Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führen zu vier wichtigen Beobachtungen:
1. Angiotensin II (Ang II) induziert sowohl in bovinen als auch in humanen Endothelzellen eine deutliche Steigerung der durch die endotheliale Xanthin-Oxidase (eXO) vermittelten Superoxidproduktion.
2. Sowohl die durch Angiotensin II induzierte Steigerung der Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase, als auch die erhöhte endotheliale Superoxidproduktion durch die endotheliale Xanthin-Oxidase sind von der Aktivität der Oxidase abhängig, da eine Inhibition der NAD(P)H-Oxidase zu einer deutlichen Aktivitätsminderung der endothelialen Xanthin-Oxidase führt.
3. Die vierwöchige Therapie sowohl mit Losartan als auch mit Allopurinol führt in vivo bei Patienten mit KHK zu einer deutlichen Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase.
4. Die vierwöchige Therapie sowohl mit Losartan als auch mit Allopurinol führt bei Patienten mit KHK zu einer signifikanten Verbesserung der FDD, wobei die Wirkung von Losartan auf die FDD etwas ausgeprägter ist als die von Allopurinol. Dies spricht für eine Beteiligung weiterer Faktoren am positiven Einfluß der AT1-Rezeptorblockade auf die FDD, die über die alleinige Wirkung der Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase hinausgeht.
In aktuellen Studien konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte vaskuläre Produktion freier Sauerstoffradikale (ROS, reaktive Sauerstoffspezies) sowohl zu einer vorzeitigen Inaktivierung des vasodilatierend wirkenden Stickstoffmonoxids (NO) als auch zu einer direkten Schädigung des Endothels führen kann [13]. Dieser Vorgang trägt entscheidend zu der Entstehung einer endothelialen Dysfunktion bei und kann im weiteren Verlauf zur Entstehung und Progression von Atherosklerose und koronarer Herzkrankheit führen [49].
Das Ausmaß der so entstehenden endothelialen Dysfunktion lässt sich durch Messung der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation (FDD) zuverlässig bestimmen und besitzt bei Patienten mit KHK und kardiovaskulären Risikofaktoren eine wichtige prognostische Ausagekraft, da eine reduzierte FDD mit dem gehäuften Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse korreliert ist [50]. Aus diesem Grund ist das Verständnis der zu einer gesteigerten vaskulären Produktion von ROS und zum Fortschreiten der endothelialen Dysfunktion führenden Mechanismen von großer Bedeutung, um die pathologisch gesteigerte vaskuläre Superoxidproduktion und die dadurch verursachte endotheliale Dysfunktion effektiv therapieren zu können.
Eine wichtige Quelle der für die vorzeitige Inaktivierung von NO verantwortlichen freien Sauerstoffradikale (reaktive Sauerstoff Spezies, ROS) stellen vor allem vaskulär exprimierte Oxidasen dar. Diese Oxidasen zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, Elektronen direkt auf molekularen Sauerstoff übertragen zu können, was zur Entstehung von ROS führt [13, 19].
Die drei wichtigsten Vertreter dieser Enzymgruppe sind die endotheliale Xanthin-Oxidase (eXO), die NAD(P)H-Oxidase und die NO-Synthase (eNOS) in ihrer entkoppelten Form, deren Rolle im kardiovaskulären System momentan im
gezeigt, dass insbesondere die endotheliale Xanthin-Oxidase eine bedeutsame Quelle der vaskulären Superoxidproduktion bei der Atherosklerose darstellt [16, 46, 52].
Einen ersten Anhaltspunkt für die These, dass eine durch die erhöhte Aktivität der Xanthin-Oxidase verursachte gesteigerte Superoxidproduktion zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von freiem NO führt, konnte durch eine Studie mit spontan hypertensiven Ratten gewonnen werden. In dieser Studie führte sowohl die Behandlung mit Superoxid-Dismutase (ecSOD), als auch die Therapie mit Oxypurinol als spezifischem Inhibitor der eXO zu einer deutlichen Reduktion des Blutdruckes [25].
Des weiteren konnten White et al. zeigen, dass die Therapie mit dem eXO-Inhibitor Allopurinol bzw. seines Metaboliten Oxypurinol bei hypercholesterolämischen Kaninchen zu einer deutlich verminderten vaskulären Superoxidproduktion und einer verbesserten endothelvermittelten Vasodilatation führte [46, 52].
Immer mehr Studien sprechen dafür, dass diese Beobachtungen auch auf den menschlichen Organismus übertragbar sind. So konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren oder chronischer Herzinsuffizienz zu einer signifikanten Verbesserung der FDD führt [25-28]. Darüberhinaus wurde kürzlich bei Patienten mit KHK, Carotisstenose oder Herzinsuffizienz eine deutlich erhöhte Aktivität der eXO nachgewiesen, welche zudem eine negative Korrelation mit der FDD als Marker der endothelialen Dysfunktion aufwies [7, 22-24, 30].
Für eine Beteiligung der eXO an der Atherogenese und der endothelialen Dysfunktion spricht auch, dass in Gewebeproben humaner atherosklerotischer
Läsionen eine deutlich erhöhte Konzentration der XO und der NAD(P)H-Oxidase gemessen wurde [21, 35]. Zuletzt bleibt zu erwähnen, dass auch die Höhe des Harnsäurespiegels im Serum als Produkt der eXO als prognostischer Marker der kardiovaskulären Mortalität angesehen werden kann [53-55].
In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass die Stimulation von bovinen und humanen aortalen Endothelzellen mit Angiotensin II (10-7mol/l) zu einer starken Erhöhung der Proteinexpression der eXO führt. Ebenfalls konnte bei diesen Zellen mittels ESR-Spektroskopie eine maßgebliche Steigerung der endothelialen Superoxidproduktion nachgewiesen werden, welche jedoch nach Applikation zweier strukturell unterschiedlicher Inhibitoren der eXO nicht mehr zu beobachten war. Diese Beobachtungen sprechen für eine maßgebliche Beteiligung der eXO an der gesteigerten endothelialen Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II.
Hinsichtlich des Wirkmechanismusses, über den die Stimulation mit Angiotensin II zu einer verstärkten Aktivierung der eXO führt, konnte gezeigt werden, dass der durch Angiotensin II auf die Endothelzellen ausgeübte Effekt über den AT1 -Rezeptor vermittelt wird, da bei einer Blockade des AT1-Rezeptors mittels des spezifischen AT1-Rezeptorblockers Losartan nach Stimulation mit Angiotensin II weder ein signifikanter Anstieg der Proteinexpression der eXO, noch der endothelialen Superoxidproduktion beobachtet werden konnte. Dahingegen führte eine Rezptorblockade des AT2-Rezeptorsubtyps mittels PD 123319 weder zu einer signifikanten Hemmung der nach Stimulation mit Angiotensin II beobachteten gesteigerten Proteinexpression der eXO, noch der dadurch vermittelten gesteigerten endothelialen Superoxidproduktion.
Des weiteren konnte gezeigt werden, dass für die durch Angiotensin II induzierte Aktivierung der eXO eine Aktivierung der NAD(P)H-Oxidase erforderlich ist. Einen ersten Anhaltspunkt für diese Vermutung lieferte eine von McNally et al. veröffentlichte Studie, in der gezeigt wurde, dass in murinen Endothelzellen, denen die p47-phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase fehlte, die Proteinexpression der eXO reduziert war [21, 56].
In der vorliegenden Studie wird ein neuer Signalweg beschrieben, bei dem die NAD(P)H-Oxidase in mit Angiotensin II stimulierten Zellen die endotheliale Xanthin-Oxidase über einen redox-sensitiven Mechanismus aktiviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Stimulation mit Angiotensin II nach gezielter Inhibition der NAD(P)H-Oxidase mit dem spezifischen Hemmstoff Apocynin wie auch mittels gegen die p47phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase gerichteter siRNA weder zu einer erhöhten Proteinexpression der eXO noch zu einer gesteigerten vaskulären Superoxidproduktion führt [21, 57, 58]. Diese Befunde sprechen für eine massgebliche Beteiligung der NAD(P)H-Oxidase an der Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase in mit Angiotensin II stimulierten Endothelzellen.
Des weiteren gibt es zunehmend Hinweise dafür, dass auch Wasserstoffperoxid (H2O2) und Peroxynitrit an einer Steigerung der vaskulären Superoxidproduktion beteiligt sind [59, 60]. Angesichts dieser Beobachtungen wurde untersucht, welchen Einfluss Peroxynitrit und Wasserstoffperoxid auf die Aktivierung der eXO in mit Angiotensin II stimulierten Zellen haben. Es zeigte sich, dass nach Behandlung mit dem spezifischen Hemmstoff der NO-Synthase L-NAME(10
-6mol/l) sowie mit dem H2O2 abbauenden Enzym Catalase (4000 Units/ml) jeweils nur ein geringerer Anstieg der Proteinexpression der eXO nach Stimulation mit Angiotensin II zu beobachten war. Diese Ergebnisse
unterstützen die These, dass auch Wasserstoffperoxyd und Peroxynitrit an der durch Angiotensin II induzierten Steigerung der eXO-Proteinexpression beteiligt sind.
Da die zunächst an bovinen Zellen durchgeführten Untersuchungen auch bei der Verwendung humaner aortaler Endothelzellen vergleichbare Ergebnisse lieferten, wurde schließlich eine klinische Studie durchgeführt, bei der auch die klinische Relevanz der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der eXO für Patienten mit koronarer Herzkrankheit in vivo untersucht werden sollte.
Hierzu wurde bei KHK-Patienten zunächst der Einfluss einer über einen Zeitraum von vier Wochen durchgeführten Therapie mit dem AT1 -Rezeptorblocker Losartan auf die mittels ESR-Spektroskopie bestimmte Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Blutplasma untersucht.
Dabei zeigte sich, dass die vierwöchige Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan (2x 50mg/d) zu einer signifikanten Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase führte, während in einer Placebogruppe keine signifikanten Änderungen der eXO-Aktivität beobachtet wurden.
Weiterhin wurde eine Gruppe von KHK-Patienten für vier Wochen mit dem spezifischen eXO-Inhibitor Allopurinol (2x 300mg/d) behandelt. Auch bei dieser Patientengruppe konnte eine Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase festgestellt werden. Diese Beobachtungen sprechen für die Annahme, dass sowohl die direkte eXO-Inhibition mittels Allopurinol als auch die AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan bei KHK-Patienten in vergleichbarem Ausmaß zu einer maßgeblichen Reduktion der plasmatischen Aktivität der eXO führt. Dies spricht wiederum dafür, dass Angiotensin II durch Aktivierung der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase auch beim Menschen
Herzkrankheit spielt. Angesichts dieser Beobachtungen lässt sich die Aussage treffen, dass die AT1-Rezeptorblockade über eine Verminderung der Aktivität der eXO einen wirksamen Mechanismus zur Reduktion des vaskulären oxidativen Stresses und der endothelialen Dysfunktion bei dieser Patientengruppe darstellen kann.
Um diese Aussage weiter belegen zu können, wurde bei der klinischen Studie auch der Einfluss der AT1-Rezeptorblockade mit Losartan sowie der eXO-Inhibition mittels Allopurinol auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilation (FDD) untersucht. Die FDD stellt einen zuverlässigen klinischen Marker für die endotheliale Dysfunktion dar und besitzt eine wichtige prognostische Bedeutung für das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse [7, 39, 50].
Als Ergebnis führte die vierwöchige Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan bei den KHK-Patienten zu einer signifikanten Verbesserung der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation (FDD). Es ist weiterhin hervorzuheben, dass auch die akute Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase mit einer Oxypurinol-Kurzinfusion vor Therapiebeginn zu einer deutlichen Verbesserung der basalen FDD-Werte führte. Nach vierwöchiger AT1-Rezeptorblockade führte die Kurzinfusion von Oxypurinol bemerkenswerterweise jedoch nicht mehr zu einer signifikanten Verbesserung der FDD.
Auch diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Angiotensin II kritisch an der durch die endothelgebundene Xanthin-Oxidase vermittelten endothelialen Dysfunktion bei Patienten mit KHK beteiligt ist. Es ist davon auszugehen, dass durch die chronische AT1-Blockade die FDD zumindest zu einem Teil dadurch
verbessert wurde, dass die Aktivität der eXO bereits zuvor durch die langfristige AT1-Blockade deutlich reduziert wurde womit der akute Effekt der direkten Hemmung der eXO durch Oxypurinol im Vergleich zum Therapiebeginn deutlich abgenommen hat. Diese Aussage wird durch die Befunde der Allopurinol-Gruppe weiter unterstützt, da sich auch hier eine mit der Losartanwirkung vergleichbare, jedoch etwas geringer ausgeprägte Wirkung auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation der KHK-Patienten beobachten ließ.
Angesichts der Tatsache, dass bei diesen beiden Patientengruppen eine vergleichbar starke Aktivitätsminderung der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase festgestellt werden konnte, spricht dies auch für eine Beteiligung weiterer Faktoren an der positiven Wirkung der AT1-Rezeptorblockade auf die FDD, die über die reine Inhibition der eXO hinausgeht, welche bereits durch die Gabe von Allopurinol erreicht werden konnte [51]. Als weitere Faktoren, durch die sich eine AT1-Rezeptorblockade positiv auf die FDD auswirkt, kommen eine Reduktion der durch die NAD(P)H-Oxidase vermittelten endotheliale Superoxidproduktion, ein verstärkter Abbau von Superoxidradikalen durch die ecSOD, sowie eine verstärkte Aktivierung der AT2 - Rezeptorsubtypen nach vollständiger Blockade der AT1-Rezeptoren in Frage. Der Einfluss derartiger Faktoren müsste in Folgestudien genauer untersucht werden [7, 12, 34, 61].
Einen Anhaltspunkt hierfür liefert diesbezüglich eine kürzlich veröffentlichte tierexperimentelle Studie, bei der Oak et al. nachweisen konnten, dass durch die AT1-Rezeptorblockade ein verstärktes Recoupling der endothelialen NO-Synthase (eNOS) erreicht wird. Dabei führte die gesteigerte Umwandlung der peroxynitritproduzierenden entkoppelten Form der eNOS zu ihrer
ursprünglichen Form zu einer verminderten vaskulären ROS-Produktion und einem erhöhtem Angebot von freiem NO [51].
Sowohl nach AT1-Blockade, als auch nach Inhibition der eXO ist in vielen aktuellen Studien eine deutliche Reduktion des vaskulären oxidativen Stresses und eine Verbesserung der endothelialen Dysfunktion gezeigt worden [35, 46, 52, 58, 62, 63].
So konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase auch bei Patienten mit Hypercholesterinämie zu einer Verbesserung der Endothelfunktion führt [62]. Bei dieser Patientengruppe konnte außerdem eine gesteigerte Aktivität des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS), und eine erhöhte Dichte der AT1-Rezeptorexpression nachgewiesen werden [62, 64]. Eine pathologisch erhöhte Aktivität des RAAS wurde auch bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz nachgewiesen, bei denen eine Inhibition der eXO ebenfalls zu einer signifikanten Verbesserung der Endothelfunktion führte [25, 26].
Die in der vorliegenden Studie gewonnenen Daten könnten auch einen Ansatz zur Konsolidierung des scheinbaren Missverhältnisses liefern, dass sowohl die AT1-Blockade als auch die Inhibition der eXO [46, 52] und der NAD(P)H-Oxidase [21, 59, 65] jeweils zu einer Verbesserung der Endothelfunktion führen.
Hierfür kann ein redoxsensitives Modell formuliert werden, bei dem die durch Angiotensin II über den AT1-Rezeptor induzierte Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase über die NAD(P)H-Oxidase moduliert wird (siehe Abbildung 23)[14].
Anhand der Tatsache, dass die Aktivierung der NAD(P)H-Oxidase für die Aktivität der endothelialen Xanthin-Oxidase von essentieller Bedeutung zu sein scheint, kann die NAD(P)H-Oxidase als übergeordnete Kontroll-Oxidase der
eXO angesehen werden. So führte die Inhibition der NAD(P)H-Oxidase sowohl zu einer deutlichen Aktivitätsminderung der durch die endotheliale Xanthin-Oxidase vermittelten Superoxidproduktion als auch zu einer verminderten eXO-Proteinexpression [56].
Wenn man die NAD(P)H-Oxidase als Kontrollorgan der gesteigerten Superoxidproduktion ansehen würde, stellt die endotheliale Xanthin-Oxidase gewissermaßen den ausführenden Teil dieser in Reihe geschalteten Enzymkaskade dar, die vor allem für die Produktion von Superoxidradikalen verantwortlich zu sein scheint [14, 57, 66].
Es ist jedoch davon auszugehen, dass die Aktivierung der superoxidproduzierenden Enzymsysteme nicht von einem einzelnen Mediator Abbildung 23:
Schematische Darstellung des erarbeiteten Modells für die redoxsensitive Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase durch Angiotensin II
Superoxidproduktion steuernden Kräfte als komplexes Zusammenspiel der verschiedenen Oxidasen und ihrer Modulatoren angesehen werden, welches ständig im Fluss ist und von einer Vielzahl externer Faktoren beeinflussbar ist.
Es ist bekannt, dass alle hier betrachteten Enzyme in der Lage sind sowohl selbst ROS zu produzieren, aber auch selbst durch ROS in ihrer Aktivität gesteigert werden zu können [4, 14, 59, 66]. So hat sich gezeigt, dass bereits durch kurzzeitige Stimulation mit geringen Mengen von ROS eine langanhaltende Superoxidproduktion verursacht werden kann, die selbst dann noch aufrechterhalten wird, nachdem der eigentliche Reiz schon lange nicht mehr gegenwärtig ist [66]. Diese Beobachtungen lassen sich als eine Art feed-forward-Mechanismus deuten, bei dem die von einem Enzym produzierten ROS ein anderes Enzym zur eigenständigen Produktion von ROS anregen können, wobei das Gleichgewicht zwischen pro- und antioxidativen Faktoren in Richtung eines prooxidativen Hintergrundes verschoben werden kann [31, 66].
Als Beispiele wären hier zu nennen, dass von der endothelialen Xanthin-Oxidase oder der NAD(P)H-Xanthin-Oxidase produziertes H2O2 oder O- in der Lage sind, die Umwandlung von XDH zu XO zu verstärken und so die Superoxidproduktion weiter angeregt werden kann [21, 59, 66]. Des weiteren ist die eNOS zu nennen, welche durch die Produktion von NO einen starken antioxidativen und vasoprotektiven Effekt ausübt. Kommt es aber durch von der endothelialen Xanthin-Oxidase oder NAD(P)H-Oxidase produzierte ROS zu einer verstärkten Oxidierung und somit Inaktivierung von Tetrahydrobiopterin als Kofaktor der endothelialen NO-Synthase, führt dies zu einer Entkopplung der eNOS, mit dem Ergebnis, dass diese von nun an Peroxynitrit produziert [51,67-69]. Aufgrund dieser Möglichkeit zum Wechsel des Kopplungsstatus kommt der eNOS eine entscheidende Rolle als Modulator der beiden anderen
Oxidasen zu. So führt eine Entkopplung der eNOS nicht nur zu einer Produktion von Peroxynitrit, als auch zu einer verminderten Produktion von NO als stark antioxidativem Faktor, welcher wiederherum in der Lage ist, die endotheliale Xanthin-Oxidase und die NAD(P)H-Oxidase direkt zu inhibieren [19, 70-72].
Bei einem langanhaltendem Überwiegen der prooxidativen Faktoren kann es so denkbarerweise auch zu einem oxidativen circulus vitiosus kommen, bei dem die aufgrund von fehlenden antioxidativen Faktoren verstärkt produzierten ROS die Superoxidproduktion eigenständig chronisch aufrechterhalten können und so zu einem prooxidativem Milieu mit den entsprechenden Folgeschäden führen [31,73]. Im Gegenzug dazu bieten diese kürzlich gemachten Beobachtungen einen Anhaltspunkt dafür, dass durch eine chronische AT1 -Blockade ein starker antioxidativer Effekt ausgeübt wird, durch den wiederum das vaskuläre oxidative Gleichgewicht in eine antioxidative Richtung verschoben werden kann [12, 51].
Abschließend ist folgendes anzumerken: Als eine potentielle Limitation dieser Arbeit ließe sich die geringe Größe der im klinischen Teil dieser Studie verwendeten Placebogruppe ansehen. Die Erklärung für die geringe Größe der Placebogruppe ist die Tatsache, dass anhand der neuen ESC-Richtlinien der Einsatz eines ACE-Hemmers zur Behandlung von Patienten mit KHK eindeutig empfohlen wird, so dass - in Absprache mit unserer Ethikkomission - von einem Einschluss weiterer Patienten in die Placebogruppe abgesehen wurde. Es bleibt jedoch zu betonen, dass die durchgeführten Messungen zur Bestimmung der Aktivität der endothelialen Xanthin-Oxidase mittels ESR-Spektroskopie zu einer Vielzahl von Zeitpunkten nach der Heparin-Bolusinjektion durchgeführt wurden und dass diese Messmethode eine besonders hohe Genauigkeit besitzt.
Des weiteren war diese Studie nicht darauf angelegt, den Einfluss einer Losartan-Therapie auf die Höhe der Harnsäure-Spiegel im Blut zu untersuchen, welche als Produkt der Xanthin-Oxidase eine prognostische Aussagekraft bezüglich des Auftretens kardiovaskulärer Ereignisse besitzen könnte. In einer kürzlich durchgeführten Analyse der Ergebnisse der LIFE-Studie konnte gezeigt werden, dass bei den Studienteilnehmern, die für 4.8 Jahre mit Losartan behandelt worden waren, ein geringerer Anstieg des Harnsäurespiegels beobachtet wurde, als bei den Patienten in der Atenolol-Gruppe. Es wird momentan angenommen, dass dieser Unterschied über einen längerfristigen Zeitraum für über 29 Prozent des primären Behandlungseffektes mit Losartan verantwortlich ist [74]. Anhand dieser Überlegungen ließe sich weiterhin die Einschätzung geben, dass die Losartantherapie nicht nur durch die bekannte urikosurische Wirkung des Losartans selbst, sondern auch durch die Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase durch die AT1-Rezeptorblockade langfristig dazu beitragen kann, einen Anstieg des Harnsäurespiegels im Serum zu reduzieren.