Produktion der Antikörper aus eigener Herstellung

Einfrieren von Hybridomzellen

Die Zellen wurden mit Trypanblau zur Bestimmung von Zellzahl und Vitalität gefärbt. Es wurden nur dann Zellen eingefroren, wenn sich mehr als 95 % der Zellen als vital darstellten (vitale Zellen: hell; tote Zellen: dunkelblau) und keine Kontaminationen vorlagen. Die Zellen wurden bei 200 x g, 10 min und RT zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen in kaltem FCS mit einem Volumen aufgenommen, so daß man eine Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml erhielt. Das gleiche Volumen an eisgekühltem Einfriermedium (FCS + 20%

Dimethylsulfoxid, von Merck, Darmstadt) wurde hinzugegeben. Somit betrug die Endkon-zentration der Zellen im Einfrierröhrchen (Nalge Nunc International, Wiesbaden) 1 x 10⁶ Zellen/ml. Die Zellen wurden über Nacht bei – 80° C eingefroren und darauf in den Stickstofftank bei – 196° C umgefroren.

Auftauen von Hybridomzellen und Antikörpergewinnung

Das Zellkulturmedium bestand aus RPMI 1640 (GibcoÔ, Invitrogen Corp., Paisley, Schottland), 10 % FCS, 50 U/ml Penicillin (Biochrom KG Seromed, Berlin), 50 mg/ml Streptomycin (Biochrom KG Seromed, Berlin) und 4mM L-Glutamin (ICN Biochemicals GmbH, Eschwege).

Nach vorsichtigem Auftauen unter schnell fließendem, warmen Wasser wurden die Zellen in einem 15ml-Zentrifugationsröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) mit 10 ml Zellkulturmedium aufgenommen und nach sorgfältigem Mischen einmal gewaschen (Zentrifugation bei 200 x g, 10 min, Raumtemperatur (RT)). Das Zellpellet wurde mit 10 ml Zellkulturmedium aufgenommen, mit Trypanblau zur Vitalitätskontrolle gezählt und in der gewünschten Konzentration in Zellkulturgefäßen (Kulturfläche 75 cm², Nalge Nunc International, Wiesbaden) ausgesät. Abhängig von ihrem Zustand nach dem Auftauen lagen die Suspensionszellen in einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen/ml und adhärente Zellen in einer Konzentration von 1 x 10⁴ Zellen/ml vor.

Die Hybridomzellen wurden bei 37° C, 5 % CO₂-Partialdruck und 95 % Luftfeuchtigkeit für maximal fünf Tage kultiviert. Nach Zentrifugation bei 300 x g, 10 min und 4° C wurden mindestens 500 ml Überstand gesammelt. Der restliche Überstand und die Zellen wurden mit dem Zellkulturmedium rekultiviert.

Antikörperaufreinigung über Protein G Puffer:

Im folgenden werden die Zusammensetzungen der einzeln benötigten Puffer zur Aufreinigung der Antikörper aufgelistet:

Waschpuffer: Mischung aus 20 mM Na2HPO4 und 20 mM NaH2PO4-Lösung; pH-Wert 7,0.

Elutionspuffer: 100 mM Salzsäure (HCl)-Glycin-Lösung; pH-Wert 2,7. Der pH-Wert wurde gegebenenfalls mit HCl korrigiert.

Neutralisationspuffer: 1 M Tris-HCl-Lösung; pH-Wert 9,0.

Zwei Sorten Regenerationspuffer:

1.) 2 M Harnstoff; pH-Wert 7,0

2.) 0,1 M Tris-HCl/0,5 M NaCl; pH-Wert 9,0. Dazu wurden in 100 ml Neutralisationspuffer (siehe oben) 29,22 g NaCl gelöst und 800 ml Wasser zugegeben. Sobald das NaCl gelöst war, wurde der pH-Wert neu eingestellt. Zum Schluß wurde mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Antikörperaufreinigung und Proteinbestimmung

Vor der Antikörperaufreinigung wurde der Hybridomüberstand mit HCl auf einen pH-Wert von 6,7 eingestellt und durch einen Celluloseacetatfilter mit der Maschenweite von 0,45 mm (Sartorius, Göttingen) gegeben. Die Aufreinigung wurde mit einer ProteinG-Sepharose Säule (Econo Columns, Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA) bei 4° C durchgeführt und war dabei an eine Chromatographieanlage (Pharmacia LKB GP-10, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey, USA) angeschlossen. Die Säule wurde zunächst mit Waschpuffer equilibriert, d. h. mit fünffacher Menge entsprechend des Säulenvolumens gespült, bei einer Flußrate von 1 – 2 ml/min. Darauf wurde der Überstand mit einer Flußrate kleiner als 1 ml / min über die Säule gegeben, wobei die Antikörper im Überstand an das Protein G binden. Um nicht bindende Substanzen, wie Albumin, zu entfernen, wurde die Säule mit Waschpuffer bei einer Flußrate von 1 – 2 ml solange gespült, bis die Chromatographieanlage kein Protein detektieren konnte (Nullinie). Anschließend wurden die an die Säule gebundenen Antikörper

mit Elutionspuffer bei einer Flußrate von 1 ml /min herausgespült. Sobald ein Proteinpeak vom Chromatographen angezeigt wurde, wurde das Eluat mit 1 ml Neutralisationspuffer in einem 50 ml-Röhrchen aufgefangen. Bei Peakabfall auf die Hälfte der Peakstrecke wurde die Elution gestoppt, die Säule bis zur Nullinie weiter mit Elutionspuffer gespült. Danach wurde sie mit Harnstoff-, Tris-HCl/NaCl-, Elutions- und Waschpuffer regeneriert. Zur Aufbewahrung wurde abschließend 20 % EtOH über die Säule gegeben.

Das gewonnene Antikörpereluat wurde über Nacht in einem Dialyseschlauch (Durchmesser 12 – 14 kD, Medicell International Ltd., London, Großbritannien) gegen PBS dialysiert.

Die Proteinbestimmung des Eluats erfolgte nach Bradford. Dazu wurde eine Verdünnungsreihe bis 1:32 hergestellt. 100 ml der Proben wurden mit 100 ml Coomassie Brillantblau Lösung G250 (Sigma, Deisenhofen, bestehend aus 70 % entionisiertem Wasser, 25 % Methanol, 5 % Essigsäure und 0,1 % Coomassie Brillantblau) gemischt. Bei einer Wellenlänge von 595 nm wurde die Absorption in einem Photometer (Titertek, ICN Biomedical GmbH, Eschwege) gemessen. Der Proteingehalt wurde über Vergleich mit der Eichreihe bestimmt. Der aufgereingte Antikörper wurde aliquotiert und eingefroren oder anschließend zur Biotinylierung bzw. Kopplung mit dem FITC weiter verwendet.

Biotylinierung der monoklonalen Antikörper

Das Biotin dient in den FACS-Färbungen als Bindungspartner der Fluoreszenzfarbstoffe Allophycocyanin (APC) oder Tricolor. Durch seine vier freien Bindungsstellen für seine Partner sendet es gleichzeitig ein intensiveres Signal als das FITC-Molekül mit nur einer Bindungsstelle.

Puffer:

Biotin-Kopplungspuffer: 0,1 M Natriumhydrogencarbonat; pH-Wert 7,7 Biotin:

Das Biotin wurde als Biotinamidocaproate N-Hydroxysuccinimide Ester von Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim) bezogen.

Durchführung

Die Biotinylierung fand in zwei Schritten statt: zuerst wurden die Antikörper vom PBS in den Biotin-Kopplungspuffer umgepuffert, anschließend erfolgte die Biotinylierung.

3,5 mg Antikörper wurden mit dem Biotin-Kopplungspuffer auf ein Endvolumen von 2,5 ml verdünnt. Die PD10-Säulen (Amersham Pharmacia Biotech, New Jersey, USA) zur Umpufferung wurden mit 20 ml Biotin-Kopplungspuffer equilibriert. Die Antikörper-Lösung wurde auf die Säule gegeben, wobei das Eluat verworfen wurde. Dann wurden 3,5 ml Biotin-Kopplungspuffer aufgetragen und dabei dieses Eluat, das die umgepufferten Antikörper enthielt, aufgefangen. Danach wurde die Säule mit PBS equilibriert. Das Endvolumen der Antikörper-Lösung betrug 3,5 ml.

Das Biotin wurde mit Dimethylformamid (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Das umgepufferte Eluat wurde mit 50 mg Biotin / mg Protein versetzt. Die Antikörper wurden für 30 min bei Raumtemperatur mit dem Biotin auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde zur Aufbewahrung der biotinylierten Antikörper in PBS umgepuffert. Dazu wurden 2,5 ml der Lösung auf die PBS-equilibrierte PD10-Säule gegeben und das Eluat verworfen. Danach wurden 3,5 ml PBS auf die Säule gegeben und das Eluat dabei aufgefangen. Zu der übriggebliebenen Antikörper-Lösung von einem 1 ml-Volumen wurden 1,5 ml PBS gegeben und, wie bereits beschrieben, über die PD10-Säule gegeben. Die Antikörper wurden bis zur Austitrierung bei – 20° C gelagert.

FITC-Konjugation von Antikörpern Puffer:

FITC-Kopplungspuffer: 0,1 M Natriumcarbonat mit 0,1 M Natriumchlorid; pH-Wert von 9,2.

FITC:

Das Fluoroisothiocyanat wurde als Fluorescein Isothiocyanate Mixed Isomers von Sigma (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA) bezogen.

Durchführung

Auch die Kopplung der Antikörper mit FITC erfolgte in zwei Schritten: erst Umpufferung von PBS in FITC-Kopplungspuffer, anschließend die Kopplung selbst.

Die Umpufferung wurde mit den PD10-Säulen durchgeführt, wie oben beschrieben. Dabei wurden zur Equilibrierung 20 ml und zum Umpuffern 3,5 ml FITC-Kopplungspuffer eingesetzt.

Die FITC-Stammlösung lag in einer Konzentration von 2 mg FITC/ ml Kopplungspuffer vor.

Das umgepufferte Eluat wurde mit 50 mg FITC / mg Protein versetzt. Die Inkubation der Antikörper mit dem FITC erfolgte, in Folie umwickelt, für 4 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Danach wurden die FITC-konjugierten Antikörper zur Aufbewahrung in PBS umgepuffert. Dazu wurden 2,5 ml der Lösung auf die PBS-equilibrierte PD10-Säule gegeben und das Eluat verworfen. Dabei erhielt man zwei Fraktionen in gelblicher Farbe. Die erste Fraktion stellten die FITC-konjugierten Antikörper dar, die zweite Fraktion war unkonjugiertes FITC. Mit 3,5 ml PBS wurden die konjugierten Antikörper herausgespült und gesammelt, das unkonjugierte FITC verblieb dabei in der Säule und wurde verworfen. Zu den restlichen 1 ml der Antikörper-Lösung wurde 1,5 ml PBS dazugegeben und, wie oben beschrieben, über die PD10-Säule laufen gelassen. Die beiden Antikörper-FITC-Lösungen wurden entweder zusammen oder getrennt austitriert.

Die Biotin- und FITC-gekoppelten Antikörper wurden in verschiedenen Konzentrationen ausgetestet. Nach Beurteilung der Färbequalität mit einer Kontrolle bekannter Konzentration wurde die optimale Verdünnung zu den Färbungen festgelegt.