3 ERGEBNISSE
3.1 Ergebnisse in vitro
3.1.2 Effekt von Angiotensin II auf die endotheliale Superoxidproduktion
Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase auch zu einer signifikanten Steigerung der endothelialen Superoxidproduktion bei vergleichbarem Zeitverlauf (siehe Abbildung 7). Dies konnte mit Hilfe der ESR-Spektroskopie (Elektronenspinresonanz-ESR-Spektroskopie) nachgewiesen werden.
Bei der ESR-Messmethode wird die Umwandlung der als Radikalfänger fungierenden Chemikalie CP-H (1-hydroxy-3-carboxy-pyrrolidine), dem so genannten spin trap, von der reduzierten in eine oxidierte Form CP-°
(paramagnetisches 3-carboxy-proxyl) registriert. Dass es sich bei den nachgewiesenen Radikalen zum größten Teil um Superoxidradikale handelt, konnte dadurch gezeigt werden, dass durch Zugabe von 350 Einheiten PEG-SOD (polyethyleneglycol-superoxide dismutase) die Oxidation des CP-H zum größten Teil verhindert werden konnte.
Abbildung 6:
Einfluss von Angiotensin II (10-7 mol/l) auf die Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase, n=3-7
3.1.3 Effekt der Inhibition der endothelialen Xanthin-Oxidase mit Oxypurinol und Tungsten
Zur genaueren Bestimmung des Ursprungs der durch Stimulation mit Angiotensin II gesteigerten endothelialen Superoxidproduktion wurden weitere Versuchsreihen mit spezifischen Inhibitoren verschiedener potentiell an der gesteigerten Produktion von ROS beteiligten Enzyme durchgeführt. Als wichtiger Befund zeigte sich, dass durch den Einsatz zweier strukturell unterschiedlicher spezifischer Inhibitoren der eXO, nämlich Oxypurinol und Tungsten (Wolfram-Natrium-Komplex), eine deutliche Reduktion der durch Stimulation mit Angiotensin II induzierbaren Superoxidproduktion zu erreichen war (Abbildung 8).
Diese Beobachtungen unterstützen die Ansicht, dass die eXO als bedeutsamer Produzent von ROS einen massgeblichen Anteil an der durch Angiotensin II Abbildung 7:
Einfluss der Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l) auf die mittels ESR-Spektroskopie (spin trap: CP-H) bestimmte endotheliale Superoxidproduktion im Zeitverlauf, n=4-8
3.1.4 Rolle des Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyps 1 (AT1)
Zunächst konnte mit Hilfe des WesternBlot - Analyseverfahrens demonstriert werden, dass die verwendeten Endothelzellen den AT1-Rezeptor exprimieren.
Anschließend wurden die Endothelzellen 12 Stunden vor Stimulation mit Abbildung 8:
Einfluss von Oxypurinol (10-6 mol/l) und Tungsten (10-6 mol/l) als strukturell unterschiedlichen Inhibitoren der endothelialen Xanthin-Oxidase auf die mittels ESR-Spektroskopie bestimmte endotheliale Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7mol/l),n=6-9
Angiotensin II mit jeweils einem Rezeptorblocker der AT1- und AT2 -Rezeptorsubtypen behandelt.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Behandlung der mit Angiotensin II stimulierten Endothelzellen mit dem für den AT1-Rezeptor spezifischen Hemmstoff Losartan (10-6 mol/l) zu einer fast vollständigen Hemmung sowohl der Superoxidproduktion in der ESR-Messung als auch der gesteigerten Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase im WesternBlot führte.
Die Tatsache, dass der gleiche Versuchsaufbau mit dem für den AT2-Rezeptor spezifischem Hemmstoff PD123319 (10–7 mol/l) zu keiner signifikanten Hemmung der Superoxidproduktion oder XO-Proteinexpression führte, spricht für die Annahme, dass der durch Angiotensin II induzierte Effekt über den AT1 -Rezeptor vermittelt wird (siehe Abbildungen 9 und 10) .
Abbildung 9:
Einfluss des AT1-Rezeptorblockers Losartan (10-6 mol/l) und des AT2 -Rezeptorblockers PD 123319 (10-7 mol/l) auf die Proteinexpression der
3.1.5 Bedeutung der NAD(P)H-Oxidase für die durch Angiotensin II induzierte Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase
Es wurde der Einfluß der NAD(P)H-Oxidase auf die endotheliale Xanthin-Oxidase überprüft, indem die NAD(P)H-Xanthin-Oxidase der verwendeten Endothelzellen auf zwei unterschiedliche Arten inhibiert wurde, um so deren Einfluß auf die durch Angiotensin II vermittelte Aktivierung der eXO und auf die endotheliale Superoxidproduktion bestimmen zu können.
Zur Inhibition der NAD(P)H-Oxidase wurde zum einen der spezifische Hemmstoff Apocynin in einer Konzentration von 600 µmol/l verwendet, zum anderen gegen die p47phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase gerichtete spezifische siRNA (small interfering RNA). Bei beiden Versuchsansätzen konnte gezeigt werden, dass durch die Hemmung der NAD(P)H-Oxidase sowohl der Anstieg Superoxidproduktion (ermittelt mittels
ESR-Abbildung 10:
Einfluss des AT1-Rezeptorblockers Losartan (10-6 mol/l) und des AT2 -Rezeptorblockers PD 123319 (10-7 mol/l) auf die endotheliale Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-6
Spektroskopiemessung), als auch der Proteinexpression der eXO (im Western-Analyseverfahren bestimmt) nach Stimulation mit Angiotensin II fast vollständig inhibiert werden konnte (siehe Abbildung 11 und 12).
Diese Beobachtungen unterstützen die Annahme, dass die NAD(P)H-Oxidase maßgeblich an der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der eXO beteiligt ist.
Abbildung 11 :
Einfluss der Inhibition der NAD(P)H-Oxidase mittels Apocynin (600 µmol/l) und siRNA auf die Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-8
3.1.6 Rolle von Wasserstoffperoxid und Peroxynitrit
In vorausgegangenen Versuchsreihen konnte bereits beobachtet werden, dass durch Behandlung der mit Angiotensin II stimulierten Zellen mit PEG-Superoxid-Dismutase der Anstieg der endothelialen Superoxidproduktion zu einem massgeblichen Anteil reduziert werden konnte. Um die Mechanismen der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase weiter differenzieren zu können, wurde der Einfluss weiterer antioxidativ wirksamer Substanzen, sowie auch der Einfluss spezifischer Inhibitoren von endothelial exprimierten Enzymsystemen auf die Proteinexpression der eXO untersucht.
Verwendet wurden hierfür die PEG-Superoxid-Dismutase (350 Units/ml), das antioxidativ wirksame N-Acetylcystein (NAC, 10-6mol/l), Catalase (4000 Abbildung 12:
Einfluss der Inhibition der NAD(P)H-Oxidase mittels Apocynin (600µmol/l) und siRNA auf die endotheliale Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-8
Units/ml) als abbauendes Enzym von Wasserstoffperoxid (H2O2) sowie L- NAME (Nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride, 10-6mol/l) als spezifischer Inhibitor der NO-Synthase.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen eine signifikante Reduktion der Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase durch Angiotensin II vor allem durch Catalase und L-NAME (siehe Abbildung 13). Das lässt darauf schließen, dass sowohl Wasserstoffperoxid als auch Peroxynitrit an der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der eXO beteiligt sein müssen [47].
Reproduzierbarkeit der bisherigen Befunde mit humanen Endothelzellen
Um ausschließen zu können, dass der beobachtete Effekt von Angiotensin II auf die endotheliale Xanthin-Oxidase spezies-spezifisch ist, wurde der Einfluss von Angiotensin II auch auf die endotheliale Xanthin-Oxidase in humanen Abbildung 13:
Einfluss von Peroxynitrit und Wasserstoffperoxid auf die Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase nach Stimulation mit Angiotensin II (10-7 mol/l), n=3-8
Vorhandensein der Aktivität von eXO bereits nachgewiesen wurde, untersucht [48]. Die mit den humanen Zellen durchgeführten Versuche zeigten nach Stimulation mit Angiotensin II eine mit den bovinen Zellen vergleichbare Aktivitätssteigerung der endothelialen Xanthin-Oxidase und der endothelialen Superoxidproduktion, die sich ebenfalls durch Oxypurinol, Tungsten und weitere Hemmstoffe erfolgreich inhibieren ließ.
Da die durchgeführten Versuche sowohl mit bovinen als auch humanen aortalen Endothelzellen vergleichbare Ergebnisse zeigten, wurde eine klinische Studie durchgeführt, um die Relevanz der Angiotensin II-induzierten Aktivierung der eXO bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit in vivo bestimmen zu können.
3.2 Ergebnisse der klinischen Studie
Es wurde bei Patienten mit KHK der Einfluss einer vierwöchigen AT1 -Rezeptorblockade mit Losartan und einer ebenfalls vierwöchigen Inhibition der Xanthin-Oxidase mittels Allopurinol zum einen auf die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase, zum anderen auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilation (FDD, flow-dependant endothelium mediated vasodilation) untersucht.
Zur Durchführung der doppelt geblindeten Studie wurden insgesamt 24 Patienten mit KHK und vergleichbaren Charakteristika (siehe Tabelle 2) in drei Gruppen eingeteilt. Dabei erhielt die erste Gruppe den AT1-Rezeptorblocker Losartan (Losartangruppe:n=10, 50 mg Losartan p.o. 2 x täglich). Die zweite Gruppe wurde mit Allopurinol als spezifischem Inhibitor der eXO (Allopurinolgruppe: n= 9, 300 mg p.o. 2x täglich)behandelt. Die dritte Gruppe (Placebogruppe: n=5) erhielt als Kontrollgruppe ein Placebopräparat ohne tatsächlichen Wirkstoff.
Jeder Studienteilnehmer wurde nach ausführlicher Aufklärung über Studieninhalt und Procedere und erteilter schriftlicher Einwilligung zweimal untersucht: Die erste Untersuchung erfolgte dabei vor Beginn der jeweiligen Therapie, die abschließende zweite Untersuchung wurde nach Beendigung der vierwöchigen Behandlung durchgeführt (siehe auch Methodikteil).
Tabelle 1 Charakteristika der Patienten mit koronarer Herzkrankheit ---
Placebogruppe Losartan-Gruppe Allopurinol-Gruppe
(n=5) (n=10) (n=9)
3.2.1 Effekt von Losartan (2x50mg/d) und von Allopurinol (2x300mg/d) auf die Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase in vivo
Bei allen drei Patientengruppen war eine signifikante Zunahme der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Anschluss an die Heparinbolusinfusion im Sinne einer erfolgten Ablösung der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase in das zirkulierdende Blutvolumen feststellbar (Siehe Abbildungen 14,16 und 18).
Bei der Untersuchung der basalen Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Blutplasma vor Beginn der jeweiligen Therapie zeigten sich bei allen drei Patientengruppen vergleichbare Messbefunde. Nach Beendigung der vierwöchigen Therapien ließen sich jedoch signifikante Unterschiede der eXO-Aktivität bei der Losartan- und auch der Allopurinolgruppe gegenüber der Placebogruppe feststellen.
Insbesondere konnte bei den Studienteilnehmern der Losartangruppe nach vierwöchiger Therapie eine massgebliche Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase festgestellt werden, während bei den Patienten der Placebogruppe keine signifikante Änderung der Aktivität der
Placebogruppe
Abbildung 14:
Aktivitätszunahme der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Zeitverlauf bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Placebobehandlung
Abbildung 15:
Gesamtaktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Placebobehandlung
endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Blutplasma zu beobachten war (siehe Abbildungen 15 und 17).
Losartangruppe
Abbildung 16:
Aktivitätszunahme der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Zeitverlauf bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Behandlung mit Losartan
Abbildung 17:
Gesamtaktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Behandlung mit Losartan
Auch bei der Allopurinolgruppe war nach vierwöchiger Therapie mit dem XO-Inhibitor Allopurinol eine signifikante Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase messbar, die hinsichtlich der Aktivitätsminderung mit den bei den Patienten der Losartangruppe erhobenen Befunden vergleichbar war (siehe Abbildungen 18 und 19).
Allopurinolgruppe
Abbildung 18:
Aktivitätszunahme der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Zeitverlauf bei Patienten mit KHK vor und nach vierwöchiger Behandlung mit Allopurinol
3.2.2 Effekt von Losartan (2x50mg/d) und von Allopurinol (2x300mg/d) auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation
Um den Einfluss der vierwöchigen Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan bzw. dem XO-Inhibitor Allopurinol auf die Endothelfunktion der KHK-Patienten darstellen zu können, wurde die FDD der A. radialis vor Therapiebeginn und nach der vierwöchigen Therapie - jeweils unter basalen Bedingungen und nach einer Kurzinfusion des XO-Inhibitors Oxypurinol - untersucht (siehe auch Methodikteil). Es zeigte sich hierbei, dass die Kurzinfusion des XO-Inhibitors Oxypurinol (600 µg/min für 10 min) bei diesen Studienteilnehmern zum Messzeitpunkt vor Therapiebeginn zu einer signifikanten Verbesserung des basalen FDD-Wertes führte (siehe Abbildung 20).
Dabei ist zu erwähnen, dass die Oxypurinol-Kurzinfusion keinen Einfluss auf den basalen Arteriendurchmesser der A. radialis (3.03+0.10 vs.3.04+0.11 mm, P n.s.), den Unterarmblutfluss in Ruhe (Oxypurinol versus Kontrolle, 28.9+2.1 vs. 26.9 +1.6 ml/min) und die maximale reaktive Hyperaemie hatte (84.3+7.8 vs. 85.7 +9.1 ml/min-1). Des weiteren hatte die Oxypurinol-Kurzinfusion keinen Einfluss auf die endothelunabhängige Vasodilatation nach Infusion von Nitroprussid-Natrium (19.7+1.3 vs. 20.6+1.2%; P=n.s.; n=9). Anhand dieser Befunde kann davon ausgegangen werden, dass die Oxypurinol-Kurzinfusion die FDD über einen spezifischen Wirkmechanismus verbesserte.
Zum Zeitpunkt der zweiten Messung am Ende der vierwöchigen Studie konnte die bedeutsame Beobachtung gemacht werden, dass sich die basale FDD bei den Patienten in der Losartangruppe signifikant verbessert hatte. Bei den
Studienteilnehmern der Placebogruppe waren demgegenüber keine signifikanten Unterschiede bei der basalen FDD feststellbar.
Bemerkenswerterweise zeigte die Oxypurinol-Kurzinfusion bei den Patienten in der Losartangruppe nur noch eine gering ausgeprägte weitere Verbesserung der FDD, während bei den Patienten der Placebogruppe durch eine Oxypurinol-Kurzinfusion nach wie vor eine deutliche Verbesserung der FDD erreicht werden konnte (siehe Abbildung 21).
Abbildung 20:
Einfluss der vierwöchigen Placebobehandlung auf die FDD bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit vor und nach Oxypurinol-Kurzinfusion
Placebogruppe
Auch bei den Studienteilnehmern der Allopurinolgruppe wurde die FDD vor und nach vierwöchiger Therapie mit dem spezifischem XO-Inhibitor Allopurinol gemessen sowie der Einfluss der Oxypurinol-Kurzinfusion auf die FDD bestimmt. Es zeigte sich dabei eine signifikante Verbesserung der basalen FDD nach vierwöchiger Therapiedauer. Ein weiterer wichtiger Befund war, dass sich bei der Allopurinolgruppe nach vierwöchiger XO-Inhibition praktisch keine zusätzliche Verbesserung der FDD nach Oxypurinol-Kurzinfusion zeigte (siehe Abbildung 22). Dies kann im Sinne einer fast vollständigen Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase nach vierwöchiger Allopurinoltherapie gedeutet werden.
Abbildung 21:
Einfluss der vierwöchigen Therapie mit Losartan auf die FDD bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit vor und nach Oxypurinol-Kurzinfusion
Losartangruppe
Vergleicht man nun anhand dieser Befunde die Therapien mit Losartan bzw.
Allopurinol hinsichtlich des Ausmasses der Verbesserung der FDD nach vierwöchiger Therapie, läßt sich feststellen, dass Losartan einen ausgeprägteren positiven Effekt auf die flussabhängige endothelvermittelte Vasodilatation hatte als Allopurinol (∆FDD Losartan 5.5+1.1 vs. ∆FDD Allopurinol 3.1+0.5% P<0.05).
Abbildung 22:
Einfluss der vierwöchigen Therapie mit Allopurinol auf die FDD bei Patienten mit KHK vor und nach Oxypurinol-Kurzinfusion
Allopurinolgruppe
4 Diskussion
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führen zu vier wichtigen Beobachtungen:
1. Angiotensin II (Ang II) induziert sowohl in bovinen als auch in humanen Endothelzellen eine deutliche Steigerung der durch die endotheliale Xanthin-Oxidase (eXO) vermittelten Superoxidproduktion.
2. Sowohl die durch Angiotensin II induzierte Steigerung der Proteinexpression der endothelialen Xanthin-Oxidase, als auch die erhöhte endotheliale Superoxidproduktion durch die endotheliale Xanthin-Oxidase sind von der Aktivität der Oxidase abhängig, da eine Inhibition der NAD(P)H-Oxidase zu einer deutlichen Aktivitätsminderung der endothelialen Xanthin-Oxidase führt.
3. Die vierwöchige Therapie sowohl mit Losartan als auch mit Allopurinol führt in vivo bei Patienten mit KHK zu einer deutlichen Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase.
4. Die vierwöchige Therapie sowohl mit Losartan als auch mit Allopurinol führt bei Patienten mit KHK zu einer signifikanten Verbesserung der FDD, wobei die Wirkung von Losartan auf die FDD etwas ausgeprägter ist als die von Allopurinol. Dies spricht für eine Beteiligung weiterer Faktoren am positiven Einfluß der AT1-Rezeptorblockade auf die FDD, die über die alleinige Wirkung der Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase hinausgeht.
In aktuellen Studien konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte vaskuläre Produktion freier Sauerstoffradikale (ROS, reaktive Sauerstoffspezies) sowohl zu einer vorzeitigen Inaktivierung des vasodilatierend wirkenden Stickstoffmonoxids (NO) als auch zu einer direkten Schädigung des Endothels führen kann [13]. Dieser Vorgang trägt entscheidend zu der Entstehung einer endothelialen Dysfunktion bei und kann im weiteren Verlauf zur Entstehung und Progression von Atherosklerose und koronarer Herzkrankheit führen [49].
Das Ausmaß der so entstehenden endothelialen Dysfunktion lässt sich durch Messung der flussabhängigen endothelvermittelten Vasodilatation (FDD) zuverlässig bestimmen und besitzt bei Patienten mit KHK und kardiovaskulären Risikofaktoren eine wichtige prognostische Ausagekraft, da eine reduzierte FDD mit dem gehäuften Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse korreliert ist [50]. Aus diesem Grund ist das Verständnis der zu einer gesteigerten vaskulären Produktion von ROS und zum Fortschreiten der endothelialen Dysfunktion führenden Mechanismen von großer Bedeutung, um die pathologisch gesteigerte vaskuläre Superoxidproduktion und die dadurch verursachte endotheliale Dysfunktion effektiv therapieren zu können.
Eine wichtige Quelle der für die vorzeitige Inaktivierung von NO verantwortlichen freien Sauerstoffradikale (reaktive Sauerstoff Spezies, ROS) stellen vor allem vaskulär exprimierte Oxidasen dar. Diese Oxidasen zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, Elektronen direkt auf molekularen Sauerstoff übertragen zu können, was zur Entstehung von ROS führt [13, 19].
Die drei wichtigsten Vertreter dieser Enzymgruppe sind die endotheliale Xanthin-Oxidase (eXO), die NAD(P)H-Oxidase und die NO-Synthase (eNOS) in ihrer entkoppelten Form, deren Rolle im kardiovaskulären System momentan im
gezeigt, dass insbesondere die endotheliale Xanthin-Oxidase eine bedeutsame Quelle der vaskulären Superoxidproduktion bei der Atherosklerose darstellt [16, 46, 52].
Einen ersten Anhaltspunkt für die These, dass eine durch die erhöhte Aktivität der Xanthin-Oxidase verursachte gesteigerte Superoxidproduktion zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von freiem NO führt, konnte durch eine Studie mit spontan hypertensiven Ratten gewonnen werden. In dieser Studie führte sowohl die Behandlung mit Superoxid-Dismutase (ecSOD), als auch die Therapie mit Oxypurinol als spezifischem Inhibitor der eXO zu einer deutlichen Reduktion des Blutdruckes [25].
Des weiteren konnten White et al. zeigen, dass die Therapie mit dem eXO-Inhibitor Allopurinol bzw. seines Metaboliten Oxypurinol bei hypercholesterolämischen Kaninchen zu einer deutlich verminderten vaskulären Superoxidproduktion und einer verbesserten endothelvermittelten Vasodilatation führte [46, 52].
Immer mehr Studien sprechen dafür, dass diese Beobachtungen auch auf den menschlichen Organismus übertragbar sind. So konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren oder chronischer Herzinsuffizienz zu einer signifikanten Verbesserung der FDD führt [25-28]. Darüberhinaus wurde kürzlich bei Patienten mit KHK, Carotisstenose oder Herzinsuffizienz eine deutlich erhöhte Aktivität der eXO nachgewiesen, welche zudem eine negative Korrelation mit der FDD als Marker der endothelialen Dysfunktion aufwies [7, 22-24, 30].
Für eine Beteiligung der eXO an der Atherogenese und der endothelialen Dysfunktion spricht auch, dass in Gewebeproben humaner atherosklerotischer
Läsionen eine deutlich erhöhte Konzentration der XO und der NAD(P)H-Oxidase gemessen wurde [21, 35]. Zuletzt bleibt zu erwähnen, dass auch die Höhe des Harnsäurespiegels im Serum als Produkt der eXO als prognostischer Marker der kardiovaskulären Mortalität angesehen werden kann [53-55].
In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass die Stimulation von bovinen und humanen aortalen Endothelzellen mit Angiotensin II (10-7mol/l) zu einer starken Erhöhung der Proteinexpression der eXO führt. Ebenfalls konnte bei diesen Zellen mittels ESR-Spektroskopie eine maßgebliche Steigerung der endothelialen Superoxidproduktion nachgewiesen werden, welche jedoch nach Applikation zweier strukturell unterschiedlicher Inhibitoren der eXO nicht mehr zu beobachten war. Diese Beobachtungen sprechen für eine maßgebliche Beteiligung der eXO an der gesteigerten endothelialen Superoxidproduktion nach Stimulation mit Angiotensin II.
Hinsichtlich des Wirkmechanismusses, über den die Stimulation mit Angiotensin II zu einer verstärkten Aktivierung der eXO führt, konnte gezeigt werden, dass der durch Angiotensin II auf die Endothelzellen ausgeübte Effekt über den AT1 -Rezeptor vermittelt wird, da bei einer Blockade des AT1-Rezeptors mittels des spezifischen AT1-Rezeptorblockers Losartan nach Stimulation mit Angiotensin II weder ein signifikanter Anstieg der Proteinexpression der eXO, noch der endothelialen Superoxidproduktion beobachtet werden konnte. Dahingegen führte eine Rezptorblockade des AT2-Rezeptorsubtyps mittels PD 123319 weder zu einer signifikanten Hemmung der nach Stimulation mit Angiotensin II beobachteten gesteigerten Proteinexpression der eXO, noch der dadurch vermittelten gesteigerten endothelialen Superoxidproduktion.
Des weiteren konnte gezeigt werden, dass für die durch Angiotensin II induzierte Aktivierung der eXO eine Aktivierung der NAD(P)H-Oxidase erforderlich ist. Einen ersten Anhaltspunkt für diese Vermutung lieferte eine von McNally et al. veröffentlichte Studie, in der gezeigt wurde, dass in murinen Endothelzellen, denen die p47-phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase fehlte, die Proteinexpression der eXO reduziert war [21, 56].
In der vorliegenden Studie wird ein neuer Signalweg beschrieben, bei dem die NAD(P)H-Oxidase in mit Angiotensin II stimulierten Zellen die endotheliale Xanthin-Oxidase über einen redox-sensitiven Mechanismus aktiviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Stimulation mit Angiotensin II nach gezielter Inhibition der NAD(P)H-Oxidase mit dem spezifischen Hemmstoff Apocynin wie auch mittels gegen die p47phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase gerichteter siRNA weder zu einer erhöhten Proteinexpression der eXO noch zu einer gesteigerten vaskulären Superoxidproduktion führt [21, 57, 58]. Diese Befunde sprechen für eine massgebliche Beteiligung der NAD(P)H-Oxidase an der Aktivierung der endothelialen Xanthin-Oxidase in mit Angiotensin II stimulierten Endothelzellen.
Des weiteren gibt es zunehmend Hinweise dafür, dass auch Wasserstoffperoxid (H2O2) und Peroxynitrit an einer Steigerung der vaskulären Superoxidproduktion beteiligt sind [59, 60]. Angesichts dieser Beobachtungen wurde untersucht, welchen Einfluss Peroxynitrit und Wasserstoffperoxid auf die Aktivierung der eXO in mit Angiotensin II stimulierten Zellen haben. Es zeigte sich, dass nach Behandlung mit dem spezifischen Hemmstoff der NO-Synthase L-NAME(10
-6mol/l) sowie mit dem H2O2 abbauenden Enzym Catalase (4000 Units/ml) jeweils nur ein geringerer Anstieg der Proteinexpression der eXO nach Stimulation mit Angiotensin II zu beobachten war. Diese Ergebnisse
unterstützen die These, dass auch Wasserstoffperoxyd und Peroxynitrit an der durch Angiotensin II induzierten Steigerung der eXO-Proteinexpression beteiligt sind.
Da die zunächst an bovinen Zellen durchgeführten Untersuchungen auch bei der Verwendung humaner aortaler Endothelzellen vergleichbare Ergebnisse lieferten, wurde schließlich eine klinische Studie durchgeführt, bei der auch die klinische Relevanz der durch Angiotensin II induzierten Aktivierung der eXO für Patienten mit koronarer Herzkrankheit in vivo untersucht werden sollte.
Hierzu wurde bei KHK-Patienten zunächst der Einfluss einer über einen Zeitraum von vier Wochen durchgeführten Therapie mit dem AT1 -Rezeptorblocker Losartan auf die mittels ESR-Spektroskopie bestimmte Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase im Blutplasma untersucht.
Dabei zeigte sich, dass die vierwöchige Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan (2x 50mg/d) zu einer signifikanten Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase führte, während in einer Placebogruppe
Dabei zeigte sich, dass die vierwöchige Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan (2x 50mg/d) zu einer signifikanten Reduktion der Aktivität der endothelgebundenen Xanthin-Oxidase führte, während in einer Placebogruppe