehrfunktion der Makrophagen möglicherweise durch TGF-β attenuiert wird [34]. Verschiedene in vitro Studien konnten zeigen, dass TGF-β die Expression des Thrombospondinrezeptors CD36, an den TGF-β1 über seinen Liganden Thrombospondin binden kann, herunterregulieren kann [33]. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Phagozytoseleistung von Makrophagen indirekt über Regulation von CD36 durch TGF-β attenuiert wird. In murinen myeloiden Zelllinien konnte ebenfalls die Herunterregulation der γ-einheit des FcγRΙ- und des FcγRΙΙΙ-Rezeptors und damit ein negativer Einfluss von TGF-β auf die IgG abhängige Phagozytose beobachtet werden [33]. Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass der TLR-Signalweg, der eine wichtige Rolle in der Erkennung und Abwehr von Pneumokokken spielt, durch TGF-β in vitro gehemmt werden kann. TGF-β reduziert des Weiteren die durch Lipopolysaccharid induzierte Sekretion von TNF-α, MMP-12, MIP 1α und MIP-2 in vitro [33]. Diese Hinweise deuten in Zusammenschau darauf hin, dass TGF-β vermutlich eine überwiegend inhibitorische Funktion in der Immunmodulation von Makrophagen einnimmt. Die Bedeutung dieser überwiegend in vitro erhobenen Befunde für die Pathomechanismen der Lungenfibrose in vivo sind bislang jedoch ungeklärt [33-35].
1.5 Streptococcus pneumoniae
George Miller Sternberg und Louis Pasteur isolierten 1881 zum ersten Mal Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) aus Patientensputum. Der Mensch ist das natürliche Reservoir der Pneumokokken. Pneumokokken können durch Tröpfcheninfektion von Mensch zu Mensch übertragen werden, oft handelt es sich jedoch bei Pneumokokkeninfekten um endogene Translokation des Erregers ausgehend von einer Pneumokokkenbesiedelung des Nasopharynx [36, 37]. Nach WHO-Daten sind circa 80% aller Kinder unter sechs Monaten asymptomatischer Träger des Erregers [36, 37].
Streptococcus pneumoniae ist der klassische Erreger der Lobärpneumonie. Er verursacht über 70% der community-acquired pneumonia (CAP). Das Kompetenznetzwerk CAPNETZ (Kompetenznetz ambulant erworbene Pneumonie) zählte allein in Deutschland 400.000 bis 670.000 Fälle der CAP pro Jahr. Betroffen sind vor allem ältere Patienten mit
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prädisponierenden Faktoren wie chronisch interstitiellen Lungenerkrankungen.
In Deutschland liegt die Letalität der CAP für über 65-jährigen zwischen 10% und 20% [38]. Streptococcus pneumoniae ist weltweit für 1,6 Millionen Todesfälle jährlich verantwortlich und zählt damit zu den fünf häufigsten infektionsbedingten Todesursachen [39].
Die antibiotische Therapie der ambulant erworbenen Pneumonie erfolgt risikostratifiziert. Bei ambulant erworbener Pneumonie ohne zusätzliche Risikofaktoren werden in Deutschland überwiegend Aminopenicilline eingesetzt.
Bei Patienten mit Risikofaktoren für schwere Verläufe (Antibiotika- sowie Krankenhausvorbehandlungen, Unterbringung in Pflegeheimen und schwere Begleiterkrankungen) werden Aminopenicillin mit Betalaktamaseinhibitor angewendet. Bei schwerer Pneumonie oder zusätzlichen Risikofaktoren für Pseudomonasinfektion erfolgt die Therapie mit pseudomonaswirksame Betalaktame wie Piperacillin. Weltweit stellen zunehmende Resistenzentwicklungen von bis zu 50% der Pneumokokkenstämme in Spanien und Osteuropa gegen Penicillin ein ernst zu nehmendes medizinisches Problem dar [38, 40].
Aktuell stehen präventiv in Deutschland zwei Pneumokokkenimpfstoffe zur Verfügung: eine 23-valente Polysaccharidvakzine sowie ein 13-valenter Konjugatimpfstoff. Die 23-valente Polysaccharidvakzine bietet einen klinischen Schutz zwischen 60% und 70% gegen invasive Pneumokokkenerkrankungen. Seit 2011 ist der 13-valente Konjugatimpfstoff auf Grund von verbesserter mukosaler Immunität durch höhere Serumantikörperspiegel auch für Erwachsene über 50 Jahren zugelassen. Eine bisher nicht publizierte doppelblinde Studie mit Erwachsenen über 65 Jahren in den Niederlanden (CAPITA) zeigt eine Abnahme der invasiven Pneumokokkenerkrankung um 75% sowie der ambulant erworbenen Pneumonie um 46% nach Immunisierung mit dem 13-valenter Konjugatimpfstoff im Vergleich zu Placebo [41]. Das Center of Diseaese Control and Prevention in den USA empfiehlt die Impfung mit dem 13-valenten Konjugatimpfstoff für Personen über 65 Jahre.
Streptococcus pneumoniae, der häufigster Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie, ist ein Gram-positives, fakultativ anaerobes Bakterium (Diplococcus pneumoniae), dessen Polysaccharidkapsel ein wichtiger
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Virulenzfaktor ist. Diese Polysaccharidkapsel erschwert den Makrophagen die Phagozytose des Keims und schützt den Erreger vor Komplement-Opsonierung [37, 42]. Ausschließlich bekapselte Pneumokokken verursachen eine Pneumonie, wohingegen unbekapselte Pneumokokken weitgehend avirulent sind. Pneumokokken werden nach der serologischen Struktur ihrer Polysaccharidkapsel in > 90 Serotypen unterteilt. Weitere für die Besiedelung und Pathogenität entscheidende Virulenzfaktoren sind die zellwandassoziierten Oberflächenmoleküle Phosphorylcholine (ChoP) und Pneumococcal surface protein A (PspA). Der Pathogenitätsfaktor ChoP bindet an den Rezeptor für den Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF-R) auf der Oberfläche von Epithelzellen und ermöglicht darüber Pneumokokken, den Nasopharynx zu besiedeln. PspA verhindert die Bindung des Komplementfaktors C3 an die Pneumokokkenoberfläche und erschwert so die komplementassoziierte Phagozytose [36, 37, 39, 43]. Als weiterer wichtiger Virulenzfaktor von Streptococcus pneumoniae ist Pneumolysin zu nennen, welches von allen klinisch isolierten Pneumokokkenstämmen produziert wird. Pneumolysin wirkt durch die Bildung von Transmembranporen in Zellen direkt zytotoxisch und induziert die Lyse unter anderem von Epithelzellen und Alveolarmakrophagen [36, 37, 39].
Zur Erkennung der Infektionserreger wie Streptococcus pneumoniae nutzen Makrophagen eine Reihe verschiedener sogenannter Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors (PRR)), wie zum Beispiel Toll-like Rezeptoren (TLR) und Nucleotide-binding oligomerization domain containing receptors (NOD-Rezeptoren), an die konservierte Strukturen der Erreger, sogenannte pathogen-asssociated molecular patterns (PAMPs) binden [30, 39]. Die Bindung von PAMPs an TLRs induziert in Alveolarmakrophagen und anderen an der Infektabwehr beteiligten Zellpopulationen über den NFκB-Signalweg ein großes Spektrum an immunologischen Reaktionen. Über den NFκB-Signalweg werden die Ausschüttung von inflammatorischen Zytokinen, chemotaktischen und antimikrobiellen Faktoren sowie die Neutrophilenrekrutierung und das Abtöten von Bakterien induziert [25]. TLR2 und TLR4 werden auf der Zelloberfläche von Makrophagen exprimiert und erkennen Zellwandkomponenten wie Peptidoglykane und Lipoteichonsäure von Pneumokokken, sowie deren
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intrazellulären Virulenzfaktor Pneumolysin [36, 37, 39, 43]. Pneumolysin kann jedoch auch über den intrazellulären Proteinkomplex NLRP3 erkannt werden und so zur Wirtsabwehr gegenüber Pneumokokkenpneumonie beitragen [44].
TLR9 ist ein intrazellulärer Mustererkennungsrezeptor unter anderem von Alveolarmakrophagen, welcher Streptococcus pneumoniae nach Phagozytose des Pathogens erkennt. Der Rezeptor spielt eine Rolle in der Modulation und Verstärkung der Phagozytose [25, 39]. NOD-Rezeptoren sind im Zytosol von Epithelzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen lokalisierte PRRs. NOD-1 ist ein wichtiger epithelialer Aktivator der angeborenen Immunantwort und fungiert als erster Sensor einer bakteriellen Infektion. Die Bindung von Streptococcus pneumoniae-Liganden an NOD-1- und NOD-2-Rezeptoren induziert synergistisch mit den TLRs über den NFκB-Signalweg eine Immunantwort [39, 42]. Aktivierte Makrophagen schütten als Antwort auf eine Pneumokokkeninfektion inflammatorische Zytokine wie zum Beispiel TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-10 aus [30]. TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, welches überwiegend von Makrophagen produziert wird [25, 26]. Das Zytokin wirkt chemotaktisch auf andere Entzündungszellen und verstärkt unter anderem die Phagozytose durch Makrophagen.
Ziel der Arbeit
11 Ziel der Arbeit
Patienten mit chronischen Lungenerkrankungen, wie zum Beispiel der idiopathischen pulmonalen Fibrose haben ein erhöhtes Risiko, an bakteriellen Infektionen der Lunge zu erkranken. Dieses warf die Frage auf, welche Bedeutung das im Rahmen fibrotischen Remodellings der Lunge pulmonal freigesetzte TGF-β1 für die pulmonale Infektabwehr hat. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein robustes in vitro Modell des adenoviralen Gentransfers von biologisch aktivem TGF-β1 in etablierten sowie primär isolierten Typ II Alveolarepithelzellen der Maus zu entwickeln. Dieses Modell sollte als Grundlage für die Untersuchung dienen, ob epithelial produziertes TGF-β1 die antibakterielle Abwehr pulmonaler Makrophagen gegenüber Streptococcus pneumoniae attenuiert.
Insbesondere wurden folgende Aspekte bearbeitet:
1. Lassen sich etablierte Alveolarepithel-Zelllinien und frisch isolierte Typ II Alveolarepithelzellen mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 zur Generierung eines profibrotischen Mikromilieus in vitro transfizieren?
2. Welchen Effekt hat konditioniertes Medium von mit AdTGF-β1 transfizierten Epithelzellen beziehungsweise rekombinantes TGF-β1 auf die Pneumokokkenphagozytose und das -killing durch Alveolarmakrophagen?
Material und Methoden
12 2 Material und Methoden
2.1 MH-S Zellen
Als etablierte Makrophagen-Zelllinie wurden in der vorliegenden Arbeit MH-S Zellen (ATCC CRL-2019) verwendet, die aus der bronchoalveolären Lavage (BAL) von Balb/cJ Mäusen gewonnen und mit dem Simian-Virus SV 40 transformiert wurden [45].
2.1.1 Zellkultur der MH-S Zellen
MH-S Zellen wurden in 15 ml RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-1640-Kulturmedium mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 5%
Glutamin und 5% Penicillin bei 37 °C und 5% Kohlendioxid (CO2) kultiviert.
Konfluente Zellen wurden wöchentlich dreimal gesplittet und in T 75 Kulturflaschen à 3 bis 5 Millionen Zellen ausgesät. Das Kulturmedium wurde dreimal wöchentlich gewechselt.
2.1.2 Passagieren von adhärenten Zellen
Für das Passagieren der adhärenten MH-S Zellen wurde zunächst das alte Medium abgenommen und die Zellen mit sterilem RPMI gewaschen.
Anschließend wurden 3 ml Accutaselösung pro T 75 Zellkulturflasche zugegeben, um die Zellen abzulösen. Nach 5 bis 10 Minuten Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 ließen sich die Zellen mit serumhaltigem RPMI Medium lösen. Die proteolytische Wirkung der Accutase wurde durch Zugabe des FCS-haltigen Mediums gestoppt. Die abgelösten Zellen zentrifugierten für 10 Minuten bei 125 g und Raumtemperatur. Das Zellpellet wurde in 10 ml Kulturmedium resuspendiert, ein Aliquot mit Trypanblaulösung 1:1 verdünnt und die Zellzahl anschließend mittels einer Neubauerzählkammer bestimmt. Die Zellmembran vitaler Zellen ist für Trypanblau nicht durchlässig, wohingegen tote Zellen durch Trypanblau angefärbt werden. Die MH-S Zellen wurden anschließend à 3 bis 5 Millionen lebende Zellen in 15 ml Kulturmedium auf T 75 Zellkulturflaschen verteilt.
2.2 MLE-12-Zellen
Als etablierte Alveolarepithel-Zelllinie wurden in der vorliegenden Arbeit MLE-12-Zellen (ATCC-Nr. CRL-2110) verwendet, die 1992 von
Material und Methoden
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K. A. Wilkenheiser erstmals aus Lungentumoren transgener Mäuse gewonnen wurden. Die mit SV 40 transformierten Zellen ähneln in Funktion und Morphologie dem distalen Alveolarepithel. MLE-12-Zellen exprimieren die spezifischen Surfactant-assoziierten Protein SP-B und SP-C. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu Alveolarepithelzellen Typ II dienen MLE-12-Zellen unter anderem als Modell zur Untersuchung der Regulation und Synthese von Surfactant [46, 47].
2.2.1 Zellkultur der MLE-12-Zellen
MLE-12-Zellen wurden im 15 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-Medium) mit 10% FCS, 5% Glutamin und 5% Penicillin bei 37 °C und 5% CO2 in T 75 Kulturflaschen in Kultur gehalten. Das Kulturmedium wurde dreimal wöchentlich gewechselt. Die konfluenten MLE-12-Zellen wurden zweimal wöchentlich mit einer Subkultivierungsrate von 1:10 (entspricht etwa 3 Millionen Zellen) passagiert. Dazu wurden die adhärenten Zellen zunächst vom verbrauchten Medium befreit und mit 2 ml Trypsin-EDTA gespült. Zum Ablösen wurden die Zellen mit 500 µl Trypsin-EDTA für 10 Minuten bei 37 °C und 10% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden mit serumhaltigem DMEM- Kulturmedium vom Flaschenboden gespült, im Kulturmedium aufgenommen mit einer Subkultivierungsrate von 1:10 auf neue T 75 Zellkulturflaschen verteilt.
2.3 Bronchoalveoläre Lavage zur Gewinnung von residenten Alveolarmakrophagen
Zur Gewinnung residenter Alveolarmakrophagen wurde die Trachea von zuvor getöteten Mäusen freipräpariert und quer inzidiert. Anschließend wurde eine stumpfe Kanüle (21g) in der Trachea mit Hilfe einer Ligatur fixiert. Über diesen BAL-Katheter wurde die Lunge mit insgesamt 6 ml eiskalter PBS/EDTA-Lavagelösung à 500 µl Aliquots lavagiert. Die Lavageflüssigkeit wurde für 10 Minuten bei 1400 rpM und Raumtemperatur zentrifugiert und das Zellpellet in 500 µl RPMI-Kulturmedium aufgenommen. Mit Hilfe einer Neubauerzählkammer wurde die Gesamtzellzahl bestimmt.
2.4 Isolation von Alveolarepithelzellen aus murinem Lungengewebe Die Isolation primärer Alveolarepithelzellen (AEC) wurde nach der Methode von Corti et al. mit einigen Veränderungen durchgeführt. Zur Isolation der
Material und Methoden
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Typ II Alveolarepithelzellen wurde nach der bronchoalveolären Lavage zunächst das linke Atrium des Herzens vorsichtig eröffnet und der rechte Ventrikel mittels Butterflynadel (21g) punktiert. Anschließend wurde die Lunge mit 5 bis 10 ml HBSS ohne Phenolrot solange perfundiert, bis das Lungenparenchym weiß (d.h. optisch frei von Blut) war. Nun wurde über den BAL-Katheter langsam circa 1 ml Dispase in die Lunge gefüllt, bis sich alle Lungenlappen entfalteten. Zusätzlich wurden 0,5 ml 45 °C warme 1% low melting Agarose über den Katheter in die Lunge infundiert. Nachdem die Agarose sich verfestigt hatte, wurden die Lunge zusammen mit Trachea und Fixationsfaden herauspräpariert sowie das Herz entfernt. Anschließend inkubierten die Lunge und Trachea für 45 Minuten steril bei Raumtemperatur in 2 ml warmer Dispaselösung. Danach wurde die Lunge in 0,01%
DNase-haltigem DMEM-Medium vorsichtig in ihre einzelnen Lappen zertrennt.
Der Bronchialbaum sowie die Trachea wurden verworfen. Die Lungenlappen wurden in kleine Gewebsstücke zerzupft und anschließend für 10 Minuten bei Raumtemperatur kontinuierlich geschwenkt. Die Zellsuspension filtrierte zunächst über einen 100 µm, dann über einen 40 µm Cell Strainer und schließlich über ein steriles Nylonnetz mit 20 µm großen Poren. Anschließend wurde die Zellsuspension bei 130 g und 4 °C 8 Minuten lang zentrifugiert, dekantiert und in 10 ml DMEM-Kulturmedium resuspendiert. Die Anzahl der vitalen Zellen wurde mit Trypanblau in einer Neubauerzählkammer bestimmt.
Zur Anreicherung von Alveolarepithelzellen Typ II aus der Zellsuspension erfolgte die Selektion der Zellen mit Hilfe von Antikörpern gegen CD 16/32 und CD 45. Hierzu inkubierten die Zellen bei 37 °C für 30 Minuten mit biotinyliertem Antikörper gegen CD 16/32 (0,65 µg/106 vitale Zellen) sowie gegen CD 45 (2 µl/106 vitale Zellen). Während der Inkubation wurde die Suspension von an Streptavidin gekoppelten Magnetpartikeln zweimal mit sterilem PBS mit Hilfe eines Magnets gewaschen. Anschließend wurde die Zellsuspension bei 130 g und 4 °C für 8 Minuten zentrifugiert, das Zellpellet in 7 ml DMEM-Kulturmedium aufgenommen und mit den gewaschenen magnetischen Streptavidinpartikeln (1 mg Streptavidinpartikel/70 µg Antikörper CD 16/32/45) inkubiert. Die Zellsuspension inkubierte zusammen mit Antikörpern und Streptavidinpartikeln 30 Minuten auf dem Rollinkubator. Um die Alveolarepithelzellen über die Antikörper aufzureinigen, wurde die Suspension für 15 Minuten in einem
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Magneten inkubiert. Schließlich wurde die Zellsuspension, die nicht über den Antiköper-Streptavidin-Komplex am Magneten gebunden war, eluiert. Die CD 16/32-negativen und CD 45-negativen Zellen wurde bei 130 g und 4 °C 8 Minuten zentrifugiert und anschließend in 2 ml DMEM-Kulturmedium aufgenommen. Die Zellzahl wurde erneut mit Trypanblau bestimmt.
Schlussendlich wurden die aufgereinigten Alveolarepithelzellen à 500.000 lebende Zellen für mindestens 2h auf mit Fibronektin beschichtete 24-Well-Platten ausgesät. Die Zellen adhärierten für 48h im DMEM-Kulturmedium bei 37 °C und 10% CO2 [48].
2.4.1 Färbung nach Papanicolaou
Zur Bestimmung der Reinheit der gewonnen Alveolarepithelzellen Typ II wurden die Zellen nach der modifizierten Färbemethode von Papanicolaou gefärbt. Die Zellen wurden in einer Zytozentrifuge auf vertikal montierte Objektträger bei 500 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die über 18h luftgetrockneten Präparate wurden in gefiltertem Hämatoxylin für 3 bis 4 Minuten gefärbt. Anschließend wurden die Präparate in destilliertem Wasser gewaschen und für 2 Minuten in einer frisch angesetzten Lithiumcarbonatlösung (2 ml gesättigte Lithiumcarbonatlösung mit 158 ml destilliertem Wasser) inkubiert. Die Präparate wurden erneut in destilliertem Wasser gewaschen. Zur Entwässerung der Präparate wurden sie in einer aufsteigenden Alkoholreihe (50% Ethanol für 90 Sekunden; 80% Ethanol für 15 Sekunden; 95% Ethanol für 15 Sekunden; 100% Ethanol für 30 Sekunden; Xylol: Ethanol im Verhältnis 1:1 für 30 Sekunden) und schließlich für 60 Sekunden in reinem Xylol inkubiert.
Unter dem Mikroskop erfolgte die zelluläre Differenzierung bei 800-facher Vergrößerung. Die Identifikation von Typ II Zellen erfolgte anhand dunkel gefärbter Einschlusskörperchen, den sogenannten lamellar bodies, die nur in Alveolarepithelzellen Typ II zu finden sind [49].
2.5 Etablierung des adenoviralen Gentransfers von biologisch aktivem TGF-β1 in murinen Alveolarepithelzellen
Zur Schaffung eines profibrotischen Mikromilieus wurden eine murine Alveolarepithel-Zelllinie mit dem adenoviralen Genvektor AdTGF-β1223-225 (AdTGF-β1) transfiziert. Um Veränderungen der MLE-12-Zellen allein durch die Transfektion mit einem adenoviralen Vektor auszuschließen, wurden als
Material und Methoden
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Kontrollexperiment MLE-12-Zellen mit dem Leervektor AdDL70-3 transfiziert [17, 23].
2.5.1 Adenovirale Vektoren
Der adenovirale Genvektor AdTGF-β1223-225 enthält die cDNA der kodierenden Sequenz des kompletten porcinen TGF-β1. Durch den Austausch der Aminosäure Zystein gegen Serin an Position 223 und 225 wird ausschließlich biologisch aktives TGF-β1 von den transfizierten Zellen sezerniert. Der Leervektor AdDL70-3 wurde als Kontrollvektor eingesetzt [17, 23].
2.5.2 Vorbereitung von MLE-12-Zellen bzw. primären
Alveolarepithelzellen auf die Transfektion mit AdTGF-β1
Die MLE-12-Zellen wurden am Vortrag à 2 Millionen Zellen in DMEM-Kulturmedium pro T 25 Zellkulturflasche ausgesät. Die Zellen adhärierten über Nacht im Brutschrank bei 37 °C und 10% CO2. Am Versuchstag wurden die Zellen aus einer Zellkulturflasche mit Trypsin-EDTA abgelöst und die Zellzahl in einer Neubauerzählkammer bestimmt. Primäre pulmonale Typ II Alveolarepithelzellen (AEC II) wurden wie unter 2.4 beschrieben aus der Maus isoliert und adhärierten bis zur Transfektion 48h in 24-Well-Platten.
2.5.3 Transfektion der MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1
Die adenoviralen Vektoren wurden in verschiedenen Infektionsdosen (Multiplicity of infection (MOI) von 10, 20, 50, 100) in 1 ml serumfreiem DMEM-Medium pro T 25 Zellkulturflasche aufgenommen. Zur Vorbereitung wurden die adhärenten MLE-12-Zellen dreimal mit 5 ml serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Schließlich wurden die MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 beziehungsweise zur Kontrolle mit AdDL70-3 für 1, 5, 3 oder 6h mit einer MOI von 20 und 50 bei 37 °C und 10% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation mit dem adenoviralen Vektor wurde der Überstand abgenommen und die Zellen auf Transwell-Inserts ausgesät. Die transfizierten Zellen wurden mit 500 µl Trypsin-EDTA für 10 Minuten bei 37 °C und 10% CO2 inkubiert, in serumhaltigen DMEM-Medium aufgenommen und bei 1.200 rpm für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Zellzahl wurde mit einer Neubauerzählkammer bestimmt. 100.000 transfizierte MLE-12-Zellen wurden in
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30 µl DMEM-Kulturmedium aufgenommen und auf eine Transwell-Insert- Unterseite ausgesät. Nach 4h Adhärenz auf der Unterseite wurden die Transwellinserts umgedreht und in der Transwellplatten mit 470 µl DMEM-Kulturmedium bei 37 °C und 10% CO2 inkubiert. Das Medium wurde nach 1h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h abgenommen und bei - 20 °C eingefroren.
2.6 Transfektion von primären Alveolarepithelzellen mit AdTGF-β1 Zur Vorbereitung wurden die adhärenten primären Alveolarepithelzellen dreimal mit 5 ml serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Anschließend wurden die primären Alveolarepithelzellen mit AdTGF-β1 mit einer MOI von 20 und 50 für 1,5h und 6h inkubiert. Das konditionierte Medium der primären Alveolarepithelzellen wurde 24h und 48h nach Transfektion abgenommen und bei -20 °C eingefroren.
2.6.1 Gewinnung von konditioniertem Medium
Konditioniertes Medium wurde 24h nach Transfektion von 2 Millionen MLE-12- Zellen mit AdTGF-β1 mit einer MOI von 50 gewonnen, aliquotiert und bei -20 °C eingefroren. Jedes Aliquot wurde ein einziges Mal zum Einsatz in einem Versuch aufgetaut.
2.6.2 Bestimmung der TGF-β1-Konzentration mittels ELISA
Die Konzentration von TGF-β1 aus dem Medium der AdTGF-β1-transfizierten MLE-12-Zellen beziehungsweise primären Alveolarepithelzellen nach 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h Inkubation wurde mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) (R&D Systems) nach Anleitung bestimmt. Die untere Nachweisgrenze des TGF-β1 lag bei 31,2 pg/ml, die obere bei 2000 pg/ml. Der ELISA misst die biologisch aktive Form von TGF-β1 und wurde ohne vorherige Aktivierung des (latenten) TGF-β1 durchgeführt, da der eingesetzte Genvektor die Sekretion von biologisch aktivem TGF-β1 induziert.
2.6.3 Messung proinflammatorischer Zytokine nach Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1
Epithelzellen sezernieren zahlreiche inflammatorische Zytokine [30]. Um zu analysieren, welchen Effekt die Transfektion mit AdTGF-β auf die Zytokinsekretion von MLE-12-Zellen hat, wurde die Konzentration der Zytokine
Material und Methoden
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CCL-2, KC, IL-6. MIP-2 und TNF-α im konditionierten Medium bestimmt. Hierzu wurden die entsprechenden Zytokine mittels ELISA (R&D Systems) gemessen.
Die Detektionsspanne der verwendeten ELISAs lag für CCL-2: 15,6 pg/ml bis 1000 pg/ml, für KC: 15,6 pg/ml bis 1000 pg/ml, für IL-6: 7,8 pg/ml bis 500pg/ml, für MIP-2: 7,8 pg/ml bis 500 pg/ml, und für TNF-α: 23,5 pg/ml bis 1500 pg/ml.
2.7 Kultur und Quantifizierung von Streptococcus pneumoniae In den folgenden Versuchen wurde ein bekapseltes, Pneumolysin- produzierendes klinisches Isolat des Pneumokokkenserotyps 19F (EF 3030) verwendet. Die Pneumokokken wurden in Todd-Hewitt Broth (THB) mit 20%
FCS bis zu einer mittleren log-Stufe kultiviert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C aufbewahrt. Zur Bestimmung der Keimlast wurden die Pneumokokken seriell verdünnt und auf Schafblutagarplatten ausplattiert. Nach 18h Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 konnte die Keimzahl pro Aliquot anhand der Colony forming Units (CFU) bestimmt werden.
2.8 Etablierung eines Pneumokokken-Makrophagen-Phagozytose- Assays in vitro
Zur Untersuchung des Potentials von MH-S Zellen, Streptococcus pneumoniae zu phagozytieren, wurden MH-S Zellen mit verschiedenen MOIs infiziert. Zur Beurteilung der Phagozytoseleistung wurde die intrazelluläre Pneumokokkenlast nach Infektion bestimmt. Die MH-S Zellen wurden à 500.000 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte ausgesät. Die Zellen adhärierten über Nacht im Brutschrank bei 37 °C und 5% CO2. Die Zellzahl wurde am Versuchstag erneut in 2 Wells verifiziert. Die zuvor quantifizierten Pneumokokken wurden aufgetaut, in ein 15ml Falconröhrchen überführt, mit THB aufgefüllt und 10 Minuten bei 4000 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Die Pneumokokken wurden entsprechend einer MOI von 10, 20, 50 und 100 in 100 µl RPMI-Medium ohne Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) aufgenommen.
Zur Verifizierung der Infektionsdosis wurden 100 µl der eingesetzten Pneumokokkensuspension seriell in THB verdünnt und auf Columbia- Agarplatten ausgestrichen. Zur Entfernung des Pen/Strep aus der Kultur der MH-S Zellen wurden die adhärenten MH-S Zellen viermal mit 1 ml RPMI ohne Zusätze gewaschen. Anschließend wurden 100 µl RPMI-Kulturmedium ohne
Material und Methoden
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Pen/Strep auf die Makrophagen gegeben sowie mit 100 µl der vorbereiteten Pneumokokkensuspension infiziert. Die mit Pneumokokken infizierten MH-S Zellen wurden bei 3000 rpm und Raumtemperatur für 3 Minuten zentrifugiert, um die Pneumokokken im Überstand auf die adhärenten MH-S Zellen zu zentrifugieren. Die MH-S Zellen inkubierten mit den Pneumokokken zusammen für 30 Minuten im Brutschrank bei 37 °C und 5% CO2. Zur Bestimmung der nicht phagozytierten Pneumokokken wurden die Überstände der MH-S Zellen abgenommen, seriell in THB verdünnt und auf Schafblutagarplatten ausgestrichen. Nach 18h Inkubation bei 37 °C und 10% CO2 wurden die CFU auf den Schafblutagarplatten bestimmt. Um die Effektivität der Waschschritte zur Entfernung der extrazellulären, nicht- phagozytierten Pneumokokken aus Kulturen Streptococcus pneumoniae- infizierter MH-S Zellen zu evaluieren, inkubierte eine Gruppe Pneumokokken- infizierter MH-S Zellen in RPMI-Medium mit 20 µg/ml Gentamicin. Eine zweite Gruppe Streptococcus pneumoniae-infizierter MH-S Zellen wurde in vier Waschschritten mit je 1 ml HBSS ohne Ca2+/Mg2+ gewaschen und anschließend in antibiotikafreiem Medium inkubiert. Zur Evaluierung der Waschschritte wurden die Zellen beider Gruppen nach 30 Minuten Inkubationszeit lysiert und die Pneumokokkenlast wie unten beschrieben analysiert.
2.8.1 Bestimmung der intrazellulären Pneumokkenlast der MH-S Zellen Zur Evaluierung der Phagozytoseleistung von MH-S Zellen gegenüber Streptococcus pneumoniae wurde die intrazelluläre Pneumokokkenlast bestimmt. Nach 30 Minuten Inkubation wurde alle MH-S Zellen in vier Waschschritten mit je 1 ml HBSS ohne Ca2+/Mg2+ von extrazellulären Pneumokokken befreit. Um die intrazelluläre Pneumokokkenlast zu bestimmen, wurden die gewaschenen, infizierten MH-S Zellen lysiert. Zur Lyse inkubierten die Zellen mit 450 µl HBSS sowie 50 µl 1% Saponinlösung in PBS-/- für 10 Minuten bei 37 °C und 5% CO2. Das Zelllysat wurde seriell verdünnt, auf Schafblutagarplatten ausgestrichen und für 18 h bei 37 °C und 5% CO2
inkubiert und anschließend die CFU bestimmt.
2.9 Etablierung eines Pneumokokken-Killing-Assays in vitro
In einem zweiten Schritt wurde das Potential der MH-S Zellen, die phagozytierten Pneumokokken intrazellulär abzutöten, untersucht. Hierzu
Material und Methoden
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wurde der Verlauf der intrazellulären Pneumokokkenlast nach Phagozytose bestimmt. Zur Bestimmung des Killingpotentials wurden die MH-S Zellen wie oben beschriebenen 30 Minuten lang mit Pneumokokken bei einer MOI von 20, 50 und 100 inkubiert. Anschließend wurden die extrazellulären Pneumokokken mit vier Waschschritten mit je 1 ml HBSS ohne Ca2+/Mg2+ aus der Kultur entfernt. Die infizierten MH-S Zellen wurden anschließend für weitere 30, 60, 90 und 120 Minuten in 500 µl antibiotikafreiem Medium bei 37 °C und 5% CO2
inkubiert. Zur Bestimmung der intrazellulären Pneumokokkenlast nach den entsprechenden Inkubationszeiten wurden die MH-S Zellen wie oben beschrieben lysiert, das Zelllysat seriell verdünnt und zur Bestimmung der CFU auf Agarplatten ausgestrichen.
2.10 Untersuchung des Pneumokokkenwachstums unter dem Einfluss von TGF-β1
In Vorarbeit auf die Untersuchung des Einflusses von rekombinantem TGF-β1 auf die antibakterielle Abwehrfunktion von Makrophagen wurde zunächst der Einfluss von rekombinantem TGF-β1 auf das Wachstum von Pneumokokken untersucht. Zur Bestimmung des Pneumokokkenwachstums unter dem Einfluss von rekombinantem TGF-β1 wurden 1x107 CFU Streptococcus pneumoniae pro 12-Well-Kulturschale für 2h bei 37 °C und 5% CO2 in An- und Abwesenheit von je 10 ng/ml und 100 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Da rekombinantes TGF-β1 in einer inaktiven Form vorliegt, wurde das Zytokin vor Einsatz durch Ansäuern aktiviert.
Die entsprechenden Kontrollversuche wurden bei demselben pH nach Ansäuern mit HCL durchgeführt. Anschließend wurden die Pneumokokken aus den Wells in insgesamt 15 ml THB aufgenommen, erneut bei Raumtemperatur bei 4.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, dekantiert und in 2 ml THB resuspendiert. 100 µl der Suspension wurden dekadisch verdünnt und auf Schafblutagarplatten ausgestrichen. Nach 18h Inkubation bei 37 °C und 5%
CO2 wurden die CFU gezählt.
2.11 Effekt von konditioniertem Medium bzw. rekombinantem TGF-β1 auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen Um den Einfluss konditionierten Mediums von transduzierten MLE-12-Zellen beziehungsweise rekombinantem TGF-β1 auf die Phagozytoseleistung von
Material und Methoden
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MH-S Zellen gegenüber Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, inkubierten MH-S Zellen vor der Infektion mit Streptococcus pneumoniae mit TGF-β1-haltigem Medium. Hierfür wurden die MH-S Zellen am Vortag à 500.000 Zellen pro 24-Well-Platte ausgesät. Nach drei Waschschritten mit RPMI inkubierten die Zellen für 3h mit 200 µl konditioniertem Medium der mit AdTGF-β1 transduzierten MLE-12-Zellen beziehungsweise Medium mit rekombinantem TGF-β1 bei 37 °C und 5% CO2. TGF-β1-konditioniertes Medium von MLE-12-Zellen, dessen TGF-β1 Gehalt zuvor mittels ELISA bestimmt wurde, wurde in einer Endkonzentration von 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml und 1,5 ng/ml TGF-β1 zu den kultivierten MH-S Zellen pipettiert. In parallel durchgeführten experimentellen Ansätzen zugefügtes rekombinantes TGF-β1 wurde nach Aktivierung durch Ansäuern in den Endkonzentrationen von 10 ng/ml sowie 100 ng/ml zugefügt. Nach 3h Vorinkubation mit TGF-β1 wurden die Zellen mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 infiziert und weitere 30 Minuten zur Phagozytose der Pneumokokken bei 37 °C und 5% CO2
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1% Saponin lysiert, das Lysat seriell verdünnt und ausgestrichen. Nach 18h Inkubation bei 37 °C und 5% CO2
wurde die Anzahl der CFU bestimmt.
2.12 Effekt von konditioniertem Medium auf das Pneumokokken- Killing durch MH-S Zellen
Zur Untersuchung des TGF-β1 Effekts auf das Killing-Potential von MH-S Zellen gegenüber Streptococcus pneumoniae wurden die Zellen nach erfolgter Phagozytose mit durch MLE-12-Zellen konditioniertem TGF-β1-haltigem Medium inkubiert. Hierfür wurden am Vortag 500.000 Zellen pro 24-Well-Platte ausgesät. Nach drei Waschschritten mit RPMI inkubierten die MH-S Zellen zur Phagozytose der Pneumokokken für 30 Minuten mit Streptococcus pneumoniae entsprechend einer MOI von 50. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 wurden die adhärenten Zellen viermal mit HBSS gewaschen.
TGF-β1-konditioniertes Medium von MLE-12-Zellen, dessen TGF-β1 Gehalt zuvor mittels ELISA bestimmt wurde, wurde in einer Endkonzentration von 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml und 1,5 ng/ml TGF-β zu den mit Pneumokokken infizierten MH-S Zellen gegeben. Die MH-S Zellen inkubierten weitere 30 Minuten bei 37 °C und 5% CO2 mit konditioniertem Medium von MLE-12-Zellen.
Material und Methoden
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Anschließend wurden die Zellen mit 0,1% Saponin lysiert und seriell 1:10 verdünnt ausgestrichen. Nach 18h Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 wurde die CFU bestimmt.
2.13 Bestimmung der Zellvitalität
Zur Überprüfung der Vitalität der MH-S Zellen wurden die in 500 µl enthaltenden Zellen mit 50 µl Propiumjiodid in einer Konzentration von 1 mg/ml für 5 Minuten in Dunkelheit angefärbt. Anschließend wurde unter dem Fluoroszenzsmikroskop der Anteil rotfluoreszierender Zellen (nekrotische Zellen) prozentual bestimmt.
2.14 Statistik
Die Angabe der Daten erfolgt als Mittelwert ± SD (standard deviation).
Vergleiche zwischen den Gruppen wurden nach Durchführung einer ANOVA-Varianzanalyse gefolgt von einem two-tailed Student’s t-test durchgeführt. Werte von p ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
Die statistische Analyse wurde nach Beratung durch das Institut für Biometrie der Medizinischen Hochschule durchgeführt.
Ergebnisse
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Kinetik der TGF-β1-Sekretion der MLE-12-Zellen nach Transfektion mit AdTGF- β1 dargestellt. Nach 1,5h, 3h, 6h und 12h lässt sich noch keine TGF-β1- Sekretion nachweisen. An Tag 1 post Transfektion zeigen sich erhebliche TGF- β1-Spiegel von circa 9 ng/ml, welche im Vergleich zu 48h signifikant anstiegen, 72h nach erfolgter Transfektion auf circa 12 ng/ml weiter ansteigen, um anschließend an Tag 5 post Transfektion im Vergleich zum Maximum nach 72h wieder auf circa 10 ng/ml nach 120h abzufallen.
Abbildung 3 stellt den Einfluss unterschiedlicher Inkubationszeiten (1,5h, 3h und 6h) von MLE-12-Zellen nach AdTGF-β1 Transfektion mit einer MOI von 20 und 50 auf die TGF-β1-Sekretion 24h und 48h nach Transfektion dar. Es lässt sich zeigen, dass Epithelzellen zeitabhängig mehr TGF-β1 sezernieren, je länger sie mit AdTGF-β1 inkubiert wurden. Die im Überstand gemessenen TGF-β1-Konzentrationen sind im Vergleich zur AdDl70-3 Kontrollgruppe für alle Infektionsdosen signifikant erhöht. Der Kontrollvektor AdDl70-3 induziert keine messbare TGF-β1-Sekretion.
Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass sich MLE-12-Zellen mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 transfizieren lassen und nach Transfektion zeit- und dosisabhängige TGF-β1 sezernieren.
Ergebnisse
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In den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transfektionsexperimenten wurde das Potential etablierter Epithelzellen zur TGF-β1-Sekretion nach Transfektion mit AdTGF-β1 zunächst unter Standardbedingungen unter Verwendung von in Kulturschalen angezogenen beziehungsweise kultivierten Epithelzellen ausgetestet. Um zukünftig auch eine Aussage darüber treffen zu können, ob AdTGF-β1-transfizierte Epithelzellen gleichermaßen in der Lage sind, TGF-β1 zu sezernieren, wenn sie nicht in Kulturschalen, sondern auf Transwellinserts kultiviert werden, und damit auch für zukünftige Kokulturexperimente mit Alveolarmakrophagen eingesetzt werden könnten, wurde in den nächsten Versuchen analysiert, ob sich auf Transwells kultivierte MLE-12-Zellen auch mit AdTGF-β1 transfizieren lassen. Hierfür wurden MLE-12-Zellen zunächst auf einem Transwellsystem kultiviert und anschließend mit AdTGF-β1 transfiziert. In einem ersten Versuchsansatz wurden die Zellen auf der Unterseite eines Transwellinserts ausgesät und anschließend mit AdTGF-β1 für bis zu 24h bei einer MOI von 20 bis 100 inkubiert, während die Kontrollgruppe mit Kontrollvektor AdDL70-3 inkubiert wurde. Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass unter keiner der ausgetesteten experimentellen Bedingungen eine TGF-β1-Sekretion nach AdTGF-β1-Transfektion von auf Transwells kultivierten MLE-12-Zellen nachzuweisen war (Daten nicht gezeigt).
Daher wurden in einem zweiten Schritt in T 75 Zellkulturflaschen ausgesäte MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 bei einer MOI von 20 und 50 über 6h zunächst transfiziert. Anschließend wurden diese transfizierten Zellen abgelöst und auf die Unterseite vorbereiteter Transwellinserts ausgesät. Nachfolgend wurde die TGF-β1-Konzentration sowohl im oberen als auch im unteren Kompartiment des Transwellsystems zu verschiedenen Zeitpunkten nach Aussaat der Zellen mittels ELISA bestimmt (siehe Abbildung 4 A). Abbildung 4 B zeigt die TGF-β1-Sekretion im unteren Kompartiment durch MLE-12-Zellen 18h, 24h, 48h, 72h, 96h und 120h nach Transfektion mit AdTGF-β1 mit einer MOI von 20 und 50 beziehungsweise Kontrollvektor. Für alle Zeitpunkte ist eine signifikant höhere TGF-β1-Sekretion von MLE-12-Zellen, die mit einer MOI von 50 im Vergleich zur MOI 20 transfiziert wurden, zu beobachten. Hierbei zeigen sich bei einer MOI von 50 bereits 18h nach Transfektion erhöhte TGF-β1-Spiegel von circa 1 ng/ml, welche 72h nach erfolgter Transfektion auf circa 3 ng/ml ansteigen, um anschließend an Tag fünf post Transfektion wieder auf circa
Ergebnisse
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2 ng/ml abzufallen. Die TGF-β1-Konzentrationen im unteren Kompartiment des Transwells lagen stets im Vergleich zum oberen Kompartiment zehnfach höher.
Diese Daten zeigen, dass MLE-12-Zellen auf Transwell nach Transfektion mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 eine dosisabhängige TGF-β1 sezernieren.
Ergebnisse
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3.2 Effekt der Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 auf die Sekretion proinflammatorischer Zytokine
Alveolarepithelzellen der Lunge können zahlreiche proinflammatorische Zytokine sezernieren [30, 36]. Um zu klären, welchen Effekt die Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 auf die proinflammatorische Zytokinsekretion hat, wurden diverse proinflammatorische Zytokine im konditionierten Medium von MLE-12-Zellen nach AdTGF-β1 Transfektion bestimmt. Hierzu wurde die Zytokinkonzentration von IL-6, MIP-2, TNF-α, CCL-2 und KC im konditionierten Medium von MLE-12-Zellen nach 24h und 48h nach Transfektion mit AdTGF-β1 (mock, 20 und 50) bestimmt. Es zeigte sich, dass für die Zytokine IL-6, MIP-2 und TNF-α kein Nachweis im konditionierten Medium der durch AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen möglich war. Abbildung 3 B, D und F zeigt die CCL2-Konzentration nach 24h und 48h im Medium von nicht transfizierten beziehungsweise mit AdDL70-3 transfizierten Zellen sowie in konditioniertem Medium von MLE-12-Zellen, die mit AdTGF-β1 mit einer MOI von 20 und 50 für 1,5h, 3h und 6h transfiziert wurden. Die CCL2-Konzentration ist im konditionierten Medium der mit AdTGF-β1 transfizierten Zellen genauso hoch wie im Medium der nicht-transfizierten Zellen. Die KC-Konzentration ist sowohl im konditionierten Medium der AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen, als auch im Kontrollmedium der nicht-transfizierten Zellen 24h nach Transfektion mit circa 200 pg/ml und nach 48h mit circa 400 pg/ml erhöht. Die KC-Konzentration im konditionierten Medium der AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen zeigt keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu Kontrollmedium der nicht-transfizierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, dass MLE-12-Zellen keine relevanten Mengen der analysierten Zytokine sezernieren, wobei die gemessenen CCL-2-Konzentrationen nur knapp oberhalb der Nachweisgrenze lagen. Lediglich KC zeigte mit circa 200-400 pg/ml nach 24h und 48h deutlich erhöhte Zytokinspiegel im konditionierten Medium, jedoch ohne signifikanten Unterschied zwischen Kontrollgruppe und AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen. Zusammenfassend induziert die Transfektion sowohl mit AdTGF-β1 als auch mit Kontrollvektor keine vermehrte Sekretion der untersuchen proinflammatorischen Zytokine.
Ergebnisse
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Um den Einfluss extrazellulär an MH-S Zellen adhärierender Pneumokokken auf die CFU-Bestimmung im Phagozytosetest auszuschließen, wurde Gentamicin-haltiges RPMI-Medium im Vergleich zu antibiotikafreiem RPMI-Medium im Phagozytose Assay eingesetzt. Der Einsatz von Medium mit Gentamicin im Vergleich zum Einsatz von antibiotikafreiem Medium ergab zu keinem Zeitpunkt Unterschiede in der intrazellulären Pneumokokkenlast, was darauf hindeutet, dass im durchgeführten Phagozytose-Assay keine relevanten Mengen an extrazellulären Pneumokokken an MH-S Zellen adhärierten und somit das Versuchsergebnis durch extrazelluläre Pneumokokkenadhärenz nicht verfälscht wurde.
3.5 Etablierung eines Makrophagen-Killing-Assays
Zur Untersuchung einer weiteren entscheidenden Abwehrfunktion der Makrophagen - das intrazelluläre Abtöten von Erregern - wurden Streptococcus pneumoniae-infizierte MH-S Zellen nach 30, 60 und 120 Minuten lysiert und ihre intrazelluläre Pneumokokkenlast bestimmt. Für eine optimale Quantifizierbarkeit der Pneumokokkenmenge im zeitlichen Verlauf wurden zunächst verschiedene MOIs ausgetestet. Abbildung 7 A zeigt den Versuchsaufbau, Abbildung 7 B stellt den zeitlichen Verlauf der intrazellulären Keimlast 30, 60 und 90 Minuten nach Infektion von MH-S Zellen mit Pneumokokken in einer MOI von 20, 50 und 100 dar. Abbildung 7 C zeigt exemplarisch die intrazelluläre Pneumokokkenlast der MH-S Zellen nach Infektion mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 für die Zeitpunkte 30, 60, 90 und 150 Minuten nach abgeschlossener Infektion. In Abbildung 7 B ist dargestellt, dass bei einer MOI von 20 mit Streptococcus pneumoniae vorbeladene MH-S Zellen bereits nach 60 Minuten Inkubationszeit keine intrazellulären Pneumokokken mehr aufweisen. Die intrazelluläre Pneumokokkenlast von MH-S Zellen, die mit einer MOI von 50 infizierten wurden, nahmen über einen Zeitraum von 30, 60, 90 bis 150 Minuten stetig ab. Auch bei einer MOI von 100 war eine kontinuierliche Abnahme der intrazellulären Pneumokokkenmenge im Verlauf der Zeit zu beobachten. In einzelnen Versuchen kam es bei dieser hohen Infektionsdosis jedoch zum Auswachsen der Pneumokokken und dadurch bedingt zu vermehrtem Zelltod, sodass eine MOI von 50 als Infektionsdosis zur Charakterisierung des
Ergebnisse
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3.7 Effekt von TGF-β1 auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen
Ausgehend von den Befunden unserer Arbeitsgruppe im Ganztiermodell, welche zeigen, dass eine sich entwickelnde Lungenfibrose zu einer reduzierten Abwehrfunktion gegenüber bakteriellen Infektionen führt, stellte sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Frage, ob möglicherweise ein profibrotisches Mikromilieu die Phagozytose-Kapazität von Alveolarmakrophagen negativ beeinflusst. Daher wurde zur Klärung der Frage, welchen Einfluss TGF-β1 auf die Abwehrfunktion von Makrophagen gegenüber Streptococcus pneumoniae hat, zum einen ein Pneumokokken-Phagozytose-Assay in Anwesenheit von rekombinantem TGF-β1 durchgeführt. Zum anderen wurde ein Phagozytose-Assay durchgeführt, in welchem die mit Pneumokokken beladenen MH-S Zellen in Anwesenheit von konditioniertem Medium von mit AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen kultiviert wurden. Um den Effekt von TGF-β1 auf die Phagozytose-Leistung von MH-S Zellen gegenüber Pneumokokken zu untersuchen, wurden die Zellen über 3h mit TGF-β1 vorinkubiert, danach gewaschen und anschließend mit Pneumokokken infiziert und nach weiteren 30 Minuten zur Bestimmung der intrazellulären Pneumokokkenlast lysiert. Abbildung 9 zeigt die intrazelluläre Pneumokokkenlast (CFU) in MH-S Zellen 30 Minuten nach Infektion mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 in Abhängigkeit von der Vorinkubation mit verschiedenen TGF-β1-Konzentrationen. Nach Vorinkubation von MH-S Zellen von mit AdTGF-β1-transfizierten MLE-12-Zellen konditioniertem Medium in der Endkonzentration von 0,5 ng/ml TGF-β1 sowie 1,5 ng/ml TGF-β1 lässt sich eine signifikante Steigerung der intrazellulären Pneumokokkenlast im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachten. Die Bestimmung der CFU zeigt keine Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und MH-S Zellen, welche mit 10 ng/ml und 100 ng/ml rekombinantem TGF-β1 nach vorangehender Aktivierung durch Ansäuern vorstimuliert wurden, sodass TGF-β1 in dieser Dosierung offensichtlich keinen Einfluss auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen hat. Zusätzlich wurde in jeder Gruppe nach Infektion mit Pneumokokken die Zellvitalität überprüft. In allen Gruppen lag die Nekroserate der Zellen unter 5%. Somit lässt sich der Einfluss von Zelltod auf die Phagozytose-Kapazität der analysierten Zellen weitgehend ausschließen.
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3.8 Effekt von TGF-β1 auf das bakterielle Killing von Pneumokokken durch MH-S Zellen
Zur Klärung der Frage, welchen Einfluss TGF-β1 auf das Pneumokokken-Killing durch MH-S Zellen hat, wurde ein Makrophagen-Killing-Assay durchgeführt.
Hierzu wurden MH-S Zellen zunächst mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 infiziert und anschließend zur Entfernung extrazellulärer Bakterien mehrfach gewaschen und die Zellen für weitere 30 Minuten in konditioniertem Medium inkubiert. Das für die Makrophagenkultur verwendete konditionierte Medium stammte von mit AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen und enthielt eine Endkonzentration von 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml und 1,5 ng/ml TGF-β1, während das Kontrollmedium kein TGF-β1 enthielt. Abbildung 10 zeigt die intrazelluläre Keimlast von Pneumokokken-infizierten MH-S Zellen nach Vorinkubation mit konditioniertem Medium, welches TGF-β1 in den Endkonzentration von 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml und 1,5 ng/ml enthielt. Hierbei ließ sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Keimlast für die TGF- β1-Konzentration von 1,0 ng/ml beobachten. Im konditionierten Medium selbst konnten neben TGF-β1 keine weiteren Zytokine in relevanter Menge nachgewiesen werden (siehe Kapitel 3.2).
