AUS DER ABTEILUNG
KARDIOLOGIE UND ANGIOLOGIE (Direktor: Professor Dr. med. Helmut Drexler)
der
MEDIZINISCHEN HOCHSCHULE HANNOVER
Angiotensin II führt zur Aktivierung der
endothelialen Xanthin-Oxidase: Bedeutung für die endotheliale Dysfunktion bei Patienten mit
koronarer Herzkrankheit
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Henrik Christoph Preuß aus Hannover Hannover 2008
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 15.12.2008
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: PD Dr. med. Ulf Landmesser
Referent: Prof. Dr. med. Wilfried Gwinner Koreferent: PD Dr. med. Kathrin Seidemann
Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2008
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Hermann Haller Prof. Dr. Rainer Nustede Prof. Dr. Christoph Klein
meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG... 1
2 METHODEN... 7
2.1 Allgemeine Methoden ... 7
2.1.1 Proteinbestimmung ... 8
2.1.2 Western Blot ... 9
2.2 Methoden Zellkultur... 12
2.2.1 Verwendete Zellen, Herkunft und Materialien ... 12
2.2.2 Stimulation der Endothelzellen mit Angiotensin II und Inhibitoren ... 12
2.2.3 Bestimmung der zellulären Superoxidproduktion mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR)... 14
2.2.4 Transfektion der Endothelzellen mit siRNA gegen die p47phox- Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase ... 16
2.3 Methoden der klinischen Studie ... 19
2.3.1 Bestimmung der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation ( FDD )... 19
2.3.2 Bestimmung des Arteriendurchmessers, Messung von Blutdruck und Pulsfrequenz... 19
2.3.3 Auswertung der erhobenen Daten... 22
2.3.4 Patientencharakteristika ... 22
2.3.5 Untersuchungsprotokoll... 23
2.3.6 Statistische Auswertung der Messergebnisse ... 25
3 ERGEBNISSE... 27
3.1 Ergebnisse in vitro ... 27
3.1.1 Effekt von Angiotensin II auf die Expression der endothelialen Xanthin- Oxidase ... 27
3.1.2 Effekt von Angiotensin II auf die endotheliale Superoxidproduktion.... 28
3.1.3 Effekt der eXO-Inhibition mit Oxypurinol und Tungsten ... 29
3.1.4 Rolle des Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyps 1 (AT1)... 30
3.1.5 Bedeutung der NAD(P)H-Oxidase für die durch Angiotensin II induzierte Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase ... 32
3.1.6 Rolle von Wasserstoffperoxid und Peroxynitrit ... 34
3.2 Ergebnisse der klinischen Studie... 37
3.2.1 Effekt von Losartan (2x50mg/d) und von Allopurinol (2x300mg/d) auf die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase in vivo... 38
3.2.2 Effekt von Losartan (2x50mg/d) und von Allopurinol (2x300mg/d) auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation ... 42
4 DISKUSSION... 46
5 ZUSAMMENFASSUNG ... 59
6 SCHRIFTENVERZEICHNIS ... 62
7 Curriculum Vitae ... 66
8 Erklärung nach §2 Abs.2 Nr.5 und 6 der PromO... 68
9 ANHANG... 70
9.1 Chemikalien ... 70
9.2 Lösungen... 73
9.3 Geräte... 74
9.4 Materialien ... 75
9.5 Puffer ... 76
9.6 Software ... 78
Verzeichnis der Abkürzungen
Abkürzung Bedeutung
Ang II Angiotensin II
BAECs Bovine Aorten-Endothelzellen
BH4 Tetrahydrobiopterin
ED Endotheliale Dysfunktion
eNOS endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase ESR Elektronenspinresonanz-Spektroskopie eXO endotheliale Xanthin-Oxidase bzw.
Endothelgebundene Xanthin-Oxidase
FDD Flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation (flow-dependant vasodilatation)
HAECS Humane Aortenendothelzellen
KHK Koronare Herzkrankheit
L-NAME Nitro-L-arginine-methyl ester-hydrochloride
MI Myokardinfarkt
NAC N-Acetyl-L-Cystein
NO Stickstoffmonoxid
pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit PBS-Puffer Phosphate-buffered-Saline-Buffer
PEG Polyethylenglycol-coated
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
ROS Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species) SEM Standardfehler des arithmetischen Mittels
siRNA small interfering- RNA
(ec)SOD (extrazelluläre) Superoxid-Dismutase
1 Einleitung
Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist die häufigste Todesursache in Deutschland und den westlichen Industrienationen [1].
Im Jahr 2000 betrug die alterstandardisierte Inzidenzrate für Myokardinfarkte je 100.000 Einwohner in Deutschland 312 für Männer und 105 für Frauen [2].
Das organische Korrelat der KHK ist die Atherosklerose der Herzkranzgefäße, die zu einer stetigen Einengung der Koronararterien und schließlich meist durch eine Plaqueruptur zu einem Myokardinfarkt (MI) führen kann [3].
Die Atherosklerose ist jedoch nicht nur maßgeblich an der Entstehung von KHK und Myokardinfarkt beteiligt, sondern übt auch einen wichtigen Einfluß auf Progredienz und Prognose anderer bedeutsamer kardiovaskulärer Erkrankungen wie Apoplex und pAVK aus, welche als Komplikationen der Atherosklerose zu sehen sind [4].
Um diese Erkrankungen früh diagnostizieren, effektiv therapieren oder gar verhindern zu können, ist es wichtig, die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen zu verstehen.
Als Ausgangspunkt der Atherosklerose wird heute eine Schädigung des vaskulären Endothels angesehen, die zu einer endothelialen Dysfunktion (ED) führt. So zeigen Studien der letzten Jahre, dass bei Patienten mit KHK eine deutliche endotheliale Dysfunktion vorliegt [5-7]. Diese gestörte Funktion des vaskulären Endothels führt nicht nur zu Regulationsstörungen von Gefäßtonus und Gefäßpermeabilität, sondern begünstigt auch durch eine verstärkte Thrombozytenaggregation und Infiltration von Leukozyten in die Gefäßwand eine Progression der Atherosklerose [8].
Neuere Untersuchungen zeigen, dass eine eingeschränkte Endothelfunktion mit einem gesteigerten Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse assoziiert ist [9, 10].
Aus diesem Grund stellt die endotheliale Dysfunktion gerade für Patienten mit KHK einen wichtigen prognostischen Marker dar [5, 11, 12].
Es gibt zunehmend Hinweise dafür, dass oxidativer Stress bei der Entstehung und Progression der endothelialen Dysfunktion eine entscheidende Rolle spielt [13, 14]. In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass durch die Applikation von Antioxidantien wie Ascorbinsäure in hohen Dosen die endothelvermittelte Vasodilation akut erheblich verbessert wird [8, 13, 15-18].
Eine der entscheidenden Ursachen für die endotheliale Dysfunktion bei Patienten mit KHK ist die vorzeitige Inaktivierung des vasodilatierend und antiatherogen wirksamen Stickstoffmonoxids (NO) durch freie Sauerstoffradikale (reaktive Sauerstoffspezies, ROS) [13, 19, 20].
An dieser vorzeitigen Inaktivierung des NOs sind verschiedene enzymatische Quellen von freien Sauerstoffradikalen beteiligt [4, 13]. In aktuellen Untersuchungen haben sich drei Enzymsysteme als bedeutsame Produzenten von ROS herauskristallisiert: Neben der NAD(P)H-Oxidase und der NO- Synthase (eNOS) in ihrer entkoppelten Form ist insbesondere die endotheliale Xanthin-Oxidase (eXO) eine potentiell wichtige Quelle von ROS und ist so maßgeblich an der Inaktivierung von freiem NO im Endothelbereich beteiligt [14, 21].
So konnte kürzlich demonstriert werden, dass die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase als eines der bedeutsamen prooxidativen Enzymsysteme bei Patienten mit KHK signifikant erhöht ist [22].
Des weiteren konnte bei Patienten mit KHK und Carotisstenose eine erhöhte Aktivität der endothelialen Xanthin-Oxidase nachgewiesen werden und auch in
Homogenaten von Koronargefäßen mit atherosklerotischen Läsionen war eine signifikant erhöhte Aktivität der eXO und der NAD(P)H-Oxidase feststellbar [4, 22-24]. Von besonderer Bedeutung ist auch die Erkenntnis, dass die bei diesen Patienten beobachtete erhöhte Aktivität der endothelgebundenen Xanthin- Oxidase eine inverse Korrelation mit der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation (FDD) als zuverlässigem Marker der endothelialen Dysfunktion aufwies und dass die Inhibition der eXO bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren oder chronischer Herzinsuffizienz zu einer signifikanten Verbesserung der FDD führte [25-28].
Bedeutung und Lokalisation der Xanthin-Oxidase
Die 1968 von Fridovich und McCord zuerst beschriebene Xanthin-Oxidase ist ein essentielles Enzym im Nucleotidstoffwechsel. Sie ist dort Katalysator zweier Reaktionsschritte des Purin-Nucleotidabbaus: Zum einen bei der Oxidation von Hypoxanthin zu Xanthin und zum anderen bei der Oxidation von Xanthin zu Harnsäure, wobei jeweils zwei Protonen und ein Superoxidradikal (O²-) freigesetzt werden (siehe Abbildung 1) [29].
Die Xanthin-Oxidase ist in den Gefäßen im Bereich des Endothels als Syntheseort des NOs und der Schicht der glatten Gefäßmuskulatur als Zielstruktur des NOs stark exprimiert (siehe Abbildung 2) [30]. Ein wichtiges antioxidativ wirksames Enzym ist die ebenfalls im Bereich des Gefäßendothels exprimierte (extrazelluläre) Superoxid-Dismutase. Sie schützt eukaryotische Zellen vor der in der Atmungskette generierten reaktiven Sauerstoffverbindung Superoxid.
Die Superoxid-Dismutase reagiert dabei in ihrer oxidierten Form mit einem Superoxidion unter Bildung von Sauerstoff und der reduzierten Form des Enzyms. Die reduzierte Form der Superoxid-Dismutase reagiert daraufhin mit einem zweiten Superoxidion und zwei Protonen zu Wasserstoffperoxid und der oxidierten Form des Enzyms.
Abbildung 2:
Lokalisation und Funktion der endothelgebundenen Xanthinoxidase in der arteriellen Gefäßwand
Befunde aktueller Studien weisen darauf hin, dass das komplexe oxidative Gleichgewicht im Bereich des vaskulären Endothels, und somit die Größe des oxidativen Stresses, durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflußt wird, die jedoch bis jetzt noch unzureichend verstanden werden [31].
Bedeutung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems für die ROS-Produktion
So wurde kürzlich in experimentellen Studien gezeigt, das Angiotensin II (Ang II) einen starken Stimulus für die endotheliale Superoxidproduktion darstellt und das Hemmstoffe des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) die vaskuläre Produktion freier Sauerstoffradikale supprimieren und somit die Entstehung und Progression der Atherosklerose verhindern können [32-35].
Diese Untersuchungsbefunde finden Bestätigung in den Ergebnissen der HOPE-Studie, die zeigen konnte, dass das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse bei Patienten mit KHK durch Hemmstoffe des Renin-Angiotensin- Aldosteron-Systems gesenkt werden konnte [36].
Aus diesem Zusammenhang ergeben sich folgende Fragestellungen für die folgende Dissertationsarbeit:
1. Reguliert das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System die Aktivität und die Expression der endothelialen Xanthin-Oxidase?
2. Wenn ja, spielt dann eine AT1-Rezeptorblockade bei Patienten mit KHK in vivo eine Rolle für die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase?
3. Welchen Einfluss hat eine AT1-Rezeptorblockade bei Patienten mit KHK in vivo auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation?
Um diese Fragestellungen beantworten zu können, wurde eine klinisch- experimentelle Studie durchgeführt, bei der sowohl der Einfluss von Angiotensin II auf die Aktivität der endothelialen Xanthin-Oxidase untersucht, als auch bei einem Patientenkollektiv mit koronarer Herzkrankheit der Einfluss einer Therapie mit dem AT1–Rezeptorblocker Losartan oder dem eXO-Inhibitor Allopurinol auf die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase sowie auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation (FDD) als Marker der endothelialen Dysfunktion bestimmt wurde.
2 Methoden
2.1 Allgemeine Methoden
Übersicht
Um die formulierten Fragestellungen effektiv bearbeiten zu können wurden etablierte Methoden ausgewählt, die sich bereits in vielen auf diesem Forschungsgebiet durchgeführten Untersuchungen bewährt haben. Die Zielsetzung bei der Verwendung etablierter Messverfahren wie z.B. des Westernblot-Analysverfahrens bestand insbesondere darin, zuverlässige und reproduzierbare Messergebnisse zu erheben sowie eine Vergleichbarkeit der Befunde mit anderen auf diesem Gebiet veröffentlichten Untersuchungen zu gewährleisten.
Ein Schwerpunkt der in dieser Promotionsarbeit durchgeführten Untersuchungen wurde auf die Verwendung der Elektronenspinresonanz- Spektroskopie gelegt. Die ESR-Spektroskopie stellt eine der genauesten Methoden zum Nachweis von oxidativem Stress in Biosystemen dar. Sie besitzt sowohl bei der von uns durchgeführten Messung von Sauerstoffradikalen (ROS) in der Zellkultur als auch bei der im Rahmen der klinischer Studie durchgeführten Bestimmung der plasmatischen Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase (eXO) eine ausgezeichnete Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Gerade bei den an kultivierten Zellen durchgeführten Experimenten stellt die sehr niedrige Nachweisgrenze von ROS bei dieser Messmethode einen wichtigen Aspekt für die erfolgreiche Abklärung der erhobenen Fragestellungen dar.
Bei den in der klinischen Studie eingesetzten Messverfahren sind insbesondere
sowie die Bestimmung der plasmatischen Aktivität der eXO mittels ESR- Spektroskopie von besonderer Relevanz. Die Bestimmung der FDD der A.
radialis mittels Ultraschall stellt eine äußerst zuverlässige Methode zur nichtinvasiven Messung der Endothelfunktion dar, welche in unserem Labor schon langjährig etabliert und validiert ist und eine ausgezeichnete Variabilität und Reproduzierbarkeit aufweist. Zur Bestimmung der plasmatischen Aktivität der eXO wurde bei den Teilnehmern der klinischen Studie die etablierte Methode der durch eine Heparin-Bolusinjektion erreichten Ablösung der eXO ins Blutplasma eingesetzt. Die mittels ESR-Spekroskopie nachgewiesene Änderung der eXO-Aktivität im Blutplasma der Studienteilnehmer stellt einen zuverlässig nachweisbaren Maßstab für das Ausmaß der vaskulären ROS- Produktion und somit auch für die potentielle endotheliale Schädigung durch oxidativen Stress dar.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die verwendeten Methoden eine wissenschaftlich etablierte und verlässlich reproduzierbare Arbeitsgrundlage zur Abklärung der erhobenen Fragestellungen darstellen.
2.1.1 Proteinbestimmung
Die Bestimmung der Proteinmengen erfolgte unter Verwendung eines hochsensitiven Assays der Firma Bio-Rad ( Bio–Rad Dc-Protein Assay).
Zu Beginn jeder Messung wurde eine Eichstandardreihe in aufsteigenden Konzentrationen von 10 bis 50 µg mit Hilfe einer Albuminlösung bekannter Konzentration (1µg/µl, Sigma) erstellt. Die Eichproben wurden dann mit Kaliumphosphat-Puffer auf ein Volumen von 50µl aufgefüllt.
Zu jeweils 50 µl des frisch gewonnenen Zellysates wurden zur Fällung der Proteine zuerst 250 µl der Reagenz A ( alkalische Kupfer-Tartrat-Lösung) und 2
ml der Reagenz B ( verdünnte Folin-Reagenzlösung ) hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur, während der sämtliche Proben mehrfach mittels Vortex durchmischt wurden, erfolgte die spektrophotometrische Bestimmung der Extinktionswerte in einem Photometer bei 750 nm gegen den Leerwert.
Jede Probe wurde in Dreifachbestimmung gemessen. Die Auswertung erfolgte mittels Bestimmung der Eichgeraden in MS Excel.
2.1.2 Western Blot
Vorbereitung der Proben
Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurde ein 30 µg Proteingehalt entsprechendes Volumen des Zellysates im Verhältnis 1:2 mit Laemmli Sample Puffer verdünnt. Anschließend wurden die Eppendorfgefäße zusammen mit den Proben für 5 Minuten bei 95 °Celsius inkubiert und danach auf Eis gekühlt.
In einen Gelgießstand wurde zuerst das 7,5 % Trenngel gegossen und dann mit ca. 1 ml Isopropanol überschichtet, um eine Wellenbildung der Geloberfläche zu vermeiden. Nachdem das Trenngel nach etwa 30 Minuten ausgehärtet war, wurde das Isopropanol abgegossen und mit Aqua dest. gespült. Anschließend wurde es mit dem Sammelgel überschichtet, in das ein 9-well Gel-Kamm der Firma BioRad mit 67 µl Füllvolumen eingesetzt wurde. Nach weiteren 20 Minuten wurde das ausgehärtete Gel in die Trennkammer eingesetzt, die darauf mit ca. 1 Liter Running-Puffer gefüllt wurde. Als nächstes wurde der Gel-Kamm vorsichtig entfernt. Die jetzt entstandenen Kammern im Trenngel wurden nun langsam mit den Proben, dem Marker und mit Positivkontrollen beladen.
An die verschlossene Trennkammer wurde zunächst für 30 Minuten eine Spannung von 80 Volt angelegt. Während dieser Zeit durchliefen die Proben das Sammelgel. Anschließend wurde für weitere 2,5 Stunden die Spannung auf 110 Volt erhöht, bis die Proben unter regelmäßiger Kontrolle der Markerlinien ausreichend weit im Trenngel gewandert waren.
Als nächstes wurde das Gel zusammen mit einer Nitrocellulose-Membran (Hybond-ECL, Amersham Biosciences, Kat.Nr.:RPN2020D) in eine mit 1 Liter Blotting-Puffer gefüllte Blotting-Kammer eingesetzt. An diese wurde für eine Stunde eine Spannung von 100 Volt angelegt, um die Proteine auf die Nitrocellulose-Membran zu übertragen.
Abschließend wurde die Nitrozellulosemembran mit den Proben über Nacht bei 4 °C auf einer Schüttelbank in einer 3 prozentigen TBST/Milchpulver-Lösung inkubiert.
Antikörperinkubation und Entwicklung
Am folgenden Tag wurde die Membran nach einmaligem Spülen mit TBST- Lösung für 90 Minuten zusammen mit dem monoklonalen gegen Xanthin- Oxidase gerichteten Primärantikörper (Firma Neomarkers) in einer Verdünnung von 1:200 auf einer Schüttelbank bei Raumtemperatur inkubiert.
Nachdem die Membran viermal für je 5 Minuten sorgfältig mit TBST-Lösung gewaschen worden war, wurde der sekundäre Antikörper (Goat vs. Mouse, HRP, Firma BioRad) in einer Verdünnung von 1:2000 für eine Stunde hinzugegeben und danach die Membran erneut gründlich gewaschen.
Die Entwicklung der Membran erfolgte in einer Dunkelkammer unter Verwendung des an den Sekundärantikörper angepassten ECL- Entwicklungssystems der Firma Bio-Rad.
Zunächst wurde die Membran für eine Minute mit der ECL-Entwicklungslösung überschichtet, danach kurz abgetrocknet und zusammen mit einem Blatt hochsensitiver Röntgenfolie (Kodak XB 1, 8x10inch, Cat#834027) in eine Röntgenkassette überführt. Dieser Vorgang wurde pro Membran für mindestens zwei Belichtungs-Zeitschritte (7 und 15 Minuten) durchgeführt. Anschließend wurden die Röntgenfolien in einem Fotoautomaten entwickelt und danach ausgewertet.
Densiometrische Auswertung
Zur densiometrischen Auswertung wurde das Gel – Doc 2000 Scannersystem mit der dazugehörigen Software Quantity 1 (beide BioRad) verwendet.
Die Differenzierung zwischen der Xanthin-Oxidase und der Xanthin- Dehydrogenase erfolgte anhand der unterschiedlichen Molekulargewichte der beiden Enzyme mit Hilfe der Westernblot-Analyse. Die Xanthin-Dehydrogenase hat ein Molekulargewicht von 130 kD, wohingegen die von uns nachgewiesene Xanthin-Oxidase ein Molekulargewicht von 85 kD besitzt. Der von uns verwendete primäre Antikörper weist sowohl Xanthinoxidase- als auch Xanthin- Dehydrogenase-Banden nach.
Nachweis des AT1-Rezeptors mittels des Westernblot-Analyseverfahrens:
Mit Hilfe des WesternBlot-Analysverfahrens konnte gezeigt werden, dass die von uns verwendeten Endothelzellen den AT1-Rezeptor in signifikanter Quantität exprimieren.
Hierfür wurden der Anti-AT1-Rezeptor-Antikörper und die AT1-Rezeptor- Positivkontrolle der Firma Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg, verwendet (siehe auch Anhang).
2.2 Methoden Zellkultur
2.2.1 Verwendete Zellen, Herkunft und Materialien
Die verwendeten Zellarten, die bereits in vielen wissenschaftlichen Veröffentlichungen benutzt wurden, wurden mit ausschließlicher Verwendung der von den Herstellerfirmen empfohlenen Zusatzstoffe und Nährmedien und unter Berücksichtigung der empfohlenen Pflegeprozeduren kultiviert (siehe auch Anhang). Abweichungen von den üblichen Behandlungsmethoden wurden im jeweiligem Abschnitt des Methodikteils gesondert erwähnt.
Der Vitalitätszustand der Zellen wurde mehrfach täglich mikroskopisch kontrolliert, um auf etwaige Veränderungen schnellstmöglich reagieren zu können.
Bei den durchgeführten Experimenten wurden nur Zellen bis zur 8.
Tochtergeneration verwendet, um eine Degeneration und Verminderung der Rezeptorexpression zu vermeiden. Sämtliche an den Zellen durchgeführten Prozeduren erfolgten unter sterilen Bedingungen. Ein möglichst kontaminationsfreies Vorgehen wurde durch Einsatz von steriler Einmal- Plastikware bei der Zellpflege sowie durch häufige Desinfektion der Arbeitsflächen gewährleistet. Wenn nicht anders angegeben, erfolgten alle Arbeitsschritte bei einer Temperatur der verwendeten Lösungen von 37 °C.
2.2.2 Stimulation der Endothelzellen mit Angiotensin II und Inhibitoren
Vorbereitung
Sämtliche zur Stimulation der Zellen verwendeten Chemikalien wurden zunächst in 1-molarer Konzentration in PBS-Puffer gelöst. Danach wurden die einzelnen Stoffe so weiterverdünnt, dass ihre Konzentration um den Faktor 10
größer war als die gewünschte Endkonzentration, da durch das Nährmedium eine Verdünnung um den Faktor 10 erfolgte. Abschließend wurden die verdünnten Lösungen in Falcon-Tubes unter sterilen Bedingungen mit 22 µm- Nanopure-Filtern (Sterifix, Firma Braun) steril filtriert.
Liste der verwendeten Inhibitoren und deren Konzentrationen:
- Apocynin (Aldrich): 1 bis 500*10-6 mol/l - Losartan (MSD): 1* 10-6 mol/l
- L – NAME (Sigma): 1* 10-6 mol/l
- N – Acetylcystein (Sigma): 1* 10-6 mol/l - Oxypurinol (Sigma): 1* 10-6 mol/l
- PD 123319 (Sigma): 1* 10-6 mol/l
Stimulation der Zellen
Die Stimulation der Endothelzellen mit Angiotensin II (10-7 mol/l, Sigma) erfolgte für eine Dauer von 12 Stunden, da in zuvor durchgeführten Zeitreihen nach diesem Zeitraum das Stimulationsmaximum bestimmt werden konnte. Die verwendeten Zellen hatten zum Zeitpunkt der Stimulation die vollständige Konfluenz erreicht. Der gesamte Boden der Zellkulturflasche musste dabei gleichmäßig und vollständig mit Zellen bedeckt sein.
Vor der Stimulation wurde pro Flasche 4 ml frisches Nährmedium hinzugegeben, von dem unter sterilen Bedingungen 400 µl ( 10% des Nährmediums) gegen eine Angiotensin II-Lösung (10-6 mol/l) ausgetauscht wurde. Durch diese Verdünnung um den Faktor 10 wurde eine
von Inhibitoren wurden diese 12 Stunden vor Beginn der Angiotensin II- Stimulation mit hinzugegeben.
Aufschließung der Zellen für die Immuno-Blot Analyse
Bei der Weiterverarbeitung der stimulierten Endothelzellen für das Western- Blotting-Verfahren wurde nach Ablauf der Stimulationszeit zunächst das Nährmedium entfernt und dann der Zellrasen mehrfach mit 37 °C warmem PBS-Puffer nachgespült.
Anschließend wurde zur Zerstörung der Zellmembranen in jede Flasche 400 µl RIPA-Lysis-Puffer hinzugegeben und gleichmäßig über den Zellrasen verteilt.
Als nächstes wurde der Zellrasen mit Hilfe eines Zell-Scrapers (Firma Sarstedt) vollständig vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst, mit einer Pipette in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
Nach Ablauf der 30 Minuten konnte das Zell-Lysat für Proteinbestimmung und Western-Blotting genutzt werden. Bei Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt konnte es bei –86 °C eingefroren werden.
2.2.3 Bestimmung der zellulären Superoxidproduktion mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR)
Vorbereitung der Zellen
Zur Aktivitätsbestimmung mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR) wurde das Nährmedium unmittelbar vor der Messung entfernt und der Zellrasen mehrfach mit 37 °C warmem PBS-Puffer gespült.
Als nächster Schritt wurde in jede Zellkulturflasche 1 ml 37 °C warmer PBS- Puffer einpipettiert, in dem ein Protease-Inhibitor-Cocktail ( Complete Mini, Roche,Cat.Nr.:11836153001) enthalten war. Anschließend wurde der Zellrasen sehr vorsichtig mittels Zell-Scraper vom Boden der Zellkulturflasche gelöst und
in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Die Eppendorf-Röhrchen wurden danach für 8 Minuten bei 6000 g zentrifugiert und danach im Heizblock bei 37 °C bis zur Messung aufbewahrt.
Grundsätzlich wurde darauf geachtet, die Zeit zwischen der Vorbereitung der Zellen und der eigentlichen Messung möglichst gering zu halten, um ein stärkeres Abkühlen der abgelösten Endothelzellen zu vermeiden.
Durchführung der ESR-Messung
Vor Beginn der Messung wurde das ESR-Gerät eine Stunde lang warmlaufen gelassen und per Steuersoftware autokalibriert. Der Ablauf der Messung verlief in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurde zunächst die Eigenaktivität des verwendeten Spintraps bestimmt. Im zweiten Schritt wurde danach die Gesamtaktivität der im Spintrap schwimmenden Endothelzellen ermittelt. Aus der Differenz der zwei ermittelten Werte wurde die Eigenaktivität der Endothelzellen errechnet.
Zur Bestimmung der Eigenaktivität des Spintraps wurden 50 µl der Spintrap- Lösung während einer Inkubationszeit von zwei Minuten in ein Kapillarröhrchen aufgezogen und nach vorheriger Kalibrierung des ESR-Gerätes gemessen.
Um die Aktivität der Endothelzellen bestimmen zu können, wurde der Überstand der zentrifugierten Zellen abpipettiert und das Zellpellett in 50 µl der Spintrap-Lösung resuspendiert. Während einer Inkubationszeit von zwei Minuten wurde die Zellsuspension in ein Kapillarröhrchen überführt und dieses zur Messung in die Messkavität des ESR-Geräts eingesetzt.
Erstellen der Eichgeraden
Um die Größe der Radikalproduktion mengenmäßig bestimmen zu können, wurde eine Eichgerade erstellt, die es ermöglichte, die von der Analysesoftware ausgegebenen Arbeitseinheiten in molare Mengenangaben umzurechnen.
Als Eichstoff wurde die Reinform des oxidierten Spintraps cp° (Firma Alexis) verwendet, der dem Nachweisprodukt der durchgeführten Versuche entsprach.
Das cp° wurde in Aqua BiDest gelöst und in linearen Verdünnungsschritten gemessen, so dass das gesamte Messspektrum zwischen Nachweisgrenze und Maximalwert erfasst wurde.
Anschließend wurde die Eichgerade und die Formel zur Umrechnung der Arbeitseinheiten in molare Mengenangaben mit Hilfe von Microsoft Excel erstellt.
2.2.4 Transfektion der Endothelzellen mit siRNA gegen die p47phox- Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase
Bei dieser Versuchsreihe sollte die NAD(P)H-Oxidase gezielt auf RNA-Ebene inhibiert werden. Dies erfolgte durch den Einsatz von speziell gegen die RNA der NAD(P)H-Oxidase gerichtete small interfering-RNA (siRNA).
Die für diese Versuche benötigte speziell angefertigte siRNA sowie sämtliche Materialien für die Transfektion, also die Überführung der siRNA in die Zellen, wurden von der Firma Qiagen (Qiagen, Hilden, Deutschland) geliefert, deren Produkte bereits bei vielen auf diesem Gebiet durchgeführten Untersuchungen Verwendung gefunden haben.
Verwendet wurde das „4 for silencing“-Komplettpaket, welches vier verschiedene siRNA Varianten gegen die gewünschte Ziel-RNA enthält, von denen mindestens eine die Expression des Produktes der Ziel-mRNA garantiert
um mindestens 70 Prozent inhibieren sollte. Die speziell angefertigte siRNA war gegen die mRNA der bovinen p47-phox NADPH-Oxidase gerichtet.
Außerdem wurde zu Beginn der Versuchsreihe das „siRNA Starter Kit“ der Firma Qiagen verwendet. Damit kann der Transfektionserfolg bei den verwendeten Endothelzellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie anhand Fluoreszin-markierter siRNA festgestellt werden.
Bei der Versuchsreihe wurden bovine Aorten-Endothelzellen verwendet, die zum Zeitpunkt der Transfektion eine Konfluenzrate von 50 bis 60 Prozent erreicht hatten.
Zielsequenzen der verwendeten siRNA (alle Qiagen):
I : AAG AAG ACG TCA CAG GTT ACT II: AAG CCA TTG AGG TCA TTC ATA III: AAA GCC AGA GAC ATA CCT GAT IV: AAA GGG CTC GAG TTC CCA AAT Fluorescin – markierte Kontroll siRNA:
AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT
Vorbereitung der Zellen für die Transfektion
Als erster Schritt wurden unter sterilen Bedingungen für jede 25 cm2 Zellkulturflasche 60 µl der siRNA-Lösung entsprechend einer Proteinmenge von 15 µg mit 250 µl EC-R Pufferlösung in einem Cryo-Röhrchen vermischt.
Anschließend wurden 90 µl der RNAiFect-Transfektionsreagenz hinzugegeben, was einem vom Hersteller empfohlenem Verhältnis von 6 µl
Transfektionsreagenz pro 1 µg verwendeter siRNA entsprach. Dies führte zu einem Gesamtvolumen von 400 µl pro Cryo-Röhrchen.
Damit sich zwischen der siRNA und der Transfektionsreagenz Komplexe ausbilden konnten, wurden die Cryo-Röhrchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Als nächstes wurde das alte Nährmedium aus den Zellkulturflaschen entfernt und die 400 µl des Transfektionsgemisches zusammen mit 3,6 ml des auf 37 °C erwärmtem Nährmediums in jede Kulturflasche hinzugegeben.
Die Zellkulturflaschen wurden bei 37 °C und 5 % CO2-Konzentration für 48 Stunden inkubiert. Dabei wurde 24 Stunden nach Transfektionsbeginn das Nährmedium erneuert und 36 Stunden nach Beginn der Transfektion die Stimulation der Endothelzellen mit Angiotensin II vorgenommen.
Kontrolle des Transfektionserfolges durch Fluoreszenzmikroskopie
Um den Erfolg der Transfektion messen zu können, wurden parallel zu jedem Versuchsansatz mit inhibierender siRNA auch Endothelzellen mittels nicht- inhibierender siRNA, die Fluoreszin-markiert war, transfiziert.
Diese Endothelzellen wurden während des gesamten Versuches analog zu den mit inhibiernder siRNA transfizierten Zellen behandelt.
Die Rate des Transfektionserfolges wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt und mit Hilfe einer speziellen Digitalkamera dokumentiert. Für die durchgeführten Versuche musste die Transfektion bei über 80 Prozent der verwendeten Endothelzellen erfolgreich gewesen sein.
Als Negativkontrolle wurde die mit Fluoreszin markierte, nicht inhibierende siRNA verwendet. Diese wies keine Homologie zu menschlicher oder tierischer RNA auf und diente gleichzeitig als Indikator für den Erfolg der Transfektion.
2.3 Methoden der klinischen Studie
2.3.1 Bestimmung der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation ( FDD )
Die Bestimmung der endothelvermittelten flussabhängigen Vasodilatation (FDD, flow dependend vasodilation) der Arteria radialis mittels Ultraschall stellt eine äußerst zuverlässige nichtinvasive Methode zur Endothelfunktionsmessung dar.
Sie weist eine enge Korrelation mit Endothelfunktionsmessungen an Koronargefäßen auf [5]. Diese Messmethode ist in unserem Labor schon langjährig etabliert und validiert und weist eine ausgezeichnete Variabilität und Reproduzierbarkeit auf [18, 33, 37-40].
Die Messungen der FDD wurden nach einer durch 8-minütige Okklusion der Arteria radialis verursachten passagären Ischämie des distalen Gefäßabschnitts in der Phase der reaktiven Hyperämie durchgeführt. Dabei ist die flussabhängige Dilatation als maximale Durchmesseränderung nach Beendigung der Gefäßokklusion im Vergleich zum Ausgangsdurchmesser unter Kontrollbedingungen definiert.
2.3.2 Bestimmung des Arteriendurchmessers, Messung von Blutdruck und Pulsfrequenz
Bei allen Studienteilnehmern wurde der Durchmesser der Arteria radialis mit Hilfe eines hochauflösenden A-Mode-Ultraschallverfahrens mit Oversampling- Technik bestimmt. Bei dem verwendetem Ultraschallverfahren steht A-Mode für die Aufzeichnung der empfangenen Signale in modifizierter Form als Amplituden in Abhängigkeit zur Signalintensität (siehe Abbildung 3). Durch die Oversampling-Technik werden 312 Momentaufnahmen pro Sekunde
eine sehr präzise quantitative Auswertung des gemessenen Signals, bei der eine maximale Auflösung von 2,5µm erreicht wird [40].
Die beim A-Mode-Sonographieverfahren ausgesandten Ultraschallsignale breiten sich in Form einer Longitudinalwelle aus und werden an den Grenzschichten der untersuchten Gewebestrukturen unterschiedlich stark reflektiert. Anhand der Laufzeitdifferenzen der ausgesandten Schallwellen im Gewebe konnte die Vorder- und Hinterwand der Arteria radialis mit Hilfe eines Oszilloskopes genau dargestellt werden.
Das von uns verwendete Ultraschallgerät (Firma Asulab, Neuchatel, Schweiz) zeichnet den Gefäßdurchmesser über jeweils 5 Herzzyklen auf und errechnet daraus den mittleren arteriellen Durchmesser. Die bei der Messung verwendete 10 MHz-Ultraschallsonde wurde 15 cm proximal des Handgelenks des nicht dominanten Armes der Studienteilnehmer rechtwinklig zur Arteria radialis positioniert und dabei mit einer Haltevorrichtung fixiert. Die genaue Positionierung der Ultraschallsonde erfolgte unter Dopplerführung ohne direkten Hautkontakt und unter Verwendung eines wasserlöslichen Ultraschallgels zur Gewährleistung einer ausreichenden Eindringtiefe des Ultraschallstrahls.
Messung von Blutdruck und Herzfrequenz
Die systolischen, diastolischen und mittleren Blutdruckwerte und die Herzfrequenz wurden nichtinvasiv am kontralateralen Arm nach Riva-Rocci erfasst.
Abbildung 3:
Ultraschallsignal der Arteria radialis auf dem Oszilloskop.
Anterior Wall: Vorderwand; Posterior Wall: Hinterwand.
Abbildung 4: Monitor der Ultraschall-Messeinheit
Zu Abbildung 4:
In der oberen Zeile (post) wird die Bewegung der Hinterwand der Arteria radialis aufgezeichnet, in der mittleren Zeile (ant) die der vorderen Wand im Verlauf von Systole und Diastole. Die untere Kurve zeigt die Änderung des Durchmessers (dia = diameter) während jedes Herzzyklusses an. Bei jeder Messung wurde der systolische, der diastolische sowie der mittlere Durchmesser ermittelt und abgespeichert.
2.3.3 Auswertung der erhobenen Daten
Auswertung der Durchmesserdaten
Bei sämtlichen Auswertungen und Berechnungen wurde jeweils der mittlere arterielle Durchmesser verwendet. Die Ausgangswerte wurden unter Kontrollbedingungen mit Hilfe der über 5 Minuten alle 30 s gemessenen gemittelten Werte berechnet. Nach Beendigung der Handgelenksokklusion wurde die FDD ermittelt, indem der Gefäßdurchmesser der Arteria radialis in den ersten 2 Minuten in Intervallen von 20 Sekunden, danach alle 30 Sekunden gemessen wurde, und zwar so lange, bis die Ausgangswerte unter Ruhebedingungen wieder erreicht waren. Anhand der Differenz der beiden ermittelten Werte konnte jeweils die absolute (in mm) und die prozentuale Änderung des Gefäßdurchmessers errechnet werden.
2.3.4 Patientencharakteristika
An der klinischen Studie nahmen insgesamt 24 Patienten mit angiographisch dokumentierter stabiler koronarer Herzkrankheit (linksventrikuläre Ejektionsfraktion >45%) teil. Dabei erhielten 10 Patienten den AT1 - Rezeptorblocker Losartan (2 x 50 mg Losartan p.o. täglich für 4 Wochen) und weitere 9 Patienten Allopurinol als Hemmstoff der Xanthin-Oxidase (2x 300 mg Allopurinol p.o. täglich für 4 Wochen). Die restlichen 5 Studienteilnehmer erhielten als Kontrollgruppe ein wirkstoffreies Placebopräparat. Das durchschnittliche Alter der Studienteilnehmer der Losartan-Gruppe betrug 60 ±4 Jahre, die Studienteilnehmer der Allopurinol-Gruppe waren im Durchschnitt 60
±3 Jahre alt. Das Durchschnittsalter der Placebogruppe betrug 64±3 Jahre.
Vasoaktive Medikamente sowie Nikotin und Koffein wurden 12 Stunden vor Beginn der Messung abgesetzt. Die Auswahl der Probanden orientierte sich an
den in Tabelle 1 aufgeführten Ein- bzw. Ausschlusskriterien. Ein Votum der Ethikkommission über die unbedenkliche Durchführbarkeit der klinischen Studie war vor Studienbeginn eingeholt worden.
Tabelle 1: Kriterien für die Studienteilnahme der gesunden Kontrollpersonen und der Patienten mit KHK
Einschlusskriterien Ausschlusskriterien
Patienten mit KHK:
- Angiographisch gesicherte KHK - Normale linksventrikuläre Ejektions-
fraktion (>45%)
- Einnahme von Vitaminpräparaten - Heparinbehandlung in den
vergangenen 48 Stunden - akutes Koronarsyndrom - Hypercholesterinämie (LDL > 180 mg/dl)
- Unkontrollierte Hypertonie (RR-Werte >140/90 mmHG) - Diabetes mellitus
- Patienten mit hämatologischen, renalen oder hepatischen
Erkrankungen
2.3.5 Untersuchungsprotokoll
Die an der Studie teilnehmenden Patienten wurden einige Tage vor der jeweiligen Messung über die bevorstehende Untersuchung aufgeklärt. Dabei wurde ihnen insbesondere das Untersuchungsprotokoll erläutert, ein ausführliches Anamnesegespräch geführt und eine körperliche Untersuchung
schriftliche Einwilligung zum Studienprotokoll eingeholt. Alle Teilnehmer wurden gebeten, zwölf Stunden vor Beginn der Endothelfunktionsmessung weder Koffein noch Alkohol zu konsumieren und am Morgen der Untersuchung ein leichtes fettarmes Frühstück zu sich zu nehmen. Am jeweiligen Tag der Messung wurde den Studienteilnehmern erneut der Ablauf des Untersuchungsprotokolls erläutert.
Die Teilnehmer der Studie wurden gebeten, sich auf eine bequeme Liege zu legen, worauf ihnen unter sterilen Bedingungen und Lokalanästhesie ein handelsüblicher Polyäthylenverweilkatheter in die Arteria brachialis gelegt wurde. Des weiteren wurde eine venöse Verweilkanüle in eine großlumige epifaszial gelegene Vene am Ellenbogengelenk des nichtdominanten Armes gelegt. Um eine Aufrechterhaltung der Kanülen für Infusionen und spätere Blutabnahmen zu gewährleisten, wurde isotone Kochsalzlösung infundiert.
Zur Bestimmung der Baselinewerte wurden den Studienteilnehmern zuerst jeweils zwei arterielle und zwei venöse Blutproben entnommen. Um die endothelial gebundene Xanthin-Oxidase abzulösen, bekamen die Probanden anschließend 5000 IE Heparin im Bolus über den arteriellen Verweilkatheter in die Arteria brachialis infundiert. Um den Anstieg der extrazellulären Xanthin- Oxidase-Aktivität im Plasma bestimmen zu können, wurden 1, 3, 5, 7 und 10 Minuten nach Heparingabe jeweils 2,7 ml EDTA-Blut über den venösen Verweilkatheter abgenommen [41-46]. Nach Durchführung der Blutabnahme erfolgte am nichtdominanten Arm des Studienteilnehmers die Messung der flussabhängigen Vasodilatation der Arteria radialis. Am kontralateralen Arm wurde zur nichtinvasiven Bestimmung von Blutdruck und Herzfrequenz die Manschette eines Blutdruckmessgerätes angelegt, um ein ständiges Kreislaufmonitoring während der Endothelfunktionsmessung zu gewährleisten.
Anschließend wurde den Studienteilnehmern eine Kinderblutdruckmanschette an das nichtdominante Handgelenk angelegt, mit der die spätere Okklusion der Blutzufuhr erreicht werden sollte. Um Bewegungsartefakte während der Messung zu vermeiden, wurde vor Positionierung der Ultraschallsonden der zu untersuchende Arm in einer Schiene fixiert (siehe Abbildung 5).
2.3.6 Statistische Auswertung der Messergebnisse
Alle in dieser Studie erhobenen Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standardfehler des arithmetischen Mittels (SEM) angegeben. Um die Daten der Studienteilnehmer miteinander vergleichen zu können, wurde eine ANOVA- Analyse (one way analysis of variance) und anschließend ein Student-Newman- Keuls-Test durchgeführt. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit einer
Zu Abbildung 5:
Am linken Bildrand ist die im 45°-Winkel zur Arteria radialis angebrachte Doppler-Sonde, rechts daneben die orthogonal über der Arteria radialis fixierte Echosonde zu erkennen.
Abbildung 5: Aufbau der Ultraschall-Messeinheit
klinischen Teil dieser Studie erhobenen Daten wurde als zusätzliches Analyseverfahren die PROC MIXED-Prozedur der SAS-Statistiksoftware, Version 9.1, verwendet.
3 Ergebnisse
3.1 Ergebnisse in vitro
3.1.1 Effekt von Angiotensin II auf die Expression der endothelialen Xanthin-Oxidase
Die Stimulation sowohl boviner als auch humaner aortaler Endothelzellen mit Angiotensin II in einer Konzentration von 10-7 mol/l führte zu einer deutlichen Zunahme der Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase (eXO). Dies konnte mit Hilfe des Western-Blotting Verfahrens nachgewiesen werden. In zuvor durchgeführten Versuchsreihen zur Bestimmung des Einflusses der Stimulationsdauer auf die Zunahme der eXO-Proteinexpression konnte ein Maximum der Proteinexpression 12 Stunden nach Stimulationsbeginn beobachtet werden (siehe Abbildung 6). In den folgenden Versuchsreihen wurde deshalb eine Zeitspanne von 12 Stunden als Standardwert für die Maximalantwort der gesteigerten eXO-Proteinexpression auf den Stimulationsreiz von Angiotensin II festgelegt. Bezüglich der Abhängigkeit der Proteinexpression auf die verwendete Dosis von Angiotensin II konnte in verausgegangenen Versuchsreihen gezeigt werden, dass weder höhere (10-6 mol/l) noch niedrigere (10-8 mol/l) Dosen von Angiotensin II zu einer ausgeprägteren Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase führten.
Deshalb wurde die auch in anderen aktuellen Studien etablierte Konzentration von 10-7 mol/l als Standardkonzentration festgelegt wurde. Ein signifikanter Einfluß der Stimulation mit Angiotensin II auf die Proteinexpression der Xanthindehydrogenase wurde nicht beobachtet.
3.1.2 Effekt von Angiotensin II auf die endotheliale Superoxidproduktion Die Stimulation mit Angiotensin II führte neben der gesteigerten Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase auch zu einer signifikanten Steigerung der endothelialen Superoxidproduktion bei vergleichbarem Zeitverlauf (siehe Abbildung 7). Dies konnte mit Hilfe der ESR- Spektroskopie (Elektronenspinresonanz-Spektroskopie) nachgewiesen werden.
Bei der ESR-Messmethode wird die Umwandlung der als Radikalfänger fungierenden Chemikalie CP-H (1-hydroxy-3-carboxy-pyrrolidine), dem so genannten spin trap, von der reduzierten in eine oxidierte Form CP-°
(paramagnetisches 3-carboxy-proxyl) registriert. Dass es sich bei den nachgewiesenen Radikalen zum größten Teil um Superoxidradikale handelt, konnte dadurch gezeigt werden, dass durch Zugabe von 350 Einheiten PEG- SOD (polyethyleneglycol-superoxide dismutase) die Oxidation des CP-H zum größten Teil verhindert werden konnte.
Abbildung 6:
Einfluss von Angiotensin II (10-7 mol/l) auf die Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase, n=3-7
3.1.3 Effekt der Inhibition der endothelialen Xanthin-Oxidase mit Oxypurinol und Tungsten
Zur genaueren Bestimmung des Ursprungs der durch Stimulation mit Angiotensin II gesteigerten endothelialen Superoxidproduktion wurden weitere Versuchsreihen mit spezifischen Inhibitoren verschiedener potentiell an der gesteigerten Produktion von ROS beteiligten Enzyme durchgeführt. Als wichtiger Befund zeigte sich, dass durch den Einsatz zweier strukturell unterschiedlicher spezifischer Inhibitoren der eXO, nämlich Oxypurinol und Tungsten (Wolfram-Natrium-Komplex), eine deutliche Reduktion der durch Stimulation mit Angiotensin II induzierbaren Superoxidproduktion zu erreichen war (Abbildung 8).
Diese Beobachtungen unterstützen die Ansicht, dass die eXO als bedeutsamer Produzent von ROS einen massgeblichen Anteil an der durch Angiotensin II Abbildung 7:
Einfluss der Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l) auf die mittels ESR- Spektroskopie (spin trap: CP-H) bestimmte endotheliale Superoxidproduktion im Zeitverlauf, n=4-8
3.1.4 Rolle des Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyps 1 (AT1)
Zunächst konnte mit Hilfe des WesternBlot - Analyseverfahrens demonstriert werden, dass die verwendeten Endothelzellen den AT1-Rezeptor exprimieren.
Anschließend wurden die Endothelzellen 12 Stunden vor Stimulation mit Abbildung 8:
Einfluss von Oxypurinol (10-6 mol/l) und Tungsten (10-6 mol/l) als strukturell unterschiedlichen Inhibitoren der endothelialen Xanthin- Oxidase auf die mittels ESR-Spektroskopie bestimmte endotheliale Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7mol/l),n=6-9
Angiotensin II mit jeweils einem Rezeptorblocker der AT1- und AT2- Rezeptorsubtypen behandelt.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Behandlung der mit Angiotensin II stimulierten Endothelzellen mit dem für den AT1-Rezeptor spezifischen Hemmstoff Losartan (10-6 mol/l) zu einer fast vollständigen Hemmung sowohl der Superoxidproduktion in der ESR-Messung als auch der gesteigerten Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase im WesternBlot führte.
Die Tatsache, dass der gleiche Versuchsaufbau mit dem für den AT2-Rezeptor spezifischem Hemmstoff PD123319 (10–7 mol/l) zu keiner signifikanten Hemmung der Superoxidproduktion oder XO-Proteinexpression führte, spricht für die Annahme, dass der durch Angiotensin II induzierte Effekt über den AT1- Rezeptor vermittelt wird (siehe Abbildungen 9 und 10) .
Abbildung 9:
Einfluss des AT1-Rezeptorblockers Losartan (10-6 mol/l) und des AT2- Rezeptorblockers PD 123319 (10-7 mol/l) auf die Proteinexpression der
3.1.5 Bedeutung der NAD(P)H-Oxidase für die durch Angiotensin II induzierte Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase
Es wurde der Einfluß der NAD(P)H-Oxidase auf die endotheliale Xanthin- Oxidase überprüft, indem die NAD(P)H-Oxidase der verwendeten Endothelzellen auf zwei unterschiedliche Arten inhibiert wurde, um so deren Einfluß auf die durch Angiotensin II vermittelte Aktivierung der eXO und auf die endotheliale Superoxidproduktion bestimmen zu können.
Zur Inhibition der NAD(P)H-Oxidase wurde zum einen der spezifische Hemmstoff Apocynin in einer Konzentration von 600 µmol/l verwendet, zum anderen gegen die p47phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase gerichtete spezifische siRNA (small interfering RNA). Bei beiden Versuchsansätzen konnte gezeigt werden, dass durch die Hemmung der NAD(P)H-Oxidase sowohl der Anstieg Superoxidproduktion (ermittelt mittels ESR-
Abbildung 10:
Einfluss des AT1-Rezeptorblockers Losartan (10-6 mol/l) und des AT2- Rezeptorblockers PD 123319 (10-7 mol/l) auf die endotheliale Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-6
Spektroskopiemessung), als auch der Proteinexpression der eXO (im Western- Analyseverfahren bestimmt) nach Stimulation mit Angiotensin II fast vollständig inhibiert werden konnte (siehe Abbildung 11 und 12).
Diese Beobachtungen unterstützen die Annahme, dass die NAD(P)H-Oxidase maßgeblich an der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der eXO beteiligt ist.
Abbildung 11 :
Einfluss der Inhibition der NAD(P)H-Oxidase mittels Apocynin (600 µmol/l) und siRNA auf die Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-8
3.1.6 Rolle von Wasserstoffperoxid und Peroxynitrit
In vorausgegangenen Versuchsreihen konnte bereits beobachtet werden, dass durch Behandlung der mit Angiotensin II stimulierten Zellen mit PEG-Superoxid- Dismutase der Anstieg der endothelialen Superoxidproduktion zu einem massgeblichen Anteil reduziert werden konnte. Um die Mechanismen der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase weiter differenzieren zu können, wurde der Einfluss weiterer antioxidativ wirksamer Substanzen, sowie auch der Einfluss spezifischer Inhibitoren von endothelial exprimierten Enzymsystemen auf die Proteinexpression der eXO untersucht.
Verwendet wurden hierfür die PEG-Superoxid-Dismutase (350 Units/ml), das antioxidativ wirksame N-Acetylcystein (NAC, 10-6mol/l), Catalase (4000 Abbildung 12:
Einfluss der Inhibition der NAD(P)H-Oxidase mittels Apocynin (600µmol/l) und siRNA auf die endotheliale Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-8
Units/ml) als abbauendes Enzym von Wasserstoffperoxid (H2O2) sowie L- NAME (Nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride, 10-6mol/l) als spezifischer Inhibitor der NO-Synthase.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen eine signifikante Reduktion der Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase durch Angiotensin II vor allem durch Catalase und L-NAME (siehe Abbildung 13). Das lässt darauf schließen, dass sowohl Wasserstoffperoxid als auch Peroxynitrit an der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der eXO beteiligt sein müssen [47].
Reproduzierbarkeit der bisherigen Befunde mit humanen Endothelzellen
Um ausschließen zu können, dass der beobachtete Effekt von Angiotensin II auf die endotheliale Xanthin-Oxidase spezies-spezifisch ist, wurde der Einfluss von Angiotensin II auch auf die endotheliale Xanthin-Oxidase in humanen Abbildung 13:
Einfluss von Peroxynitrit und Wasserstoffperoxid auf die Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-8
Vorhandensein der Aktivität von eXO bereits nachgewiesen wurde, untersucht [48]. Die mit den humanen Zellen durchgeführten Versuche zeigten nach Stimulation mit Angiotensin II eine mit den bovinen Zellen vergleichbare Aktivitätssteigerung der endothelialen Xanthin-Oxidase und der endothelialen Superoxidproduktion, die sich ebenfalls durch Oxypurinol, Tungsten und weitere Hemmstoffe erfolgreich inhibieren ließ.
Da die durchgeführten Versuche sowohl mit bovinen als auch humanen aortalen Endothelzellen vergleichbare Ergebnisse zeigten, wurde eine klinische Studie durchgeführt, um die Relevanz der Angiotensin II-induzierten Aktivierung der eXO bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit in vivo bestimmen zu können.
3.2 Ergebnisse der klinischen Studie
Es wurde bei Patienten mit KHK der Einfluss einer vierwöchigen AT1- Rezeptorblockade mit Losartan und einer ebenfalls vierwöchigen Inhibition der Xanthin-Oxidase mittels Allopurinol zum einen auf die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase, zum anderen auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilation (FDD, flow-dependant endothelium mediated vasodilation) untersucht.
Zur Durchführung der doppelt geblindeten Studie wurden insgesamt 24 Patienten mit KHK und vergleichbaren Charakteristika (siehe Tabelle 2) in drei Gruppen eingeteilt. Dabei erhielt die erste Gruppe den AT1-Rezeptorblocker Losartan (Losartangruppe:n=10, 50 mg Losartan p.o. 2 x täglich). Die zweite Gruppe wurde mit Allopurinol als spezifischem Inhibitor der eXO (Allopurinolgruppe: n= 9, 300 mg p.o. 2x täglich)behandelt. Die dritte Gruppe (Placebogruppe: n=5) erhielt als Kontrollgruppe ein Placebopräparat ohne tatsächlichen Wirkstoff.
Jeder Studienteilnehmer wurde nach ausführlicher Aufklärung über Studieninhalt und Procedere und erteilter schriftlicher Einwilligung zweimal untersucht: Die erste Untersuchung erfolgte dabei vor Beginn der jeweiligen Therapie, die abschließende zweite Untersuchung wurde nach Beendigung der vierwöchigen Behandlung durchgeführt (siehe auch Methodikteil).
Tabelle 1 Charakteristika der Patienten mit koronarer Herzkrankheit ---
Placebogruppe Losartan-Gruppe Allopurinol-Gruppe
(n=5) (n=10) (n=9)
---
Alter (Jahre) 64 ± 3 60 ± 4 60 ± 3
Geschlecht (m/w) 4/1 8/2 8/1
LV-Ejektionsfraktion (%) 52 ± 6 58 ± 3 56 ± 2
LDL-cholesterol (mg/dl) 148 ± 34 181 ± 21 135 ± 21
Kreatinin (mg/dl) 0.9 ± 0.1 0.9 ± 0.1 0.9 ± 0.1
Gewicht (kg) 80 ± 4 78 ± 4 88 ± 2
Mittlerer Blutdruck (mm Hg) 89 ± 5 82 ± 4 83 ± 5
Grösse (cm) 172 ± 2 170 ± 2 172 ± 2
ASS 5/5 10/10 10/10
Statin 4/5 8/10 7/9
Betablocker 4/5 8/10 8/9
3.2.1 Effekt von Losartan (2x50mg/d) und von Allopurinol (2x300mg/d) auf die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase in vivo
Bei allen drei Patientengruppen war eine signifikante Zunahme der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Anschluss an die Heparinbolusinfusion im Sinne einer erfolgten Ablösung der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase in das zirkulierdende Blutvolumen feststellbar (Siehe Abbildungen 14,16 und 18).
Bei der Untersuchung der basalen Aktivität der endothelgebundenen Xanthin- Oxidase im Blutplasma vor Beginn der jeweiligen Therapie zeigten sich bei allen drei Patientengruppen vergleichbare Messbefunde. Nach Beendigung der vierwöchigen Therapien ließen sich jedoch signifikante Unterschiede der eXO- Aktivität bei der Losartan- und auch der Allopurinolgruppe gegenüber der Placebogruppe feststellen.
Insbesondere konnte bei den Studienteilnehmern der Losartangruppe nach vierwöchiger Therapie eine massgebliche Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase festgestellt werden, während bei den Patienten der Placebogruppe keine signifikante Änderung der Aktivität der
Placebogruppe
Abbildung 14:
Aktivitätszunahme der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Zeitverlauf bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Placebobehandlung
Abbildung 15:
Gesamtaktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Placebobehandlung
endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Blutplasma zu beobachten war (siehe Abbildungen 15 und 17).
Losartangruppe
Abbildung 16:
Aktivitätszunahme der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Zeitverlauf bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Behandlung mit Losartan
Abbildung 17:
Gesamtaktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Behandlung mit Losartan
Auch bei der Allopurinolgruppe war nach vierwöchiger Therapie mit dem XO- Inhibitor Allopurinol eine signifikante Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase messbar, die hinsichtlich der Aktivitätsminderung mit den bei den Patienten der Losartangruppe erhobenen Befunden vergleichbar war (siehe Abbildungen 18 und 19).
Allopurinolgruppe
Abbildung 18:
Aktivitätszunahme der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Zeitverlauf bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Behandlung mit Allopurinol
3.2.2 Effekt von Losartan (2x50mg/d) und von Allopurinol (2x300mg/d) auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation
Um den Einfluss der vierwöchigen Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan bzw. dem XO-Inhibitor Allopurinol auf die Endothelfunktion der KHK- Patienten darstellen zu können, wurde die FDD der A. radialis vor Therapiebeginn und nach der vierwöchigen Therapie - jeweils unter basalen Bedingungen und nach einer Kurzinfusion des XO-Inhibitors Oxypurinol - untersucht (siehe auch Methodikteil). Es zeigte sich hierbei, dass die Kurzinfusion des XO-Inhibitors Oxypurinol (600 µg/min für 10 min) bei diesen Studienteilnehmern zum Messzeitpunkt vor Therapiebeginn zu einer signifikanten Verbesserung des basalen FDD-Wertes führte (siehe Abbildung 20).
Dabei ist zu erwähnen, dass die Oxypurinol-Kurzinfusion keinen Einfluss auf den basalen Arteriendurchmesser der A. radialis (3.03+0.10 vs.3.04+0.11 mm, P n.s.), den Unterarmblutfluss in Ruhe (Oxypurinol versus Kontrolle, 28.9+2.1 vs. 26.9 +1.6 ml/min) und die maximale reaktive Hyperaemie hatte (84.3+7.8 vs. 85.7 +9.1 ml/min-1). Des weiteren hatte die Oxypurinol-Kurzinfusion keinen Einfluss auf die endothelunabhängige Vasodilatation nach Infusion von Nitroprussid-Natrium (19.7+1.3 vs. 20.6+1.2%; P=n.s.; n=9). Anhand dieser Befunde kann davon ausgegangen werden, dass die Oxypurinol-Kurzinfusion die FDD über einen spezifischen Wirkmechanismus verbesserte.
Zum Zeitpunkt der zweiten Messung am Ende der vierwöchigen Studie konnte die bedeutsame Beobachtung gemacht werden, dass sich die basale FDD bei den Patienten in der Losartangruppe signifikant verbessert hatte. Bei den
Studienteilnehmern der Placebogruppe waren demgegenüber keine signifikanten Unterschiede bei der basalen FDD feststellbar.
Bemerkenswerterweise zeigte die Oxypurinol-Kurzinfusion bei den Patienten in der Losartangruppe nur noch eine gering ausgeprägte weitere Verbesserung der FDD, während bei den Patienten der Placebogruppe durch eine Oxypurinol- Kurzinfusion nach wie vor eine deutliche Verbesserung der FDD erreicht werden konnte (siehe Abbildung 21).
Abbildung 20:
Einfluss der vierwöchigen Placebobehandlung auf die FDD bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit vor und nach Oxypurinol-Kurzinfusion
Placebogruppe
Auch bei den Studienteilnehmern der Allopurinolgruppe wurde die FDD vor und nach vierwöchiger Therapie mit dem spezifischem XO-Inhibitor Allopurinol gemessen sowie der Einfluss der Oxypurinol-Kurzinfusion auf die FDD bestimmt. Es zeigte sich dabei eine signifikante Verbesserung der basalen FDD nach vierwöchiger Therapiedauer. Ein weiterer wichtiger Befund war, dass sich bei der Allopurinolgruppe nach vierwöchiger XO-Inhibition praktisch keine zusätzliche Verbesserung der FDD nach Oxypurinol-Kurzinfusion zeigte (siehe Abbildung 22). Dies kann im Sinne einer fast vollständigen Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase nach vierwöchiger Allopurinoltherapie gedeutet werden.
Abbildung 21:
Einfluss der vierwöchigen Therapie mit Losartan auf die FDD bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit vor und nach Oxypurinol-Kurzinfusion
Losartangruppe
Vergleicht man nun anhand dieser Befunde die Therapien mit Losartan bzw.
Allopurinol hinsichtlich des Ausmasses der Verbesserung der FDD nach vierwöchiger Therapie, läßt sich feststellen, dass Losartan einen ausgeprägteren positiven Effekt auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation hatte als Allopurinol (∆FDD Losartan 5.5+1.1 vs. ∆FDD Allopurinol 3.1+0.5% P<0.05).
Abbildung 22:
Einfluss der vierwöchigen Therapie mit Allopurinol auf die FDD bei Patienten mit KHK vor und nach Oxypurinol-Kurzinfusion
Allopurinolgruppe
4 Diskussion
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führen zu vier wichtigen Beobachtungen:
1. Angiotensin II (Ang II) induziert sowohl in bovinen als auch in humanen Endothelzellen eine deutliche Steigerung der durch die endotheliale Xanthin- Oxidase (eXO) vermittelten Superoxidproduktion.
2. Sowohl die durch Angiotensin II induzierte Steigerung der Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase, als auch die erhöhte endotheliale Superoxidproduktion durch die endotheliale Xanthin-Oxidase sind von der Aktivität der NAD(P)H-Oxidase abhängig, da eine Inhibition der NAD(P)H- Oxidase zu einer deutlichen Aktivitätsminderung der endothelialen Xanthin- Oxidase führt.
3. Die vierwöchige Therapie sowohl mit Losartan als auch mit Allopurinol führt in vivo bei Patienten mit KHK zu einer deutlichen Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase.
4. Die vierwöchige Therapie sowohl mit Losartan als auch mit Allopurinol führt bei Patienten mit KHK zu einer signifikanten Verbesserung der FDD, wobei die Wirkung von Losartan auf die FDD etwas ausgeprägter ist als die von Allopurinol. Dies spricht für eine Beteiligung weiterer Faktoren am positiven Einfluß der AT1-Rezeptorblockade auf die FDD, die über die alleinige Wirkung der Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase hinausgeht.
In aktuellen Studien konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte vaskuläre Produktion freier Sauerstoffradikale (ROS, reaktive Sauerstoffspezies) sowohl zu einer vorzeitigen Inaktivierung des vasodilatierend wirkenden Stickstoffmonoxids (NO) als auch zu einer direkten Schädigung des Endothels führen kann [13]. Dieser Vorgang trägt entscheidend zu der Entstehung einer endothelialen Dysfunktion bei und kann im weiteren Verlauf zur Entstehung und Progression von Atherosklerose und koronarer Herzkrankheit führen [49].
Das Ausmaß der so entstehenden endothelialen Dysfunktion lässt sich durch Messung der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation (FDD) zuverlässig bestimmen und besitzt bei Patienten mit KHK und kardiovaskulären Risikofaktoren eine wichtige prognostische Ausagekraft, da eine reduzierte FDD mit dem gehäuften Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse korreliert ist [50]. Aus diesem Grund ist das Verständnis der zu einer gesteigerten vaskulären Produktion von ROS und zum Fortschreiten der endothelialen Dysfunktion führenden Mechanismen von großer Bedeutung, um die pathologisch gesteigerte vaskuläre Superoxidproduktion und die dadurch verursachte endotheliale Dysfunktion effektiv therapieren zu können.
Eine wichtige Quelle der für die vorzeitige Inaktivierung von NO verantwortlichen freien Sauerstoffradikale (reaktive Sauerstoff Spezies, ROS) stellen vor allem vaskulär exprimierte Oxidasen dar. Diese Oxidasen zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, Elektronen direkt auf molekularen Sauerstoff übertragen zu können, was zur Entstehung von ROS führt [13, 19].
Die drei wichtigsten Vertreter dieser Enzymgruppe sind die endotheliale Xanthin-Oxidase (eXO), die NAD(P)H-Oxidase und die NO-Synthase (eNOS) in ihrer entkoppelten Form, deren Rolle im kardiovaskulären System momentan im
gezeigt, dass insbesondere die endotheliale Xanthin-Oxidase eine bedeutsame Quelle der vaskulären Superoxidproduktion bei der Atherosklerose darstellt [16, 46, 52].
Einen ersten Anhaltspunkt für die These, dass eine durch die erhöhte Aktivität der Xanthin-Oxidase verursachte gesteigerte Superoxidproduktion zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von freiem NO führt, konnte durch eine Studie mit spontan hypertensiven Ratten gewonnen werden. In dieser Studie führte sowohl die Behandlung mit Superoxid-Dismutase (ecSOD), als auch die Therapie mit Oxypurinol als spezifischem Inhibitor der eXO zu einer deutlichen Reduktion des Blutdruckes [25].
Des weiteren konnten White et al. zeigen, dass die Therapie mit dem eXO- Inhibitor Allopurinol bzw. seines Metaboliten Oxypurinol bei hypercholesterolämischen Kaninchen zu einer deutlich verminderten vaskulären Superoxidproduktion und einer verbesserten endothelvermittelten Vasodilatation führte [46, 52].
Immer mehr Studien sprechen dafür, dass diese Beobachtungen auch auf den menschlichen Organismus übertragbar sind. So konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren oder chronischer Herzinsuffizienz zu einer signifikanten Verbesserung der FDD führt [25-28]. Darüberhinaus wurde kürzlich bei Patienten mit KHK, Carotisstenose oder Herzinsuffizienz eine deutlich erhöhte Aktivität der eXO nachgewiesen, welche zudem eine negative Korrelation mit der FDD als Marker der endothelialen Dysfunktion aufwies [7, 22-24, 30].
Für eine Beteiligung der eXO an der Atherogenese und der endothelialen Dysfunktion spricht auch, dass in Gewebeproben humaner atherosklerotischer
