Niedrigtemperaturgaren zur schonenden Erhitzung von Geflügel- und Schweinefleisch – Einfluss auf
sensorische und mikrobiologische Qualität
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von André Becker
Bad Dürkheim
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Frerk Feldhusen
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2015
Das Projekt wurde finanziell durch die Ahrberg-Stiftung unterstützt.
Meiner Familie
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ... 2
2.1 Fleisch ... 2
2.1.1 Definition ... 2
2.1.2 Zusammensetzung und Aufbau ... 2
2.1.3 Fleischreifung ... 3
2.1.4 Schweinefleisch ... 4
2.1.5 Putenfleisch ... 5
2.2 Einfluss der Gartemperatur ... 6
2.2.1 Myofibrilläre Proteine ... 6
2.2.2 Kollagen ... 7
2.2.3 Enzyme ... 9
2.2.4 Farbe und Aussehen ... 9
2.2.5 pH ...11
2.2.6 Textur ...11
2.3 Mikrobiologische Sicherheit ...13
2.3.1 Allgemein ...13
2.3.2 Listeria monocytogenes ...14
2.3.3 Salmonella Enteritidis ...16
2.3.4 Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) ...17
3 MATERIAL UND METHODEN ...19
3.1 Rohstoffe ...19
3.2 Versuchsaufbau ...20
3.2.1 Inokulationsversuche ...20
3.2.2 Langzeit-Garung Schweinefleisch ...21
3.2.2.1 Versuchsteil 1 ...21
3.2.2.2 Versuchsteil 2 ...21
3.2.3 Langzeit-Garung Putenfleisch ...21
3.3 Untersuchungsmethoden ...22
3.3.1 Kombidämpfer und Erhitzungsvarianten ...22
3.3.2 Mikrobiologie ...24
3.3.3 pH-Messungen ...30
3.3.4 Leitfähigkeitsmessungen ...30
3.3.5 Schrumpfung des Muskels ...30
3.3.6 Gewichtsverlust ...31
3.3.7 Scherkraftmessungen ...31
3.3.8 Sensorische Untersuchungen ...35
3.3.9 Vollanalysen ...35
3.3.9.1 Probennahme ...35
3.3.9.2 Trockensubstanz und Gesamtwasser ...36
3.3.9.3 Asche ...36
3.3.9.4 Fett ...37
3.3.9.5 Protein ...38
3.3.9.6 Kollagen ...38
3.4 Statistische Auswertung ...39
4 ERGEBNISSE ...40
4.1 Inokulationsversuche ...40
4.1.1 Schweinefleisch ...40
4.2.1 Mikrobiologische Untersuchungen ...44
4.2.1.1 Versuchsteil 1 ...44
4.2.1.2 Versuchsteil 2 ...44
4.2.2 Physikalische Untersuchungen ...46
4.2.2.1 Versuchsteil 1 ...46
4.2.2.2 Versuchsteil 2 ...50
4.2.3 Chemische Untersuchungen ...54
4.2.4 Sensorik ...56
4.2.4.1 Versuchsteil 1 ...56
4.2.4.2 Versuchsteil 2 ...58
4.3 Langzeit-Garung Putenfleisch ...61
4.3.1 Mikrobiologische Untersuchungen ...61
4.3.2 Physikalische Untersuchungen ...62
4.3.3 Sensorik ...66
5 DISKUSSION ...68
5.1 Versuchsdurchführung ...68
5.2 Diskussion der Ergebnisse ...71
5.2.1 Mikrobiologische Untersuchungen ...71
5.2.2 Physikalische Untersuchungen ...76
5.2.3 Chemische Untersuchungen ...85
5.2.4 Sensorik ...86
5.2.5 Abschließende Diskussion und Ausblick ...90
6 SCHLUSSFOLGERUNGEN ...92
7 ZUSAMMENFASSUNG ...95
8 SUMMARY ...98
9 LITERATURVERZEICHNIS ...101
10 ANHANG ...119
10.1 Geräte, Verbrauchsmaterialien, Medien ...119
10.2 Tabellenverzeichnis ...128
10.3 Abbildungsverzeichnis ...130
10.4 Tabellenanhang ...133
11 DANKSAGUNG ...138
a*-Wert Rotwert
ANOVA analysis of variance
b*-Wert Gelbwert
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
BVDF Bundesverband der Deutschen Fleischwarenin-
dustrie e.V.
BHI Brain Heart Infusion
CFC Agar Cephalothin-Sodium Fusidate-Cetrimide Agar
Cfu colony forming units
CIE Commission Internationale de l’éclairage
DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobio-
logie
DSM Nummer eines Keimes vergeben durch die
DSMZ
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen
D-Wert Dezimale Reduktionszeit
Eae E. coli attaching and effacing-Gen
EFSA European Food Safety Authority
EHEC enterohämorrhagische Escherichia coli
GKZ Gesamtkeimzahl
Gn Gewicht nach Garung
Gv Gewicht vor Garung
HP Hydroxyprolin
HUS hämolytisch urämisches Syndrom
i.m. intramuskulär
IfSG Infektionsschutzgesetz
ISO International Organization for Standardization
KbE Koloniebildende Einheiten
konv. konventionell
L*-Wert Helligkeitswert
L. Schrumpfung Longitudinale (Längs-) Schrumpfung des Mus-
kels
LF Leitfähigkeit
LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futter- mittelgesetzbuch
Ln Länge nach Garung
LSD least significant difference
LTLT low temperature long time
Lv Länge vor Garung
M. Musculus
MKTTn Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin (An-
reicherungsbouillon)
mS Millisiemens
n Anzahl
n.s. nicht signifikant
NACMCF National advisory committee on microbiological
criteria for food
NT Niedrigtemperatur Garung
OCLA OXOID chromogener Listerien Agar
p Irrtumswahrscheinlichkeit
p.m. post mortem
PCPLC Phosphotidylcholin-Phospholipase C
pH24 pH-Wert 24 Stunden nach Schlachtung
PIPLC Phosphotidylinositol-Phospholipase C
RKI Robert Koch-Institut
RTE ready-to-eat
RVS Rappaport-Vassiliadis Medium
SCVPH Sub-Committee on Veterinary Public Health
SEM standard error of mean
SOB- Sorbitol negativ = nicht zur Sorbitolverwertung
fähig
subsp. / spp. Subspezies
SSF slice shear force
ßGLU- ß Glucuronidase negativ = keine ß Glucuro-
nidase Aktivität
STEC Shigatoxin bildende Escherichia coli
Stx Shigatoxin
T. Schrumpfung transversale (Quer-) Schrumpfung des Muskels
TA.XT.plus Texturanalysegerät
TBX Tryptone Bile X-Glucuronide-Agar
VO Verordnung
VRB Violet Red Bile Agar
VTEC Verotoxin bildende Escherichia coli
XLD Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar
Teilergebnisse dieser Dissertation wurden an folgenden Stellen veröffentlicht:
A. Becker, A. Boulaaba, S. Pingen, A. Röhner, G. Klein (2015): „Low temperature, long time treatment of porcine M. longissimus thoracis et lumborum in a combi steamer under commercial conditions” (Journal Artikel)
In: Meat Science 110 (2015) 230-235
http://dx.doi.org/10.1016/j.meatsci.2015.07.024
A. Becker, A. Boulaaba, A. Röhner, G. Klein (2014): „Mikrobiologische Sicherheit von low temperature long time (LTLT) gegartem Schweine- und Putenfleisch“
(Poster)
In: 55. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Gar- misch-Partenkirchen vom 23.09. bis 26.09.2014, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle (Sonderausgabe), ISSN 0945-3296
A. Becker, A. Boulaaba, A. Röhner, G. Klein (2015): „Möglichkeiten und Grenzen der LTLT Garung in einem handelsüblichen Kombidämpfer“ (Poster)
In: 56. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Gar- misch-Partenkirchen vom 28.09. bis 02.10.2015, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle (Sonderausgabe), ISSN 0945-3296
A. Becker (2015): „LTLT Garung – ist weniger mehr?“ (Vortrag) Doktorandense- minar am Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Hannover (21.01.2015)
1 1 EINLEITUNG
Verbraucher legen in den Industriestaaten zunehmend Wert auf qualitativ hochwerti- ges Fleisch und ausgefallenere Zubereitungsmethoden. Mit Ausnahme einiger ge- trockneter oder fermentierter Produkte wird Fleisch in der Regel vor dem Verzehr erhitzt (BEJERHOLM et al. 2014). Die Erhitzung erhöht die Schmackhaftigkeit und die Verdaulichkeit bei gleichzeitiger Reduktion potentiell gefährlicher Krankheitserre- ger. Es kommt zu hitzebedingten Veränderungen der Fleischbestandteile, welche zu Texturveränderungen führen und, je nach Zubereitungsart, ein unterschiedliches Ge- schmackserlebnis bieten. Neben verschiedener Gartemperaturen und Garzeiten be- einflusst die Kochmethode entscheidend die Eigenschaften des Endproduktes. Das Zubereiten von Fleisch bei niedrigen Ofen- und Kerntemperaturen gewinnt dabei immer mehr an Bedeutung. Diese schonenden Garmethoden führen zu niedrigen Kochverlusten, aufgrund einer geringen Proteindenaturierung (AASLYNG et al. 2003;
CHIAVARO et al. 2009; CHRISTENSEN et al. 2011a). Außerdem wird das Fleisch bei längeren Garzeiten durch die sogenannte LTLT (low temperature long time) Be- handlung zarter (CHRISTENSEN et al. 2011b). Dieses Prinzip hat sich die Lebens- mittelindustrie bei der „sous-vide“ Garung bereits zu Nutze gemacht. Hierbei wird Fleisch vakuumverpackt und für mehrere Stunden im Wasserbad erhitzt. In Großkü- chen und Restaurants werden jedoch vermehrt moderne Kombidämpfer verwendet.
Die vorliegende Studie untersuchte daher das Potential moderner Kombidämpfer als Erhitzungstechnologie für Langzeit-Garungen von Geflügel- (Musculus (M.) pectora- lis) und Schweinefleisch (M. longissimus dorsi), welche den Großteil des pro Kopf verzehrten Fleisches in Deutschland ausmachen (BVDF 2014). Durch physikalisch- chemische Messungen nach verschiedenen Zeit-Temperatur-Kombinationen wurden die Einflüsse der Langzeit-Garung auf Wasserhaltung, Zartheit und Aussehen der Proben untersucht. Mit Hilfe von Inokulationsversuchen wurde geklärt, ob die ver- schiedenen Behandlungen ausreichen, um potentiell pathogene Bakterien abzutöten.
Schließlich wurden in verbraucherorientierten sensorischen Analysen Langzeit- Garungen mit alternativen Erhitzungsmethoden verglichen, um Rückschlüsse auf die Akzeptanz der Produkte zu ziehen.
2
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Fleisch
2.1.1 Definition
Die Leitsätze für Fleisch- und Fleischerzeugnisse und die VO 853/2004 Anhang 1 definieren Fleisch als alle Teile von geschlachteten oder erlegten warmblütigen Tie- ren, die zum Genuss für den Menschen bestimmt sind bzw. als alle genießbaren Tei- le von Huftieren, Geflügel, Hasentieren, frei lebendem Wild, Farmwild, Kleinwild und Großwild. Die Leitsätze erläutern im Folgenden, dass bei gewerblicher Herstellung von Fleischerzeugnissen nur die Skelettmuskulatur mit anhaftendem oder eingela- gertem Fett- und Bindegewebe sowie eingelagerten Lymphknoten, Nerven, Gefäßen und Speicheldrüsen als Fleisch verstanden wird. Im Verbraucherhaushalt dagegen schließe Fleisch teilweise auch einen entsprechenden Anteil an eingewachsenen Knochen und Knorpeln sowie, bei Schweinefleisch, Schwarte (u.a. den Rücken- speck) mit ein.
2.1.2 Zusammensetzung und Aufbau
Skelettmuskulatur besteht hauptsächlich aus Wasser (etwa 74 %) und Proteinen (et- wa 19 %) (KEETON et al. 2014). In geringeren Mengen kommen Fette (etwa 5 %), Kohlenhydrate (etwa 1 %) und Asche (etwa 1 %) vor.
Der gesamte Muskel ist von einer bindegewebigen Umhüllung, dem sogenannten Epimysium, umgeben (PURSLOW 2005). Muskelfaserbündel und Muskelfasern be- sitzen jeweils eine zusätzliche Umhüllung (Perimysium bzw. Endomysium). Alle 3 Umhüllungen bestehen vorwiegend aus Kollagenfasern und definieren, neben der myofibrillären Komponente, die Zartheit von Fleisch (PURSLOW 2005).
Sarkomere bilden die funktionelle Einheit der Myofibrillen innerhalb der Muskelfaser.
Diese machen die größte Gruppe der Proteine des Skelettmuskels aus (KEETON et al. 2014). Sarkomere bestehen vorwiegend aus Aktin- und Myosin-Filamenten und sind von entscheidender Bedeutung für die Wasserbindung des Muskelfleisches (KEETON et al. 2014). Der Großteil des Wassers wird zwischen den Muskelfilamen-
3 ten gehalten (HUFF-LONERGAN u. LONERGAN 2005; TORNBERG 2005). Verän- derungen innerhalb dieses Gefüges führen daher zu Wasserverlusten (MARTENS et al. 1982; BENDALL u. RESTALL 1983; OFFER u. TRINICK 1983). Wasser kann so- wohl während der Fleischreifung in Form von Tropfsaftverlusten als auch bei Erhit- zung als Kochverlust austreten (HUFF-LONERGAN u. LONERGAN 2005).
Sarkoplasmatische, oder wasserlösliche Proteine befinden sich im Sarkoplasma bzw.
in der Flüssigkeit welche die Myofibrillen umgibt. Dazu gehören oxidative Enzyme, verschiedene Häm-Pigmente, mitochondriale Enzyme der Atmungskette, lysosomale Enzyme und Nukleoproteine (KEETON et al. 2014).
Der Fettgehalt im Fleisch ist je nach Muskel und Tierart sehr variabel (1,5 % bis 13 %) (KEETON et al. 2014). Tierisches Fettgewebe ist hauptsächlich aus Triglyceri- den und Phospholipiden aufgebaut. Lipide dienen als Energiequelle sowie als struk- turelle und funktionelle Einheit der Zellmembran. Intramuskuläres Fett lockert die Zellstrukturen auf und erhöht damit die Wasserbindung des Fleisches. Der intramus- kuläre Fettgehalt korreliert deshalb positiv mit Zartheit und Saftigkeit von Fleisch (O’QUINN et al. 2012; STRAADT et al. 2013; PANNIER et al. 2014).
2.1.3 Fleischreifung
Der schlachtwarme Muskel ist in der Regel für den Verbraucher noch ungenießbar.
Während der Umwandlung des Muskels in Fleisch kommt es zur pH-Wert- Absenkung, welche unterschiedlich schnell verlaufen kann (HONIKEL 2014b). Nach Erreichen des ultimativen pH setzt die Fleischreifung in Form enzymatischer Prozes- se ein (DEVINE 2014). Diese Vorgänge führen letztendlich zu den typischen Farb- und Textureigenschaften des Fleisches (MONIN u. SANTÉ-LHOUTELLIER 2014).
Während der Reifungsphase werden Strukturproteine durch endogene Enzyme wie Calpaine und Cathepsine abgebaut, wodurch das Fleisch zarter wird. Während das myofibrilläre Gerüst geschwächt wird, scheint die Reifung dagegen keinen großen Effekt auf die Bindegewebestabilität zu haben, weshalb Fleischreifung ein vorwie- gend myofibrilläres Phänomen darstellt (DEVINE 2014). Obwohl der Mechanismus
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der Reifung bei allen Spezies ähnlich ist, unterscheiden sich die Reifedauern deutlich (Geflügel < Schwein < Lamm < Rind). Dadurch variiert die empfohlene Fleischreifung zwischen wenigen Tagen bis mehreren Wochen. Geflügelfleisch ist besonders schnell reifend wodurch die optimale Zartheitsentwicklung schon nach 6-8 Stunden (Hühnerfleisch) oder 12-24 Stunden (Putenfleisch) eintritt (DEVINE 2014).
2.1.4 Schweinefleisch
Schweinefleisch war im Jahre 2013 mit 38,1 kg die Fleischsorte mit dem höchsten pro Kopf Verzehr in Deutschland (BVDF 2014). Dabei zeichnete sich von 2010 (39,5 kg) bis 2013 ein leichter Abwärtstrend ab. Der Verbraucher bevorzugt zunehmend mageres Fleisch, was eine generelle Verringerung des intramuskulären Fettgehaltes zugunsten des Wasser- und Eiweißgehaltes zur Folge hatte (VON LENGERKEN et al. 2007). Dadurch, dass Zartheit und Saftigkeit durch den intramuskulären Fettgehalt positiv beeinflusst werden (O’QUINN et al. 2012; STRAADT et al. 2013; PANNIER et al. 2014), kann diese Entwicklung allerdings auch durchaus kritisch gesehen werden.
Die intramuskulären Fettgehalte variieren je nach Muskel und Schweinerasse und schwanken auch innerhalb des Muskels (VON LENGERKEN et al. 2007). Außerdem bestehen zwischen den verschiedenen Muskeln Unterschiede bezüglich Sarkomer- Länge, Kollagengehalt und Zartheit (WHEELER et al. 2000). Bei dem in dieser Stu- die verwendeten langen Rückenmuskel (M. longissimus dorsi) handelt sich um das sogenannte Kotelett, welches sich durch vergleichsweise mageres Fleisch auszeich- net und zu den wertvollen Teilstücken (Schinken, Bug, Kamm, Kotelett, Filet) des Schlachtkörpers gezählt wird. Diese können zu Bratenstücken zugeschnitten und besonders hochpreisig vermarktet werden (VON LENGERKEN et al. 2007). Der M.
longissimus dorsi besteht aus etwa 22-24 % Eiweiß, 1-3 % Fett, 72-75 % Wasser und etwa 1 % Asche (VON LENGERKEN et al. 2007).
Normalerweise kommt es postmortal zu einem gleichmäßigen Absinken des pH- Wertes durch den Abbau der in Form von Glykogen vorliegenden Energiereserven und eine damit verbundene Laktatbildung (HONIKEL 2014b). Beim Schwein ist die- ser Prozess nach etwa 8 Stunden weitgehend abgeschlossen und damit der End-pH-
5 Wert erreicht (HONIKEL 2014a). Neben dem normalen Absinken des pH-Wertes kann es allerding auch zu einem beschleunigten bzw. zu einem unvollständigen Ab- sinken kommen. Dabei entstehen Fleischmängel, welche unter anderem die Was- serhaltung während des Erhitzens negativ beeinflussen können. Zu den bekanntes- ten Abweichungen zählt das sogenannten PSE Fleisch (pale, soft, exsudative), bei welchem durch Membranschäden, Faserschrumpfungen und Proteindenaturierungen eine Verringerung der Wasserbindung auftritt (MITCHELL u. HEFFRON 1982). Das sogenannte DFD (dark, firm, dry) Fleisch zeichnet sich dagegen durch eine dunkle, feste und trockene Schnittfläche aus, mit der Gefahr des schnellen Verderbs wegen der ausbleibenden Ansäuerung (NEWTON u. GILL 1978). Weiterhin tritt bei Schwei- nen der Rasse Hampshire noch das sogenannte Acid Meat auf, welches durch ext- rem niedrige End-pH-Werte wegen eines erhöhten glykolytischen Potentials charak- terisiert ist (MONIN u. SELLIER 1985). Schließlich ist noch das RSE (red, soft, exsu- dative) Fleisch zu nennen welches trotz eines normalen pH-Wert-Verlaufs ein ähnlich schlechtes Wasserbindungsvermögen wie PSE Fleisch aufweist (VAN LAACK u.
KAUFFMAN 1999). Da bei Erhitzungsvorgängen die Wasserbindung von erheblicher Bedeutung für die spätere Saftigkeit der Produkte ist, sollte man Fleisch mit entspre- chenden Qualitätsmängeln nicht für die Zubereitung verwenden.
2.1.5 Putenfleisch
Der Verzehr von Geflügelfleisch in Deutschland stieg zwischen den Jahren 2010 und 2013 von 11,1 auf 11,6 kg pro Kopf an, während der Schweinefleisch-Verbrauch leicht rückläufig war (BVDF 2014). Geflügelfleisch liegt damit hinter Schweinefleisch auf Platz 2 des Fleischkonsums in Deutschland.
Die wertbestimmenden Teile der Geflügelkarkasse sind die Brustmuskulatur, die Keulen und die Flügel. Der in der vorliegenden Studie verwendete Brustmuskel (M.
pectoralis) besteht aus etwa 22-25 % Eiweiß, 0,3-1,8 % Fett, 73-75 % Wasser und 1 % Asche (SOUCI-FACHMANN-KRAUT 2007). Damit enthält er weniger Fett als der ohnehin schon vergleichsweise magere M. longissimus dorsi des Schweines. Allge- mein zeichnet sich die Muskulatur des Geflügels durch eine hohe Faserdichte und feiner Faserung aus (PINGEL et al. 2007). Der Anteil des intramuskulären Bindege-
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webes ist vergleichsweise gering und wird als Grund für die hohe Zartheit von Geflü- gelfleisch angesehen (PINGEL et al. 2007).
Die postmortale pH-Wert-Absenkung verläuft bei Geflügelfleisch deutlich schneller als bei Schweine- oder Rindfleisch. Der End-pH-Wert wird deshalb bei Putenbrust- Fleisch schon nach 2-4 Stunden erreicht (HONIKEL 2014a). Durch Züchtungserfolge in den vergangenen Jahren konnte der Brustmuskelansatz bei Mastputen deutlich erhöht werden und macht nun, mit etwa 35 %, einen Großteil des Schlachtgewichts aus. Dabei liegt der Anteil am Schlachtgewicht sogar 10-15 % höher im Vergleich zu anderen Fleisch liefernden Vogelarten (BRANSCHEID et al. 2004). Allerdings kön- nen dadurch auch Probleme auftreten, welche die Fleischqualität nachhaltig beein- flussen. Die auftretenden Phänomene ähneln beispielsweise dem beim Schwein be- kannten PSE Fleisch und werden deshalb als ASS (aviäres Stresssyndrom) be- zeichnet. Die Ursache ist vermutlich in der Muskelhypertrophie und daraus resultie- renden Störungen des Zellstoffwechsels begründet (BRANSCHEID et al. 2004). Im Fleisch betroffener Tiere kommt es postmortal zur überstürzten Glykolyse mit der Folge einer reduzierten Wasserbindung. Wie auch beim Schwein beeinflusst die Fleischqualität die Zartheit und Saftigkeit der Produkte und Fleischmängel sollten deshalb möglichst erkannt und vermieden werden.
2.2 Einfluss der Gartemperatur 2.2.1 Myofibrilläre Proteine
Als myofibrilläre Proteine werden Proteine des kontraktilen Apparates bezeichnet.
Wird Fleisch erhitzt, kommt es zur hitzebedingten Denaturierung (BEJERHOLM et al.
2014). Der Grad der Denaturierung ist abhängig von der Temperatur und wirkt sich auf die Wasserbindung und die Texturentwicklung aus.
Myosin denaturiert schon bei relativ niedrigen Temperaturen von etwa 40-60 °C (MARTENS et al. 1982). Als Folge dessen schrumpft die Muskelfaser transversal und es treten durch verringerte Wasserbindung die ersten Kochverluste auf (OFFER et al. 1984; PALKA u. DAUN 1999).
7 Aktin denaturiert dagegen erst bei deutlich höheren Temperaturen von etwa 70-80 °C was mit einem Zähigkeitsanstieg und longitudinaler Faserschrumpfung in Verbindung gebracht wird (MARTENS et al. 1982; BERTOLA et al. 1994; CHRISTENSEN et al.
2000). Auch diese Veränderung der Integrität der Myofibrillen geht mit erhöhtem Kochverlust einher (OFFER et al. 1984).
CHRISTENSEN et al. (2000) konnten zeigen, dass die Bruchfestigkeit isolierter Mus- kelfasern zwischen 60 °C und 80 °C deutlich zunimmt, was der Denaturierung myo- fibrillärer Proteine zugeschrieben wurde. Niedrigtemperatur-Garungen in Bereichen unter 60 °C versuchen deshalb diesen Zähigkeitsanstieg zu umgehen, um Kochver- luste zu minimieren und die Zartheit zu erhalten. Allerdings finden auch bei Niedrig- temperatur-Garungen unter 60 °C, nach entsprechend langer Gardauer von 20 Stun- den, Aktin-Denaturierungen statt (CHRISTENSEN et al. 2011a).
2.2.2 Kollagen
Neben den myofibrillären Proteinen spielt das Bindegewebe eine tragende Rolle bei der Zartheitsentwicklung von Fleisch. Der Einfluss des intramuskulären Bindegewe- bes auf die Zähigkeit gekochten Fleisches wird hauptsächlich dem Kollagen zuge- schrieben (PURSLOW 2014).
Der Kollagengehalt schwankt zwischen verschiedenen Muskeln und variiert in der Regel zwischen 1 und 10 % der Trockenmasse (BENDALL 1967). Kollagen besteht aus drei Polypeptidketten, welche eine Tripelhelix (Tropokollagen) bilden. Diese Mo- leküle lagern sich zu Fibrillen zusammen, welche schlussendlich Kollagenfasern bil- den (ASTRUC 2014). Die Bildung kovalenter Querverbindungen innerhalb der Kol- lagenfibrillen ist wichtig für die spätere mechanische Stärke der Kollagenfaser (BAILEY et al. 1998). Während der pränatalen Entwicklung und der postnatalen Rei- fung ändern sich diese Quervernetzungen von unreifen, divalenten in reife, trivalente Bindungen. Diese reifen Bindungen führen, aufgrund höherer Stabilität, zu einer ge- ringeren Kollagenlöslichkeit während der Erhitzung und sind deshalb der Grund für einen Zähigkeitsanstieg des Fleisches mit steigendem Alter des Tieres (BAILEY et al. 1998; CHRISTENSEN et al. 2013).
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Während der Erhitzung von Fleisch kommt es zunächst zu einer Erhöhung der Reiß- festigkeit des Bindegewebes zwischen 40 und 50 °C, was durch eine Erhöhung der Faserdichte im Querschnitt erklärt wird (CHRISTENSEN et al. 2000). Ab 50 °C nimmt die Bindegewebsstärke aufgrund von partieller Denaturierung und Schrumpfung von Kollagenfasern ab (LAAKONEN et al. 1970a; CHRISTENSEN et al. 2000;
BRÜGGEMANN et al. 2010). Im weiteren Verlauf, bei Temperaturen über 75 °C, wird Kollagen löslich und gelatinisiert was mit einer weiteren Schwächung des Bindege- webes einhergeht (BEJERHOLM et al. 2014). Man nahm zunächst an, dass diese Veränderungen des Kollagens nur bei entsprechend hohen Temperaturen stattfin- den, allerdings geht Kollagen schon bei deutlich niedrigeren Temperaturen in Lösung wenn Fleisch ausreichend lang erhitzt wird (CHRISTENSEN et al. 2011b;
CHRISTENSEN et al. 2013). CHRISTENSEN et al. (2011b) konnten zeigen, dass sogar Temperaturen von 53 °C bei entsprechender Langzeiterhitzung ausreichen, um Kollagen löslich zu machen. Dieser Effekt kann durch feuchte Hitze noch ver- stärkt werden (BEJERHOLM et al. 2014).
Man kann also festhalten, dass einige Kollagene des Bindegewebes thermisch labil sind. Das bedeutet, dass sie durch Erhitzung leicht extrahierbar werden. Dieser labile Kollagenanteil variiert je nach Muskel beim Schwein zwischen 14,2 und 19,2 % (VOUTILA et al. 2007). Nach einer neuen Hypothese von PURSLOW (2014) geht diese labile Fraktion bereits nach kurzer Kochdauer in Lösung und spielt damit keine tragende Rolle bei der Stärke des intramuskulären Bindegewebes nach Erhitzung.
Die verbleibende Fraktion ist bei kurzer Gardauer hitzeunlöslich, kann allerdings durch sehr lange Garung bei mittleren Temperaturen (beispielsweise durch sous-vide Garung) oder durch lange Garung bei hohen Temperaturen löslich gemacht werden (PURSLOW 2014). Dieser Mechanismus kann deshalb als möglicher Grund für die Zartheitsentwicklung des unter 60 °C gegarten LTLT Fleisches angesehen werden.
Hitzeinduzierte Veränderungen des Kollagens spielen auch beim Kochverlust eine Rolle. Nach einer zunächst freien Kontraktion der Kollagenfasern des Perimysiums kommt es mit steigender Erhitzungstemperatur zu einer forcierten Kontraktion, in de-
9 ren Verlauf Druck auf die umgebende Muskelfasern und Muskelfaserbündel ausge- übt wird (LEPETIT et al. 2000; LEPETIT 2008; ASTRUC 2014). Dieser Druck führt zu einem vermehrten Wasseraustritt.
2.2.3 Enzyme
Enzyme werden im Allgemeinen mit steigenden Temperaturen inaktiviert. In niedri- gen Temperaturbereichen ist allerdings eine Restaktivität verschiedener Enzymgrup- pen zu verzeichnen.
Die bei der Fleischreifung maßgeblich zur Zartheitsentwicklung beitragende Gruppe der Calpaine wird bereits bei 55 °C inaktiviert (CHRISTENSEN et al. 2011b;
ERTBJERG et al. 2012). Kollagenasen dagegen bleiben bis 60 °C aktiv und können damit Bindewebe auflockern und den hitzeinduzierten Abbau fördern (LAAKONEN 1970b; PENFIELD u. MEYER 1975). Darüber hinaus konnten bei sous-vide gegar- tem Schweine- und Rindfleisch Aktivitäten von Cathepsinen bei Temperaturen unter 60 °C nachgewiesen werden (CHRISTENSEN et al. 2011b; CHRISTENSEN et al.
2013). Cathepsin B spielt eine wichtige Rolle beim Abbau von Kollagen durch die Zerstörung intermolekularer Querverbindungen (BURLEIGH et al. 1974). Zudem schwächt es die myofibrilläre Komponente des Fleisches (BARON et al. 2004). Es wird deshalb ein Zusammenhang zwischen Zartheitsentwicklung durch LTLT Be- handlungen und Cathepsin Aktivität vermutet (CHRISTENSEN et al. 2013)
2.2.4 Farbe und Aussehen
Die Farbe in gegartem Fleisch wird hauptsächlich durch die verschiedenen Myoglob- in-Formen und deren chemischen Umbau bestimmt (SUMAN u. JOSEPH 2013). Er- hitzung führt im Allgemeinen zu einer temperaturabhängigen Denaturierung des My- oglobins (KING u. WHYTE 2006). Die Denaturierung des Globins führt dabei zu einer erhöhten Oxidationsempfindlichkeit. Pink-rotes Globin-Hemochrom, auch Ferro- hemochrom genannt, wird deshalb zu braunem Globin-Hemichrom (Fer- rihemochrom) oxidiert. Dabei entsteht die typische braune Farbe gut durchgegarten Fleisches.
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Die Thermostabilität des Myoglobins verschiedener Tierarten kann allerdings unter- schiedlich sein. Dabei sind Unterschiede der strukturell wichtigen Aminosäureketten relevant, welche die Tertiärstruktur beeinflussen (UEKI u. OCHIAI 2004). JOSEPH et al. (2010) konnten beispielsweise zeigen, dass Myoglobin aus Putenfleisch eine hö- here thermische Stabilität als Myoglobin aus Rindfleisch besitzt.
Bei Rindfleisch tritt vereinzelt während des Erhitzens der Effekt des sogenannten
„premature browning“ auf, bei welchem Fleisch durchgegart aussieht, allerdings nicht ausreichend erhitzt wurde (HAGUE et al. 1994; HUNT et al. 1999). Dies kann zu mik- robiologischen Gefahren führen, denn der Verbraucher beurteilt die Unbedenklichkeit vor dem Verzehr oft über den Garungsgrad des Fleisches (KING u. WHYTE 2006).
Es kann also zum Konsum nicht ausreichend durchgegarter Produkte kommen. Im Gegensatz dazu tritt bei Putenfleisch hin und wieder eine persistierende rosa Fleischfarbe auf. Durch die höhere Thermostabilität des Hämoglobins (JOSEPH et al. 2010) kommt es trotz ausreichender Erhitzung zu einem ungekochten Aussehen des Fleisches, was zur Ablehnung des Verbrauchers führt (HOLOWNIA et al. 2003).
Andere Häm-Pigmente wie Hämoglobin und Cytochrom c spielen bei der Farbe ge- garten Fleisches eine eher untergeordnete Rolle, können aber bei Geflügel und Fisch, bei welchen sie in höheren Konzentrationen vorkommen, durchaus Einfluss haben. Da Cytochrom c eine höhere Hitzestabilität als Myoglobin aufweist, kann es beispielsweise noch zur pinken Farbe beitragen, wenn andere Häm-Pigmente bereits denaturiert sind (SUMAN u. JOSEPH 2014).
Bei welcher Temperatur die Myoglobin Denaturierung stattfindet hängt vom Re- doxstatus des Moleküls im Rohfleisch ab (HUNT et al. 1999). Befindet sich vermehrt Deoxymyoglobin im Rohfleisch, kommt es bei Erhitzungen auf 55 °C zu einem roten, ungekochten Aussehen. Erst bei Temperaturen von 65 und 75 °C entwickelt sich ei- ne zunehmende Bräunung des Fleisches. Oxymoglobin und Metmyoglobin denatu- rieren hingegen bereits früher (HUNT et al. 1999). Bei ganzen Fleischstücken ist da- von auszugehen, dass im Inneren vorwiegend Deoxymyoglobin vorliegt (MANCINI u.
HUNT 2005). Niedrige Temperaturen in Bereichen unter 60 °C führen demnach da-
11 zu, dass nur geringe Mengen dieser Myoglobin-Form denaturieren. Das Fleisch bleibt dadurch weitgehend pink. Sous-vide Langzeit-Garung von Schweinefleisch bei Temperaturen unter 60 °C (bis 17 Stunden) zeigten deshalb nur geringfügige Verän- derungen des instrumentell gemessenen Rotwertes (a*-Wert) (CHRISTENSEN et al.
2011b).
Sensorische Untersuchungen konnten allerdings zeigen, dass ein stärker gegartes Aussehen von Schweine- und Rindfleisch auch bei einer Kerntemperatur von 58 °C durch Verlängerung der Gardauer erreicht werden kann (CHRISTENSEN et al.
2012). Bei Hühnerfleisch wurde der Garungsgrad allerdings nur durch höhere Tem- peraturen und nicht durch verlängerte Garzeiten beeinflusst.
2.2.5 pH
Bei steigenden Temperaturen erhöht sich der pH-Wert von gegartem Fleisch (HAMM u. DEATHERAGE 1960; LAAKONEN et al. 1970a). Grund dafür ist die zunehmende Denaturierung verschiedener Proteine, mit einer Abnahme saurer und Zunahme ba- sischer Seitenketten. Dieser pH-Wert-Anstieg steht in direktem Zusammenhang mit der Hydratisierung des Fleisches (HAMM u. DEATHERAGE 1960). Der pH-Wert- Anstieg bzw. die größte Reduktion der Hydratisierung ist zwischen 40 und 50 °C zu verzeichnen, während zwischen 50 und 55 °C eine Plateauphase erreicht wird. Ab 60 °C steigt der pH-Wert zunehmend an und die Hydratisierung sinkt. Der pH-Wert- Anstieg in gegartem Fleisch kann also als Indikator für Proteindenaturierung dienen, welche wiederum mit Kochverlusten korrelieren (HAMM u. DEATHERAGE 1960).
2.2.6 Textur
Veränderungen in der Textur von gegartem Fleisch entstehen durch Veränderungen der Fleischkomponenten durch Erhitzung. Dabei sind sowohl Veränderungen der Myofibrillen (2.2.1) als auch Veränderungen des Bindegewebes (2.2.2) von Bedeu- tung.
CHRISTENSEN et al. (2000) zeigten durch isolierte Betrachtung beider Komponen- ten und anschließender Messung der Gesamt-Zähigkeit des Fleisches, dass die Tex- turentwicklung bei der Erhitzung stark abhängig von der erreichten Kerntemperatur
12
ist. Die Reißfestigkeit des Perimysiums stieg zunächst bis 50 °C an und nahm im weiteren Erhitzungsverlauf aufgrund partieller Kollagendenaturierungen und -schrumpfungen wieder ab. Isolierte Myofibrillen dagegen wurden erst zwischen 60 und 70 °C reißfester. Betrachtet man nun die Gesamt-Zähigkeit des Muskels kommt es durch das Zusammenspiel beider Komponenten zu einem Abfall der Scherkraft zwischen 50 und 60 °C. Damit besonders zartes Fleisch entsteht, werden deshalb bei Niedrigtemperatur-Garungen im Allgemeinen Temperaturen zwischen 50 und 60 °C verwendet.
Bei Langzeit-Garungen ist die Erhitzungsdauer entscheidend für die Texturverände- rungen. Es kommt dabei mit steigender Dauer zu einer Scherkraftabnahme und da- mit zur Reduktion der Zähigkeit des Fleisches (LAAKONEN et al. 1970a; BOUTON u.
HARRIS 1981; BEILKEN et al. 1986; CHRISTENSEN et al. 2011a; CHRISTENSEN et al. 2011b; CHRISTENSEN et al. 2012; CHRISTENSEN et al. 2013). In der Ver- gangenheit gab es allerdings Unstimmigkeiten darüber, weshalb es bei verlängerten Garzeiten unter niedrigen Temperaturen zu einer Zartheitserhöhung des Fleisches kommt. Während DAVEY u. NIEDERER (1977) postulierten, dass proteolytische An- griffe auf myofibrilläre Komponenten dafür verantwortlich sind, konnten andere Un- tersuchungen zeigen, dass eine Schwächung kollagenen Bindegewebes die Haupt- rolle spielt (LAAKONEN et al. 1970a; LAAKONEN 1970b; BOUTON et al. 1975;
BOUTON et al. 1981). Neuere Forschungsergebnisse bestätigen, dass vorwiegend eine Schwächung des Bindegewebes, aber auch enzymatisch bedingte Veränderun- gen der myofibrillären Strukturen, die Tenderisierungseffekte des LTLT Fleisches erklären können (CHRISTENSEN et al. 2011a; CHRISTENSEN et al. 2011b;
ERTBJERG et al. 2012; SANCHEZ DEL PULGAR et al. 2012; CHRISTENSEN et al.
2013). Das zunächst hitzestabile, unlösliche Kollagen kann durch entsprechend lan- ge Erhitzungsdauer löslich gemacht werden (PURSLOW 2014). Diese thermische Kollagendenaturierung führt zu einer deutlichen Steigerung der Zartheit.
Allerdings wird Fleisch auch zunehmend trockener, je länger es gegart wird. Da Saf- tigkeit und Zartheit bei LTLT-Behandlungen von Rind- und Schweinefleisch negativ korrelieren, muss eine optimale Kombination aus Temperatur und Zeit gefunden
13 werden, um diese beiden bedeutenden Parameter in Einklang zu bringen (CHRISTENSEN et al. 2012).
2.3 Mikrobiologische Sicherheit 2.3.1 Allgemein
Die Gewährleistung mikrobiologischer Unbedenklichkeit ist von großer Bedeutung für den Lebensmittelunternehmer. Nur ein sicheres Produkt darf an den Verbraucher abgegeben werden. Obwohl das Innere der Muskulatur nach Schlachtung in der Re- gel als steril anzusehen ist, kann es im Zuge der Weiterverarbeitung zu Kontaminati- onen kommen (AIYEGORO 2014).
Mikroorganismen auf Frischfleisch können Pathogene sein, welche ein hohes Risiko für die menschliche Gesundheit darstellen. Zudem kann Fleisch von Verderbnis- Erregern wie Pseudomonaden oder Enterobakterien befallen werden. Hitzeprozesse müssen in der Lage sein, eine potentielle Gefahr für den Konsumenten zu eliminie- ren. Das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) empfiehlt daher bei der Erhitzung von Fleisch und Fleischprodukten eine Kerntemperatur von mindestens 70 °C zu er- reichen und diese für mindestens 2 Minuten zu halten (BfR 2012). Diese Kerntempe- raturen werden allerdings bei Niedrigtemperatur-Garungen nicht erreicht.
Da die Abtötung von Mikroorganismen nicht nur temperatur- sondern auch zeitab- hängig ist, zeigten zahlreiche Studien, dass auch niedrige Temperaturen durchaus in der Lage sind Keime auf ein Minimum zu reduzieren, wenn das Fleisch für gewisse Zeit erhitzt wird (VAUDAGNA et al. 2002; CHRISTENSEN et al. 2010; GUNVIG et al.
2012). Das BfR reagierte daraufhin mit der Empfehlung, Fleisch bei mindestens 65 °C zu garen und die Garzeiten so zu verlängern, dass die mikrobiologische Si- cherheit gewährleistet ist (BfR 2013). Da im Bereich der LTLT-Garung allerdings in der Regel Temperaturen unter 60 °C verwendet werden, muss jede Behandlung auf die mikrobiologische Unbedenklichkeit untersucht werden.
Gerade zwischen 50 und 60 °C steigt die Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Hitze deutlich an. Beispielsweise verringert sich die dezimale Reduktionszeit (D-Wert) von Listeria (L.) monocytogenes, d.h. die Zeit in Minuten, welche bei gege-
14
bener Temperatur nötig ist um die Ausgangskeimzahl um 90 % zu reduzieren, in Schweinehackfleisch von 47,17 Minuten bei 55 °C auf 5,61 Minuten bei 60 °C (MURPHY et al. 2004a). Bei der vom BfR geforderten Kerntemperatur von 65 °C be- trägt der D-Wert nur noch 1,5 Minuten. Temperaturen unter 55 °C sind noch kriti- scher zu sehen und müssen entsprechend über mehrere Stunden gegart werden, um mikrobiologische Sicherheit zu erzielen. Untersuchungen in diesen Temperaturberei- chen konnten zeigen, dass Salmonella (S.) und Listeria subspecies (spp.) 8 Stunden nach Erreichen von 53 °C Kerntemperatur in Schweinefleisch um mehr als 5 log10
KbE (Kolonie bildende Einheiten) pro Gramm Fleisch reduziert werden konnten (CHRISTENSEN et al. 2010). GUNVIG et al. (2012) zeigten durch Inokulationsversu- chen mit L. monocytogenes in Rinderhackfleisch, dass bei 53 °C Kerntemperatur und einer Haltezeit von 5 Stunden eine Reduktion von mehr als 6,7 log10 KbE/g erreicht werden kann. Bei einer Gartemperatur von 58 °C wurde dieselbe Reduktion schon nach 30 Minuten erreicht.
2.3.2 Listeria monocytogenes
Listerien gehören zu den ubiquitär verbreiteten gram positiven, kurzen Stäbchen (HOLLEY u. CORDEIRO 2014). Sie besitzen Flagellen und sind bei Zimmertempera- turen von 20-25 °C beweglich. Dabei zeigen sie charakteristische Taumelbewegun- gen. Bei 37 °C sind Listerien allerdings nicht mehr oder nur noch bedingt beweglich.
Listerien sind außergewöhnlich resistent gegen Umwelteinflüsse (FARBER 1988;
GANDHI u. CHIKINDAS 2007). Sie sind beispielsweise pH-tolerant und in der Lage bei Temperaturen von 0-45 °C zu wachsen und sind deshalb gefürchtete „Kühl- schrankkeime“ (LÜCKE u. TROEGER 2007). Menschen infizieren sich häufig durch rohe bzw. zu gering erhitzte Lebensmittel sowie im Kühlschrank gelagerte RTE (ready to eat) Produkte (DESTRO u. RIBEIRO 2014; EFSA 2014). Durch die ubiqui- täre Verbreitung der Keime sind allerdings auch viele andere Nahrungsmittel betrof- fen. Im Vergleich zu anderen vegetativen Bakterien sind Listerien besonders hitzere- sistent (FARBER 1988). Aus diesem Grund werden sie gerne als Indikatorkeime bei Inokulationsversuchen zur Überprüfung mikrobiologischer Sicherheit von Lebensmit- teln verwendet (GUNVIG et al. 2012).
15 Fälle von Erkrankungen durch Listerien (Listeriose) beim Menschen werden fast ausschließlich von Stämmen der Spezies Listeria monocytogenes ausgelöst (EFSA 2014). Im Lebensmittelsektor sind v.a. drei Serotypen von Bedeutung. Die Serotypen 1/2a und 1/2b werden am häufigsten aus Lebensmitteln isoliert, während Serotyp 4b häufiger zu lebensmittelbedingten Erkrankungen führt. In der Regel ist eine Listeriose bei immunkompetenten Menschen selbst limitierend. Vereinzelt kommt es zu grippe- ähnlichen Symptomen oder fiebrigen gastrointestinalen Beschwerden nach einer 24 stündigen Inkubationszeit. Die Inkubationszeit ist allerdings sehr variabel und reicht von wenigen Tagen bis zu 3 Monaten (HOLLEY u. CORDEIRO 2014).
In Deutschland kam es im Jahre 2014 zu 609 gemeldeten Erkrankungen (RKI 2015).
Damit hat die Zahl gegenüber dem Vorjahr (468 Erkrankungen) um 30 % zugenom- men und ist die höchste Erkrankungszahl seit 2001. Die Fallzahlen steigen seit 2011 kontinuierlich an (RKI 2015).
Listeriosen können zu schweren Erkrankungen führen, die mit einem hohen Risiko der Sepsis oder Meningitis bzw. Enzephalitis (50 %) und einer Letalität von 7 % ein- hergehen (HARTUNG et al. 2015). Die schwere Form der Erkrankung etabliert sich primär in immungeschwächten Menschen wie Patienten unter immunsuppressiver Therapie, alten Menschen sowie Patienten die unter Tumorerkrankungen leiden (EFSA 2014). Außerdem sind Diabetiker und leberkranke Patienten gefährdet.
Schwangere Frauen gehören ebenfalls zur Risikogruppe. Zwar zeigt sich bei der Mutter meistens keine deutliche Krankheitssymptomatik, allerding sind Listerien in der Lage die Plazentarschranke zu überwinden und den Fetus zu infizieren (HOLLEY u. CORDEIRO 2014). Dies führt zu Tot- oder Fehlgeburten. Zudem kann es bei Neu- geborenen durch eine späte intrauterine Infektion oder durch eine Infektion im Ge- burtskanal oder im Krankenhaus ebenfalls zu Sepsis oder Meningitiden kommen. Bei Landwirten oder Tierärzten, welche in vermehrtem Kontakt zu potentiell infizierten Tieren stehen, können auch andere Krankheitsformen auftreten. Hier sind Endokardi- tiden, Hautinfektionen und verschiedene lokale Infektionen beschrieben (HOLLEY u.
CORDEIRO 2014).
16
Das BfR empfiehlt, dass Schwangere und immungeschwächte Personen bestimmte Risikoprodukte (rohes Fleisch, Rohmilchprodukte, geräucherte oder gebeizte Fische- reierzeugnisse) meiden oder nicht verzehren, außer sie wurden direkt vorher auf mindestens 70 °C Kerntemperatur erhitzt (HARTUNG et al. 2015).
2.3.3 Salmonella Enteritidis
Salmonellen gehören zu den gram negativen und fakultativ anaeroben, beweglichen Stäbchen. Die zwei bedeutsamstem Spezies, Salmonella enterica und bongori, be- stehen aus mehr als 2500 bzw. 22 Serovaren (WINGSTRAND u. AABO 2014). Die verschiedenen membrangebundenen O-Antigene und H-Antigene der Flagellen kön- nen zur Einordung nach dem Kaufmann-White Schema genutzt werden. Man unter- scheidet verschiedene wirtsadaptierte Serotypen wie Salmonella Choleraesuis (Schwein), Salmonella Dublin (Rind) sowie Salmonella Gallinarum bzw. Pullorum (Geflügel).
In Frischfleisch kommt es bei Temperaturen unter 5 °C zu keinem bakteriellen Wachstum, allerdings ist bekannt, dass Salmonellen den Einfriervorgang, sogar über mehrere Monate, überleben können (WINGSTRAND u. AABO 2014). Wie die ver- wandten Colibakterien sind auch Salmonellen durch Hitzebehandlung relativ einfach abzutöten. Infektionsquellen stellen, neben Eiern, vor allem Puten-, aber auch Schweinefleisch dar, welche beide hohe Salmonellen-Prävalenzen aufweisen. Sal- monellosen beim Menschen können potentiell von allen Serovaren ausgelöst wer- den, allerdings dominieren hier S. Enteritidis und S. Typhimurium. Dabei kann die Infektionsdosis sehr gering sein (10 Zellen), je nach Individuum und Stamm (WINGSTRAND u. AABO 2014).
Die Salmonellose des Menschen war 2014 mit 16.222 Fällen nach der Campylobac- teriose die zweithäufigste gemeldete bakterielle Erkrankung in Deutschland (RKI 2015). Die Zahl der Salmonellosen nahm seit 2001 (77.006), mit Ausnahme der Jah- re 2006 und 2007, ab (RKI 2015). Die Daten deuten darauf hin, dass vor allem der Schlachtprozess beim Geflügelfleisch eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung der Erreger spielt (HARTUNG et al. 2015).
17 Als Symptome treten nach 12-36 Stunden gastrointestinale Beschwerden auf (EFSA 2014). Oft werden sie begleitet von Fieber, Kopf- und Muskelschmerzen. Im Allge- meinen ist die Erkrankung selbst limitierend mit einer sehr geringen Mortalitätsrate.
Problematisch wird es allerdings wenn der Mensch mit wirts-adaptierten Serovaren anderer Spezies infiziert wird. Dabei kann es zu Septikämien kommen, welche anti- biotische Behandlungen notwendig machen und Mortalitätsraten von bis zu 20-30 % erreichen können (WINGSTRAND u. AABO 2014).
Um ein Infektionsrisiko zu minimieren wird deshalb dem Salmonellen-Monitoring ein hoher Stellenwert in der Lebensmittelüberwachung eingeräumt.
2.3.4 Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC)
EHEC gehören zu den gram negativen Stäbchenbakterien. Im Gegensatz zu harmlo- seren Escherichia (E.) coli Formen können Bakterien dieser Gruppe schwere Erkran- kungen beim Menschen auslösen (FEGAN et al. 2014).
Gemäß dem Infektionsschutzgesetz (IfSG) gehören zu den EHEC Keimen diejenigen Shigatoxin bzw. Verotoxin (STEC/VTEC) bildenden E. coli, welche beim Menschen Krankheiten auslösen und damit humanpathogen sind. Dies setzt die Fähigkeit zur Bildung bestimmter Zytotoxine, sogenannter Shigatoxine (Synonym: Verotoxine), voraus. Genetisch determiniert wird diese Fähigkeit durch die stx-Gene. Zusätzliches Leitmerkmal besonders pathogener Stämme ist das eae-Gen, welches das Intimin Protein kodiert mit dessen Hilfe sich die Keime an Darmzellen anheften können (HARTUNG et al. 2015). Die verschiedenen Serotypen sind durch ihre Oberflä- chenantigene O, H und K definiert. Als wichtigster Keim im Lebensmittelbereich gilt der Serotyp O157:H7 (FEGAN et al. 2014). Das Hauptreservoir dieser Erreger sind Wiederkäuer (v.a. Rinder), allerdings werden sie auch vereinzelt bei Schweinen, Pferden, Hasen, Vögeln und Fliegen nachgewiesen. Durch fäkale Verunreinigungen kann es zur Verbreitung der Erreger kommen. Hier ist vor allem der Keimeintrag in Wasser zu nennen.
Die Ergebnisse des Zoonose-Monitoring des BfR zeigen, dass VTEC deutlich regel- mäßiger in Kotproben im Bestand bzw. am Schlachthof nachgewiesen wurden als in
18
Schlachtkörper- und Fleischproben (HARTUNG et al. 2015). Offenbar gelingt es, die Schlachtkörper vor Kontamination zu schützen. Die Nachweise im Fleisch bestätigen allerdings die Möglichkeit der Infektionsquelle und die entsprechende Wichtigkeit, das Fleisch vor dem Verzehr durchzugaren (HARTUNG et al. 2015). Obwohl E. coli O157:H7 bei Kühlschranktemperaturen kein Wachstum zeigt, bleiben die Bakterien in gekühlten oder gefrorenen Produkten für längere Zeit überlebensfähig. Diese Pro- dukte können eine erhebliche Gefahr darstellen, da E. coli O157:H7 schon bei relativ geringen Infektionsdosen zu einer Erkrankung des Menschen führen kann.
Im Allgemeinen werden die relativ hitzelabilen EHEC Keime durch Hitzebehandlun- gen ausreichend abgetötet. Kommt es trotzdem zu einer Infektion, können sehr vari- able Krankheitsverläufe entstehen, von symptomlosen Trägern bis zum Tod (FEGAN et al. 2014). Der normale Krankheitsverlauf zeichnet sich durch eine Gastroenteritis mit zunächst nicht-blutigem Durchfall aus, welcher nach einigen Tagen charakteris- tisch blutig wird. Besonders gefährlich ist die Entwicklung des hämolytisch- urämischen-Syndroms (HUS) bei etwa 10-15 % aller Patienten. Aufgrund der Shiga- toxinbildung der Erreger kommt es, neben akuten Nierenschäden, auch zu extra- renalen Komplikationen wie Ödemen, Colon Nekrosen, myokardialen Schäden oder Störungen des Zentralen Nervensystems welche zum Tod des Patienten führen kön- nen. In Deutschland kam es 2014 zu 1650 übermittelten EHEC Fällen und damit zur zweithöchsten Zahl seit 2001 (RKI 2015). Es wurden außerdem 85 HUS- Erkrankungen übermittelt. In Zusammenhang mit einer EHEC Erkrankung wurden 2 Todesfälle gemeldet (RKI 2015).
19
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Rohstoffe
Für die Schweinefleisch-Untersuchungen wurden, 24 Stunden nach der Schlachtung, Schweinerücken konventionell gemästeter Hybridschweine erworben. Zur Einord- nung der Rohstoffe wurden Leitfähigkeit und pH-Werte auf Höhe des 13./14. Brust- wirbels erhoben. Der lange Rückenmuskel (M. longissimus dorsi) wurde anschlie- ßend entnommen und von aufliegendem Fett und Bindegewebe weitgehend befreit.
Zur Charakterisierung der mikrobiologischen Belastung wurde eine Probe vom krani- alen Ende des Muskels entnommen. Um den Einfluss tierindividueller Unterschiede innerhalb eines Versuchsdurchgangs auszuschließen, wurde das Fleisch eines Schweines pro Durchgang verwendet und die Muskeln nach Auslösen in 6 (1. Ver- suchsteil) bzw. 4 (2. Versuchsteil) Proben unterteilt. So konnte eine optimale Ver- gleichbarkeit der untersuchten 6 bzw. 4 unterschiedlichen Behandlungen erzielt wer- den. Das Fleisch wurde nicht eingefroren, wodurch Veränderungen durch Eiskristall- bildung ausgeschlossen werden konnten. Um mögliche Unterschiede innerhalb des Muskels zu minimieren, wurden die Proben nach dem lateinischen Quadrat angeord- net (Tab. 1). Insgesamt wurden 28 Rückenmuskeln von 14 Mastschweinen unter- sucht.
Tab. 1: Lateinisches Quadrat zur homogenen Verteilung der Proben (Versuchsteil 1).
Durchgang 10 h 53 °C 10 h 58 °C 20 h 53 °C 20 h 58 °C 30 h 53 °C 30 h 58 °C
1 a b c d e f
2 f a b c d e
3 e f a b c d
4 d e f a b c
5 c d e f a b
6 b c d e f a
a, b, c = Linker M. longissimus dorsi (vorne, mitte, hinten) d, e, f = Rechter M. longissimus dorsi (vorne, mitte, hinten)
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Für die Putenversuche wurden die 42 Brustmuskeln 16 Wochen gemästeter, weibli- cher Puten der Rasse „Big 6“ 24 Stunden nach der Schlachtung erworben. Um den Einfluss von Haltung oder Fütterung zu minimieren, wurden nur Tiere aus einer Charge bezogen. Es wurden Messungen der Leitfähigkeit und des pH-Werts im kau- dalen Bereich des M. pectoralis superficialis (supf.) vorgenommen. Zur Charakteri- sierung der mikrobiologischen Belastung wurde auch hier eine Probe entnommen und untersucht. Nach der Rohfleischuntersuchung wurden die Brustmuskeln vaku- um-verpackt und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Um die Einflüsse des Auf- tauprozesses möglichst gering zu halten, wurde das Fleisch langsam über 48 Stun- den bei 4 °C aufgetaut. Die Putenbrustmuskeln wurden im Ganzen erhitzt.
3.2 Versuchsaufbau
3.2.1 Inokulationsversuche
Suspensionen spezifischer Bakterienstämme (107 Keime/ml, Inokulum 0,1 ml) wur- den in die Schweinefleisch- (M. longissimus dorsi) sowie Putenfleischmuskulatur (M.
pectoralis supf.) injiziert. Eine Markierung der Inokulationsregionen wurde durch Beimischung grüner Lebensmittelfarbe (Städter) erreicht. Die Proben wurden in Kombidämpfern bei 20 % Feuchte über 3 bzw. 10 Stunden bei 53 °C gegart. An- schließend wurde die Gegend um den Inokulationspunkt identifiziert und steril ent- nommen.
Bei Schweinefleisch wurde zusätzlich eine Niedrigtemperatur-Erhitzung auf 60 °C Kerntemperatur bei 60 °C Ofentemperatur untersucht. Außerdem wurden konventio- nell gegarte Proben (Erhitzung auf 80 °C Kerntemperatur bei 180 °C Ofentempera- tur) untersucht.
Als Positivkontrollen dienten gleich behandelte Rohfleischproben, welche über die Garzeit im Kühlschrank bei 7 °C gelagert wurden. Bestimmungen der Mikroorganis- men erfolgten gemäß LFGB bzw. ISO Normen.
21 3.2.2 Langzeit-Garung Schweinefleisch
3.2.2.1 Versuchsteil 1
Die Fleischproben wurden direkt nach dem Auslösen zugeschnitten und über 10, 20 bzw. 30 Stunden bei 53 und 58 °C erhitzt (LTLT-Proben). Nach dem Erhitzungsvor- gang wurden die Proben auf Wasserbindung, Farbe bzw. Garungsgrad, Geschmack und Textur untersucht. Zudem wurden mikrobiologische Untersuchungen auf Ge- samtkeimzahl (GKZ), Enterobakterien und Pseudomonaden durchgeführt.
3.2.2.2 Versuchsteil 2
In einem zweiten Versuchsabschnitt wurden die Fleischproben zunächst ausgelöst, zugeschnitten und unter Vakuum für 5 Tage bei 4 °C gelagert. Anschließend wurden über 20 Stunden gegarte LTLT-Proben (Kern-/Ofentemperatur 53 bzw. 58 °C), kon- ventionell gegarte Proben (Erhitzung auf 80 °C Kerntemperatur bei 180 °C Ofentem- peratur) und einer Niedrigtemperaturvariante (Erhitzung auf 60 °C Kerntemperatur bei 60 °C Ofentemperatur) zubereitet und verglichen. Dazu wurde, neben verschie- denen chemischen und physikalischen Untersuchungen, eine Verkostung durch ein sensorisches Panel, bestehend aus Mitarbeitern des LMQS, durchgeführt.
3.2.3 Langzeit-Garung Putenfleisch
Die Fleischproben wurden ebenfalls für 10, 20 bzw. 30 Stunden bei 53 und 58 °C erhitzt (LTLT-Proben). Nach dem Erhitzungsvorgang wurden die Proben hinsichtlich mikrobiologischer Qualität, Wasserbindung, Farbe, Geschmack und Textur vergli- chen.
Neben den LTLT-Proben wurden außerdem konventionell gegarte Proben (Erhitzung auf 80 °C Kerntemperatur bei 180 °C Ofentemperatur) untersucht.
22
3.3 Untersuchungsmethoden
3.3.1 Kombidämpfer und Erhitzungsvarianten
Alle Garversuche wurden in Kombidämpfern „Joker T“ der Firma Eloma GmbH durchgeführt (Abb. 1). Um die Austrocknung zu minimieren, wurde nach Rückspra- che mit dem Hersteller des Kombidämpfers eine Feuchtigkeitseinstellung von 20 % gewählt, was der Empfehlung für Niedrigtemperaturgaren entsprach. Für die Versu- che standen 2 Kombidämpfer zur Verfügung, so dass parallel Langzeit-Garungen zweier Temperaturvarianten (53 und 58 °C) erfolgen konnten. Die Öfen waren mit einem integrierten Temperatursensor zur Überwachung der Kerntemperatur ausge- stattet. Die Erhitzung erfolgte bei allen Varianten in Aluschalen auf Grillrosten
LTLT-Proben wurden bei gleichbleibender Ofentemperatur zunächst langsam auf die gewünschte Kerntemperatur erhitzt. Nach Erreichen der Kerntemperatur wurde diese für bis zu 30 Stunden gehalten.
In Versuchsteil 1 wurden pro Ofen (53 und 58 °C) jeweils drei Schweinefleisch- Proben erhitzt und nach 10, 20 bzw. 30 Stunden Haltezeit entnommen und unter- sucht.
Im 2. Versuchsteil wurde eine einzelne Schweinefleisch-Probe pro Ofen erhitzt. Zu- nächst fand die Langzeiterhitzung bei 53 bzw. 58 °C über 20 Stunden statt. An- schließend wurden die Niedrigtemperaturvariante und das konventionell gegarte Produkt zubereitet.
Die Putenfleischproben wurden wie in Versuchsteil 1 erhitzt und nach 10, 20 und 30 Stunden entnommen. Anschließend wurde eine Probe konventionell gegart.
.
23 Abb. 1: (A) verwendeter Kombidämpfer „Joker T“ (Eloma.GmbH, Deutschland); (B) rohe Schweinefleischprobe (M. longissimus dorsi (Mittelstück)); (C) 30 Stunden bei 53 °C gegarte Putenfleischprobe (M. pectoralis). Temperaturkontrolle erfolgte mittels Kerntemperaturfühler.
24
3.3.2 Mikrobiologie
Mikrobiologische Untersuchungen wurden in Anlehnung an die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren, § 64 LFGB und entsprechenden ISO Normen durchge- führt.
Untersuchung der Rohstoffe
Das Rohmaterial wurde gemäß ISO 4833-1:2013 auf mesophile aerobe Gesamt- keimzahl (GKZ), gemäß ISO 13720:2010 auf Enterobakterien und gemäß ISO 4832:2006 auf Pseudomonaden untersucht.
Dazu wurde 24 Stunden nach Schlachtung 10 g Probe aus dem kranialen Bereich des M. longissimus dorsi bzw. aus dem M. pectoralis supf. entnommen und in 90 ml einer Natrium-Chlorid-Pepton-Lösung (Merck KGaA, Darmstadt) überführt. Die Pro- ben wurden mit Hilfe eines Stomachers (Seward, Thetford, England) für 2 Minuten bei 200 Umdrehungen pro Minute (rpm) homogenisiert und nach dezimalen Verdün- nungsreihen auf die verschiedenen Selektivplatten aufgetragen. Die Quantifizierung der GKZ erfolgte mittels Plattengussverfahren auf Standard 1 Agar (Merck KGaA, Darmstadt) nach einer Bebrütungsdauer von 72 h bei 30 °C. Enterobakterien wurden mittels Oberflächenspatelverfahren (1. Versuchsteil Schwein) bzw. Plattengussver- fahren (2. Versuchsteil Schwein und Putenfleisch) auf VRB Agar (Oxoid GmbH, We- sel) nach Bebrütung für 24 Stunden bei 37 °C bestimmt. Durch den Zusatz von Kris- tallviolett und Gallesalzen wurde die gram-positive Begleitflora im Wachstum ge- hemmt. Laktose Abbau wurde durch den beigefügten Indikator Neutralrot durch Rot- färbung verdeutlicht. Laktose negative Enterobakterien wuchsen hingegen farblos. E.
coli und coliforme Bakterien führten außerdem zu einer Ausbildung eines Galle- Präzipitat Hofes um die Kolonie. Enterokokken wurden durch rosafarbene „Nadel- stichkolonien“ gekennzeichnet. Die Bestimmung der Pseudomonaden erfolgte mittels Oberflächenspatelverfahren auf CFC Agar (Oxoid GmbH, Wesel) nach Bebrütung für 48 Stunden bei 25 °C. Neben der niedrigen Inkubationstemperatur wurden diesem Agar Antibiotika zur Hemmung störender Begleitflora beigefügt. Pseudomonas aero- ginosa wuchs grünlich und fluoreszierte unter UV Licht. Andere Pseudomonas spp.
25 wuchsen weiß, gelblich bis cremefarben. Alle Bestimmungen wurden im Doppelan- satz durchgeführt. Die entsprechenden Kolonien wurden gezählt und die Keimzahlen mit Hilfe des gewogenen arithmetischen Mittels berechnet. Nach der Garung wurden erneut Proben entnommen und untersucht.
Inokulationsversuche
Neben der Untersuchung auf nativer Keimbasis wurden Inokulationsversuche le- bensmittelrelevanter Keime (L. monocytogenes, E. coli und Salmonella E.) durchge- führt (Tab. 2). Dazu wurde eine Technik, modifiziert nach CHRISTENSEN et al.
(2010) angewandt. Die Bakterien wurden in drei verschiedene Brain Heart Infusion (BHI, Merck KGaA, Darmstadt) Bouillons überführt und wuchsen innerhalb von 24 Stunden bei 37 °C auf Keimzahlen von etwa 108 Keimen pro ml an. Diese Bakterien- lösungen wurden anschließend mit BHI Lösung und grüner Lebensmittelfarbe (Städ- ter GmbH, Allendorf, Lumda) auf eine Konzentration von 107 Keimen/ml verdünnt (0,2 ml Bakteriensuspension, 0,5 ml Lebensmittelfarbe und 1,3 ml BHI Lösung). Ein Inokulum von 0,1 ml (etwa 106 Bakterien) wurde mit einer 1 ml Spritze in die Fleisch- proben in einer dreieckigen Anordnung injiziert (Abb. 2).
Nach einer Anhaftungsphase von 20 Minuten wurden die Proben hitzebehandelt. Mit Hilfe eines integrierten Temperatursensors wurde die Kerntemperatur der Proben überwacht. Zeitgleich wurden Kontrollproben mit denselben Suspensionen inokuliert und bei 7 °C für die Dauer der Hitzebehandlung gelagert. Nach den Hitzebehandlun- gen wurden Proben und Kontrollproben quantitativ und qualitativ auf die injizierten Indikatorkeime hin untersucht. Dazu wurden je 25 g der durch den Lebensmittelfar- benzusatz gefärbten Inokulationsregionen aseptisch in einen Stomacher-Beutel über- führt und mit 225 ml Pepton Wasser (Oxoid GmbH, Wesel) bzw. ½ Fraser Bouillon (Oxoid GmbH, Wesel), im Falle von L. monocytogenes, aufgefüllt.
Für die quantitative Analyse wurde jeder Beutel homogenisiert (200 rpm für 2 Minu- ten), Verdünnungsreihen angelegt und auf die entsprechenden Selektivagar ausplat- tiert. S. Enteritidis Proben wurden auf XLD Agar (Oxoid GmbH, Wesel) ausplattiert, E. coli Proben wurden gemäß ISO 16649:2001 mit TBX Agar gegossen (Oxoid
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GmbH, Wesel) und L. monocytogenes Proben wurden nach ISO 11290-2:2005 auf OCLA Agar (Oxoid GmbH, Wesel), nach einer Wiederbelebungsphase von einer Stunde bei 20 °C, ausplattiert. Alle Bestimmungen wurden im Doppelansatz durchge- führt.
Tab. 2: Herkunft und Charakterisierung der für die Inokulation verwendeten Stämme
Name Serovar Herkunft
Salmonella enterica subsp.
enterica
Enteritidis O9:g,m:-
Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Samm- lung von Mikroorganismen und Zellkultu-
ren GmbH, Braunschweig (DSM Nr. 14221)
Listeria monocytogenes 1/2a Feldstamm, Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für Geflügel, Hannover
Escherichia coli
O157:H7 SOB/ßGLU- Stx2 negative
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin
Abb. 2: Inokulationsstellen der Schweinefleischproben. Mit Hilfe einer Spritze wurden die jeweiligen Inokulate (je 0,1 ml) in dreieckiger Anordnung in den Muskel injiziert.
Der Kerntemperaturfühler (umrandetes Kreuz) wurde in dieselbe Tiefe eingestochen.
Qualitative Analysen wurden nach ISO 6579:2003 (S. Enteritidis) und ISO 11290- 1:2005 (L. monocytogenes) durchgeführt.
27 S. Enteritidis Proben wurden in Pepton-Wasser (Oxoid GmbH, Wesel, CM1049B) für 24 Stunden bei 37 °C vorangereichert. Anschließend erfolgte die Überführung von 1 bzw. 0,1 ml in zwei Anreicherungsmedien (Tetrathionat bzw. Rappaport-Vassiliadis Medium (Oxoid GmbH, Wesel)). Nach Inkubation bei 37 bzw. 41,5 °C für 24 Stunden wurde mittels Impföse ein Tropfen entnommen und auf XLD (Oxoid GmbH, Wesel,) bzw. Rambach (VWR International GmbH, Darmstadt) Agar ausgestrichen. Beide Platten wurden für 24 h bei 37 °C inkubiert und anschließend auf S. Enteritidis unter- sucht. Die Salmonellen fermentierten die im XLD Agar enthaltene Xylose und decar- boxylierten das ebenfalls zugesetzte Lysin. Der pH-Wert verschob sich dadurch in den alkalischen Bereich. Zusätzlich bildeten die Bakterien durch eine Reaktion von Eisensulfid Thiosulfat und Ammoniumeisencitrat schwarze Koloniezentren. Typi- sches Wachstum auf XLD Agar zeigte sich daher als farblose Kolonien mit schwar- zem Zentrum (Abb. 3). Auf Rambach Agar bildeten die Salmonellen aus Propy- lenglycol Säure, was sich in Verbindung mit einem pH Indikator als Rotfärbung der Kolonien darstellte (Abb. 3). Um coliforme Keime von Salmonellen zu unterscheiden enthielt der Agar ein Chromogen, welches die Anwesenheit der für Coliforme charak- teristischen ß-Galactosidase-Spaltung anzeigte. Die gram positive Begleitflora wurde bei beiden Nährböden durch den Zusatz von Natriumdesoxycholat gehemmt.
Abb. 3: Qualitativer Nachweis von S. Enteritidis. auf XLD (li) bzw. Rambach Agar (re)
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Zur qualitativen Analyse von E. coli O157:H7 wurde der Stomacher Beutel für 24 Stunden bei 42 °C angereichert. Nach Inkubation wurde mittels Impföse ein Tropfen entnommen und auf TBX Agar (Oxoid GmbH, Wesel) ausgestrichen. Die Platten wurden für 24 Stunden bei 42 °C inkubiert. TBX Agar enthielt Gallensalze zur Hem- mung gram positiver Begleitflora sowie Trypton als Stickstoff, Vitamin und Aminosäu- relieferant. Zur Unterscheidung von E. coli O157:H7 von anderen E. coli Stämmen war in dem TBX Agar zusätzlich ein Chromophor (X-Glucuronid) enthalten. Die meis- ten E. coli Keime exprimieren das Enzym ß-Glucuronidase, welches X-Glucuronid spaltet, wodurch der Farbstoff in der Zelle akkumulieren kann. Solche E. coli Kolo- nien färbten sich blau. E. coli O157:H7 exprimierte dagegen keine ß-Glucuronidase und konnte den Farbstoff deshalb nicht umsetzten. Wachstum von E. coli O157:H7 wurde daher anhand der Bildung farbloser bzw. weißer Kolonien auf TBX Agar nach- gewiesen (Abb. 4).
Abb. 4: Qualitativer Nachweis von E. coli O157:H7 auf TBX Agar
29 Listeria monocytogenes Proben wurden zunächst in ½ Fraser Bouillon (Oxoid GmbH, Wesel) 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurde 0,1 ml der Lösung in Fraser Bouillon (Oxoid GmbH, Wesel) überführt. Nach erneuter Inkubation für 48 Stunden bei 37 °C wurde mittels Impföse ein Tropfen der Bakteriensuspension auf die beiden Selektiv Nährböden OCLA (Oxoid GmbH, Wesel) und Brilliance Listeria Agar (Oxoid GmbH, Wesel) ausgestrichen. Die Nährböden wurden bei 37 °C für 24 Stunden bebrütet. Bei beiden Nährböden beruhte das Prinzip der Identifizierung von Listerien auf der Identifizierung blau-grüner Kolonien (Abb. 5). Die Färbung entstand durch Spaltung des Chromophor X-Glucosids. Zusätzlich wurden die Kolonien von L. monocytogenes von nicht pathogenen Listerien durch Ausbildung eines opaken Hofes durch Phospholipaseaktivität unterschieden. Die Aktivität der Phosphotidylino- sitol-Phospholipase C (PIPLC) von L. monocytogenes wurde mit Hilfe des Zusatzes von Phosphatidylinositol in der OCLA Rezeptur nachgewiesen. Des Weiteren wurde mit Hilfe des Brilliance Listeria Agar durch den Zusatz von Lecithin die Lecithinase Aktivität (Phosphotidylcholin-Phospholipase C = PCPLC) nachgewiesen. Beide En- zyme sind für die Ausprägung der Pathogenität von L. monocytogenes essentiell und ihr Vorhandensein konnte somit als Nachweis dienen. Die Selektivität der Nährboden wurde durch eine Kombination aus Lithiumchlorid sowie antimikrobieller und fungizi- der Komponenten erreicht.
Abb. 5: Qualitativer Nachweis von L. monocytogenes auf OCLA Agar
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3.3.3 pH-Messungen
Zur Einordnung des Rohmaterials wurden pH-Werte 24 Stunden nach Schlachtung im Rückenmuskel (Schlachtschweine) zwischen den 13. und 14. Brustwirbeln bzw. in der Putenbrustmuskulatur erhoben. Zudem wurden im Versuchsteil 2 (Schweine- fleisch) auch pH-Werte der gegarten Produkte bestimmt. Das dafür genutzte pH Me- ter der Firma Knick GmbH (Berlin, Deutschland) war das tragbare Model Portamess® 911, kombiniert mit einer Glaselektrode (InLab 427®, Mettler-Toledo, Urdorf, Schweiz) und einem Temperatursensor. Das pH Meter wurde vor jedem Versuchstag mit 2 Kalibrierlösungen (pH 4 bzw. 7) kalibriert. Zwischen den Messungen wurde die Glaselektrode mit destilliertem Wasser gereinigt. Die Werte wurden in Triplikaten er- hoben.
3.3.4 Leitfähigkeitsmessungen
Zur Einordnung des Rohmaterials wurden Leitfähigkeitswerte 24 Stunden nach Schlachtung im Rückenmuskel (Schlachtschweine) zwischen den 13. und 14. Brust- wirbeln bzw. in der Putenbrustmuskulatur erhoben. Genutzt wurde ein tragbares Leit- fähigkeitsmessgerät LF-Star der Firma Matthäus (Klausa, Deutschland). Das LF Messgerät wurde vor jedem Versuchstag mit einem definierten Messwiderstand von 10 Millisiemens (mS) kalibriert. Ergebnisse der Messungen wurden in der Einheit mS/cm ausgedrückt.
3.3.5 Schrumpfung des Muskels
Um die hitzebedingte Schrumpfung der Muskelfasern und damit des gesamten Mus- kels zu quantifizieren wurden der Umfang und die Länge der Proben vor (Uv bzw. Lv) und nach Behandlung (Un bzw. Ln) gemessen. Dazu wurde ein Maßband um den Muskel gelegt und der Umfang in cm abgelesen. Die Länge wurde mit Hilfe eines Messschiebers mit Skalenanzeige (MarCal 16 GN) der Firma Mahr (Göttingen, Deutschland) bestimmt. Die transversale und longitudinale Schrumpfung wurde pro- zentual berechnet.
