Statistik - Einfluss alveolarepithelialer TGF-β Sekretion auf die Abwehrfunktion von Alveolarma

Die Angabe der Daten erfolgt als Mittelwert ± SD (standard deviation).

Vergleiche zwischen den Gruppen wurden nach Durchführung einer ANOVA-Varianzanalyse gefolgt von einem two-tailed Student’s t-test durchgeführt. Werte von p ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.

Die statistische Analyse wurde nach Beratung durch das Institut für Biometrie der Medizinischen Hochschule durchgeführt.

Ergebnisse

Kinetik der TGF-β1-Sekretion der MLE-12-Zellen nach Transfektion mit AdTGF-β1 dargestellt. Nach 1,5h, 3h, 6h und 12h lässt sich noch keine TGF-Ad β1-Sekretion nachweisen. An Tag 1 post Transfektion zeigen sich erhebliche TGF-β1-Spiegel von circa 9 ng/ml, welche im Vergleich zu 48h signifikant anstiegen, 72h nach erfolgter Transfektion auf circa 12 ng/ml weiter ansteigen, um anschließend an Tag 5 post Transfektion im Vergleich zum Maximum nach 72h wieder auf circa 10 ng/ml nach 120h abzufallen.

Abbildung 3 stellt den Einfluss unterschiedlicher Inkubationszeiten (1,5h, 3h und 6h) von MLE-12-Zellen nach AdTGF-β1 Transfektion mit einer MOI von 20 und 50 auf die TGF-β1-Sekretion 24h und 48h nach Transfektion dar. Es lässt sich zeigen, dass Epithelzellen zeitabhängig mehr TGF-β1 sezernieren, je länger sie mit AdTGF-β1 inkubiert wurden. Die im Überstand gemessenen TGF-β1-Konzentrationen sind im Vergleich zur AdDl70-3 Kontrollgruppe für alle Infektionsdosen signifikant erhöht. Der Kontrollvektor AdDl70-3 induziert keine messbare TGF-β1-Sekretion.

Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass sich MLE-12-Zellen mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 transfizieren lassen und nach Transfektion zeit- und dosisabhängige TGF-β1 sezernieren.

Ergebnisse

In den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transfektionsexperimenten wurde das Potential etablierter Epithelzellen zur TGF-β1-Sekretion nach Transfektion mit AdTGF-β1 zunächst unter Standardbedingungen unter Verwendung von in Kulturschalen angezogenen beziehungsweise kultivierten Epithelzellen ausgetestet. Um zukünftig auch eine Aussage darüber treffen zu können, ob AdTGF-β1-transfizierte Epithelzellen gleichermaßen in der Lage sind, TGF-β1 zu sezernieren, wenn sie nicht in Kulturschalen, sondern auf Transwellinserts kultiviert werden, und damit auch für zukünftige Kokulturexperimente mit Alveolarmakrophagen eingesetzt werden könnten, wurde in den nächsten Versuchen analysiert, ob sich auf Transwells kultivierte MLE-12-Zellen auch mit AdTGF-β1 transfizieren lassen. Hierfür wurden MLE-12-Zellen zunächst auf einem Transwellsystem kultiviert und anschließend mit AdTGF-β1 transfiziert. In einem ersten Versuchsansatz wurden die Zellen auf der Unterseite eines Transwellinserts ausgesät und anschließend mit AdTGF-β1 für bis zu 24h bei einer MOI von 20 bis 100 inkubiert, während die Kontrollgruppe mit Kontrollvektor AdDL70-3 inkubiert wurde. Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass unter keiner der ausgetesteten experimentellen Bedingungen eine TGF-β1-Sekretion nach AdTGF-β1-Transfektion von auf Transwells kultivierten MLE-12-Zellen nachzuweisen war (Daten nicht gezeigt).

Daher wurden in einem zweiten Schritt in T 75 Zellkulturflaschen ausgesäte MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 bei einer MOI von 20 und 50 über 6h zunächst transfiziert. Anschließend wurden diese transfizierten Zellen abgelöst und auf die Unterseite vorbereiteter Transwellinserts ausgesät. Nachfolgend wurde die TGF-β1-Konzentration sowohl im oberen als auch im unteren Kompartiment des Transwellsystems zu verschiedenen Zeitpunkten nach Aussaat der Zellen mittels ELISA bestimmt (siehe Abbildung 4 A). Abbildung 4 B zeigt die TGF-β1-Sekretion im unteren Kompartiment durch MLE-12-Zellen 18h, 24h, 48h, 72h, 96h und 120h nach Transfektion mit AdTGF-β1 mit einer MOI von 20 und 50 beziehungsweise Kontrollvektor. Für alle Zeitpunkte ist eine signifikant höhere TGF-β1-Sekretion von MLE-12-Zellen, die mit einer MOI von 50 im Vergleich zur MOI 20 transfiziert wurden, zu beobachten. Hierbei zeigen sich bei einer MOI von 50 bereits 18h nach Transfektion erhöhte TGF-β1-Spiegel von circa 1 ng/ml, welche 72h nach erfolgter Transfektion auf circa 3 ng/ml ansteigen, um anschließend an Tag fünf post Transfektion wieder auf circa

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2 ng/ml abzufallen. Die TGF-β1-Konzentrationen im unteren Kompartiment des Transwells lagen stets im Vergleich zum oberen Kompartiment zehnfach höher.

Diese Daten zeigen, dass MLE-12-Zellen auf Transwell nach Transfektion mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 eine dosisabhängige TGF-β1 sezernieren.

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3.2 Effekt der Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 auf die Sekretion proinflammatorischer Zytokine

Alveolarepithelzellen der Lunge können zahlreiche proinflammatorische Zytokine sezernieren [30, 36]. Um zu klären, welchen Effekt die Transfektion von MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 auf die proinflammatorische Zytokinsekretion hat, wurden diverse proinflammatorische Zytokine im konditionierten Medium von MLE-12-Zellen nach AdTGF-β1 Transfektion bestimmt. Hierzu wurde die Zytokinkonzentration von IL-6, MIP-2, TNF-α, CCL-2 und KC im konditionierten Medium von MLE-12-Zellen nach 24h und 48h nach Transfektion mit AdTGF-β1 (mock, 20 und 50) bestimmt. Es zeigte sich, dass für die Zytokine IL-6, MIP-2 und TNF-α kein Nachweis im konditionierten Medium der durch AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen möglich war. Abbildung 3 B, D und F zeigt die CCL2-Konzentration nach 24h und 48h im Medium von nicht transfizierten beziehungsweise mit AdDL70-3 transfizierten Zellen sowie in konditioniertem Medium von MLE-12-Zellen, die mit AdTGF-β1 mit einer MOI von 20 und 50 für 1,5h, 3h und 6h transfiziert wurden. Die CCL2-Konzentration ist im konditionierten Medium der mit AdTGF-β1 transfizierten Zellen genauso hoch wie im Medium der nicht-transfizierten Zellen. Die KC-Konzentration ist sowohl im konditionierten Medium der AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen, als auch im Kontrollmedium der nicht-transfizierten Zellen 24h nach Transfektion mit circa 200 pg/ml und nach 48h mit circa 400 pg/ml erhöht. Die KC-Konzentration im konditionierten Medium der AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen zeigt keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu Kontrollmedium der nicht-transfizierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, dass MLE-12-Zellen keine relevanten Mengen der analysierten Zytokine sezernieren, wobei die gemessenen CCL-2-Konzentrationen nur knapp oberhalb der Nachweisgrenze lagen. Lediglich KC zeigte mit circa 200-400 pg/ml nach 24h und 48h deutlich erhöhte Zytokinspiegel im konditionierten Medium, jedoch ohne signifikanten Unterschied zwischen Kontrollgruppe und AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen. Zusammenfassend induziert die Transfektion sowohl mit AdTGF-β1 als auch mit Kontrollvektor keine vermehrte Sekretion der untersuchen proinflammatorischen Zytokine.

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Um den Einfluss extrazellulär an MH-S Zellen adhärierender Pneumokokken auf die CFU-Bestimmung im Phagozytosetest auszuschließen, wurde Gentamicin-haltiges RPMI-Medium im Vergleich zu antibiotikafreiem RPMI-Medium im Phagozytose Assay eingesetzt. Der Einsatz von Medium mit Gentamicin im Vergleich zum Einsatz von antibiotikafreiem Medium ergab zu keinem Zeitpunkt Unterschiede in der intrazellulären Pneumokokkenlast, was darauf hindeutet, dass im durchgeführten Phagozytose-Assay keine relevanten Mengen an extrazellulären Pneumokokken an MH-S Zellen adhärierten und somit das Versuchsergebnis durch extrazelluläre Pneumokokkenadhärenz nicht verfälscht wurde.

3.5 Etablierung eines Makrophagen-Killing-Assays

Zur Untersuchung einer weiteren entscheidenden Abwehrfunktion der Makrophagen - das intrazelluläre Abtöten von Erregern - wurden Streptococcus pneumoniae-infizierte MH-S Zellen nach 30, 60 und 120 Minuten lysiert und ihre intrazelluläre Pneumokokkenlast bestimmt. Für eine optimale Quantifizierbarkeit der Pneumokokkenmenge im zeitlichen Verlauf wurden zunächst verschiedene MOIs ausgetestet. Abbildung 7 A zeigt den Versuchsaufbau, Abbildung 7 B stellt den zeitlichen Verlauf der intrazellulären Keimlast 30, 60 und 90 Minuten nach Infektion von MH-S Zellen mit Pneumokokken in einer MOI von 20, 50 und 100 dar. Abbildung 7 C zeigt exemplarisch die intrazelluläre Pneumokokkenlast der MH-S Zellen nach Infektion mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 für die Zeitpunkte 30, 60, 90 und 150 Minuten nach abgeschlossener Infektion. In Abbildung 7 B ist dargestellt, dass bei einer MOI von 20 mit Streptococcus pneumoniae vorbeladene MH-S Zellen bereits nach 60 Minuten Inkubationszeit keine intrazellulären Pneumokokken mehr aufweisen. Die intrazelluläre Pneumokokkenlast von MH-S Zellen, die mit einer MOI von 50 infizierten wurden, nahmen über einen Zeitraum von 30, 60, 90 bis 150 Minuten stetig ab. Auch bei einer MOI von 100 war eine kontinuierliche Abnahme der intrazellulären Pneumokokkenmenge im Verlauf der Zeit zu beobachten. In einzelnen Versuchen kam es bei dieser hohen Infektionsdosis jedoch zum Auswachsen der Pneumokokken und dadurch bedingt zu vermehrtem Zelltod, sodass eine MOI von 50 als Infektionsdosis zur Charakterisierung des

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3.7 Effekt von TGF-β1 auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen

Ausgehend von den Befunden unserer Arbeitsgruppe im Ganztiermodell, welche zeigen, dass eine sich entwickelnde Lungenfibrose zu einer reduzierten Abwehrfunktion gegenüber bakteriellen Infektionen führt, stellte sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Frage, ob möglicherweise ein profibrotisches Mikromilieu die Phagozytose-Kapazität von Alveolarmakrophagen negativ beeinflusst. Daher wurde zur Klärung der Frage, welchen Einfluss TGF-β1 auf die Abwehrfunktion von Makrophagen gegenüber Streptococcus pneumoniae hat, zum einen ein Pneumokokken-Phagozytose-Assay in Anwesenheit von rekombinantem TGF-β1 durchgeführt. Zum anderen wurde ein Phagozytose-Assay durchgeführt, in welchem die mit Pneumokokken beladenen MH-S Zellen in Anwesenheit von konditioniertem Medium von mit AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen kultiviert wurden. Um den Effekt von TGF-β1 auf die Phagozytose-Leistung von MH-S Zellen gegenüber Pneumokokken zu untersuchen, wurden die Zellen über 3h mit TGF-β1 vorinkubiert, danach gewaschen und anschließend mit Pneumokokken infiziert und nach weiteren 30 Minuten zur Bestimmung der intrazellulären Pneumokokkenlast lysiert. Abbildung 9 zeigt die intrazelluläre Pneumokokkenlast (CFU) in MH-S Zellen 30 Minuten nach Infektion mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 in Abhängigkeit von der Vorinkubation mit verschiedenen TGF-β1-Konzentrationen. Nach Vorinkubation von MH-S Zellen von mit AdTGF-β1-transfizierten MLE-12-Zellen konditioniertem Medium in der Endkonzentration von 0,5 ng/ml TGF-β1 sowie 1,5 ng/ml TGF-β1 lässt sich eine signifikante Steigerung der intrazellulären Pneumokokkenlast im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachten. Die Bestimmung der CFU zeigt keine Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und MH-S Zellen, welche mit 10 ng/ml und 100 ng/ml rekombinantem TGF-β1 nach vorangehender Aktivierung durch Ansäuern vorstimuliert wurden, sodass TGF-β1 in dieser Dosierung offensichtlich keinen Einfluss auf die Pneumokokken-Phagozytose durch MH-S Zellen hat. Zusätzlich wurde in jeder Gruppe nach Infektion mit Pneumokokken die Zellvitalität überprüft. In allen Gruppen lag die Nekroserate der Zellen unter 5%. Somit lässt sich der Einfluss von Zelltod auf die Phagozytose-Kapazität der analysierten Zellen weitgehend ausschließen.

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3.8 Effekt von TGF-β1 auf das bakterielle Killing von Pneumokokken durch MH-S Zellen

Zur Klärung der Frage, welchen Einfluss TGF-β1 auf das Pneumokokken-Killing durch MH-S Zellen hat, wurde ein Makrophagen-Killing-Assay durchgeführt.

Hierzu wurden MH-S Zellen zunächst mit Pneumokokken mit einer MOI von 50 infiziert und anschließend zur Entfernung extrazellulärer Bakterien mehrfach gewaschen und die Zellen für weitere 30 Minuten in konditioniertem Medium inkubiert. Das für die Makrophagenkultur verwendete konditionierte Medium stammte von mit AdTGF-β1 transfizierten MLE-12-Zellen und enthielt eine Endkonzentration von 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml und 1,5 ng/ml TGF-β1, während das Kontrollmedium kein TGF-β1 enthielt. Abbildung 10 zeigt die intrazelluläre Keimlast von Pneumokokken-infizierten MH-S Zellen nach Vorinkubation mit konditioniertem Medium, welches TGF-β1 in den Endkonzentration von 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml und 1,5 ng/ml enthielt. Hierbei ließ sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Keimlast für die TGF-β1-Konzentration von 1,0 ng/ml beobachten. Im konditionierten Medium selbst konnten neben TGF-β1 keine weiteren Zytokine in relevanter Menge nachgewiesen werden (siehe Kapitel 3.2).

Diskussion

40 4 Diskussion

Zur Etablierung eines alveolarepithelialen Zellkultursystems, dass den Einfluss eines profibrotischen Mikromilieus auf die Makrophagenabwehr von Pneumokokken zu untersuchen erlaubt, wurde zunächst die alveolarepitheliale Zelllinie MLE-12 mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 transfiziert. Die transfizierten MLE-12-Zellen sezernieren zeit- und dosisabhängig TGF-β1, jedoch im Wesentlichen keine weiteren proinflammatorischen Zytokine. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus auch die Transfektion von primären Typ II Alveolarepithelzellen mit AdTGF-β1 etabliert. Zur Klärung der Frage, ob ein profibrotisches Mikromilieu die Abwehrfunktion von Alveolarmakrophagen gegenüber Streptococcus pneumoniae beeinflusst, wurde die murine Alveolarmakrophagen-Zelllinie MH-S mit Streptococcus pneumoniae infiziert und ein Phagozytose-Killing-Assay zur Evaluierung der aufgenommenen und im Laufe der Zeit abgetöteten Pneumokokkenlast in An- und Abwesenheit von TGF-β1 etabliert. Nach Vorinkubation von MH-S Zellen von mit AdTGF-β1-transfizierten MLE-12-Zellen konditioniertem Medium in der Endkonzentration von 0,5 ng/ml sowie 1,5 ng/ml TGF-β1 lässt sich eine signifikante Steigerung der intrazellulären Pneumokokkenlast im Phagozytose-Assay nachweisen. In der Untersuchung der Killing-Kapazität von Makrophagen gegenüber Pneumokokken unter dem Einfluss von konditioniertem Medium in der Endkonzentration von 1,0 ng/ml TGF-β1 ließ sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Pneumokokkenlast beobachten.

Die Lungenfibrose ist eine chronisch-interstitielle Lungenerkrankung. Die durchschnittliche Überlebensdauer von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose beträgt drei bis fünf Jahre nach Diagnosestellung [3, 5]. Zudem haben Patienten mit chronischen Lungenerkrankungen, wie zum Beispiel pulmonaler Fibrose ein erhöhtes Risiko, an bakteriellen und viralen Infektionen der Lunge zu erkranken [3, 5]. Für die Therapie der IPF, deren Fortschreiten bisher nicht medikamentös zu beeinflussen war, zeichnen sich jüngst neue Therapieoptionen ab, nämlich der 2011 in Europa zugelassene Wirkstoff Pirfenidon und der Kinase-Inhibitor Nintedanib, die in einer Phase III Studie das Fortschreiten der Lungenfibrosierung verlangsamen konnten. [6, 7]. Die der IPF zugrunde liegenden Pathomechanismen sind weitgehend unbekannt. Auch ist

Diskussion

bis dato nicht bekannt, warum die Infektabwehr einer fibrotischen versus nicht-fibrotischen Lunge gegenüber inhalierten bakteriellen Erregern gestört ist [3].

Aktuell in der tierexperimentelle Forschung eingesetzten Modelle der pulmonalen Fibrose in kleinen Nagern sind das Bleomycin-Modell und das AdTGF-β1-Modell. Das AdTGF-β1-Modell der pulmonalen Fibrose bietet gegenüber dem Bleomycin-Modell den Vorteil, eine sich langsam und progressiv entwickelnde Lungenfibrose ohne initialen proinflammatorischen Zytokinsturm in Ratten zu induzieren [17, 19, 23]. Daneben zeigt dieses Modell weitere wesentliche Eigenschaften analog zur humanen Lungenfibrose, wie die irreversibel Destruktion des Lungenparenchyms, zumindest in Ratten, sowie partiell auch einen honigwabenartigen Umbau des Lungenparenchyms, sodass dieses Modell wahrscheinlich die Pathophysiologie der humanen Lungenfibrose besser rekapituliert als das Bleomycin-Modell der Lungenfibrose [17, 19, 23].

Hinzu kommt, dass adenovirale Vektoren einen primären Tropismus für Bronchial- und Alveolarepithelzellen haben, wodurch sich das AdTGF-β1-Fibrosemodell zur Transfektion von Alveolarepithelzellen zwecks Generierung eines intraalveolären profibrotischen Mikromilieus insbesondere auch für in vitro Untersuchungen eignet [22]. Diese Aspekte zusammengenommen bilden die Rationale dafür, dass in der vorliegenden Arbeit das AdTGF-β1-Fibrosemodell zur Untersuchung des Einflusses eines durch Alveolarepithelzellen generierten profibrotischen Mikromilieus auf die Abwehrfunktion von Makrophagen ausgewählt wurde [17, 19, 22, 23].

Hierzu wurden primäre Typ II Alveolarepithelzellen aus Mauslungen isoliert und mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 transfiziert. Nach Transfektion mit dem adenoviralen Vektor AdTGF-β1 zeigen die primären Alveolarepithelzellen eine zeit- und dosisabhängige TGF-β1-Sekretion. Das Modell mit Primärzellen bietet den Vorteil der größeren Ähnlichkeit zu in vivo Bedingungen. Die mikroskopische Kontrolle der Alveolarepithelzellen ergab keine Unterschiede in der Morphologie von Zellen nach Transfektion, jedoch ist bekannt, dass Typ II Epithelzellen in vitro sehr rasch in Typ I Epithelzellen ausdifferenzieren, und hierbei viele ihrer morphologischen und physiologischen Besonderheiten, wie zum Beispiel die Surfactantsynthese, verlieren [12].

Jedoch wurden diese Aspekte in der vorliegenden Arbeit nicht weiter untersucht.

Diskussion

In einem weiteren Schritt wurden Epithelzellen einer etablierten Zelllinie, sogenannte MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 transfiziert. Die Transfektion von MLE-12-Zellen zeigte ebenfalls eine klare Dosis- und Zeitabhängigkeit der TGF-β1-Response. Im zeitlichen Verlauf konnte 72h nach abgeschlossener Transfektion mit AdTGF-β1 die höchste Sekretion von TGF-β1 durch MLE-12-Zellen erreicht werden. Die Abnahme der TGF-β1-Sekretion im zeitlichen Verlauf lässt sich primär durch die transiente Transfektion der MLE-12-Zellen mit dem adenoviralen Genvektor erklären, während auch die fortwährende Zellteilung der MLE-12-Zellen im Versuchsverlauf zu berücksichtigen ist.

Die vorliegenden Daten zeigen, dass die TGF-β1-Konzentrationen im unteren Kompartiment des Transwellsystems im Vergleich zum oberen Kompartiment zehnfach höher liegen, was dadurch zu erklären ist, dass Epithelzellen Zytokine primär apikal und nicht basolateral sezernieren. Dies konnte durch frühere Arbeiten zur gerichteten RANTES und MCP-1 Sekretion durch Alveolarepithelzellen nach Stimulation mit TNF-α bereits gezeigt werden [50]. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass sich sowohl primäre Alveolarepithelzellen, als auch MLE-12-Zellen mit AdTGF-β1 transfizieren lassen und eine dosis- und zeitabhängige gerichtete TGF-β1 Sekretion nach Transfektion aufweisen.

Pneumokokken sind der prototypische Gram-positive Erreger der Lobärpneumonie des Menschen. Der Erreger ist weltweit für 1,6 Millionen Todesfälle jährlich verantwortlich und zählt damit zu den fünf häufigsten infektionsbedingten Todesursachen weltweit [39]. Residente Alveolarmakrophagen spielen in der angeborenen Immunabwehr gegenüber Bakterien eine Schlüsselrolle [26]. MH-S Zellen besitzen eine typische Makrohagenmorphologie. Auf Grund ihrer großen Ähnlichkeit zu primären Alveolarmakrophagen ist diese murine Zelllinie gut zur Untersuchung der immunologischen Funktionen von Makrophagen geeignet [45]. Um den Einfluss des profibrotischen Mikromilieus auf die Abwehrfunktion residenter Alveolarmakrophagen zu untersuchen, wurden zunächst Methoden zur Charakterisierung der Phagozytose und des Killings von Pneumokokken durch MH-S Zellen etabliert. In Kontrollversuchen mit Gentamicin, einem extrazellulär wirksamen Antibiotikum konnte gezeigt werden, dass ausschließlich

Diskussion

intrazellulär, das heißt durch MH-S Zellen phagozytierte Pneumokokken im den verwendeten Assays, analysiert wurden. Das profibrotische Zytokin TGF-β1 spielt in der Immunmodulation der Makrophagen eine zentrale Rolle. TGF-β1 reduziert die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (oxidativer Burst) in Makrophagen [34]. Die für die Abwehr von Pneumokokken entscheidenden Zytokine wie IL-8, TNF-α und GM-CSF durch Alveolarepithelzellen nehmen unter dem Einfluss von TGF-β1 ab [26, 35]. In der Studie von Nathan et al.

wurde berichtet, dass die Phagozytoseleistung von Makrophagen durch TGF-β in vitro marginal reduziert ist [34]. Da TGF-β1 eine Schlüsselrolle in der Entstehung der Lungenfibrose und in der Regulation vielfältiger Immunprozessen spielt, wurde in der vorliegenden Arbeit die Frage adressiert, ob TGF-β1 die Phagozytosekapazität von Streptococcus pneumoniae durch MH-S Zellen beeinflusst. Hierzu wurden MH-S Zellen mit konditioniertem Medium (0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 1,5 ng/ml TGF-β1) beziehungsweise rekombinantem TGF-β1 (10 ng/ml und 100 ng/ml) 3h lang inkubiert und anschließend mit Pneumokokken infiziert. Die Vorinkubation der Makrophagen mit TGF-β1 steht exemplarisch für den Einfluss des profibrotischen Mikromilieus der fibrosierenden Lunge vor einer möglichen pulmonalen Infektion mit Pneumokokken. Nach Vorinkubation von MH-S Zellen mit durch AdTGF-β1-transfizierten MLE-12-Zellen konditioniertem Medium in der Endkonzentration von 0,5 ng/ml sowie 1,5 ng/ml TGF-β1 ließ sich eine signifikante Steigerung der intrazellulären Pneumokokkenlast im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachten. Die Versuche zeigen, dass die Vorinkubation mit TGF-β1 möglicherweise zu einer Aktivierung der Makrophagen und damit verbundener Steigerung der Phagozytose von Pneumokokken durch Makrophagen führt. Als weitere mögliche Ursache der erhöhten intrazellulären Pneumokokkenlast ist ebenfalls ein verstärktes Pneumokokkenwachstum unter dem Einfluss von TGF-β1 zu diskutieren. Hierzu konnte jedoch in entsprechenden Kontrollexperimenten eine veränderte Wachstumsrate von Streptococcus pneumoniae unter dem Einfluss von TGF-β1 ausgeschlossen werden. Denkbar ist ebenfalls eine durch TGF-β1 induzierte Nekrose der Makrophagen und damit verbundene reduzierte Zellzahl und Phagozytosefähigkeit beziehungsweise Austritt teilungsfähiger Pneumokokken aus den zu Grunde gehenden Zellen, die so eine erhöhte intrazelluläre Keimlast

Diskussion

vortäuschen [9]. Hierzu zeigten sich in entsprechenden Kontrollversuchen für alle eingesetzten TGF-β1-Konzentrationen eine Makrophagenekrose von unter 5%, sodass eine durch TGF-β1 induzierte Makrophagennekrose als Ursache für die beobachteten erhöhten Keimzahlen in vitro ausgeschlossen werden konnte.

Denkbar als Ursache der gesteigerten intrazellulären Pneumokkokkenlast ist ein inhibitorischer Effekt des Zytokins TGF-β1 auf die Erreger-Elimination durch MH-S Zellen von Pneumokokken. Schlussendlich lässt sich jedoch gegenwärtig noch keine endgültige Aussage über den Einfluss von TGF-β1 auf die Phagozytose von MH-S Zellen gegenüber Pneumokokken treffen. Auch in vorangehenden Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen konnte keine eindeutige Aussage über den Effekt von TGF-β1 auf die Phagozytose-Kapazität von Makrophagen durch TGF-β1 gefunden werden [34].

Im nächsten Schritt wurden MH-S Zellen zunächst mit Streptococcus pneumoniae unter gleichen Bedingungen infiziert und anschließend ihr intrazelluläres Killing-Potential in An- und Abwesenheit von TGF-β1 evaluiert (siehe Abb. 9 A). Hierbei ließ sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Pneumokokkenmenge bei einer Vorinkubation der Makrophagen mit konditioniertem Medium, welches TGF-β1 in der Endkonzentration von 1,0 ng/ml enthielt, beobachten. Denkbar als Ursache der veränderten intrazellulären Keimlast ist ebenfalls eine durch TGF-β1 induzierte Nekrose [9] und die damit verminderte Killingkapazität durch Makrophagen. Hierbei zeigte sich in entsprechenden Untersuchungen mit

Im Dokument Einfluss alveolarepithelialer TGF-β Sekretion auf die Abwehrfunktion von Alveolarmakrophagen gegenüber Streptococcus pneumoniae (Seite 28-0)