der Medizinischen Hochschule Hannover
Etablierung einer allogenen Knochenmarktransplantation zur Prävention der Graft-versus-Host Reaktion mittels immunregulatorischer T-Zellen in einem
transgenen Mausmodell
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Sebastian Schwarte
aus Hannover
Hannover 2003
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Rektor: Professor Dr. med. Horst von der Hardt
Betreuer der Arbeit: Professor Dr. med. Dr. rer. nat. Matthias W. Hoffmann Referent: Professor Dr. med. Bernd Hertenstein
Koreferent: Professor Dr. med. Christoph Klein Tag der mündlichen Prüfung: 20.01.2004
Promotionsausschußmitglieder: Professor Dr. med. Karl Welte Professor Dr. med. Dietrich Peest Professorin Dr. med. Sylvia Glüer
Verwendete Abkürzungen... i
Produkte und Hersteller... ii
1 Einleitung ... 1
1.1 Selbsttoleranz und regulatorische T-Zellen... 1
1.1.1 Immunologische Selbsttoleranz ... 1
Zentrale Toleranz ... 2
Immunologische Ignoranz und periphere klonale Deletion ... 2
Anergie ... 3
1.1.2 Regulatorische T-Zellen ... 4
1.1.3 Klinische Bedeutung der regulatorischen T-Zellen... 7
1.2 Knochenmarktransplantation... 7
1.2.1 Immunologische Reaktionen bei der Knochenmarktransplantation ... 7
1.2.2 Historische Entwicklung, Indikationen und Komplikationen der KMT ... 8
1.2.3 Pathophysiologie der GvHD ... 12
1.3 Problemstellung... 19
1.3.1 Voruntersuchung ... 19
1.3.2 GvHD-Modell und Zielsetzung... 22
2 Material und Methoden ... 24
2.1 Versuchstiere ... 24
2.1.1 Tierschutzrechtliche Bestimmungen ... 24
2.1.2 Tierhaltung ... 24
2.1.3 Verwendete Stämme... 25
Nicht-transgene Tiere ... 25
MHC I - transgene Tiere ... 25
Des-TZR transgene Tiere ... 25
Des-TZRxKb-lo - transgene Mäuse ... 26
Des-TZRxLy5.1 - transgene Mäuse ... 26
2.1.4 Tierschutzgerechtes Töten der Tiere ... 27
2.2 Versuchsaufbau zur Etablierung des GvHD – Modells ... 27
2.2.1 Medien und Zusätze ... 27
2.2.2 Strahlenschutz ... 28
2.2.3 Ablauf der Knochenmarktransplantation ... 29
2.2.4 Konditionierung zur Knochenmarktransplantation ... 29
60Kobalt ... 30
Linearbeschleuniger ... 30
137Cäsium... 30
2.2.5 Präparation von Lymphknotenzellen... 31
2.2.6 Präparation von Knochenmarkzellen ... 32
2.2.7 Knochenmarktransplantation... 35
2.2.8 Monitoring und Beendigung des Versuchs ... 35
2.2.9 Statistik... 35
2.3.2 Präparation und Applikation der Zellen ... 36
2.3.3 Monitoring... 37
2.3.4 Statistik... 37
2.4 Durchflußzytometrie ... 38
2.4.1 Was ist Durchflußzytometrie?... 38
2.4.2 Durchflußzytometrische Untersuchungen... 38
2.4.3 FACS-Gerät, Medien, mAb und Fluoreszenzfarbstoffe... 40
2.4.4 Produktion der Antikörper aus eigener Herstellung... 42
Einfrieren von Hybridomzellen... 42
Auftauen von Hybridomzellen und Antikörpergewinnung... 42
Antikörperaufreinigung über Protein G ... 43
Antikörperaufreinigung und Proteinbestimmung... 43
Biotylinierung der monoklonalen Antikörper ... 44
Durchführung ... 45
FITC-Konjugation von Antikörpern ... 45
Durchführung ... 46
2.4.5 Probenmaterial... 46
Lymphknoten... 46
Milz ... 47
Blut ... 47
2.4.6 Aufarbeitung der Proben zur FACS-Analyse... 47
Milz ... 47
Lymphknoten... 48
Blut ... 48
2.4.7 Auswertung ... 49
2.5 Histologie ... 49
2.5.1 Organpräparation... 49
Haut ... 49
Milz ... 49
Leber... 50
Terminales Ileum... 50
2.5.2 Präparationstechnik zur histologischen Färbung... 50
2.5.3 Hämalaun-Eosin (H.E.)-Färbung ... 51
Färbevorgang... 51
Auswertung ... 51
3 Ergebnisse ... 52
3.1 Induktion einer GvHD... 52
3.1.1 GvH-Ergebnisse mit Injektion von KMZ... 52
3.1.2 Untersuchung des murinen KM ... 56
3.1.3 Induktion der GvHD mit Lymphknoten- und Knochenmarkzellen ... 57
3.1.4 GvH-Induktion mit Linearbeschleuniger nicht reproduzierbar... 60
3.1.5 LB-Protokoll: Niedrigere Box für Bestrahlung... 64
3.1.6 Zweiter Präventionsversuch ... 68
3.1.7 LB-Protokoll: Höhere Strahlen- und Zelldosis ... 70
3.1.8 Präventionseffekt beim Cäsium-Gerät ... 77
3.2 Histologische Ergebnisse ... 82
3.3.2 Fragestellungen ... 87
3.3.3 Proliferation... 89
3.3.4 Unterschied zwischen Präventions-und GvH-Gruppe ... 91
3.3.5 Rekonstitution und Aktivierung ... 95
4 Diskussion ... 100
4.1 Das tierexperimentelle GvHD-Modell ... 100
4.1.1 Warum ein GvHD-Modell?... 100
4.1.2 Das doppelt-transgene Mausmodell ... 102
4.2 Ergebnisse des GvHD-Modells ... 105
4.2.1 Lymphknotenzellen zusätzlich zur GvHD-Induktion notwendig ... 105
4.2.2 Bestrahlung... 111
Bestrahlungsmodell ... 111
Alopezie ... 113
Engraftment ... 114
4.2.3 Unterschiedliche Bestrahlungsmodalitäten ... 116
Technische Unterschiede... 116
Dosisaufbaueffekt... 117
GvHD und Tiefendosis... 119
Andere technische Faktoren zur GvHD-Induktion ... 122
Strahlenwirkung auf die Immunreaktion... 124
Anergie nach aktivierungsinduziertem Zelltod ... 129
Toleranz durch Internalisierung des T-Zell-Rezeptors ... 131
Anergie durch chronische Stimulation ... 132
Charakterisierung der GvH-Reaktion... 132
Modell: Chronische GvHD durch CD8+ T-Zellen ... 133
4.3 Prävention... 135
4.3.1 Wirkmechanismus der Des-TZRxKb-lo T-Zelle?... 137
Veto-Effekt... 137
"Facilitating cells" ... 139
Infektiöse Toleranz... 140
4.3.2 Des-TZRxKb-lo T-Zellen in der "infektiösen Toleranz" ... 143
Zusammenfassung ... 145
Literaturverzeichnis... 146
Danksagung ... 186
Lebenslauf ... 187
Erklärung ... 189
APC Allophycocyanin (Fluoreszenzfarbstoff) CD engl: Cluster of Differentiation;
Differenzierungsantigene auf der Zelloberfläche von Leukozyten
chron. chronisch
CTL engl.: cytotoxic T-lymphocytes; zytotoxische T-Lymphozyten Des Désirée; clonotyp-spezifischer monoklonaler Antikörper, der einen
transgenen T-Zell-Rezeptor detektiert
EtOH Alkohol
FACS engl.: Fluorescent Activated Cell Sorter; Durchflußzytometrie FITC Fluorescein-Isothiocyanat (Fluoreszenzfarbstoff)
GvHD engl.: Graft-versus-Host-Disease; Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit GvHR engl.: Graft-versus-Host-Reaction; Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion HLA engl: Human Leukocyte (Lymphocyte) Antigen;
Histokompatibilitätsantigen
IL Interleukin
KMTx Knochenmarktransplantation
KMZ Knochenmarkzellen
LB Linearbeschleuniger
LKZ Lymphknotenzellen
mAb engl.: monoclonal antibody; monoklonaler Antikörper MHC engl: Major Histocompatibility Complex;
Haupthistokompatibilitätskomplex
PBS engl.: phosphate buffered saline; Phosphat-gepufferte Salzlösung PE Phycoerythrin (Fluoreszenzfarbstoff)
TZR T-Zell-Rezeptor
500 ml-Becherglas Duran, Schott,
Mikro-Hämatokrit-Kapillare Brand, Wertheim, Deutschland
5 ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland (FACS-Röhrchen)
OP-Besteck Aesculapâ, Braun, Melsungen, Deutschland
Ketamin (Ketaminhydrochlorid) Gräub AG, Bern, Schweiz
Rompun (Xylazinhydrochlorid) Bayer AG, Leverkusen, Deutschland PBS Dulbecco w/o Ca2+ / Mg2+ Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Trypanblau Fluka AG, Buchs, Schweiz
15 ml-Polystyrol-Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland 50 ml-Polypolyren-Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Metallsieb Zentrale Forschungswerkstätten der MHH
Nylon-Gaze-Sieb eigene Herstellung
Polystyrol-Zellkulturschale Nalge Nunc International, Dänemark
Zentrifuge Varifuge 3.2 RS, Heraeus, Hanau,
Deutschland
Mikrotiterplatte NuncÔ Brand Products, Nalge Nunc
International, Dänemark
Hämatocytometer nach Neubauer Omnilab, Bremen, Deutschland
Sterilwerkbank Laminair, Heraeus, Hannover, Deutschland
0,4 mm-Einmalinjektionskanüle Sterican, Braun, Melsungen, Deutschland (0,40 mm x 12 mm BL/LB, 27 G x ½")
0,9 mm-Einmalinjektionskanüle Sterican, Braun, Melsungen, Deutschland (0,90 mm x 40 mm BL/LB, 20 G x 1½")
5 ml-, 10 ml- und 20 ml-Einmalspritze Braun, Melsungen, Deutschland
1 ml-Einmalspritze Terumo Europe, Leuven, Belgien
1,5 ml-Reagiergefäß (Eppendorf) Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pasteurpipette aus Glas Brand GmbH, Wertheim, Deutschland
Mikrotom 2800 Frigocut, Leica, Bensheim, Deutschland
Hämalaun Mayers Hämalaunlösung, Merck, Darmstadt,
Deutschland
Eosin Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA
Aceton J. T. Baker, Deventer, Holland
Dänemark
Objektträger Menzel-Gläser, Gerhard Menzel
(geschnitten, mit Mattrand, 76 x 26 mm) Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig, Deutschland
Digitalkamera Nikon E995, Nikon, Japan
Mikroskop Zeiss, Jena, Deutschland
Einwegvinyl-Probenmaterialbehälter Tissue-Tek Cryomold Standard, Miles Inc., (engl.: disposable vinyl specimen molds) Elkhart, IN, USA
Einbettmedium für Gefrierschnitte Jung, Leica Instruments GmbH, Nussloch,
(Tissue Freezing MediumÔ) Deutschland
Polylysin Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, Missouri,
USA
Waage Kern 440-53, Gottlieb Kern & Sohn GmbH,
Albstadt, Deutschland
Allophycocyanin Caltag, San Francisco, USA
Biotin Sigma-Aldrich, Steinheim
Tricolor Caltag, San Francisco, USA
Fluorescein-Isothiocyanat Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA
1 Einleitung
Das Immunsystem des Menschen ist zur wirksamen Bekämpfung vieler unterschiedlicher Krankheitserreger, wie Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten, sehr komplex organisiert. Damit die Abwehr von Mikroorganismen nicht gleichzeitig Angriffe auf den eigenen Körper hervorruft, unterliegen die Immunzellen sowohl in ihrer Reifung als auch bei ihren Funktionen zahlreichen Kontrollmechanismen. Sind diese Mechanismen defekt oder nicht richtig ausgebildet, können schwerwiegende Autoimmunkrankheiten entstehen. Bei Trans- plantationen ist die ansonsten physiologische Immunreaktion gegen das fremde Spenderorgan unerwünscht. Mit immunsuppressiver Therapie wird versucht, in beiden Fällen das Immunsystem an der Reaktion zu stoppen. Oft ist die Behandlung aber selbst mit schweren unerwünschten Wirkungen verbunden.
Daher ist es für das Verständnis der Pathogenese und damit der Weiterentwicklung wirksamerer und verträglicherer Behandlungen absolut notwendig, diese Kontrollvorgänge tiefer zu erschließen und genauer zu verstehen.
1.1 Selbsttoleranz und regulatorische T-Zellen
1.1.1 Immunologische Selbsttoleranz
Im immunologischen Mittelpunkt zum Schutz des eigenen Organismus steht das Prinzip der Selbsttoleranz: das Immunsystem unterscheidet zwischen körperfremden, potentiell krankheitsauslösenden und den körpereigenen, harmlosen Antigenen.
Autoimmunkrankheiten werden durch die Durchbrechung der Eigentoleranz verursacht; das Immunsystem erkennt körpereigene Strukturen als fremd und greift sie an. In der Transplantationsmedizin wird versucht, eine stabile "Selbsttoleranz" gegenüber dem Spenderorgan zu induzieren, um auf die immunsuppressive Therapie verzichten zu können.
Die Selbsttoleranz wird durch viele Einzelprozesse erreicht: zentral durch klonale Deletion infolge negativer Selektion im Thymus [1], peripher durch Anergie [2-11], immunologische Ignoranz [12], Deletion [13, 14], Diversion [15, 16] und klonale Erschöpfung [17, 18]. In den letzten Jahren verdichten sich die Hinweise zudem auf einen zusätzlichen aktiven, zellulär- vermittelten Mechanismus durch "regulatorische T-Zellen".
Zentrale Toleranz
Die klonale Deletion findet während der Reifung der T-Zellen im Thymus statt [19]. Während ihrer Entwicklung im Thymus müssen die jungen, unreifen T-Zellen zwei Tests überstehen:
die positive [20] und die negative Selektion [1].
Bei der positiven Selektion müssen sie körpereigene MHC:Peptid-Verbindungen an der Oberfläche von antigen-präsentierenden Zellen (APZ), wie dendritische Zellen (DZ), erkennen können und sie mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TZR) binden. Damit zeigen sie, daß ihr TZR funktionsfähig ist. Zellen, die die MHC:Peptid-Komplexe nicht binden können, bekommen kein Signal zur weiteren Reifung und sterben den natürlichen Zelltod (=Apoptose) [21-26].
Andererseits darf der TZR nicht zu stark an die körpereigenen Moleküle binden, da sonst die Gefahr eines späteren Angriffs auf den körpereigenen Organismus besteht. Somit werden bei der negativen Selektion alle T-Zellen eliminiert, die eine zu starke Bindung mit den körpereigenen Strukturen bilden. Dieser Eliminationsvorgang wird als klonale Deletion bezeichnet. Er stellt den wichtigsten Mechanismus der zentralen Toleranz dar [1, 27-31].
Die gegensätzlichen Bedingungen dieser Selektionsmechanismen erscheinen paradox und stellen eines der zentralen Rätsel der Immunologie dar. Wie kann gleichzeitig einerseits die Bindung an den Selbst-MHC:Selbst-Peptid Komplex zur weiteren Reifung, andererseits aber dieselbe Bindung zur Elimination führen?
Dazu werden zur Zeit zwei unterschiedliche Erklärungsmodelle angeboten: die Aviditäts- hypothese [32] und die differentielle Signalhypothese [33-36]. Neue Forschungsergebnisse befürworten eher die letztgenannte Hypothese, aber die Frage ist noch nicht endgültig beantwortet [37].
Viele Moleküle werden jedoch nur speziell von Organen außerhalb des Thymus im Körper gebildet und sind im Thymus während der Entwicklung der T-Zellen nicht präsentiert [37].
Die jungen, ausgereiften T-Zellen mit funktionsfähigem TZR treffen dann auf diese körpereigenen Antigene in der Peripherie und erkennen sie als "fremd". Trotz der Selbsttoleranzentwicklung im Thymus besteht also die Gefahr einer Autoaggression. In der Regel bleibt der Kontakt aber folgenlos. Warum?
Immunologische Ignoranz und periphere klonale Deletion
Um eine T-Zell-Reaktion auf ein Antigen zu erhalten, muß dieses den Immunzellen in ausreichender Menge dargeboten werden. Da die Antigene immer nur zusammen mit den Haupthistokompatibilitäts- (engl.: major histocompatibility complex; MHC)-Molekülen
präsentiert werden und nur in dieser Bindung von den T-Zellen erkannt werden können, ist die Antigenpräsentation und damit die Auslösung einer T-Zell-Antwort zunächst von der Bindungsfähigkeit (=Affinität) des Antigens zum MHC-Molekül abhängig. Ist die Affinität niedrig, wird das Antigen nur in geringer Menge präsentiert und wird unterhalb der nötigen Schwelle zur immunologischen Reaktion an der Zelloberfläche exprimiert. Damit tritt immunologische Ignoranz ein: die potentiellen autoreaktiven T-Zellen können ihr Antigen nicht erkennen, da es in zu geringer Menge vorliegt. Im Gegensatz zur klonalen Deletion werden sie jedoch nicht eliminiert und zirkulieren weiterhin im Blutkreislauf. In transgenen Mausmodellen konnten solche autoreaktive Zellen in gesunden Tieren nachgewiesen werden [12, 38, 39]. Es wird angenommen, daß bei Infektionen derartige Zellen aktiviert werden und somit zu dem oft beobachteten gleichzeitigen Auftreten von Autoimmunerscheinungen führen können [40, 41, 42, 43, 44, 45].
Ist die Affinität des Antigens zum MHC-Molekül hoch, wird es stärker an der Oberfläche exprimiert. Die T-Zelle kann es erkennen und potentiell dagegen reagieren. In diesem Fall werden zwei Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz beobachtet [37, 46]:
Einerseits kann in der Peripherie, wie im Thymus, klonale Deletion auftreten, somit wird die autoreaktive T-Zelle eliminiert. Andererseits kann die T-Zelle in einen sogenannten "anergen"
Zustand überführt werden.
Anergie
Zur Aktivierung von naiven, d. h. ausgereiften T-Zellen ohne bisherigen Antigenkontakt, werden zwei Signale benötigt: Das erste Signal kommt vom TZR, nachdem er das Antigen auf einer APZ erkannt hat; das zweite von einer Interaktion zwischen costimulatorischen Molekülen auf der T-Zelle und der APZ [47-49]. Dabei ist die Beziehung zwischen dem Molekül CD28 auf der T-Zelle und dessen Bindungspartner B7 auf der APZ am besten beschrieben [50]. Binden der TZR und das CD28 an die jeweiligen Liganden an der APZ, führt dies zur Produktion von Interleukin (IL-) 2; IL-2 ist notwendig für die Proliferation der naiven T-Zellen in der Immunantwort [51-53]. Bindet nur der TZR an das Antigen, aber nicht das CD28 Molekül an seinen Partner, bleibt die costimulatorische Wirkung aus; das IL-2 wird trotz Antigenerkennung nicht gebildet und die T-Zelle proliferiert nicht. Stattdessen wechselt die T-Zelle in den anergen Zustand [54-56]. Das Charakteristische der Anergie von T-Zellen ist deren Unfähigkeit zur IL-2 Produktion, auch wenn ihnen später das Antigen von der APZ präsentiert wird. Da die peripheren Gewebszellen im Gegensatz zu den APZ keine costimulatorischen Moleküle exprimieren, gehen die T-Zellen bei deren Antigenerkennung in den anergen Zustand über und die Selbsttoleranz ist gesichert [57].
Obwohl der anerge Effekt bislang nur in vitro gezeigt werden konnte, haben bereits erste Versuche zur klinischen Anwendung der Induktion der Anergie von T-Zellen begonnen.
Experimente bei allogenen Nierentransplantationen in nicht-humanen Primatenmodellen zur Prävention der Transplantatabstoßung durch Überführen der T-Zellen in einen anergen Zustand haben mit positivem Erfolg stattgefunden [58].
Eine wichtige Frage ist dennoch ungeklärt: warum werden nicht einfach alle autoreaktiven Zellen durch klonale Deletion eliminert, warum sollte ein Mechanismus wie die Anergie in vivo existieren?
1.1.2 Regulatorische T-Zellen
Eine mögliche Erklärung ist, daß anerge Zellen eine immunregulatorische Wirkung besitzen.
Autoimmunkrankheiten werden unter anderem dadurch ausgelöst, daß die fremden Antigene körpereigenen Strukturen sehr ähnlich sind und es somit zur Kreuzreaktion zwischen beiden kommt: naive T-Zellen reagieren dann nicht nur auf das fremde Antigen, sondern auch auf das harmlose Selbst-Antigen. Möglicherweise können die anergen T-Zellen diese Reaktion und damit die Autoimmunantwort verhindern, indem sie mit den anderen Zellen um die Bindungsplätze an den APZ konkurrieren. Da sie anerg sind und nicht mehr aktiviert werden können, wäre die Reaktion blockiert [57].
Tatsächlich können anerge T-Zellen Immunantworten in vivo unterdrücken: z. B. ver- hinderten allospezifische T-Zellen, die in vitro "anergisiert" wurden, die Abstoßung eines allogenen Hauttransplantats [59].
Doch sind die zugrundeliegenden Mechanismen eines solchen immunregulatorischen Effekts immer noch ungeklärt. Daher ist das Modell einer suppressiv wirkenden T-Zelle seit der Erstentdeckung dieses postulierten Zelltyps umstritten [60-62].
1970 transferierten Gershon und Kondo [63] Milzzellen von Mäusen, die tolerant auf Schaferythrozyten reagierten, in "normal-reagierende" syngene Mäuse. Die so behandelten Tiere reagierten danach ebenfalls nicht mehr auf die xenogenen Blutzellen. Die Toleranz war durch die transferierten Milzzellen mitübertragen worden.
Dennoch wurde nach diesem Ergebnis und nachfolgenden Versuchen die Vorstellung einer immunsuppressiv wirkenden T-Zelle (Ts) wieder verlassen.
Aus drei Gründen [61]:
1.) Es wurde angenommen, daß die Ts sich von den anderen Zellen aufgrund ihrer besonderen Funktion auch morphologisch-phänotypisch unterscheiden müßten. Im Mausmodell wurde
postuliert, daß im murinen MHC-System ein Genkomplex I-J, zwischen I-A und I-E gelegen, für ein solches Oberflächenmolekül verantwortlich wäre. Doch weder ließ sich ein solches Molekül nachweisen, noch konnte ein solcher Genort identifiziert werden.
2.) Die ersten Suppressor-Hybridome waren instabil und zeigten keine physiologischen Rearrangements der b-Kette des TZR. Somit konnten keine konventionell-funktionsfähigen TZR von den Ts ausgebildet werden.
3.) Die Ts sollten über spezielle Faktoren (TsF), die löslichen antigen-spezifischen Rezepto- ren, ihre Wirkung vermitteln. Doch diese Faktoren konnten auf molekularer Ebene weder bio- chemisch noch funktionell nachgewiesen werden.
Daher wurde die Existenz einer immunsuppressiven T-Zelle angezweifelt. Allerdings war man sich einig, daß passiv wirkende Mechanismen wie die Deletion oder Anergie zur Vermittlung der Selbsttoleranz nicht ausreichen konnten. Es mußte auch einen aktiven Mechanismus geben [61, 64].
In einem transgenen Gen-Knockout-Mausmodell konnte man die dann als
"immunregulatorisch" bezeichneten T-Zellen (Tr) genauer charakterisieren [60, 65, 66, 67]:
Gesunde transgene Mäuse mit einem spezifisch gegen das myeline basische Protein (MBP) gerichteten TZR wurden mit ebenso gesunden RAG-/- Mäusen gekreuzt. Die Nachkommen entwickelten spontan die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE), als Folge einer Autoimmunität gegenüber dem MBP. Was war passiert? In den TZR-transgenen Tieren verlief die Reifung der endogenen T-Zellen normal. Daher besaßen diese Mäuse neben dem transgenen TZR, gerichtet gegen das MBP, zusätzlich noch T-Zellen mit endogen- rearrangierten TZR unterschiedlichen Repertoires. In den RAG-/- Mäusen ist diese Reifung der endogenen TZR gestört. Bei Kreuzung dieser Mäuse konnten in den Nachkommen also nur noch T-Zellen mit dem transgenen TZR gebildet werden, ohne die endogen gereiften, und entwickelten die spezifische Autoimmunkrankheit. Die normale, endogen-gereifte T-Zell- Population der transgenen Mäuse mußte also Zellen zur Regulation dieser Reaktion enthalten, die bei den Nachkommen aufgrund der Kreuzung fehlten. Als für diesen Effekt verantwortliche Zellen wurden CD4+ T-Zellen mit bestimmten Merkmalen identifiziert.
Es handelte sich um CD4+CD25+ T-Zellen, die CD45RB in niedriger Dichte exprimieren und eine partiell anerge Ausprägung besitzen [60]. In weiteren Versuchen konnte dieser Zelltyp weiter charakterisiert werden und auch beim Menschen nachgewiesen werden [68]. Bezüglich des Mechanismus sind aber noch viele Fragen offen. Angenommen wird eine regulatorische
Wirkung sowohl durch Interleukine wie IL-10 und TGF-b als auch durch Zell-Zell-Kontakt [60, 68].
Es konnten noch weitere Zellen mit immunregulatorischer Wirkung nachgewiesen werden, darunter sogenannte Th3- [69], Tr1- [70] und anerge Zellen [71]. In Tabelle 1 sind alle Zellen mit bisheriger Kenntnis einer immunregulatorischen Wirkung aufgelistet. Ungeklärt sind dabei die Fragen, ob und inwieweit diese Zellen miteinander in Verbindung stehen und wie sich die Zellen entwickeln und heranreifen. Allerdings wird zum Mechanismus und zur Entwicklung der Tr-Zellen folgendes vermutet: Sollten sie den immunregulatorischen Effekt durch einen antigenkompetetiven Mechanismus bewirken, müßten sie zur Unterdrückung einer Immunantwort eine höhere Affinität zum Antigen zeigen als die reaktive Zelle und dies schon während ihrer Entwicklung im Thymus zeigen. Damit bewegen sich die Tr-Zellen während ihrer Heranreifung in einem engen Aviditätsfenster, da sie eine höhere Affinität als die später reaktiven Zellen besitzen müssen, aber die Bindung darf nicht zu stark werden, da sie sonst im Thymus durch klonale Deletion negativ selektioniert werden [60].
Tabelle 1: Regulatorische T-Zellen mit unterschiedlichen Wirkmechanismen [72]
Phänotyp der regulatorischen T-Zelle Angenommener Wirkmechanismus
CD4+ Th3/Tr1 IL-4, IL-10, TGF-b, CTLA-4
CD4+CD25+ Antigenkompetitiver Effekt, CTLA-4
CD4+CD45RBlow TGF-b, IL-10, CTLA-4
CD4+CD45RClow IL-4, TGF-b
Veto (CD8+) TGF-b und Fas/FasL, CD8
CD8+ CD40, CTLA-4
gd-TZR+ IL-10, TGF-b
NKT (NK1.1+CD3+CD4-CD8-) IL-4, IL-10, TGF-b, IFN-g
NK1.1 CD3+CD4-CD8- Fas/FasL
ab-TZR+CD4-CD8- Fas/FasL-Wirkung auf APZ
1.1.3 Klinische Bedeutung der regulatorischen T-Zellen
Die Aufklärung des immunregulatorischen Wirkmechanismus der regulatorischen T-Zellen könnte die Behandlung von Autoimmunkrankheiten und die Prävention von Abstoßungs- reaktionen nach Transplantationen verbessern. Spekuliert wird sowohl über eine Zelltherapie von in vitro kultivierten Zellen bei Patienten, über immunmodulatorische Medikamente zur Vergrößerung des patienteneigenen Pools an regulatorischen T-Zellen und über die Anwen- dung von den Tr-Zellen selbst produzierten Interleukine wie das IL-10 oder TGF-b [68]. Vor einer möglichen klinischen Anwendung müssen die Zellen allerdings erst noch weiter charakterisiert werden und der Wirkmechanismus zweifelsfrei feststehen. Erste Versuche zur Toleranzinduktion gegenüber dem Spenderorgan durch immunmodulatorische Effekte sind in Mäusemodellen bei Haut- [73], Herz- und Knochenmarktransplantationen bereits unternommen worden [74-76].
1.2 Knochenmarktransplantation
1.2.1 Immunologische Reaktionen bei der Knochenmarktransplantation
Von den oben erwähnten Transplantationsmodellen ist besonders die Knochenmark- transplantation (KMT) zur Untersuchung regulatorischer Effekte von T-Zellen interessant, da im Gegensatz zu anderen Organtransplantationen, wie Herz, Haut, Niere, Leber und Lunge, eine bidirektionale Immunabwehr unterdrückt werden muß:
Einerseits gilt es, die Host-versus-Graft (HvG; Empfänger-gegen-Transplantat) Reaktion, die auch bei den anderen Organtransplantationen stattfinden kann, zu kontrollieren. Dabei reagiert das Immunsystem des Empfängers auf das fremde Spendergewebe und greift es mit einhergehendem Funktionsverlust des Transplantats an.
Andererseits muß die Graft-versus-Host (GvH; Transplantat-gegen-Empfänger) Reaktion unterdrückt werden, die zusätzlich zu der HvG-Reaktion nur speziell bei Transplantationen von Geweben, die selbst mit immunkompetenten Zellen ausgestattet sind, verursacht werden kann. Die GvH-Reaktion wird bei KMT und bei Dünndarmtransplantationen beobachtet;
sowohl das Knochenmark (KM) als Bildungsstätte aller Blutzellen als auch die Peyer-Plaques im Dünndarm enthalten ausreichend viele ausgereifte Immunzellen zur Auslösung einer solchen Reaktion. Dabei können die Zellen im Transplantat den Empfängerorganismus als fremd erkennen und ihn dann in der darauf einsetzenden Immunreaktion schwer schädigen.
Das dabei entstehende Krankheitsbild des Empfängers wird als GvHD (Graft-versus-Host Disease; Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit) bezeichnet.
In dieser Immunreaktion kann noch ein weiterer Effekt beobachtet werden, der bei der KMT aufrechterhalten werden sollte: der Graft-versus-Leukemia oder Graft-versus-Tumor Effekt (GvL- /GvT- Effekt; Transplantat-gegen-Leukämie /-Tumor Effekt).
Es konnte sowohl in Tierversuchen als auch in klinischen Studien festgestellt werden, daß eine mild verlaufende GvHD zu einer geringeren Rückfallrate (=Rezidivrate) der zu behandelnden Grunderkrankung, wie Leukämie oder Lymphom, führt [77]. Die den Empfängerorganismus als fremd erkennenden, gespendeten Zellen scheinen mit einer immunologischen Reaktion auch die Tumorzellen im Empfänger anzugreifen. Der Effekt ist stark mit einer GvHD assoziiert, aber ob er auf denselben Mechanismen beruht, muß noch weiter untersucht werden [78]. Eine Depletion der T-Zellen aus dem KM-Transplantat jedenfalls verringert das Risiko einer GvHD [79, 80], führt jedoch zu einer erhöhten Rekurrenz der hämatologischen Malignitäten und einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber opportunistischen Infektionen [81].
1.2.2 Historische Entwicklung, Indikationen und Komplikationen der KMT Trotz wichtiger und weitreichender Fortschritte seit Beginn der modernen KMT bleiben die immunologischen Reaktionen, hauptsächlich die GvH, lebensbedrohlich.
Im Jahr 1939 wurde die erstdokumentierte, leider erfolglos verlaufende, Knochenmark- transplantation (KMT) bei einer Patientin mit goldinduzierter Knochenmarkaplasie durchgeführt [82]. Doch die Entwicklung der heutigen, modernen KMT begann erst am Ende des Zweiten Weltkriegs [83]. Angesichts der unvorhergesehenen Folgen nach dem Einsatz der Nuklearbomben und der potentiellen Bedrohung eines nuklearen Kriegs drängte die Frage, wie radioaktive Strahlung dem Organismus schadet und wie diese Schäden behandelt werden können. Es stellte sich dabei heraus, daß das Knochenmark das am empfindlichsten auf Radioaktivität reagierende Organsystem ist und damit die Blutbildung lebensbedrohlich eingeschränkt ist [84]. 1949 konnten in einem Versuch von Leon Jacobson et al. Mäuse eine ansonsten tödliche Strahlung überleben, wenn ihre Milz mit einer Bleifolie abgedeckt und damit vor der Bestrahlung geschützt war [85]. 1951 führten Lorenz et al. den radioprotektiven Effekt durch Infusion von Milz- und Knochenmarkzellen in Mäusen herbei [86]. 1956 konnten mittels zytogenetischer Tests von Ford et al. gezeigt werden, daß die Blutbildung der letal bestrahlten und mit Zellen behandelten Tiere tatsächlich durch die Spenderzellen
angeregt wurde [87]. Diese Versuche rückten die Frage nach der klinischen Anwendbarkeit bei hämatologischen Erkrankungen in den Vordergrund. Die Hinweise mehrten sich, bei Patienten mit hämatologisch-onkologischen Erkrankungen, wie Leukämie, durch die Anwendung von Hochdosis-Chemotherapie/-Strahlentherapie das erkrankte KM zu zerstören, wobei auch der gesunde Teil des KM zugrunde geht, und anschließend mit KMT zu behandeln.
1956 wurde zum ersten Mal über die Behandlung leukämischer Mäuse mit Infusion gesunden Knochenmarks nach supraletaler Bestrahlung berichtet [88]. Aussichtsreiche Ergebnisse zur klinischen Anwendung der Knochenmarktransplantation aber wurden erst ab 1960 in zahlreichen Hundeversuchen von E. D. Thomas produziert, der 1990 für diese Leistungen den Nobelpreis für Medizin erhielt. 1977 wurden in Seattle über 100 Patienten mit akuter Leukämie im Endstadium knochenmarktransplantiert, von denen sechs die Transplantation 11 bis 15 Jahre krankheitsfrei überlebten [89]. Die Identifizierung des humanen Haupthistokompatibilitätskomplexes, die Entwicklung neuer Medikamente zur Immun- suppression wie Ciclosporin und Methotrexat, Fortschritte in der Intensivmedizin und Verbesserungen in Chemo- und Strahlentherapie optimierten die Pflege und Behandlung der Patienten und steigerten die Heilungsrate. Die Knochenmarktransplantation ist heute ein kurativ-eingesetztes, anerkanntes Therapieverfahren bei vielen hämatologisch-onkologischen Erkrankungen (Tabelle 2). 1999 wurden in Europa 21.430 Transplantationen von 580 Zentren in 35 Ländern durchgeführt [90].
Tabelle 2: Heutige zugelassene Indikationen zur Knochenmarktransplantation (Auszug aus [91])
Nicht-maligne Erkrankungen: Maligne Erkrankungen:
Immunodefizienz (SCID, Wiskott-Aldrich-Syndrom) Akute Leukämie
Aplastische Anämie Chronische Leukämie
Hemoglobinopathien (Thalassemia major) Myelodysplasie Enzymatische Defekte (u .a. M. Gaucher) Lymphom
Myelom
Solide Tumoren, z. B.
nach Hochdosis- Chemotherapie /
Ganzkörperbestrahlung mit myelosuppressiver Wirkung bei Mammakarzinom
Dabei werden in Abhängigkeit von der Herkunft des Spendermaterials drei Transplantations- formen unterschieden:
autolog: das Material entstammt vom Patienten selbst und wird ihm wieder zurückgegeben
syngen (isolog): Empfänger und Spender sind genetisch identisch, d. h. eineiige Zwillinge
allogen: Transplantation zwischen genetisch nicht-identischen Individuen der gleichen Spezies, d. h. alle anderen Verwandten und Nicht-
Verwandten
Die autologe KMT wird nach myelosuppressiver Hochdosischemotherapie /- Strahlentherapie bei malignen Erkrankungen außer hämatologisch-onkologischen eingesetzt, da trotz gründlichen und aufwendigen Aufreinigens (= "Purging") des entnommenen KM das Risiko besteht, daß eventuell Leukämiezellen zurückbleiben können und der Patient nach Infundieren seines eigenen KM eine Remission aufgrund dieser Residualzellen erleidet [92].
Syngene KMT wären optimal, doch haben nur 1 % aller Patienten einen eineiigen Zwilling [91]. Ansonsten beträgt die Wahrscheinlichkeit, daß ein Geschwisterteil mit dem Patienten volle HLA-Kompatibilität zeigt, 1 - (0,75)n, wobei n der Anzahl der Geschwister entspricht [91].
Damit wird bei Leukämien immer noch die allogene KMT am häufigsten durchgeführt:
Hauptindikationen zur KMT waren Leukämien mit 6289 Transplantationen (34 % aller Transplantationen), von denen 70 % allogene KMT waren [90]. Auch wenn die allogene KMT mit der Gefahr der GvHD verbunden ist, die bei den anderen beiden Transplanta- tionsformen nicht auftreten kann, kann auch nur bei der allogenen KMT der rezidivprotektive GvL-Effekt beobachtet werden [77].
In der nachfolgenden Tabelle (Tabelle 3) sind noch einmal die Vor- und Nachteile der jeweiligen Transplantationsformen zusammengefaßt.
Tabelle 3: Vor- und Nachteile der KMT-Formen [89]
Vorteile Nachteile
autologe KMT Verfügbarkeit des KM, keine immunol. Risiken Kontamination, kein GvL syngene KMT keine immunol. Risiken, keine Kontamination kein GvL
allogene KMT keine Kontamination mit malignen Zellen; GvL GvHD, HvG (Abstoßung)
Die Patienten mit der Indikation zur allogenen KMT werden wegen ihrer Grunderkrankung mit Chemo- und Strahlentherapie vorbehandelt (= konditioniert). Dabei werden die immunologischen Reaktionen und Nebenfolgen der allogenen KMT durch die Nebenwirkungen der Konditionierung überlagert, so daß die unerwünschten Wirkungen der allogenen KMT insgesamt in zwei Bereiche unterschieden werden: die myeloablative / konditionierende Toxizität und die transplantationsassoziierten Nebenwirkungen (Tabelle 4).
Tabelle 4: Nebenwirkungen der Konditionierung und der allogenen KMT [91]
myeloablative / konditionierende Toxizität Transplantationsnebenwirkungen - Übelkeit, Erbrechen, Hauterythem; - GvHD (akut, chronisch)
- Panzytopenie, Infektionen - HvG (Abstoßungsreaktion) - Entzündungen: Stomatitis, Pankreatitis, - Infektionen (durch Panzytopenie,
Zystitis Immunsuppression) - Lebervenenverschlußkrankheit (Letalität: 30 %)
- Schleimhautnekrosen: Diarrhoe, Darmatonie hämorrhagische Enterokolitis
- diffus-interstitielle Pneumonie mit Hämorrhagien; Herzrhythmusstörungen, Perikarderguß
- bei Kindern als Spätfolge: vermindertes Wachstum und verzögerte Entwicklung - Männer: Azoospermie
- Frauen: Ovarialversagen - Kataraktbildung
Da die Konditionierung selbst myelodestruktiv und immunsuppressiv wirkt, treten bei der allogenen KMT im Vergleich weniger Abstoßungsreaktionen als GvHD-Reaktionen auf [91].
Das Transplantationsversagen ("engraftment failure") ist heute selten und ist mit einer nicht ausreichenden Immunsuppression oder Infektionen mit dem Herpes- oder Cytomegalievirus verbunden [91]. Doch die akute GvHD stellt immer noch ein gefährliches und lebensbedrohliches Risiko der allogenen KMT dar [91]. Die Erkrankung wird standardgemäß mit Glucocorticoiden, Ciclosporin, Methotrexat, Anti-Thymocyten-Globulin oder monoklona- len Antikörpern gegen T-Zellen behandelt [93]. 1990 ergab eine klinische Studie eine Leta- lität dieser Erkrankung zwischen 20 % (bei positiver Reaktion der Patienten auf die immun- suppressive Behandlung) bis 80 % (bei Nichtansprechen ("Steroid-Resistzenz") auf die
Behandlung) bis zum Tag 600 nach KMT, in Abhängigkeit vom Schweregrad der akuten GvHD und dem Ansprechen der Patienten auf die immunsuppressive Initialbehandlung [94].
Die Behandlung eines Patienten mit einer schweren akuten GvH-Erkrankung ist oft erfolglos [95]. Die akute GvHD muß daher präventiv mit Immunsuppressiva unterdrückt werden. Die besten Ergebnisse zeigten eine Kombination von Methotrexat und Ciclosporin; doch auch unter diesem Therapieregiment tritt bei MHC-übereinstimmenden Spenden immer noch zu 30% eine akute GvHD auf, bei nicht-kompatiblen liegt die Rate bei 60 % [91]. Die unspezifische Immunsuppression ruft allerdings ihrerseits schwere Nebenwirkungen hervor, wie leichtere Infektionsanfälligkeit mit schwererem Verlauf der Infektionskrankheiten.
Daher können ein tieferes Verständnis und genauere Kenntnisse des pathophysiologischen Mechanismus der akuten GvHD zur Entwicklung besserer Präventions- und Therapie- verfahren führen.
1.2.3 Pathophysiologie der GvHD
1955 wurde in einem Tiermodell nach einer allogenen KMT ein bis dahin unbekanntes Krankheitsbild beschrieben [96]. Um es von der "primären Krankheit", der damals so bezeichneten Strahlenkrankheit, begrifflich zu unterscheiden, wurde es als "sekundäre Krankheit" bezeichnet. Ende 1950 konnte gezeigt werden, daß diese Krankheit die Folge einer Reaktion immunkompetenter Spenderzellen in dem immungeschwächten Empfänger war. Der Begriff "Graft-versus-Host-Disease" (Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit) wurde eingeführt, um den Richtungsvektor dieses immunologischen Angriffs zu beschreiben. 1966 definierten Billingham und Brent die Kriterien zur Voraussetzung einer GvHD-Entwicklung [97]:
1.) Das Transplantat muß immunologisch kompetente Zellen besitzen.
2.) Der Empfänger muß wichtige Transplantations-(Histokompatibilitätsantigene) besitzen, die im Spendergewebe fehlen, so daß der Empfänger dem Transplantat fremd erscheint und daher eine immunologische Abwehrreaktion auslöst.
3.) Der Empfänger selbst muß immundefizient sein; d. h. er ist nicht in der Lage, eine Immunantwort gegen das Transplantat auszulösen, zumindest für die entsprechend lange Dauer, die das Transplantat zum Einwachsen und zur Wiederherstellung seiner immunologischen Fähigkeiten benötigt.
Obwohl der genaue pathophysiologische Mechanismus der GvHD zu dieser Zeit unbekannt war, haben diese Kriterien mit nur wenigen Erweiterungen, bezüglich der selten beobachtbaren GvHD bei der autologen KMT, bis heute ihre Gültigkeit behalten [96].
Die GvHD wird in eine akute und eine chronische Form unterschieden. Per definitionem tritt die akute GvHD innerhalb der ersten 100 Tage auf, meist zwischen der zweiten und der vierten Woche nach der Transplantation, die chronische (chron.) nach dem 100. Tag, obwohl entsprechende klinische Zeichen der chron. GvHD bereits schon nach 60 bis 70 Tagen auftreten können [91].
Die akute GvHD manifestiert sich hauptsächlich an den Organen Haut, Leber und Darm / Gastrointestinaltrakt (GI-Trakt) [91]. Das Erscheinungsbild an der Haut reicht vom Pruritus mit makulopapulösem Hauterythem bis zur Erythrodermie, Bildung von Bullae, Desqua- mationen und Epidermolyse bei schwerem Verlauf [98]. Die Leberschädigung äußert sich durch Ikterus mit konjugierter Hyperbilirubinämie und erhöhtem Wert an alkalischer Phosphatase [91, 98]; die Aminotransferasewerte können erhöht sein [91] oder auch normal bleiben [98]. Die GvH-Reaktion am GI-Trakt ist schwer zu behandeln [98]. Klinische Symptome sind krampfartige Abdominalschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Ileus, intestinelle Blutungen und voluminöse, oft blutige Diarrhoe [99]. Entsprechend der Symptomatik und klinischen Laborwerte kann die GvHD in vier Stadien mit unterschiedlichen Prognosen eingeteilt werden [91, 98].
Zwischen 20% und 50% aller Patienten entwickeln sechs Monate nach einer KMT eine chron.
GvHD, die Rate ist bei älteren Patienten, MHC-inkompatibler und bei vorausgegangener akuter GvHD höher [91]. Die chron. GvHD ähnelt einer Autoimmunkrankheit mit Erythem, Sklerodermie, Hautulzera, Alopezie, Polyserositis, Sicca-Syndrom, Arthritis, obliterativer Bronchiolitis und cholestatischer Hepatitis [91]. Im Mittelpunkt des Entstehungsmechanismus der chron. GvHD steht der durch die Konditionierung oder eine erfolgte akute GvHD beschädigte Thymus, der die gegen den Empfänger gerichteten, sich neu entwickelnden T- Zellen aus dem Spender-KM nicht beseitigen kann [100]. Schwerwiegende Verläufe mit letalem Ausgang ergeben sich durch die leichte Infektanfälligkeit [101] aufgrund der funktionsuntüchtigen T-Zellen. Die chron. GvHD wird mit Ciclosporin A, Steroiden, Azathioprin, Thalidomid oder UV-A Strahlen behandelt [101].
Die Pathophysiologie der akuten GvHD kann in drei Phasen eingeteilt werden [98]:
Phase 1: Konditionierung zur KMT
Die früheste Phase der akuten GvH-Reaktion beginnt noch vor der Gabe der KM- Spenderzellen [98, 100]. Die Ganzkörperbestrahlung oder Hochdosischemotherapie im Vor- feld der KMT zur Bekämpfung des Grundleidens und zur Immunsuppression schädigt den Organismus, was zu inflammatorischen Aktivierungs- und Abwehrreaktionen, im Sinne eines physiologischen Reparationsvorgangs, führt [98, 100]. Es werden vermehrt entzündungs- vermittelnde Zytokine wie Tumornekrosefaktor (TNF-) a, IL-1 und hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende-Faktor (GM- CSF; engl.: colony) sezerniert [102]. Adhäsions- und MHC-Moleküle werden vermehrt exprimiert [103-106]. Die Korrelation zwischen intensiver Konditionierung und dem erhöhten Risiko einer GvHD konnte sowohl bei Tieren [107] als auch beim Menschen [108, 109]
nachgewiesen werden und das Zusammenspiel zwischen Konditionierung, Zytokinwirkung und GvHD aufgeklärt werden [107]. Das Risiko eines Auftretens der GvHD konnte minimiert werden, wenn die KM-Zellen erst nach einer gewissen Zeitspanne verabreicht werden [110- 112].
Phase 2: Spender-T-Zell-Aktivierung
Das Spender-KM wird dem Empfänger in der Regel mittels eines Vena-cava-Katheters ("zentralen Venenkatheters" (ZVK)) intravenös zugeführt [113]. Bei der Infusion der Knochenmarkzellen (KMZ) stellt somit das Gefäßsystem des Empfängers, inklusive des Kapillarbetts, die erste und zudem sehr weite Kontaktfläche mit den immunkompetenten Spender-T-Zellen dar. Daher wurde untersucht, ob die Blutgefäße möglicherweise erkennbare antigene Strukturen besitzen und direkt eine Immunreaktion auslösen; die Ergebnisse sind nicht eindeutig [114-117]. Durch die Schädigung in der Konditionierungsphase mit erhöhter Zytokinproduktion werden Adhäsionsmoleküle im Gefäßbett zur Rekrutierung und Migration der T-Zellen in das Gewebe hochreguliert, wie das CD62E (E-Selektin), a4b1 Integrin (VLA- 4), aLb2 Integrin (LFA-1, CD11a/CD18), ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), PECAM-1 (platelet and endothelial cell adhesion molecule-1, CD31) und VCAM (vascular cell adhesion molecule) [118-119]. Befinden sich die T-Zellen im Gewebe, benötigen sie zu ihrer Aktivierung zwei Signale: die Antigenerkennung des fremden MHC:Peptidkomplexes
auf der APZ durch den TZR und ein costimulatorisches Signal. Am besten ist die Costimulation zwischen dem B7-Molekül (CD80: B7.1; CD86: B7.2) auf der APZ und dem CD28 Molekül auf der T-Zelle beschrieben [120-124]. Zu der CD28-Familie gehören weiter das CD152 (CTLA-4), was allerdings eine suppressive Wirkung hat, ICOS (inducible costimulator) und PD-1. Weitere Interaktionen sind durch die TNF-Rezeptor-Familie möglich: CD40 (auf APZ)/CD40L (auf T-Zelle), CDw137L (4-1BBL) (auf APZ)/CDw137 (4-1BB) (auf T-Zelle), CD134L (OX40L)/CD134 (OX40) und LIGHT/HVEM [100].
Es gibt bereits klinische Studien in Phase 1, mittels Induktion einer Anergie die GvHD zu verhindern [125].
Phase 3: Die Effektorphase mit zytokin- und zellvermittelten Effektoren
Ein komplexer Mechanismus führt in der letzten Phase schließlich zu den letal verlaufenden Organschäden an Leber, Haut und GI-Trakt [98].
Der zytokinvermittelte Effekt wird mit dem Begriff "Sturm der Zytokine" beschrieben [119, 126]. Dabei werden viele verschiedene Zytokine von Monozyten, Makrophagen und T-Zellen produziert. Die Monozyten / Makrophagen produzieren nach ihrer Aktivierung durch Interferon-g (IFN-g) die Zytokine TNF-a, IL-1, MIP-1a und das sehr stark gewebstoxische Stickstoffmonoxid (NO). Das IL-1 wird früh in der Anfangsphase der Entzündungsreaktion gebildet und erhöht die TNF-a Expression und die anderer Zytokine [98]. Das TNF-a ist ein Entzündungsmediator und führt zur Aktivierung des Gefäßendothels [100], gefolgt von weiterer Migration der T-Zellen aus der Blutbahn in das Gewebe. Das MIP-1a führt zur Einwanderung von CCR5+CD8+ T-Zellen in die Leber, Lunge und Milz während der GvHD [100]. Es wird außerdem eine steigende IL-6 und IL-8 Sekretion während der GvH-Reaktion beobachtet [98], doch bislang ist der Zusammenhang in dieser Reaktion noch nicht aufgeklärt.
Die aktivierten T-Zellen sezernieren in großer Menge IL-2, GM-CSF, TNF-a und IFN-g [98].
Diese Zytokine können andere T-Zellen, Monozyten, NK-Zellen und sogar restliche, die die Konditionierung überlebten, Immunzellen des Empfängerorganismus aktivieren [98].
Bei den CD4+ T-Zellen muß dabei zwischen den beiden Subtypen, TH1 und TH2, unterschieden werden, da sie gegensätzlich wirkende Zytokine produzieren. Die Differen- zierung zu einem dieser beiden Typen erfolgt während des Kontakts mit der APZ, in Abhän-
gigkeit vom aktivierenden Signal, der Dauer des Aktivierungszustandes der APZ, dem Subtyp der APZ und dem Verhältnis von APZ zu TZ [127]. Die TH1-Zytokine, IL-2 und IFN-g, sind wichtige Mediatoren in der Entstehung der akuten GvHD [100]. Es konnte gezeigt werden, daß die TH1-Zellen die GvHD effizienter als die TH2-Zellen auslösen können; dagegen wirken die TH2-Zellen oft suppressiv und können die GvHD verhindern [128, 129]. Die TH2-Zellen produzieren IL-4, IL-6 und IL-10 [98]. Während die TH1-Zellen IL-2 für ihr Wachstum benötigen, brauchen die TH2-Zellen IL-1 oder IL-4 zur Proliferation [98].
Aufgrund dieser Beobachtungen wird versucht, die Zytokinproduktion und damit den Verlauf der GvHD zu beeinflussen.
Der immunregulatorische Effekt von IL-10 ist schon seit längerem bekannt, die molekularen Mechanismen werden zur Zeit noch untersucht [130].
Ebenso wird das IL-2 im Zusammenhang mit der GvH-Reaktion untersucht. Es wird in den ersten Tagen nach allogener KMT von den CD4+ T-Zellen produziert; Zugabe von IL-2- Rezeptor- oder IL-2-Liganden-blockierenden Antikörpern kann die GvHD experimentell verhindern; in klinischen Studien wurde die Häufigkeit der IL-2-produzierenden Vorläufer-T- Zellen als Parameter für das prädiktive Risiko der GvHD eingesetzt; genauso kann der lösliche IL-2-Rezeptor als sensitiver Indikator eines Auftretens der GvHD genutzt werden, da er stark mit der Schwere des GvHD-Verlaufs korreliert [98].
Zur Zeit existieren widersprüchliche Daten bezüglich eines möglichen präventiven Effekts der inflammatorischen TH1-Zytokine IL-2, IFN-g und IL-12 [131, 132]. Neben seiner aktivierenden und schädigenden Wirkung erhöht IFN-g die Fas-Expression auf T-Zellen [132]; das Fas-Molekül löst bei entsprechender Bindung an seinen Liganden den natürlichen Zelltod der T-Zelle aus und kann somit die GvH-Reaktion einschränken. Desweiteren konnte in neuen Studien gezeigt werden, daß nicht das IL-2, sondern das IL-15 wichtig ist für die akute GvHD [100]. Wenn das IL-12 zu bestimmten Zeitpunkten gegeben wird, kann es sogar protektiv wirken [132].
Die zytotoxischen T-Zellen (CTL) vermitteln ihre Wirkung über TNF-a, andererseits haben sie auch eine direkt-zelltoxische Wirkung. Dabei sind zwei Wege möglich: durch Freisetzung von Perforin/Granzyme oder durch Fas/FasL Interaktion mit der Zielzelle [126] (Skizze 1).
Nach Aktivierung der zytotoxischen T-Zelle kann sie an die als fremd erkannte Zelle binden und das Glycoprotein Perforin bilden. Aufgrund seiner Struktur kann dieses Molekül die Membran der Zielzelle infiltrieren und somit durchlöchern, "perforieren". Ist die Zellmembran durchlässig, werden Zellgranula der CTL in die Zielzelle eingeschleust, die proteolytische Enzyme, die Granzyme A und B, enthalten. Neben der proteolytisch- zytolytischen Aktivität dieser Enzyme wird angenommen, daß sie auch die Caspase-Kaskade aktivieren können, die zur Apoptose der Zelle führt [133].
Der Wirkmechanismus der Fas-FasL-Interaktion beruht, wie bei TNF-a, auf der Aktivierung der Caspase-Signaltransduktion durch das FADD-Molekül nach Binden der jeweiligen Liganden an den Rezeptor (siehe Skizze 1).
Eine Aktivierung des Perforin/Granzyme-Weges wurde in Experimenten bei MHC-Klasse I disparaten Tiermodellen beobachtet und ist daher für die GvHD-Induktion durch CD8+ T- Zellen verantwortlich; dagegen vermittelt die Fas-FasL-Interaktion hauptsächlich bei MHC- Klasse II disparaten Modellen die GvHD-Induktion und stellt damit den Haupt- wirkmechanismus der CD4+ T-Zellen dar [134-136].
Dabei verursacht der Perforin-Weg die kachektische Reaktion und den zeitlichen Verlauf der GvH-Reaktion, aber nur minimale Veränderungen an den Organen [134]. Die Fas-FasL- Interaktion bewirkt die GvHD-Symptome an Haut und Leber, aber beeinflußt den Erscheinungszeitpunkt des Krankheitsbildes nicht [134]. Für das TNF-a konnte eine dominierende Rolle in der Ursache der GI-Trakt-GvHD nachgewiesen werden [137].
Diese Ergebnisse teilen den beiden Hauptmechanismen zytotoxischer T-Zellen bestimmte Effekte in der GvH-Reaktion zu, doch diese Eindeutigkeit wird angezweifelt. Es konnte beobachtet werden, daß auch CD4+ T-Zellen über den Perforin-Weg wirken können [138].
Ebenso konnte auch in einem doppelt-defekten, d. h. Perforin- und FasL-defizienten, Modell eine GvH-Reaktion ausgelöst werden. Allerdings war in diesen Versuchen eine höhere Anzahl von CTL zur Induktion der GvH-Reaktion notwendig [139, 140]. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß noch andere Effektormoleküle eine schwerverlaufende GvHD verursachen können.
Die Wirkmechanismen der zytotoxischen T-Zelle im Rahmen der GvH-Reaktion sind noch einmal kurz zusammengefaßt:
1.) GvHD im MHC I – disparaten Modell wird über Perforin/Granzyme B (CD8+ T-Zellen) vermittelt 2.) GvHD im MHC II – disparaten Modell wird über Fas-FasL-Interaktion (CD4+ T-Zellen) vermittelt 3.) Perforin/Granzyme B þ schwerer kachektischer Zustand, Kinetik
4.) Fas-FasL þ Organschäden an Leber und Haut 5.) TNF-aþ intestinale GvHD
SKIZZE 1: WIRKUNGSWEISE ZYTOTOXISCHER T-ZELLEN [126]
zytotoxische T-Zellen
direkter Zell-Zell-Kontakt Freisetzung von löslichen Mediatoren, z.B. TNF-a
Sekretion von Granula Ligand-Rezeptor-Interaktion zwischen Zielzelle und Effektorzelle
(Fas-FasL, TWEAK-DR3, TRAIL-DR4,5)
Perforin/Granzymes A und B z. B. Fas-FasL-Interaktion TNF-Rezeptor auf Zielzelle
Proteolyse, Aktivierung von Caspase 3 FADD
Aktivierung der Caspase-Kaskade
Freisetzung von einem Inhibitor namens ICAD, gebunden an einem Caspase – assoziierten DNase Molekül (CAD)
Fragmentierung der DNA der Zielzelle
Trotz Verbesserungen in der Therapie und neuer Erkenntnisse zum Verständnis der GvHD sind noch viele Fragen offen. Die akute GvHD stellt eine lebensbedrohliche Komplikation in der KMT dar. Eine spezifische Unterdrückung dieser Reaktion bei Aufrechterhaltung der Immunfunktion gegenüber Krankheitserregern bleibt das Ziel der Transplantationsmedizin.
1.3 Problemstellung
Obwohl die Existenz immunregulatorischer T-Zellen lange angezweifelt worden ist, konnte dennoch eine solche Fähigkeit bei einigen Subtypen von Zellen in Tiermodellen beobachtet werden und einige dieser Zellen auch beim Menschen nachgewiesen werden.
1.3.1 Voruntersuchung
In einem doppelt-transgenen Mausmodell zur Untersuchung der Thymus-Aviditätshypothese erhielt man Hinweise auf einen weiteren Zelltyp mit immunregulatorischer Fähigkeit [141].
Die doppelt-transgene Mauslinie war durch Kreuzung zwei verschiedener einfach-transgener B10.BR Inzuchtmausstämme (Haplotyp: H-2Kk) entstanden (siehe Skizze 2):
Skizze 2: Kreuzung einfach-transgener Mäuse zur Untersuchung der Aviditätshypothese
x
Des-TZR (anti-Kb) transgene Maus Kb-lo (MHC I) - transgene Maus
(B10.BR Hintergrund) (B10.BR Hintergrund)
Des-TZRxKb-lo doppelt-transgene Maus
(Negativselektion? Phänotyp der transgenen T-Zellen?)
In eine B10.BR-Mauslinie war das Genkonstrukt für das MHC-Molekül H-2Kb (Kb) eingebracht worden. Somit exprimierten die Mäuse neben ihrem eigenen MHC-Klasse I Molekül Kk das transgene Kb-Molekül zusätzlich. Für die Generierung dieser MHC-Klasse I transgenen Mauslinie war nur eine einzige Kopie des Kb-Genkonstrukts verwendet worden.
Die Expression des transgenen Moleküls war daher auf allen Körperzellen ubiquitär, betrug jedoch nur 33 %, verglichen mit der Expression dieses Moleküls im H-2Kb-Inzuchtstamm C57BL/6 (= 100 % Expressionsdichte des Kb-Moleküls). Daher wurden diese Mäuse als Kb-lo (Abkürzung "lo" = "low", niedrig) Mäuse bezeichnet.
Die andere B10.BR-Mauslinie war transgen für einen TZR, der spezifisch gegen das Kb- Molekül gerichtet ist. Dieser spezifische anti-Kb TZR konnte mit einem clonotypischen monoklonalen Antikörper namens "Desirée" detektiert werden, so daß diese T-Zellen als Des- TZR Zellen bezeichnet wurden.
Diese beiden einfach-transgenen Mauslinien wurden miteinander gekreuzt, um weitere Aufschlüsse über die Negativselektion im Thymus zu erhalten. Da die Des-TZR auf den sich entwickelnden T-Zellen in den doppelt-transgenen Mäusen spezifisch das Kb-Molekül im Thymus erkennen, müßten sie während der Negativselektion eliminert werden. Jedoch konnten in Lymphknoten der Des-TZRxKb-lo Tiere Des-TZR Zellen nachgewiesen werden;
allerdings unterschieden sie sich in ihrem Phänotyp von den Des-TZR Zellen der einfach transgenen Des-TZR Mäuse (siehe Abbildung 1).
Des-TZR Des-TZRxKb-lo
CD8 CD8
Abbildung 1: Durchflußzytometrie-Analyse von Lymphknoten aus einer Des-TZR transgenen Maus und doppelt-transgenen Des-TZRxKb-lo Maus.
Links: Des-TZR transgene Lymphknotenzellen; Phänotyp: DeshiCD8hi (R1)
Rechts: Doppelt-transgene Des-TZRxKb-lo Lymphknotenzellen; hier gibt es unterschiedliche Phänotypen: Des-TZRintCD8- (R1) und Des-TZRloCD8lo (R2) Zellen. (R3: Des-TZR-CD8+ T-Zellen)
Des-TZR Clonotype
Die doppelt-transgenen Des-TZRxKb-lo Mäuse entwickelten zwei Typen von T-Zellen:
entweder wurde auf den T-Zellen der Des-TZR mit mittelhoher (intermediärer) Dichte bei fehlender Expression des CD8 Moleküls (Des-TZRintCD8-) exprimiert oder TZR und CD8- Molekül lagen beide in niedriger Dichte vor (Des-TZRloCD8lo). Zum Vergleich exprimierten die einfach Des-TZR transgenen Elterntiere beides in hoher Dichte (DeshiCD8hi). Erklärt wurde dieses Ergebnis mit einer inkompletten Negativselektion im Thymus [141]. Durch die niedrige Expression des Kb-Antigens fand nur eine geringe Interaktion des Des-TZR mit diesem Selbstantigen statt, was zu der inkompletten Deletion der autoreaktiven Zellen führte.
Dies lieferte einen weiteren Hinweis für die Aviditätshypothese der Negativselektion.
Bei den doppelt-transgenen Mäusen konnte zu keinem Zeitpunkt eine Autoimmunkrankheit festgestellt werden, obwohl in der Peripherie potentiell autoreaktive T-Zellen auftraten. Um die Funktion dieser Zellen weiter zu untersuchen, wurden in, mit 650 rad (= 6,5 Gy) subletal bestrahlte, Des-TZRxKb-lo Mäuse 1 x 106 Lymphknotenzellen (LKZ) von Des-TZR trans- genen Tieren intravenös gespritzt. Als Positiv-Kontrolle dazu wurden ebenso behandelte Kb-lo Tiere eingesetzt. Während sieben von acht Kb-lo Tieren bis zum Tag 20 nach Injektion an einer GvH-Reaktion starben, lebten in der Des-TZRxKb-lo Gruppe zwei von fünf Tieren länger als 100 Tage, die anderen drei starben um Tag 40 und damit später als die Kontrollgruppe.
Desweiteren reagierten die DesxKb-lo T-Zellen in vitro in einer gemischten Lymphozytenkulturreaktion mit bestrahlten Kb-Zellen (engl. mixed lymphocyte reaction;
MLR) nicht auf das Kb-Antigen, auch nicht unter Zugabe von IL-2. Bei in vitro Tests mit quervernetzten monoklonalen Antikörpern gegen den Des-TZR und die TZRb-Kette konnte allerdings eine Proliferation der Des-TZRxKb-lo Zellen nachgewiesen werden, auch in Kombination mit einem Antikörper gegen das CD28-Molekül [142]. Damit zeigten die Des- Kb-lo T-Zellen einen partiell anergen Zustand, da der TZR nicht auf das Antigen reagierte, aber dennoch stimuliert werden konnte.
Diese Ergebnisse zusammenbetrachtet, ergab sich der Verdacht auf eine regulatorische Wirkung der Des-TZRxKb-lo T-Zellen, insbesondere bei Kenntnis von anergen T-Zellen mit solcher Funktion, wie bereits beschrieben.
1.3.2 GvHD-Modell und Zielsetzung
Diese immunregulatorische Wirkung der Des-TZRxKb-lo T-Zellen sollte in einem klinisch- orientierten Modell weiter untersucht und charakterisiert werden. Basierend auf den Vorversuchen mit den LKZ-Injektionen, wurde dieses Modell zu einem allogenen Knochenmarktransplantationsmodell erweitert, wobei die GvH-Reaktion durch die Des-TZRx Kb-lo T-Zellen verhindert werden sollte. Dieses Modell bot neben der Vermittlung der klinischen Relevanz noch einen entscheidenden weiteren Vorteil:
Zur Durchführung einer KMT ist im Gegensatz zu anderen Organtransplantationen in der Maus, wie Herz oder Niere, keine mikrochirurgische Erfahrung notwendig. Um eine immunregulatorische Wirkung der Zellen in einem Transplantationsmodell nachzuweisen, ist die KMT also eine sehr elegante, effiziente und effektive Methode.
Diese grundlegenden Untersuchungen zum Nachweis eines immunregulatorischen Effekts können nur in einem Tiermodell geführt werden. Für einen Einsatz in einer klinischen Studie ist die Kenntnislage zu dürftig und ist daher obsolet.
Basierend auf den Vorversuchen, wurde in folgendem Modell gearbeitet (siehe Skizze 3):
Skizze 3: Versuchsmodell
bestrahlt + Des-TZR transgene Zellen
GvHD
bestrahlt + Des-TZR transgene Zellen
keine GvHD + Des-TZRxKb-lo Zellen
Skizze 3: Kb-lo Mäuse wurden als Empfängertiere eingesetzt. Um den immunregulatorischen Effekt nachzuweisen, wurde nach letaler Bestrahlung der GvHD-Kontrollgruppe nur die Des-TZR LKZ injiziert, der Präventionsgruppe wurde zusätzlich die Des-TZRxKb-lo Zellen gespritzt.
Zur Untersuchung des präventiven Effekts mußte zunächst allerdings das GvHD-Modell mit letaler Bestrahlung und allogener KMT etabliert werden.
Danach sollten die Präventionsversuche mit den Des-TZRxKb-lo Zellen stattfinden, mit Aufklärung des regulatorischen Mechanismus. Während der Etablierung ergaben sich allerdings ungeplante und unvorgesehene Änderungen des Versuchsaufbaus bezüglich der Bestrahlung der Mäuse, die zusätzlich interessante und zu diskutierende Befunde mit klinischer Relevanz erbrachten. Dadurch konnten jedoch nicht alle Versuche, wie geplant, durchgeführt werden.
Fragestellungen der vorliegenden Arbeit waren:
1.) Etablierung des GvHD-Modells.
Geplant war die GvH-Induktion mit einer letalen Bestrahlung eines Kobaltgeräts (60Co) und einer darauffolgenden Injektion unterschiedlicher Mengen der Des-TZR (anti-Kb) transgenen Zellen in die Kb-lo Tiere. Ziel war es, die Bedingungen zur Auslösung der GvH-Reaktion festzulegen. Später mußte aus technisch-organisatorischen Gründen mit anderen Bestrah- lungsgeräten gearbeitet werden.
2.) Gibt es Unterschiede zwischen beiden Gruppen hinsichtlich der GvHD-Symptomatik?
Dazu wurden die Mäuse nach der Injektion für 120 Tage beobachtet, um auch einen Teil des Zeitraum der chronischen GvH-Reaktion zu überwachen; dabei wurde der klinische Verlauf der Empfängertiere (Gewichtsverlauf und Überlebensrate) festgehalten.
Diesbezüglich wurden zusätzlich immun-/histologische Untersuchungen an den klassischen GvHD-Organen Leber, Haut und Darm in beiden Gruppen durchgeführt.
3.) Charakterisierung der Zellen in beiden Gruppen.
Die Des-TZR und Des-TZRxKb-lo Zellen wurden mittels durchflußzytometrischer Tests bezüglich ihres Aktivierungszustands nach Injektion untersucht. Damit sollte eine direkte Wirkung der potentiell präventiven Zellen auf die GvH-reaktiven Zellen erfaßt werden.
Desweiteren wurde die Rekonstitution der Hämatopoese der letal bestrahlten Tiere durchflußzytometrisch überprüft.
2 Material und Methoden
2.1 Versuchstiere
2.1.1 Tierschutzrechtliche Bestimmungen
Eine Genehmigung der Versuche durch die Bezirksregierung Hannover liegt vor (Aktenzeichen 509i-42502-00/273). Der Experimentator erhielt durch die Bezirksregierung eine Ausnahmegenehmigung zur Durchführung von nichtoperativen Eingriffen und Behandlungen an Mäusen gemäß § 9 Absatz 1 Satz 4 des Tierschutzgesetzes (BGBL. S.
1105). Weiterhin wurden erforderliche Fachkenntnisse (§ 9 (1) des Tierschutzgesetzes) für einfache operative Eingriffe an kleinen Versuchstieren durch eine bescheinigte regelmäßige und erfolgreiche Teilnahme an dem vierzigstündigen Kurs "Tierexperimentelle Methoden I"
im Institut für Versuchstierkunde und Zentralem Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover unter Leitung von Professor Dr. med. vet. Hans-Jürgen Hedrich erworben.
2.1.2 Tierhaltung
Die Versuchstiere wurden während des gesamten Versuchszeitraums unter SPF-ähnlichen Bedingungen in einem als Genlabor der Sicherheitsstufe S1 genehmigten Raum in dem Institut für Versuchstierkunde und Zentralem Tierlaboratorium gehalten. Zur Keimabschirmung der Versuchstiere wurde der Raum mit Überdruck belüftet. Weiterhin wurde der Raum nur nach Anlegen von Schutzkleidung, OP-Kopfhaube, OP-Gesichtsmaske, Handschuhen und Überschuhen betreten.
Die Raumtemperatur betrug konstant 20° C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 60%. Der Lichtrhythmus folgte einem wechselweisen Hell-Dunkel-Intervall von 12 Stunden.
Die Lichtmenge betrug 300 Lux. In dem Raum lag der Geräuschpegel unter 70 dB bei weniger als 200 Hz. Die Fütterung der Tiere erfolgte kontinuierlich mit Altromin 1324 Alleinfutter (Altromin GmbH, Lage) und Leitungswasser in Tränkeflaschen. Die Tiere wurden auf staubfreiem Weichholzgranulat in einem Makrolonkäfig des Typs II gehalten. Der allgemeine Gesundheitszustand wurde täglich durch das Tierpflegepersonal überwacht sowie durch monatliche veterinärmedizinische Kontrollen.
2.1.3 Verwendete Stämme
Nicht-transgene Tiere
Als nicht-transgene Empfängertiere in den syngenen Kontrollen der Transplantationsversuche wurden Mäuse des Inzuchtstamms B10.BR mit dem Haplotyp H-2Kk verwendet.
MHC I - transgene Tiere
Als Empfängertiere dienten MHC-Klasse I transgene Mäuse des Inzuchtstamms B10.BR.
Diese Mäuse exprimierten auf ihrem H-2Kk Hintergrund zusätzlich das MHC-Klasse I Molekül H-2Kb [141]. Die in den Knochenmarktransplantationsversuchen verwendete Kb- transgene B10.BR Mäuselinie 179-4 besaß nur eine einzige Kopie des Kb-Genkonstrukts.
Damit wurde das Kb-Molekül in diesen Mäusen zwar auf allen Körperzellen unter der Kontrolle seines genomischen Promoters ausgebildet, aber die Expression war mit insgesamt 33 %, im Vergleich zur der in C57BL/6 Mäusen (Haplotyp: H-2Kb = 100 %), niedriger. Daher werden diese transgenen Mäuse im nachfolgenden kurz als Kb-lo Mäuse bezeichnet. Die Kb-lo Mäuse zeigten eine normale Immunkompetenz und waren somit resistent gegenüber Infektionen.
Des-TZR transgene Tiere
Die als Knochenmark- und Lymphknotenzellenspender eingesetzten anti-Kb-TZR-transgenen Tiere waren freundlicherweise von Professor Dr. med. Bernd Arnold (Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg) zur Verfügung gestellt worden [143].
Das Genkonstrukt des Des-TZR war aus dem CD8-abhängigen CTL-Klon KB5.C20 isoliert und in B10.BR Tiere eingebracht worden. Dieser transgene B10.BR Mäusestamm exprimierte diesen anti-Kb-T-Zell-Rezeptor unter der Kontrolle des endogenen Promoters und des b-chain enhancers auf allen reifen T-Zellen und auf den meisten Thymozyten. Da dieser anti-Kb-T- Zell-Rezeptor bereits rearrangiert im Genom der transgenen Mäuse vorliegt, hat der Rezeptor einen Vorteil in der Reifung und wird im Thymus noch vor der Expression der endogenen TZR ausgebildet. Dabei kann die Entwicklung der endogenen T-Zell-Rezeptoren unterdrückt werden. Somit existieren einerseits T-Zellen, die keinen endogenen TZR tragen, aber dafür den transgenen TZR in sehr hoher Dichte exprimieren, andererseits T-Zellen mit eigenem TZR und dem transgenen TZR in niedriger Dichte. Bei den TZR-transgenen Mäusen besteht eine reduzierte Resistenz gegenüber Infektionen, da fast ausschließlich T-Zellen mit nur einer Spezifität (anti-Kb) vorkommen, so daß Infektionserreger nur durch B-Zellen und T-Zellen mit einem endogenen TZR bekämpft werden können.
Des-TZRxKb-lo - transgene Mäuse
Kb-lo transgene Mäuse wurden mit anti-Kb T-Zell-Rezeptor (Des-TZR) transgenen Mäusen gekreuzt, so daß doppelt transgene Mäuse mit B10.BR Hintergrund entstanden.
Im Vergleich der Kb-lo-Expression zwischen diesen doppelt transgenen und den einfach transgenen Mäusen gab es keinen Unterschied.
Der charakteristische Phänotyp der Des-TZRxKb-lo Zellen wurde bereits beschrieben. Die Des-TZRxKb-lo T-Zellen werden im folgenden auch als "low-avidity" T-Zellen bezeichnet.
Obwohl die doppelt transgenen Mäuse T-Zellen entwickelten, die gegen ihr eigenes MHC- Molekül gerichtet waren, konnten zu keinem Zeitpunkt pathologische autoimmune Prozesse oder Erkrankungen festgestellt werden.
Durch den transgenen T-Zell-Rezeptor, der auf fast allen T-Zellen exprimiert wurde, zeigten die doppelt transgenen Tiere ebenfalls eine reduzierte Abwehr gegenüber Infektionen.
Krankheitserreger konnten nur durch B-Zellen und diejenigen T-Zellen bekämpft werden, die einen endogen rearrangierten TZR trugen.
Des-TZRxLy5.1 - transgene Mäuse
Mit der Verwendung der Des-TZRxLy5.1 transgenen B10.BR Mäuse gelang über die Anfärbung des Ly5.1 Moleküls in den Durchflußzytometrie-Untersuchungen eine sichere Unterscheidung zwischen den Des-TZR Zellen zur GvHD-Induktion und den potentiell präventiv wirksamen Des-TZRxKb-lo Zellen.
Die Bezeichnung Ly5.1 ist dabei synonym zu dem CD45 Molekül, nach der offiziellen CD- Nomenklatur. Das CD45 Molekül wird von allen hämatopoietischen Zellen und von T-Zellen exprimiert. Das CD45 Molekül liegt dabei in zwei Varianten vor, der CD45.1 und der CD45.2 Isoform, entsprechend Ly5.1 und Ly5.2.
Die Des-TZRxLy5.1 transgenen Mäuse wurden erzeugt durch Kreuzungen von Des-TZR transgenen Tieren mit Ly5.1 homozygoten Tieren, wobei beide Mäusearten dem B10.BR Stamm (H-2Kk) entsprangen. Da die Elterntiere homozygot für das Ly5.1 Molekül waren, wurde dieses Merkmal auf jedes Mitglied der F1-Generation vererbt.
Es wurden generell immer nur heterozygote Tiere in den Versuchen eingesetzt.
2.1.4 Tierschutzgerechtes Töten der Tiere
Alle Spendertiere und die Empfängertiere, bei denen zur histologischen und zu den durchfluß- zytometrischen Untersuchungen Organe entnommen wurden, wurden in dem Zentralen Tier- labor mit Kohlenstoffdioxid (CO2) bis zum Narkosestadium IV nach Guedel anästhesiert. Die Narkosetiefe wurde durch Überprüfen der Spontanbewegung, Kopfhaltung, Reflexe, Spontan- atmung und des Herzschlags festgestellt. Die Tiere wurden danach durch Luxation der Hals- wirbelsäule sicher getötet. Dieses Verfahren wurde im folgenden immer angewendet, wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt.
2.2 Versuchsaufbau zur Etablierung des GvHD – Modells
2.2.1 Medien und Zusätze
PBS:
PBS (engl.: phosphate buffered saline; Phosphat gepufferte Salzlösung) wurde bezogen von der Firma Biochrom AG, Berlin, Deutschland. Das PBS wurde bei + 4° C gelagert. Angesetzt wurde es mit 9,55 g pro Liter. Als Lösungsmittel diente bidest. Wasser.
Um eine calcium- und magnesiumabhängige Gerinnung zu verhindern, war das PBS ohne Calcium und Magnesium aus 28,0 mM NaH2PO4, 7,2 mM Na2HPO4 und 0,14 M NaCl produziert worden. Das PBS wurde bei der Aufreinigung der Knochenmarks- und Lymph- knotenzellen und als Transportmedium zur intravenösen Applikation dieser Zellen benötigt.
Ketamin-Rompun:
Die Empfängertiere wurden vor der Bestrahlung mit einem Gemisch aus 0,5 ml Ketamin- hydrochlorid (Ketaminâ, Gräub AG, Bern, Schweiz) und 0,5 ml Xylazinhydrochlorid (Rompunâ, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), gelöst in 9 ml sterilem PBS, narkotisiert.
TC199:
Das Medium 199 mit Hank's Salzen und L-Glutamin ohne NaHCO3 (TC 199) wurde geliefert von Applichem, Darmstadt, Deutschland. Es wurden 10,61 g pro Liter bidest. Wasser gelöst
