Archiv "Diagnostische Bedeutung frei zirkulierender Nukleinsäuren" (03.05.2002)

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A1224 Deutsches Ärzteblatt½½½½Jg. 99½½½½Heft 18½½½½3. Mai 2002

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ie Existenz von freien Nukle- insäuren im menschlichen Plas- ma wurde 1948 von Mandel und Métais (23) erstmalig beschrieben. Al- lerdings geriet diese Beobachtung über viele Jahre hin in Vergessenheit und wurde erst in den 60er-Jahren durch den Nachweis von zirkulierender DNA bei Patienten mit systemi- schem Lupus erythematodes (SLE) wieder aufgegriffen. In den folgenden Jahren wurde erkannt, dass freie nicht zell- oder virusgebundene Plasma- DNA nicht nur bei SLE-Patienten, sondern auch bei Patienten mit anderen Erkrankungen sowie bei gesunden Menschen vorkommt (14). In den 70er-Jahren wurde beobachtet, dass bei Patienten mit malignen Tumoren tendenziell eine höhere DNA-Kon- zentration vorliegt als bei Patienten mit benignen Erkrankungen. Heute geht man davon aus, dass ein si- gnifikanter Anteil der zirkulierenden DNA im Serum/Plasma von Patienten mit malignen Erkrankungen aus Tu- morzellen stammt (33).

Tumorerkrankungen

Die Diagnostik des frühen Metastasie- rungsstadiums ist ein wesentliches Problem in der Nachsorge von Tumorpatienten, da insbesondere bei Patienten in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung die Prognose durch eine drohende Fernmetastasierung drastisch verschlechtert ist. In der Ver- gangenheit sind daher zahlreiche La- boruntersuchungen für die Verlaufs- diagnostik von Tumorpatienten eva- luiert worden. Viele der dabei einge- setzten Serumtests erwiesen sich jedoch als ungeeignet. Nach neueren Forschungsergebnissen kann aus Se- rum/Plasma von Tumorpatienten ge-

netisches Material extrahiert werden, das Charakteristika der DNA aus Tu- morzellen aufweist (33). Insbesondere können Mutationen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen (32), Gen-Rearrangements (7) und Genam- plifikationen, Mikrosatellitenaltera- tionen (24) sowie tumorassoziierte Hypermethylierungen regulatorischer Gensequenzen in DNA-Material aus zellfreiem Serum/Plasma analysiert werden. Beispielsweise gelang im Plasma von Patienten mit malignem Melanom im Stadium der regionären Metastasierung (Stadium III) der Nachweis tumorassoziierter Mikrosa- telliten-DNA. Eine amerikanische Studie hat kürzlich gezeigt, dass die Präsenz solcher Mikrosatelliten-DNA im Plasma mit einer signifikant erhöh- ten Rezidivrate und einer verminder- ten Gesamtüberlebensrate einhergeht (27). Weiter gelang an Plasma-DNA von Patienten mit Prostatakarzino- men bei über 70 Prozent der Fälle der Nachweis einer tumorassoziierten Hy- permethylierung spezifischer Gense- quenzen. Vergleichbar hohe Anteile ergaben sich auch bei anderen soliden Tumoren. Bei einem Großteil der untersuchten Blutproben wurden kri- tische Mutationen in Bereichen klassi- scher Onkogene und Tumorsuppres- sorgene (K-ras, N-ras, p53) gefunden (1, 3, 25, 26).

Weitere potenzielle Anwendungs- gebiete einer extrazellulären Nukle- insäurendiagnostik ergäben sich für die Transplantationsmedizin über den Nachweis spenderspezifischer Nukle-

insäuren in Serum/Plasma von Or- gantransplantierten im Verlauf von akuten und chronischen Abstoßungs- reaktionen (22).

Virusassoziierte Tumorerkrankungen

Bei der Entstehung bestimmter Neo- plasien spielen offensichtlich Viren eine zentrale Rolle. Zu diesen Erkran- kungen zählt das in Südostasien ge- häuft vorkommende Nasopharynxkar- zinom, das ätiologisch mit einer Ep- stein-Barr-Virus-(EBV-)Infektion as- soziiert ist. Kürzlich wurde von einer chinesischen Arbeitsgruppe gezeigt, dass bei einem Großteil der Patienten mit Nasopharynxkarzinom im Se- rum/Plasma freie EBV-DNA zirku- liert (20). Eine hohe Serumkonzen- tration dieser freien EBV-DNA war den Untersuchungen nach mit einem schwereren Krankheitsverlauf assozi- iert und erwies sich damit als ein unab- hängiger prognostischer Faktor. Kon- trollierte Verlaufsstudien zeigten, dass klinische Vollremissionen mit einer Elimination der extrazellulären EBV- DNA einhergingen und dass ein er- neuter Nachweis von zirkulierender EBV-DNA sehr frühzeitig ein begin- nendes Rezidiv anzeigte.

Vergleichbare Resultate wurden auch bei Patientinnen mit Zervixkar- zinomen erzielt. Bei der Entstehung dieser Tumorentität sind humane Pa- pillomviren (HPV) beteiligt. So kann bei über 95 Prozent aller invasiven Zervixkarzinome integrierte HPV- DNA im Tumormaterial nachgewiesen werden. Bei einem hohen Prozent- satz der Zervixkarzinomzellen ist dies HPV-16-DNA. Nach neueren For- schungsergebnissen ist zirkulierende HPV-DNA bei bis zu 70 Prozent der

Diagnostische Bedeutung frei zirkulierender Nukleinsäuren

Uwe Reinhold

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, Claus H. Schröder

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Editorial

1Universitäts-Hautklinik und Poliklinik (Direktor: Prof.

Dr. med. Wolfgang Tilgen), Universitätskliniken des Saarlandes, Homburg/Saar

2 Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen (Leiter:

Prof. Dr. rer. nat. Claus H. Schröder) Deutsches Krebsfor- schungszentrum, Heidelberg

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Patientinnen mit Zervixkarzinomen nachweisbar (5). Die Präsenz von HPV-DNA im Plasma korrelierte jedoch nicht mit dem Tumorstadium.

Allerdings war in erfolgreich behan- delten Fällen mit nachfolgender Voll- remission bei vorher HPV-DNA-positiven Fällen anschließend im Plasma keine HPV-DNA mehr nachweisbar, während Frührezidive und progre- diente Erkrankungsstadien mit erneut oder persistierend positiven HPV- DNA-Befunden einhergingen.

Pränatale Diagnostik

Im Jahre 1997 gelang erstmalig der Nachweis fetaler DNA im Plasma von Schwangeren. Im Vergleich zur DNA aus zirkulierenden Fetalzellen ist die Menge von fetaler DNA im zellfreien Plasma/Serum deutlich höher (13, 18, 36). Während im ersten Trimenon der Anteil zirkulierender Fetalzellen etwa 0,001 Prozent der Blutzellfraktion be- trägt, wird in dieser Schwangerschafts- phase bereits circa 3,4 Prozent der zirkulierenden Gesamt-DNA im Plasma durch fetale DNA repräsentiert. Im dritten Trimenon steigt dieser Anteil auf circa 6,2 Prozent an, während der Anteil fetaler Zellen im Blut der Schwangeren etwa 0,01 Prozent be- trägt.

Es ist davon auszugehen, dass sich, basierend auf diesen Befunden, ein neues Anwendungsgebiet für die prä- natale DNA-Diagnostik entwickeln wird (21, 28). Das einfache und nichtinvasive Verfahren, die DNA aus maternalem Plasma zu gewinnen, ist eine attraktive Alternative zu den bisherigen invasiven Methoden der DNA-Gewinnung, beispielsweise zur Amniozentese. Die derzeit am weite- sten entwickelte Anwendungsmög- lichkeit betrifft die nichtinvasive Be- stimmung des fetalen Rhesus-D-Sta- tus in maternalem Plasma (38). Weite- re potenzielle Anwendungsmöglich- keiten für die pränatale Diagnostik betreffen die Früherkennung genetischer Erkrankungen, wie bei der myo- tonen Dystrophie (2) und der Achon- droplasie (31) bereits gezeigt werden konnte. Nach neuen Untersuchungs- ergebnissen könnte die quantitative

Bestimmung des fetalen DNA-Gehal- tes im Plasma eventuell auch eine diagnostische Bedeutung bei schwanger- schaftsassoziierten Erkrankungen, wie zum Beispiel der Präeklampsie (12, 16) und bei drohenden Frühgebur- ten erlangen (17). Im Serum von Schwangeren mit klinisch manifester Präeklampsie wurden im Vergleich zu schwangeren Kontrollpersonen bis zu fünffach erhöhte Konzentratio- nen an fetaler DNA beobachtet (19).

Erste Verlaufsstudien haben ergeben, dass der Anstieg der fetalen DNA- Konzentration im Serum zeitlich der klinischen Manifestation der Prä- eklampsie vorausgeht und als diagno- stischer Parameter bei Risikopatien- tinnen genutzt werden kann (16).

RNA zellulären und viralen Ursprungs

Einer makroskopisch nachweisbaren Fernmetastasierung geht eine zeitlich variable Phase voraus, in der bereits Tumorzellen im peripheren Blut vorhanden sind. Die frühzeitige Detekti- on von Tumorzellen im peripheren Blut könnte daher bei klinisch tu- morfreien Patienten eine beginnende Fernmetastasierung anzeigen (11).

Die derzeit untersuchten Verfahren zum Nachweis von zirkulierenden Tu- morzellen beruhen im Wesentlichen auf der Identifizierung tumor- oder gewebeassoziierter RNA aus Blutzell- material.

Beispielsweise gelingt über den Nachweis von spezifischer mRNA für Tyrosinase, einem Schlüsselenzym bei der Melaninsynthese, der Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut von Melanompatienten. Verfahren zum molekulargenetischen Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen konnten allerdings bisher nicht stan- dardisiert werden und sind selbst bei positiven Reaktionen hinsichtlich ih- rer diagnostischen Relevanz umstrit- ten. Erschwerend kommt hinzu, dass zirkulierende Tumorzellen offensichtlich nur passager und nicht permanent nachweisbar vorhanden sind (30).

Zellfreie RNA konnte bereits 1972 (14) bei gesunden Individuen, später auch bei Krebspatienten (37) nachge-

wiesen werden. Neue Perspektiven zur Fernmetastasierung ergeben sich aus dem erstmals 1998 geführten Nachweis von tumorassoziierter ex- trazellulärer RNA im Serum/Plasma von Patienten mit malignem Melanom (9, 15). Diese Beobachtung erschien zunächst unglaubwürdig, da im Se- rum/Plasma in hoher Konzentration RNA-abbauende Enzyme (RNasen) vorhanden sind. Allerdings gibt es Hinweise dafür, dass zirkulierende RNA über assoziierte Moleküle (zum Beispiel als RNA-Proteolipidkomple- xe) vor dem Angriff von Serum- RNasen geschützt sein könnten (37).

Eigene Untersuchungen bei Me- lanompatienten deuten darauf hin, dass extrazelluläre RNA im Serum in- nerhalb von Apoptosekörperchen vorliegt und damit vor einem Angriff RNA-abbauender Enzyme geschützt ist (10). Nachfolgende Studien haben die Präsenz tumorassoziierter RNA im Serum/Plasma auch bei Patienten mit anderen Tumorentitäten (Bron- chial-, Pankreas-, Mammakarzinom) bestätigt (4, 6, 8).

Kürzlich wurde die Präsenz fetaler mRNA im Serum/Plasma von Schwangeren nachgewiesen (29). Ihre Identifizierung erlaubt daher grundsätzlich auch eine Analyse der fetalen beziehungsweise einer aber- ranten Genexpression.

Die Präsenz zellfreier RNA im Blut ist auch für die Infektion mit DNA-Vi- ren belegt. Beispiele sind EBV-RNA bei Patienten mit Nasopharynxkarzi- nom (20) und HPV-E6-mRNA bei Pa- tientinnen mit Zervixkarzinom (35).

Untersuchungen der Autoren von RNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) in Gewebe und Blut ermöglichen die Be- stimmung verschiedener Stadien der chronischen Infektion und insbesondere auch der okkulten Infektion (34).

Ein hierfür entwickeltes RT-PCR-Ver- fahren unterscheidet Transkripte vol- ler Länge von verkürzten Transkripten, denen ein für die HBV-Replikation es- senzieller Bereich fehlt. Eine Studie mit Gewebeproben von HBV-Trägern mit hepatozellulärem Karzinom be- legte einen zunehmenden Anteil ver- kürzter RNA-Transkripte mit steigen- dem Alter der Patienten und mit der Progression hin zu nichtreplikativen M E D I Z I N

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Infektionsstadien. Bei der Untersu- chung zirkulierender viraler RNA aus Serum ergab sich ein ähnliches Bild der Infektionsprogression. Die unter- scheidbaren Formen viraler Serum- RNA gestatteten somit, im Zusam- menwirken mit der konventionellen Serologie, Infektionsstadien differen- zierter als bisher anzusprechen. Ein diagnostisches Potenzial liegt insbesondere in der Anwendung eines noch zu etablierenden automatisierten Nachweisverfahrens auf okkulte In- fektionen, die bisher vielfach nur über Leberbiopsien erfassbar sind.

Zusammenfassend lässt sich fest- stellen, dass im menschlichen Se- rum/Plasma nachweisbare Mengen an freien Nukleinsäuren vorliegen, die potenziell für die nichtinvasive medi- zinische Diagnostik genutzt werden können. Über die Herkunft und bio- chemische Struktur der frei zirkulierenden Nukleinsäuren ist bisher nur sehr wenig bekannt. Die vorliegenden Studienergebnisse deuten jedoch an, dass über den spezifischen Nachweis freier DNA und RNA neue diagnostische Ansätze entwickelt werden kön- nen, deren zukünftige Anwendung in der Frühdiagnostik, Therapieeffizi- enzkontrolle und im Patientenmonito- ring nach erfolgter Therapie liegen könnte. Weitere Forschungsanstren- gungen zur Etablierung und Optimie- rung der Methodik und zur Standardi- sierung der Technik sind erforderlich, um den klinischen Wert dieses neuen diagnostischen Ansatzes sicher beur- teilen zu können.

Manuskript eingereicht: 26. 3. 2001; revidierte Fassung angenommen: 16. 1. 2002

❚Zitierweise dieses Beitrags:

Dtsch Arztebl 2002; 99: A 1224–1228 [Heft 18]

Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literatur- verzeichnis, das über den Sonderdruck beim Verfasser und über das Internet (www.aerzteblatt.de) erhältlich ist.

Anschrift der Verfasser:

Prof. Dr. med. Uwe Reinhold Universitäts-Hautklinik und Poliklinik Universitätskliniken des Saarlandes 66421 Homburg/Saar

Prof. Dr. rer. nat. Claus H. Schröder Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 280 69120 Heidelberg

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nter dem Titel „Das Genompro- jekt und seine Konsequenzen für die Medizin“ berichtete Prof. Dr.

H.-Hilger Ropers vom Max-Planck- Institut für Molekulare Genetik, Ber- lin, auf dem 26. Interdisziplinären Forum der Bundesärztekammer über die bisherigen Erfolge des weltweit operierenden Forschungsvorhabens zur Entschlüsselung des menschlichen Genoms. Das Forum fand vom 10. bis zum 12. Januar 2002 statt. Er betonte, dass die nahezu abgeschlossene Se- quenzierung des menschlichen Ge- noms einen wichtigen ersten Schritt zur Aufklärung der Funktion aller Ge- ne und für das Verständnis der Lebens- prozesse darstellt. Jedoch liegt die Aufklärung der Funktion aller Gene noch in weiter Ferne.

Besonders hervorzuheben ist, so Ropers, die Erarbeitung der Identität und Funktion der genetischen Varian- ten, die bei vielen Krankheiten wie zum Beispiel beim Diabetes mellitus, bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und beim Krebs eine Rolle spielen. Erst in vielen Jahren werde sich herausstel- len, ob sich aus diesen Kenntnissen therapeutische oder präventive Maß- nahmen ableiten lassen.

Keine voreilige Euphorie

Ropers verwies auf die bisherigen Er- folge bei der Klassifikation und The- rapie maligner Tumoren unter Einbe- ziehung der genetischen Faktoren sowie bei der Aufklärung von Wirkun- gen von Antibiotika auf der Basis der Kenntnisse über dreidimensionale Strukturen von Proteinen und Zellor- ganellen.

Gleichzeitig warnte er vor einer un- begründeten Euphorie. Es wäre falsch

zu glauben, dass man in absehbarer Zeit nahezu alle genetisch bedingten Krankheiten mithilfe einer Genthe- rapie heilen könne. Damit dies er- reicht werden kann, sei noch sehr viel Grundlagenarbeit erforderlich, um die Verfahren zur Korrektur von Gende- fekten in bestimmten Körperzellen und Organen effektiver und vor allem sicherer zu machen.

Molekularbiologische Untersuchung

Ein wichtiges Element bei der Einbin- dung genetischer Faktoren in die Kenntnisse von Krankheitsgeschehen und -ursachen ist nach Ropers auch die spezifische molekularbiologische Untersuchung von Personen und Fa- milien.

In dem Zusammenhang machte Prof. Ropers auch einen Exkurs in die Berufspolitik, in dem er die Zentrie- rung humangenetischer Versorgung in Deutschland anmahnte. Diese ist sicher für extrem schwierige Fragen be- denkenswert, kann aber wohl die der- zeitig vorhandene Struktur der hu- mangenetischen Beratung kaum erset- zen.