Aus dem Zentrum Kinderheilkunde, Humangenetik und Dermatologie Pädiatrische Pneumologie und Neonatologie
der Medizinischen Hochschule Hannover Leiter: Prof. Dr. med. H. von der Hardt
Nasale Potenzialdifferenzmessung in Therapie und Diagnostik der Cystischen Fibrose
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von Christine Rokahr
aus Hannover
Hannover, 2005
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 16.05.2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Präsident:: Prof. Dr. D. Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. Horst von der Hardt
Referent: Prof.`in Dr. Brigitte Schlegelberger
Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Andreas Schapowal
Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.2006
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Karl Welte Prof. Dr. Dietrich Peest Prof.`in Dr. Sylvia Glüer
Inhaltsverzeichnis
3
Inhaltsverzeichnis
Seite
Glossar………...…….5
1. Einleitung……….6 – 17 1.1 Allgemeines………..6
1.2 Ionentransportstörung am respiratorischen Epithel………....10
1.3 Transepitheliale Potenzialdifferenzmessung………...14
1.4 Diagnostik………...16
1.5 Zielsetzung………..17
2. Methodik………18 – 35 2.1 Physiologische und pathophysiologische Grundlagen………...18
2.1.1 Blockade des Natriumeinstroms………...18
2.1.2 Induktion der Chloridsekretion………..………… ….19
2.1.3 Unterstützung der Chloridsekretion………...….19
2.2 Material und Gerätebeschreibung zur transepithelialen Potenzialdifferenzmessung……… ………...21
2.2.1 Materialien……….….21
2.2.2 Geräte………...….21
2.2.3 Herstellung der Standardlösungen……….….23
2.2.4 Herstellung der Ceramidlösungen………...24
2.2.5 Herstellung der Elektroden……….24
2.3 Versuchsanordnung zur Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz……… ………25
2.4 Vorgehen bei der Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz………..27
2.5 Untersuchungskollektive………30
2.5.1 Untersuchungskollektiv der transepithelialen Potenzialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik……….30
2.5.1.1 Anamnese………....30
Inhaltsverzeichnis
4
2.5.1.2 Schweißtest………...…..30
2.5.1.3 Rachenabstrich………31
2.5.1.4 Molekulargenetisches Gutachten………..…..31
2.5.1.5 Pankreasfunktion………...31
2.5.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung………...…..31
2.5.2 Untersuchungskollektiv der Ceramid-Pilotstudie……….…..33
2.5.3 Untersuchungskollektiv der transepithelialen PD bei Patienten mit seltenen/milden CF-Mutationen……….…..33
2.6 Statistische Methoden………...…..34
3. Ergebnisse………..35 – 49 3.1. Ergebnisse aus dem Untersuchungskollektiv der trans- epithelialen Potenzialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik………… ...…...35
3.1.1 Anamnese……….…...35
3.1.2 Schweißtest………...…..35
3.1.3 Rachenabstrich……….…...35
3.1.4 Molekulargenetisches Gutachten……….…...36
3.1.5 Pankreasfunktion………..…...36
3.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung………...…..36
3.1.7 Transepitheliale Potenzialdifferenz des respiratorischen Epithels………..38
3.2 NPD-Ergebnisse der Ceramid-Pilotstudie………..43
3.3 Ergebnisse der transepithelialen PD bei Patienten mit seltenen/ milden CF-Mutationen……….…...48
4. Diskussion………..50 – 53
5. Zusammenfassung……….54 – 55 6. Literaturverzeichnis………..56 – 66 7. Anhang………67 - 70
Glossar
5
Glossar
Amilorid Amiloridhydrochloriddihydrat
apikal lumenwärtige Seite der Luftwegmukosa ATP Adenosin 5`-triphosphat
basal zur Submukosa gerichtete Seite der Luftwegmukosa Ca 2+ Calcium
cAMP Adenosin3`,5`-cyclisches Monophosphat CF Cystische Fibrose
CFTR CF transmembrane conductance regulator Cl - Chlorid
et al und Mitarbeiter (et altera)
F508del Deletion im CFTR-Gen resultierend in Verlust von Phenylalanin an Position
508 im CFTR-Protein
Gesunde Nicht-CF-Patienten
ICM Intestinale Kurzschlussstrom Messung (Intestinal current meassurment) K+ Kalium
mV Millivolt Na + Natrium
nPD nasale Potenzialdifferenz
PD transepitheliale Potenzialdifferenz
Einleitung
6
1.Einleitung
1.1 Allgemeines
Die Mukoviszidose, im angloamerikanischen Sprachraum als Cystische Fibrose (CF) bezeichnet, ist in der weißen (kaukasischen) Bevölkerung eine der häufigsten autosomal rezessiv vererbten und tödlichen Krankheiten mit einer Prävalenz von 1/2000 bis 1/3000 aller Lebendgeburten in Europa und Nordamerika [1, 2, 3]. Schon aus dem Mittelalter sind Beobachtungen bekannt, die einen Zusammenhang zwischen einer gestörten Schweißdrüsenfunktion und einer verkürzten Lebensdauer beschreiben [4]. Bereits im 17. Jahrhundert gab es Berichte über Kinder mit Mekoniumileus, Pankreas- und Lungenkrankheiten sowie Salzverlust. Als eigenständiges Krankheitsbild ist die CF jedoch erstmals 1938 von Anderson beschrieben worden.
[5]. Seit 1985 ist das Mukoviszidose-Gen auf dem langen Arm des Chromosoms 7 (7q31.2) identifiziert [6] und 1989 erstmals geklont worden [7, 8, 9].
Das CF transmembran conductance regulator (CFTR) Gen kodiert für das CFTR- Protein, welches als Cl--Kanal in der apikalen Zellmembran von exokrinen Epithelien wie Schweißdrüse, Respirations-, Gastrointestinal-, Hepatobiliär- und Urogenitaltrakt fungiert [10, 11]. Insgesamt 27 Exons kodieren für ein aus 1.480 Aminosäuren (AS) bestehendes Protein mit einer Molekularmasse von 168.138 Dalton. Das CFTR–
Protein setzt sich aus zwei „Membrane spanning domains“ (MSD1, MSD2), zwei
„nucleotide binding folds“ (NBF1, NBS2) und einer „Regulartory Domain“ ( R ) zusammen. Dabei bilden die beiden Membrandomaine den CFTR Cl--Kanal [12]
(Abb. 1). Das Öffnungsverhalten dieses Cl--Kanals wird an der „Regulatory Domain“
durch Adenosin 3’,5’-cyclisches Monophosphat (cAMP) vermittelte Phosphorylierung, an der „nucleotide binding fold1“ durch Bindung von Adenosintriphosphat (ATP) und Hydroloyse des ATP an der „nucleotide binding fold 2“ kontrolliert, wobei Phosphorylierung über cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) oder Proteinkinase C (PKC) in Anwesenheit von ATP ein Öffnen des CFTR- Kanals bewirkt.
Einleitung
7
Abb. 1: Modell zur Veranschaulichung der Struktur und Regulation des CFTR-Proteins MSD, membrane- spanning domains; NBD, nucleotide- binding- domains; PKA, cAMP abhängige Proteinkinase
(Modifiziert nach Anderson et al) [13]
Bislang sind über 1.400 Mutationen im CFTR-Gen identifiziert worden [14]. Mit einer Häufigkeit von 70 bis 75 % liegt in der kaukasischen Bevölkerung [15] vorwiegend eine 3-Basen-Deletion vor, welche zum Verlust der Aminosäure Phenylalanin an Position 508 im CFTR-Protein führt (F508del). Andere häufige Mutationen in Deutschland und Österreich sind die Mutationen R553X, CFTRdele2,3, R347P und N1303K [16].
Die große Vielzahl an Mutationen bewirkt ganz unterschiedliche Defekte des CFTR Cl--Kanals [17].
Einleitung
8
So führen Frame-shifts, splicing oder Stopcodon-Mutationen zum kompletten Fehlen des CFTR-Proteins, zum Missverhalten des veränderten CFTR-Proteins [18], zum Einbau von CFTR in die apikale Zellmembran ohne Cl--Sekretions-Funktion aufgrund fehlerhaften Bindens von ATP an die NBFs sowie zu verringerter Cl--Sekretions- Funktion des CFTR-Proteins durch Veränderungen an den MSDs als weitere Ursachen für Defekte im CFTR-Cl--Kanal (Abbildung 2). Gemeinsam ist allen ein abnormer Ionen- und Flüssigkeitstransport der exokrinen Drüsenepithelien, welche an den verschiedenen Organen unterschiedlich ausgeprägt sind.
- extrapulmonale Manifestation:
Klinisch manifestiert sich dies an den Schweißdrüsen durch eine erhöhte Konzentration von Chlorid und Natrium (Na) im Schweiß.
Im exokrinen Pankreas wird ein zähes Drüsensekret gebildet, welches zur Obstruktion der Ausführungsgänge und letztlich zur exokrinen Pankreasinsuffizienz bei histopathologisch fortschreitender Pankreasfibrose (cystische Fibrose) führt [19, 51, 52].
Typische klinische Symptome im Gastroeintestinaltrakt sind der Mekoniumileus des Neugeborenen [20,21] sowie bei älteren Patienten das Distale Intestinale Obstruktionssyndrom (DIOS) und im Hepatobiliärtrakt kommt es intrahepatisch zu fokalen, biliären Fibrosen [1].
Im Genitaltrakt führen die Veränderungen bei 98 % der männlichen CF-Patienten zur Infertilität (Verödung der Samenleiter)[22].
Im weiblichen Genitale sind die Drüsen im Cervix uteri überdehnt, der Cervixschleim hochviskös und somit eingeschränkt passierbar für die Spermien. Aufgrund dieser Veränderungen und der Tatsache, dass Frauen mit CF Kinder geboren haben, wird eine eingeschränkte weibliche Fertilität diskutiert.
- Manifestation am Respirationstrakt: Pathophysiologie und klinische Symptome Da sich die vorliegende Arbeit hauptsächlich auf die Pathomechanismen am respiratorischen Epithel beziehen, konzentrieren sich die folgenden Ausführungen auf die Ionentransportstörungen am Bronchialsystem bei CF und deren klinische Auswirkungen .
Einleitung
9
Abb.2: Biogenese, Aktivierung und Entsorgung des CFTR- Chlorid- Kanals zur Veranschaulichung der unterschiedlichen Defekte auf biochemischer und zellulärer Ebene.
(Modifiziert nach Lukacs et al) [24]
Einleitung
10
1.2 Ionentransportstörungen am respiratorischen Epithel
Das gesunde respiratorische Epithel kann Natriumchlorid absorbieren und sezernieren.
Wie in Abbildung 3 schematisch dargestellt ist, gelangen Natrium- und Chloridionen an der basalen Zellmembran über einen Na+K+2Cl-Kotransport ins Zellinnere. Das intrazelluläre Natrium wird über eine energieverbrauchende Na+-K+-ATPase an der basolateralen Membran der Mukosazelle wieder ausgeschleust [25]. Dadurch entsteht ein Konzentrationsgradient für Natrium vom Lumen ins Zellinnere, der den Eintritt von Natriumionen über epitheliale Natriumkanäle möglich macht. Um die Elektroneutralität zu wahren, strömen die Chloridionen sowohl über aktivierte CFTR- Kanäle ins Zellinnere als auch parazellulär ins submuköse Kompartiment [26].
Eine aktive Chlorid-Sekretion über apikale CFTR-Ionenkanäle wird per Phosphorylierung über cAMP Moleküle gesteuert und unter normalen Bedingungen nicht gesehen [27, 28]. Sie kann allerdings bei einem entsprechenden elektrischen Gradienten, z. B. bei einer Hyperpolarisation der Apikalmembran, induziert werden.
Hervorgerufen werden kann dies durch Substanzen wie Beta-Sympathomimetika und Prostaglandin E1, welche eine Erhöhung des Spiegels an cAMP induzieren [28, 29, 30, 31]. Ein passiver Kaliumausstrom entlang des Konzentrationsgradienten von intrazellulär nach extrazellulär hat den gleichen Effekt. Im Falle einer Chloridsekretion müssen Natriumionen parazellulär ins Lumen folgen.
Da der Chloridionenfluss durch CFTR passiv entlang eines elektrochemischen Gradienten erfolgt, kann über CFTR somit Chloridsekretion und Chloridabsorption erfolgen.
Einleitung
11 3a
3b Abb. 3a und 3b:
3a: Schematische Darstellung des Ionentransports am gesunden, respiratorischen Epithel des Menschen.
3b: Schematische Darstellung der Ionentransportstörung bei CF am Beispiel des respiratorischen Epithels: Die Chlorid- Sekretion in das Bronchiallumen über die cAMP regulierten CFTR- Chlorid- Kanäle ist defekt, die Natrium- Absorption aus dem Bronchiallumen ist gesteigert und führt zum Flüssigkeitsverlust des Bronchialsekrets. Eine unzulängliche Kompensation der Chlorid- Sekretion erfolgt über die Calcium- abhängigen alternativen Chlorid- Kanäle (Modifiziert nach Knowles et al) [40].
Einleitung
12
Zusätzlich zu seiner Funktion eines Chloridkanals reguliert CFTR die Aktivität vieler anderer Membranproteine [32, 33]. Ein Beispiel dafür ist eine Klasse von Chloridkanälen, die aufgrund ihrer nicht-linearen Strom-Spannungs-Charakteristik als outwardly rectifying chlorid channels (ORCC) bezeichnet werden [32]. Im respiratorischen Gewebe von Gesunden lassen sich ORCCs durch Proteinkinase A und ATP aktivieren [35, 36, 37], jedoch nicht im CF-Epithelgewebe, obwohl sie in der Plasmamembran von Mukoviszidosepatienten vorhanden sind [38, 39]. Jüngste
Forschungsergebnisse zeigten jedoch neuartige Aktivierungsmechanismen für ORCC’s, hervorgerufen durch Zellschwellung sowie durch Aktivierung der Tyrosinkinase p56lck. Dieser Effekt konnte an Lymphozyten von Gesunden als auch an Lymphozyten von CF-Patienten induziert werden [41, 42]. Ein weiterer Zusammenhang ist zwischen funktionell aktiven CFTR-Kanälen und Amilorid- sensitiven epithelialen Natriumkanälen (ENaC) beschrieben worden. In einer Studie über die Leitfähigkeit einzelner ENaCs konnte ein hemmender Einfluss von CFTR auf die Aktivität dieser Natriumkanäle gezeigt werden [33].
Vermutlich keinen Einfluss hat CFTR auf folgende, ebenfalls an der Sekretion beteiligte Chloridkanäle, die nicht per Phosphorylierung der cAMP Moleküle gesteuert werden. Dazu zählen die kalziumabhängigen Chloridkanäle. Das Gen für die ersten Vertreter dieser Kanäle konnte mittlerweile geklont werden und die Kanaleigenschaften funktional charakterisiert werden [43, 44]. Diese Kanäle werden auch als „alternative“ Kanäle bezeichnet, da sie wahrscheinlich einen Teil der defekten Chlorid-Sekretion kompensieren [45, 46] und somit als Modifikatoren des Phenotyps fungieren [47].
Klinische Veränderungen im Respirationstrakt:
Bei der Mukoviszidose ergeben sich durch den Gendefekt folgende pathophysiologische Vorgänge: eine relative Undurchlässigkeit der apikalen Zellmembran für Chloridionen [27, 48] sowie eine exzessive Absorption von Natrium und Wasser in die Zelle, was zu einer Viskositätszunahme des Sekrets und zur Sekretretention mit nachfolgender Schädigung vieler Organe führt – s.o. [30, 49, 50].
Im respiratorischen Flimmerepithel führt die reduzierte mukoziliäre Clearance, hervorgerufen durch den eingedickten Schleim und die Sekretretention [20, 53], zur chronischen Besiedlung mit Krankheitserregern wie Staphylococcus aureus,
Einleitung
13
Haemophilus influenza und schließlich Pseudomonas aeruginosa, wobei die Dauerbesiedelung mit diesen Keimen, vor allem mit Pseudomonas aeruginosa nicht nur Folge der verminderten Clearance, sondern auch der pathologischen Komposition des Sekretes ist [54]. Tachypnoe, chronischer Husten, chronische Pansinusitiden sowie Nasenpolypen sind die typischen klinischen Symptome des erkrankten Respirationstraktes [55].
Die sekretbedingte Atemwegsobstruktion, die bakterielle Dauerbesiedelung und die für die CF typische persistierende Entzündungsreaktion führen zur irreversiblen Schädigungen der Bronchialwand sowie zum fortschreitenden Gewebeverlust der Lunge. Die Folgen sind intrapulmonale Verteilungsstörung, Gasaustauschstörung, pulmonale Hypertonie und Rechtsherzbelastung, schließlich Tod in der respiratorischen Insuffizienz (Ersticken) [56].
Da bislang keine kausale Therapie für die Cystische Fibrose gefunden wurde, ist das vorrangige Ziel der konventionellen Therapie, für eine möglichst normale Lungenentwicklung und Lungenfunktion zu sorgen. Grundpfeiler der Behandlung sind Sekretelimination durch aktive krankengymnastische Maßnahmen und antiobstruktive Inhalationstherapie, Minderung der bakteriellen Kontamination durch gezielten Einsatz von Antibiotika [57] sowie bei bestehender Pankreasinsuffizienz, Substitution der fehlenden Enzyme und Vitamine, unter anderem auch mit dem Ziel, die Infektionsabwehr zu stützen. In späten Stadien bleibt als Therapieoption oft nur die Lungentransplantation [58,59]. Durch die konsequente Verbesserung der verschiedenen Therapien hat sich die Lebenserwartung in den letzten Jahrzehnten wesentlich erhöht. Dazu haben besonders die gezielte und vor allem kontinuierliche pseudomonaswirksame Antibiotikatherapie, die intensivierte patientengerechte Inhalations- und Physiotherapie und die durch die Entwicklung der Magen-pH- resistenten Pankreasenzympräparate möglich gewordene hyperkalorische Ernährung beigetragen [1].
Die große Vielzahl, mittlerweile über 1.400 [14], der verschiedenen Mutationen führt zu unterschiedlichen klinischen Ausprägungen des Krankheitsbildes der Mukoviszidose [60]. Nur in einzelnen Sonderfällen erscheint eine Zuordnung von Genotyp zu einem Phänotyp möglich [47]. Voraussagungen für das zu erwartende
Einleitung
14
Alter eines jetzt geborenen Patienten zu treffen, erscheint aufgrund des heterogenen Phänotyps immer noch schwierig. Momentan wird die mittlere Lebenserwartung auf 33 Jahre geschätzt [61].
1.3 Transepitheliale Potenzialdifferenzmessung am respiratorischen Epithel
Aufgabe von Membranen und Epithelien eines Organismus ist es, als selektiv permeable Barrieren zur Regulation der Elektrolyt- und Flüssigkeitskompartimente beizutragen. Dies geschieht unter physiologischen Bedingungen zum größten Teil durch aktive Transportmechanismen, welche das Volumen und die Zusammensetzung der Sekrete regulieren [62]. Ein passiver Ionenfluss verläuft dazu parallel.
Durch diese aktiven Ionentransportvorgänge und die passive Ionenpermeabilität über die Zelle, zusammen mit passiven Ionenflüssen über parazelluläre Barrieren, baut sich eine messbare elektrische Spannung auf, die transepitheliale Potentialdifferenz (PD).
Diese elektrische Spannung, in Millivolt (mV) angegeben, stellt ein durch verschiedene Ionen bedingtes Summenpotential dar und ist, bezogen auf die Submukosa, lumennegativ [28, 63, 64].
Das mehrreihige Flimmerepithel der Regio respiratoria im unteren Nasengang der Nasenschleimhaut stimmt in der Konfiguration der Zellverbindungen, der Zelltypen und der Zusammensetzung der Oberflächenflüssigkeit mit dem Epithel der Bronchialschleimhaut überein [28, 65].
Da die Submukosa des respiratorischen Epithels, das Interstitium, isoelektrisch mit der Subkutis ist [28, 66], ist es möglich, die transepitheliale Potentialdifferenz als eine elektrische Spannung zwischen dem Flimmerepithel der Nasenschleimhaut unterhalb der Concha inferior und der Subkutis zu messen. Diese Messorte sind relativ einfach zu erreichen. Somit können Veränderungen der transepithelialen Potentialdifferenz, z.B. nach lokaler medikamentöser Beeinflussung, relativ einfach gemessen werden [28, 65].
Die Potentialdifferenz am respiratorischen Epithel entsteht hauptsächlich durch die Sekretion von Chlorid-Ionen und einer gleichzeitigen Reabsorption von Natriumionen
Einleitung
15
[62]. Die Arbeitsgruppe um Knowles führte als erste in vivo Messungen am respiratorischen Epithel des Menschen durch. Dabei stellte sich heraus, dass am Flimmerepithel bei CF-Patienten eine deutlich negativere PD gemessen werden konnte als bei gesunden Probanden [28, 65, 67, 68]. Der Natriumkanalblocker Amilorid, welcher durch nasale Superfusion appliziert wird, inhibiert den transmembranen Natriumeinstrom und führt zu einem deutlich positiveren transepithelialen Potential, Ein Effekt, der bei Mukoviszidosepatienten deutlich besser zu erkennen ist als bei gesunden Probanden [62, 65, 67]. Ein Chloriddiffusionspotential wird durch Perfusion mit chloridfreier Lösung bei Non-CF- Probanden aufgebaut, während sich bei CF-Patienten nur eine kleine oder geringe Änderung der PD zeigt.
Kann der CFTR-Cl-Kanal bei CF-Kranken durch das Sympathikomimetikum Isoprotenerol zur Sekretion von Chloridionen stimuliert werden, muss dies als ein Hinweis für die Restfunktion dieses Proteins gedeutet werden [69, 70, 71]. Neben der Regulation des CFTR-Cl-Kanals hat der Defekt im CFTR-Gen Einfluss auf andere Chloridkanäle. So können z. B. durch ATP, welches die Phospholipase C aktiviert und zu einem Anstieg des intrazellulären Calciums führt, alternative, Ca2+-abhängige Chloridkanäle aktiviert werden [71].
Die nasale PD-Messung ist eine aussagekräftige und wenig invasive Messmethode zur Objektivierung der Ionentransportstörung bei Mukoviszidose. Seit bekannt ist, dass es einige Mutationsformen bei dieser Krankheit gibt, bei denen die Schweißelektrolytmessung nach Pilocarpinstimulation grenzwertig bis nicht pathologisch ausfällt, die PD-Werte im pathologischen Bereich liegen und mit der genetische Mutationsnalyse CF verursachende Mutationen nachgewiesen werden, hat die PD Messung für die Sicherung der Diagnose CF zusätzlich an Bedeutung gewonnen [72, 73].
Mit der PD-Messung lassen sich Verdachtsdiagnose bestätigen, Aussagen über das Maß der Restfunktion machen sowie pharmakologische Interventionen einzelner Substanzen überprüfen.
Einleitung
16
1.4 Diagnostik
In den meisten Fällen wird die Diagnose CF durch die Analyse des Natrium- und Chloridionengehaltes im Schweiß nach Stimulation mit Pilocarpin bestätigt. Als Standardmethode gilt der von Gibson and Cooke 1959 entwickelte Schweißtest [74].
Da jedoch auch mit normalen Resultaten eine CF nicht verlässlich ausgeschlossen werden kann [72, 73], gibt es weitere Methoden, die in der CF-Diagnostik Anwendung finden. Hierzu zählen unter anderem die Mutationsanalyse im CFTR-Gen sowie die Bestimmung der nasalen PD. Folgende CF-Diagnostik-Konsensus-Kriterien müssen für die Diagnose CF erfüllt sein:
1. Mindestens ein oder mehrere klinische Symptome, die mit CF einhergehen oder ein Geschwisterkind mit der Diagnose CF oder ein positives Neugeborenenscreening und
2. Nachweis der CFTR-Dysfunktion mittels zweimaliger Bestimmung einer Chloridkonzentration über 60 mmol/l im Schweiß oder der Nachweis von zwei CFTR-Mutationen oder charakteristische Veränderungen des Ionenflusses mittels nPD. [75]
Zusätzlich findet seit einiger Zeit die intestinale Kurzschlussmessung (ICM) an isolierten Epithelverbänden, entnommen im Rahmen einer oberflächlichen Rektumschleimhaut PE , ergänzende Anwendung in der CF-Diagnostik [76, 77].
Auf diese ergänzende Messmethode wird weiter unten eingegangen.
Einleitung
17
1.5 Zielsetzung
Das Ziel dieser Arbeit ist es, mit der Nasenpotienzialmessung die Diagnostik bei unklarer CF zu evaluieren, eine mögliche CFTR-Restfunktion nachzuweisen sowie die Effizienz pharmakologischer Interventionen zu prüfen.
• Personen, welche aufgrund CF- phänotypischer Symptome trotz eines normalen oder grenzwertigen Schweißtests und ohne bisherigen Nachweis von 2 CF- verursachenden Mutationen nicht diagnostiziert werden konnten, sollten eine ausführliche, die nPD-Messung als CFTR-Funktionstest einschließende Diagnostik erhalten.
• Darüber hinaus wurden bei einigen Patienten mit milder/ atypischer CF Messungen der transepithelialen Potentialdifferenz durchgeführt, um Aussagen über eine mögliche CFTR- vermittelte Restfunktion als Modulator des klinischen Verlaufes machen zu können.
• Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit befasste sich mit der Prüfung der Effizienz pharmakologischer Interventionen zur Kompensation des Basisdefekts bei CF. Im Rahmen dieser Arbeit wurde aus aktuellem Anlass eine Interventionsstudie mit Ceramid durchgeführt: diese Ceramid-Pilotstudie basiert auf Forschungsergebnissen der Arbeitsgruppe von Prof. Lang am Physiologischen Institut der Universität Tübingen, die eine Aktivierung der ORCCs durch Ceramid an Lymphozyten, unabhängig von intakten CFTR, zeigten [41, 42]. Ziel unserer Untersuchung war es, mittels nPD- Messung zu überprüfen, ob Ceramid am respiratorischen Epithel vom Menschen alternative Chloridkanäle, wie die ORCCs, aktivieren kann, um so den Basisdefekt der CF zu kompensieren.
Methodik
18
2. Methodik
2.1 Physiologische und pathophysiologische Grundlagen
Wie bereits beschrieben wurde, resultiert die Spannung, welche bei der nasalen PD gemessen wird, hauptsächlich aus der Sekretion von Chloridionen und einer gleichzeitigen Reabsorption von Natriumionen [62]. Die CF-typischen Veränderungen des Natrium- und Chloridtransportes sind eine massiv gesteigerte Natriumabsorption sowie eine gestörte cAMP-vermittelte Chloridsekretion [45,48]. Bei der Messung der nasalen PD spiegeln sich diese CF-typischen Veränderungen in einer wesentlich stärker negativen PD, in einer stärkeren durch den Natriumkanalblocker Amilorid hervorgerufenen Depolarisation und einer geringen oder keiner Hyperpolarisation durch Perfusion mit chloridfreier Lösung wider [69].
Im Detail werden nun die einzelnen Möglichkeiten beschrieben, mit denen diese typischen Veränderungen in vivo am Nasenepithel beeinflusst und quantifiziert werden können.
2.1.1 Blockade des Natrium-Einstroms
Bei der Messung der nasalen PD wird die Blockierung der Natrium-Kanäle durch Amilorid hervorgerufen. Hierbei handelt es sich chemisch um N-amidino-3,5- diamino-6-chlorpyrazin-2-carboxamid und ist folglich ein Cycloamidin. Natrium und Amilorid wirken am Natriumkanal wie schnelle Kompetitoren [78], wobei die Affinität von Amilorid geringer ausfällt. Bei in vitro Messungen am respiratorischen Epithel des Menschen wurde gezeigt, dass Amilorid eine komplette Blockade der Natriumkanäle induzieren kann [78,79]. In vivo ist eine komplette Blockierung, welche eine Depolarisation der PD gegen 0 mV zur Folge hat, nicht möglich [28, 65, 80]. Der Grund hierfür ist nicht genau bekannt, wahrscheinlich induziert Amilorid
Methodik
19
neben der Natriumkanalblockade auch eine Chloridsekretion an der apikalen Zellmembran, welche ein Absinken der PD auf 0 mV verhindert.
Klinisch wird Amilorid als kaliumsparendes Diuretikum angewendet. Im Urogenitaltrakt blockiert es die Natriumreabsorption im distalen Tubulus und vermindert das transepitheliale Potenzialgefälle. Dabei wird die passiv ablaufende Kaliumexkretion verringert.
2.1.2 Induktion der Chloridsekretion
Die Funktion des CFTR-Chloridkanals bei der Messung der nPD wird durch Perfusion mit chloridfreier Lösung plus Amilorid überprüft. Für diese Lösung wird das Natriumchlorid durch Natriumgluconat ersetzt. Die Perfusion des Nasenepithels mit dieser Lösung führt am gesunden Epithel zu einer cAMP-vermittelten Chloridsekretion, diese folglich zu einer Hyperpolarisation. Aufgrund des gestörten CFTR-Chloridkanals bei CF-Patienten bleibt die PD gleich oder ändert sich nur minimal [28].
2.1.3 Unterstützung der Chloridsekretion
Beta-2-Sympathomimetika aktiveren die Adenylatcyclase und führen somit zu einem intrazellulären Anstieg des cAMP [26, 31], welcher eine Stimulation der Chloridsekretion bei Non-CF-Probanden induziert. CF-Patienten zeigen in der Regel keine Änderung der PD [71]. Als Beta-2-Symphathomemetika wurde bei der nPD- Messung Isoproterenol verwendet.
Alternative Chloridkanäle können durch Perfusion mit ATP zur Sekretion angeregt werden. ATP bindet an einen Purinrezeptor (P2-Rezeptor) in der apikalen Zellmembran und aktiviert die Phospholipase C. Dies führt zu einem intrazellulären Kalziumanstieg und die Ca2+-vermittelten Chloridkanäle werden zur Sekretion
angeregt [76, 81, 82].
Einleitung
20
Neuere Studien befassen sich mit der medikamentösen Beeinflussung der ORCCs, welche im gesunden Gewebe, aber nicht bei CF-Patienten über cAMP aktiviert werden können. Bei in vitro Messungen an Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass die src-like-tyrosinkinase lck56, unabhängig von funktionsfähigem CFTR, ORCCs aktivieren kann. Sowohl CD 95 triggering als auch die Applikation von Ceramid konnten die ORCCs, lck 56 vermittelt, aktivieren [41, 42]. Als second-messenger ist Ceramid bei der Regulierung verschiedener Zellvorgänge, wie z. B. der Zelldifferenzierung, der Zellalterung und der Apoptose beteiligt [83, 84, 85]. ORCCs sind Chloridkanäle in Zellmembranen von Lymphozyten, Fibroblasten und Atemwegsepithelzellen [35, 36, 37]. Eine Aktivierung der ORCCs durch Ceramid am respiratorischen Epithel des Menschen könnte einen neuartigen Chloridsekretionsweg aufzeigen, welcher den Basisdefekt der CF kompensieren könnte [42].
In einer Pilotstudie haben wir die Wirkung von Ceramide auf die Potentialdifferenz des respiratorischen Epithels der Nasenschleimhaut in vivo getestet.
Methodik
21
2.2 Material- und Gerätebeschreibung zur transepithelialen Potenzial-
differenzmessung (nPD)
Folgende Materialien und Zubehör wurden zum Aufbau und zur Durchführung der transepithelialen Potenzialdifferenzmessung verwendet.
2.2.1 Materialien:
-Na- Gluconat, Sigma® G9005, MW= 218,1 -K- Gluconat, Sigma® G4500, MW= 234,25 -Natriumchlorid, Merck® 1.06404, MW= 58,44
-Natriumdihydrogenphosphat NaH2PO4, Merck® 6346, MW= 137,99 -Di- Natriumhydrogenphosphat Na2HPO4, Merck® 1.06586, MW= 358,14 -Kaliumchlorid KCl- , Merck® 4936
-Amiloride, Sigma® A-7410, MW= 266,1 -Isoproterenol, Sigma® I-6379, MW= 211,3
-Adenosid 5`- Triphosphat, Sigma® A-2383, MW= 550,1 -Agarose, electrophoresis grade, GlibcoBRL®
-C6-Ceramide, Sigma® H6524, MW=397,63
2.2.2 Geräte:
-1 hochohmiges Voltmeter (Potenzialdifferenzmessgerät) aus der Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover
-1 Batterie 9 V
-1 Ein- Kanalschreiber L200 der Firma WPI®
-1 Stoppuhr der Firma Junghans®
-1 Infusionspumpe, Typ Injectomat S der Firma Fresenius®
-5 Infusionspumpen , Typ Injectomat c-IS der Firma Fresenius®
-1 Zero Dead Space Manifold (MPP-5) der Firma Warner Instrument Corp®
Methodik
22
-2 Elektroden ITEM Nr. EKV der Firma WPI®
-6 50ml Original- Perfusor Spritzen OPS der Firma Bauer®
-5 Polyethylen Schläuche PE 160/10 150 cm lang, 1,57mm OD x 1,14mm ID der Firma Warner Instrument Corp.®
-1 Original Perfusor- Leitung mit Anschlussstück, 150 cm lang der Firma Braun®
-2 Drei- Wege- Hähne Discofix der Firma Braun®
-1 Nabelgefäßkatheter 5Ch (1,7mm) der Firma Sherwood®
-2 Venenverweilkatheter Typ Surflo 0,67 x 19mm der Firma Terumo®
-1 1ml-Spritze Omnifix 40 der Firma Braun®
-1 Nadel Typ Sterican 0,9 x 40mm der Firma Braun®
-Pflaster, Typ Leukosilk® zur Fixierung -Hautdesinfektionsspray
Abb.4: Photographische Aufnahme der Geräte zur Bestimmung der transepithelialen Potenzialdifferenz aus dem elektrophysiologischen Labor der Medizinischen Hochschule Hannover
Methodik
23
2.2.3 Herstellung der Standardlösungen
Zur Herstellung der Lösungen wurde destilliertes Wasser verwendet. Das PBS und die Chlorid- freie Lösung, jedoch ohne Amilorid, wurden nach dem unten genannten Protokoll gemischt und anschließend für einen Zeitraum von 30 Minuten autoklaviert.
Zu den noch warmen Flüssigkeiten wurde das Amilorid hinzugefügt, so dass die Lösungen 1.-3. fertig und bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden konnten.
Das Isoproterenol und Adenosid 5`- Triphosphat wurden erst 30 Minuten vor Beginn der Messung mit der Chlorid-freien-Lösung gemischt und lichtgeschützt in Alufolie verpackt.
Standardprotokoll:
1.PBS
120 mM NaCl MW= 58,44 = 7,0128 g/l 25 mM Na- Gluconat MW= 218,1 = 5,4525 g/l 5 mM K- Gluconat MW= 234,25 = 1,17125 g/l 0,4 mM NaH2PO4 MW= 137,99 = 0,055196 g/l 2,4 mM Na2HPO4 MW= 358,14 = 0,859536 g/l
2. PBS mit Amilorid
10-4 mM Amilorid MW= 266,1 = 0,02661 mg/ml
3. Chlorid- freie- Lösung
145 mM Na- Gluconat MW= 218,1 =31,6245 g/l 5 mM K- Gluconat MW= 234,25 =1,17125 g/l 0,4 mM NaH2PO4 MW= 137,99 =0,055196 g/l 2,4 mM Na2HPO4 MW= 358,14 = 0,859536 g/l 10-4 mM Amilorid MW=266,1 =0,02661mg/ml
Methodik
24 4. Chlorid- freie- Lösung mit Isoproterenol
10-4 Isoproterenol MW= 211,3 =0,02113mg/ml
5. Chlorid- freie- Lösung mit Isoproterenol und Adenosid 5`- Triphosphat (ATP) 10-3 mM ATP MW= 550,1 = 0,5501 mg/ml
-5 Infusionspumpen , Typ Injectomat c-IS der Firma Fresenius
2.2.4 Herstellung der Ceramidlösungen
Wie eingangs beschrieben wurde, handelt es sich bei Ceramid um ein Sphingolipid.
Aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften musste Ceramid zuerst in Ethanol gelöst werden. 30 Minuten vor Beginn der Messung wurden 5 mg Ceramid in 1,257 ml 98%igem Ethanol gelöst und 50 ml dieser Mischung in 50 ml chloridfreie Lösung gegeben. Die Messung lief nach folgendem Protokoll ab:
1. PBS
2. PBS + 0,1 mM Amilorid 3. chloridfreie Lösung
4. chloridfreie Lösung + 0,01 mM Ceramid 5. chloridfreie Lösung + 0,1 mM Isoproterenol
Um einen möglichen Effekt des Lösungsmittels Ethanol abgrenzen zu können, wurde nach gleichem Protokoll Messungen nur mit Ethanol ohne Ceramid durchgeführt.
2.2.5 Herstellung der Elektroden
Zur Herstellung der Elektroden wurden 2 g Agarose mit 50 ml Wasser und 3 mol/l Kaliumchlorid (KCl) in der Mikrowelle erhitzt. Der flüssige Agar wurde vor dem Erkalten kurz zentrifugiert, um ihn blasen- und luftfrei zu bekommen. Danach wurde der Agar zügig in die Elektrodenkappen aufgezogen. Dabei musste darauf geachtet werden, dass nur die Spitzen gefüllt sind und beim Aufziehen keine erneute
Methodik
25
Blasenbildung entsteht. Die Elektrodenkappen wurden vollständig mit 4 Mol KCl gefüllt und mit den Silber/Silberchloridelektroden (Ag/AgCl-Elektroden) luftdicht verschlossen. Die Elektroden mit den Agargelbrücken wurden zum Erkalten und zur vollständigen Sättigung über Nacht in die PBS-Lösung gestellt und an das Voltmeter angeschlossen. Im Falle ihrer Funktionsfähigkeit zeigte das Voltmeter nur eine geringe Potenzialdifferenz an. Eine hohe Potenzialdifferenz wurde als Verminderung der Leitfähigkeit gedeutet und konnte ein Hinweis für Luftblasen, Risse im Gel oder ein Leck der Elektrode sein.
2.3 Versuchsanordnung zur Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz
Zur Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz wurde ein hochohmiges Voltmeter (Potenzialdifferenzmessgerät aus der Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover) mit zwei Silberchloridelektroden verschaltet.
Die Referenzelektrode wurde mit einem 3-Wege-Hahn verbunden und an den Konus einer Venenverweilkanüle (Typ Surflo 0,67 x 19 mm) angeschlossen. Gespült wurde die Referenzelektrode mit PBS, welches aus einer 50 ml Injektionsspritze mittels Perfusor in den 3-Wege-Hahn gepumpt wurde. Das PBS wurde in der Apotheke in der MHH unter sterilen Bedingungen hergestellt. Die Messelektrode war über einen 3- Wege-Hahn mit einem Nabelgefäßkatheter (Polyethylenschlauch (PE 50) Sherwood) und einem Zero-Dead-Manifold (MPP-5 WPI) verbunden. An den Manifold wurden fünf Schläuche (PE 160/10) gesteckt, welche hierbei an eine 50 ml-Injektionsspritze angeschlossen wurden. Jede Spritze wurde in einer Infusionspumpe platziert.
Folglich bildete die Referenzelektrode eine kleinkalibrige Venenverweilkanüle und die Messelektrode ein Nabelgefäßkatheter. Aufgezeichnet wurde die Messung mit einem 1-Kanal-Schreiber (L 200 WPI), welcher mit dem Messgerät verkabelt war.
Verschaltung und Anordnung sowie Lösungen und Elektroden gingen in dieser Form auf die Arbeitsgruppe um Knowles zurück [63, 67, 71].
Methodik
26 .
Abb.5: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Messung der nasalen transepithelialen Potenzialdifferenz.
Methodik
27
2.4 Vorgehen bei der Messung der nasalen transepithelialen PD
Eine kleinkalibrige Venenverweilkanüle wurde auf eine 1-ml-Spritze, welche mit sterilem PBS gefüllt war, gesteckt und einmal durchgespült. Diese Kanüle wurde bei den Probanden subkutan, im Unterhautfettgewebe des rechten Unterarmes platziert und 0,1 bis 0,2 ml PBS wurden subkutan gespritzt. Nach Entfernen der Nadel wurde die Kanüle mit Pflaster fixiert und der Konus mit PBS gefüllt. Auf den Konus wurde der 3-Wege-Hahn mit der Referenzelektrode und einer Infusionsleitung geschraubt, und der Perfusor auf eine Geschwindigkeit von 1ml/h. eingestellt. Dabei wurde darauf geachtet, dass sich in dem System keine Luft befindet. Nacheinander wurde jede Infusionsleitung mit der entsprechenden Lösung gespült und mit dem Manifold verbunden. Die 50 ml Injektionsspritzen wurden in die Infusionspumpen eingespannt und in den Stand-by-modus geschaltet. Die Messelektrode wurde mit einem 3-Wege- Hahn an den Manifold sowie den Nabelgefäßkatheter angeschlossen und die PBS- Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1ml/min gestartet.
Der sitzende Patient wurde gebeten, sich in eine bequeme Position zu begeben, mit dem Hinweis, sich möglichst wenig zu bewegen, um ein Verrutschen des Katheters in der Nase möglichst zu verhindern.
Das Messgerät war auf einem Brett oberhalb des Patienten platziert, damit sowohl die Anzeige als auch der Patient sich im Sichtfeld des Untersuchers befanden. Bei leicht rekliniertem Kopf des Patienten wurde der Nabelgefäßkatheter mit der rechten Hand des Untersuchers unterhalb der Concha inferior nach lateral dorsal, circa 3-4 cm tief in die Nase eingeführt. Durch langsames Vorziehen von okcipital nach rostral in Richtung Nasenöffnung wurde die Stelle mit dem höchsten Messwert aufgesucht, welche sich normalerweise ca. 3 bis 4 cm von der Nasenöffnung aus befand.
(Abbildung 5) Die gesamte Messung über wurde der Katheter mit einem Pflaster auf der Stirn des Patienten fixiert (Abbildung 6). Aufgrund intraindividueller Variationen wurden beide Nasenlöcher nach dem genannten Protokoll gemessen.
Methodik
28
Abb.6: Skizze zur Lage der Messelektrode unterhalb der unteren Nasenmuschel (Abbildung modifiziert nach W. F. Thumfort)
Methodik
29
Abb.7: Fixierung des Nabelgefäßkatheters auf der Stirn des Patienten
Methodik
30
2.5 Untersuchungskollektive
2.5.1 Untersuchungskollektiv der transepithelialen Potentialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik
Es wurden 21 Patienten im Alter von 2 bis 59 Jahren (18,89 ± 13,29) untersucht;
davon waren 10 weiblich und 10 männlich. Dieses Kollektiv setzte sich zusammen aus Patienten, die zur Diagnoseabklärung aus der gesamten Bundesrepublik Deutschland an die Medizinische Hochschule kamen. Vor Durchführung der nasalen PD-Messung wurden folgende für die CF-Diagnose wesentlichen Informationen gewonnen und für die weitere Auswertung festgehalten [75]: die klinischen Symptome aus einer ausführlichen Anamnese, das Ergebnis eines aktuell durchgeführten Schweißtests, die Ergebnisse aktuell durchgeführter Rachenabstriche, die Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen sowie die Feststellung der Pankreasfunktion.
Zusätzlich zur nPD wurde aktuell bei allen Patienten eine ICM Messung durchgeführt.
Das Einverständnis der Ethikkommission der MHH lag für alle oben genannten Untersuchungen vor.
2.5.1.1 Anamnese
Ergänzend zu einer ausführlichen klinischen Anamnese wurde der Patient nach dem Vorhandensein von Nasenpolypen gefragt. Weiterhin wurde evaluiert, ob in der Familiengeschichte ein Geschwisterkind mit CF vorliegt
2.5.1.2 Schweißtest
Der Natrium- und Chloridionengehalt im Schweiß wurde bei allen Patienten mit dem bereits beschriebenen Schweißtest nach Gibson and Cooke bestimmt [74].
Methodik
31 2.5.1.3 Rachenabstrich
Eine typische Keimbesiedlung des Respirationstraktes kann diagnostisch hilfreich sein bei Patienten mit Verdacht auf CF. Mittels Rachenabstrich wurde speziell nach Pseudomonas aerugionsa, Staphylococus aureus, Haemophilus influenza und Burkholderia cepacia gesucht, da diese Keime gehäuft bei Patienten mit CF nachzuweisen sind [86, 87].
2.5.1.4 Molekulargenetisches Gutachten
Eine partielle Genotypanalyse am CFTR-Gen wurde bei allen Patienten durchgeführt.
Das Humangenetische Gutachten schloss die häufigsten CF-Mutationen in Mitteleuropa mit ein und wurde an unterschiedlichen Zentren in Deutschland bearbeitet. Nach folgenden Mutationen wurde bei allen Patienten, unabhängig vom Institut, gesucht: F508del, d I507, 1677delTA, R117H, 621+1G>T, R334W, R347P, 1078delT, A445E, 1717-1G-A, G542X, G551D, R553X, 2183AA->G, 3659delC, R11162X, 3849+10kbC->T, S1251N, W1282X, N1303K. Eine komplette Gensequenzierung wurde nicht durchgeführt.
2.5.1.5 Pankreasfunktion
Bei allen Patienten wurde evaluiert, ob eine exokrine Pankreasinsuffizienz vorliegt.
Hierfür wurde neben den klinischen Symptomen das Ergebnis der Pankreaselastasenmessung im Stuhl verwendet.
2.5.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung
Da diese Messmethode im Labor etabliert war und nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, wird sie an dieser Stelle nur zusammenfassend dargestellt
Methodik
32
Die Messung der Ionenströme am Kolonepithel ex vivo in einer Mikro-Ussing- Kammer ist eine weitere Methode zur Diagnose der CF. Mit Hilfe verschiedener Stimulantien der Cl-Sekretion kann diese bei gesunden Probanden, im Gegensatz zu CF-Patienten, induziert werden.
Bei allen Patienten wurde am Untersuchungstag eine Rektumschleimhautbiopsie entnommen und in eine Mikro-Ussing-Kammer eingespannt [88]. Den gesamten Versuch über wird das Gewebe mit Meyler-Pufferlösung gespült und die Potenzialdifferenz als Kurzschluss-Strom längs des Gewebes gemessen. In Anwesenheit von Glucose wird zuerst gewartet, bis sich der Basiswert stabilisiert hat und dann in nachstehender Reihenfolge die Substanzen zugegeben: Amilorid, Indomethacin, Carbachol, cAMP, DIDS (4,4`- diisothiocyanostilbene-2,2`- disulfonische Säure), und Histamin.
Wie bei der nPD Messung blockiert Amilorid die ENaC abhängigen Natriumkanäle [89, 90]. Die Zugabe von Indomethacin hemmt die endogene Prostaglandinsynthese, um eine cAMP-Produktion und cAMP vermittelte Cl-Sekretion zu verhindern [91, 92]. Beides führt zu einer Erniedrigung des Kurzschluss-Stroms. Carbachol induziert ein Ca2+- abhängiges Öffnen von apikalen und basolateralen K+-Kanälen. Der Kaliumausstrom von intrazellulär nach extrazellulär erhöht den elektrochemischen Gradienten und führt zu einem Auswärtsstrom von Chloridionen.
Zusätzlich aktiviert Carbachol direkt CFTR-Chloridkanäle durch Stimulierung des Proteinkinase C- abhängigen Signalwegs.
Alternative Chloridkanäle, wie ORCCs, werden ebenfalls zur Chloridsekretion angeregt [93, 94, 95, 96, 97]. Am Non-CF- Gewebe ist der Auswärtsstrom von Chloridionen zu messen, welcher eine Zunahme des Kurzschlußstroms nach sich zieht, während am CF-Gewebe der Auswärtsstrom von K+-Ionen zu einem entgegen- gesetzten Amplitudenausschlag führt. Forskolin und cAMP stimulieren direkt die CFTR-Cl—Kanäle im Non-CF-Gewebe, während im CF-Gewebe ohne Chloridrestfunktion keine Antwort auf cAMP erfolgt [98]. Um eine Restfunktion der CFTR Cl—Kanäle zu bestimmen, werden durch die Zugabe von DIDS die alternativen Chloridkanäle irreversibel gehemmt und eine Reaktivierung der Ca2+-und PKA/PKC vermittelten Chloridsekretion durch Histamin induziert [99, 100, 101].
Methodik
33
Mit diesem Protokoll lässt sich nicht nur die Diagnose CF stellen, sondern darüber hinaus können auch Aussagen über eine residuelle intestinale Cl-Sekretion getroffen werden [102].
2.5.2 Untersuchungskollektiv der Ceramid-Pilotstudie
Die Untersuchungen der Wirkungen von Ceramid auf die respiratorische Nasenschleimhaut wurden mit 9 CF-Patienten und 8 gesunden Probanden durchgeführt. Die Gruppe der CF-Patienten setzte sich aus 6 weiblichen und 3 männlichen Teilnehmern im Alter von 17 bis 26 Jahren (21,14±3,44) zusammen. Alle Patienten sind homozygot für die Mutation F508del. Klinische Kriterien spielten bei der Selektion der Patienten keine Rolle, jedoch galten eine akute Rhinitis, eine Polyposis nasi, anamnestisch eine Polypektomie oder Schwangerschaft bei weiblichen Probanden als Ausschlusskriterien. Das Vergleichskollektiv bildeten 6 weibliche und 2 männliche Probanden im Alten 24 bis 45 Jahren (29,38±6,32), die aus gesunden Mitgliedern der CF-Forschungsgruppe der MHH rekrutiert wurden. Alle Teilnehmer waren über den Sinn der Untersuchung aufgeklärt und die PD-Messungen geschahen mit dem Einverständnis der Probanden und gegebenenfalls ihrer Eltern. Das Einverständnis der Ethikkommission der MHH zur Durchführung der Studie lag vor.
2.5.3 Untersuchungskollektiv der transepithelialen PD bei Patienten mit
seltenen/milden CF-Mutationen
Zu diesem Untersuchungskollektiv zählten insgesamt 5 CF-Patienten. Drei dieser Patienten waren Geschwister, die alle homozygot für die Mutation M1101K sind. Die beiden Töchter sind 12 und 11 Jahre alt gewesen und der Sohn zum Zeitpunkt der Messung 6 Jahre alt. Die älteste Tochter und der Sohn leiden an einer Pankreasinsuffizienz, welche durch Bestimmung der Elastase im Stuhl überprüft wurde. Die jüngere Tochter hat Elastasewerte im Normbereich und somit eine intakte exokrine Pankreasfunktion. Es wurde sowohl die Messung der nasalen PD als auch die
Methodik
34
ICM-Messung am Rektumbiopsat dieser Patienten durchgeführt, um zu überprüfen, ob ein Unterschied in der respiratorischen und intestinalen CFTR-Funktion vorliegt.
Die zwei weiteren Patienten sind Brüder im Alter von 62 und 64 Jahren mit einem Genotyp F508del/2789+5G>A. Die Diagnose wurde im Alter von 45 bzw. 43 Jahren durch Bestimmung der Chloridionen im Schweiß gestellt und im später durchgeführten molekulargenetischen Gutachten bestätigt. Highsmith et all wiesen 1997 bei Patienten mit dem Genotyp F508del/2789+5G>A circa 4 % intaktes CFTR in der Nasenschleimhaut nach [103]. Wir führten bei diesen Patienten eine nPD-Messung in beiden Nasenlöchern durch um herauszufinden, ob diese kleine Menge an intaktem CFTR sich in einer messbaren Restfunktion widerspiegelt.
2.6 Statistische Methoden
Die in dieser Arbeit eingesetzte Statistik dient lediglich der Beschreibung, Darstellung und Strukturierung der in dieser Arbeit erbrachten Ergebnisse. Dabei gibt n den Stichprobenumfang, d.h. die Anzahl der nPD- Messungen der Patienten bzw. der Probanden, an. Die Daten werden, soweit nicht anders angegeben, als Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD) aufgelistet. Tabellarisch wurden die jeweiligen Zielgrößen, wie z.B. die Veränderung der PD nach Applikation von Amilorid, anhand von Mittelwert, Median, Standardabweichung sowie der kleinsten (min) und größten (max) Merkmalsausprägung dargestellt.
Zusätzlich wurde bei den vergleichenden Referenzuntersuchungen der U-Test von Wilcoxon, Mann and Whitney, ein verteilungsunabhängiger Test für unabhängige Stichproben, angewendet. Dieser Test prüft zwei unabhängige Stichproben auf Gleichverteilung. Die statistischen Analysen wurden alle mit der SPSS® Statistik Software berechnet.
Ergebnisse
35
3. Ergebnisse
3.1 Ergebnisse aus dem Untersuchungskollektiv der transepithelialen Potentialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik
3.1.1 Anamnese
Bei keinem der 20 Patienten war ein Geschwisterkind an Cystischer Fibrose erkrankt.
An einer Polyposis nasi litten zum Zeitpunkt der Untersuchung 7/20 Patienten.
3.1.2 Schweißtest
Bei dem Schweißtest von Gibbson und Cooke [74], der am gleichen Tag wie die nPD Messung an der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt wurde, zählten Werte von <40 mmol/l Chlorid als Normwerte und ein Chloridgehalt des Schweißes von >60mmol/l als pathologischer Wert, welcher mit einer CF vereinbar ist. Als grenzwertig werden die Werte zwischen 40-60 mmol/l Chlorid im Schweiß bezeichnet. Wie aus der Tabelle 3 zu entnehmen ist, wiesen 2 einen pathologischen Schweißtest auf, 5 einen grenzwertigen und 13 hatten einen Chloridgehalt des Schweißes, welcher mit Gesunden übereinstimmt.
3.1.3 Rachenabstrich
Eine Keimbesiedlung mit Keimen der Normalflora konnte bei 6 Personen nachgewiesen werden. Von den 14 Patienten mit pathologischer Keimbesiedelung handelte es sich in 5 Fällen um PS, 9 Fällen St. aureus und in 6 Fällen um Hib. Bei einigen Patienten konnten mehrere der aufgezählten Keime gleichzeitig nachgewiesen werden. Eine Besiedelung mit Burkholderia cepacia lag bei keinem der Patienten vor.
Ergebnisse
36 3.1.4 Molekulargenetisches Gutachten
Von den 20 bereits aufgelisteten Mutationen konnte bei 3 Patienten eine Heterozygotie für die Mutation F508del nachgewiesen werden.
3.1.5 Pankreasfunktion
Die Pankreaselastase im Stuhl wurde bei allen Patienten gemessen, um Hinweise auf die exokrine Pankreasfunktion zu erlangen. Weniger als 100 µg Pankreaselastase pro Gramm Stuhl (<100µg/g Stuhl) galten als pathologisch. Eine intakte exokrine Pankreasfunktion lag vor, wenn die Pankreaselastase mehr als 200 µg/g Stuhl betrug.
Ein Patient der insgesamt 20 untersuchten Patienten wies mit einer Pankreaselastasemenge von 47 µg/g Stuhl eine exokrine Pankreasinsuffizienz auf.
Alle weiteren Patienten zeigten Werte über 200 µg/g Stuhl.
3.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung
Bei 18 der Patienten konnten 2 interpretierbare Messungen nach dem bereits beschriebenen Protokoll ausgewertet werden. Beide Biopsien zeigten hier dasselbe intraindividuelle ICM-Muster. Nur eine der beiden Biopsien konnte bei 2/20 Patienten interpretiert werden, was auf technische Gründe wie unzureichende Größe und Dicke der Biopsien zurückzuführen ist. Bei der ICM-Messung sind die Ionenströme nach Stimulation der Chloridsekretion mit Carbachol, cAMP und Histamin die Zielgrößen.
17 der insgesamt 20 Patienten zeigten eine positive Carbacholreaktion und eine deutliche Reaktion nach Zugabe von cAMP/Forskolin (non-CF-typisch), wohingegen drei Patienten einen Carbacholausschlag in die entgegengesetzte Richtung zeigten und eine geringe Reaktion nach Zugabe von cAMP/Forskolin (CF-typisch).
Ergebnisse
37 Tabelle 3: Klinische Patientendaten
Patient Sex
Schweisstest
mmol/l Cl Normalflora PSA St.aureus HiB B.
cepacia Genetik
Elastase µg/g
ICM-
Mess. nPD
Basisw.
mV
∆ Ami mV
∆ Cl mV
∆ Iso mV
∆ ATP
mV Resultat
1 w <40 mmol/l ja neg. neg. neg. neg d F 508/ ? >500 non-CF re -27,1 10,3 -12,8 -5,5 -1,3 non-CF
w li -22,4 4,8 -14,4 -7,2 -1,5
2 w <40 mmol/l ja neg. neg. neg. neg. Ø Mutation 406 non-CF re -26,1 6,6 -9,7 -1,9 -5,1 non-CF
3 w <40 mmol/l ja neg. neg. neg. neg. Ø Mutation >500 non-CF re -27,5 17,8 -21,1 -10,3 4,6 non-CF
w li -17,6 8,2 -23,5 -9,7 -2,6
4 m <40 mmol/l nein neg. pos. pos. neg. Ø Mutation 408 non-CF re -24,4 6,4 -11,9 3,2 -2,5 non-CF
m li -33,9 5,9 -10,6 15,1 -18,4
5 m 40-60 mmol/l nein neg. neg. pos. neg. Ø Mutation 474,8 non-CF re -34,6 11,4 -19,2 -3,5 1,2 non-CF
m li -25,6 4,3 -14,1 -3,5 -1,8
6 w <40 mmol/l nein pos. neg. neg. neg. Ø Mutation 313 non-CF re -22,2 8,7 -9,4 -4,1 3,9 non-CF
7 w <40 mmol/l nein neg. pos. neg. neg. Ø Mutation >500 non-CF re -31,1 7,8 -14,9 -3,7 -1,8 non-CF
w li -31,1 5,2 -18,4 0,4 -2,5
8 m <40 mmol/l nein pos. neg. pos. neg. Ø Mutation non-CF re -17,8 0,9 -13,8 -7,7 0,2 non-CF
m li -17,8 3 -20,3 -14,9 4,2
9 m 40-60 mmol/l nein neg. pos. pos. neg. Ø Mutation 479 non-CF li -23,8 7 -22,3 -8 2,3 non-CF
m re -20 8,4 -19,6 -4,1 2,9
10 m <40 mmol/l ja neg. neg. neg. neg. Ø Mutation >500 non-CF re -32,8 5,5 -23,5 2,7 0,6 non-CF
11 w <40 mmol/l nein pos. neg. neg. neg. Ø Mutation 265 non-CF re -23,8 9,3 -35 -8,9 -0,5 non-CF
12 m >60 mmol/l nein neg. pos. neg. neg. Ø Mutation 386 non-CF li -34 5,2 -25,2 8 -14,1 non-CF
13 w <40 mmol/l nein neg. pos. neg. neg. Ø Mutation 454 non-CF re -16,1 2,1 -20,3 -6,7 -1,3 non-CF
w li -30,6 9,5 -20,1 -1,6 -0,5
14 m 40-60 mmol/l ja neg. neg. neg. neg. Ø Mutation neg. non-CF re -19,4 7,1 -13,9 -4,8 -1,7 non-CF
m li -16,2 5,6 -19,4 1,6 1,0
15 w <40 mmol/l nein neg. neg. pos. neg. R75Q/? >500 non-CF re -16,5 -0,2 -18,2 -0,4 0,4 non-CF
w li -16,6 7,3 -25 -11,8 2,8
16 w <40 mmol/l nein pos. neg. neg. neg. Ø Mutation >500 non-CF re -24,1 9,8 -26,3 -4,9 4,3 non-CF
w li -19,7 4,6 46,4 -3,5 3,3
17 m >60 mmol/l nein neg. pos. neg. Ø Mutation 47 CF re -46,6 30,5 2,5 1,2 0,1 CF
18 m 40-60 mmol/l nein pos. pos. neg. neg. d F 508/ ? >500 CF re -53,3 45,7 -21,9 -1,8 -4,4 CF
m li -53,5 24 -13,6 7,1 -6,8
19 w <40 mmol/l nein neg. pos. neg. neg. Ø Mutation >500 CF li -29,4 16,9 -5,4 -4,8 -11,8 CF
w re -43,7 29,2 -7,4 -7,6 -4,5
20 m 40-60 mmol/l nein neg. pos. pos. neg d F 508/ ? 462,3 CF re -60,3 10,7 -4 -4,7 -3,7 CF
m li -76,4 45 -5 -0,4 -1,4
Ergebnisse
38
3.1.7. Transepitheliale Potenzialdifferenz des respiratorischen Epithel
Bei 21 Personen wurde versucht, die nPD-Messung nach dem Standardprotokoll in beiden Nasenlöchern durchzuführen. Bei 6 von 20 Patienten konnten aufgrund von einseitigen Nasenpolypen oder nach einseitigen Operationen im Nasenbereich oder weil die Patienten die Messung sehr schlecht tolerierten oder aufgrund des jungen Alters nicht lange genug still sitzen konnten, nur eine Messung in einem Nasenloch ausgewertet werden. Aufgrund eines Batterieausfalls des hochohmigen Voltmeters (Potenzialdifferenzmessgerät) konnte bei einem Patienten keine Messung dokumentiert und mit dem 1-Kanal-Schreiber aufgezeichnet werden.
Bedauerlicherweise konnte die Messung nicht wiederholt werden. Zwei interpretierbare Messungen des rechten und linken Nasenloch waren bei n = 14 Patienten möglich.
Folglich lagen von n=20 Patienten 34 auswertbare Messungen vor.
Nach Interpretation der klinischen Daten, der ICM-Messung und der nPD-Messung konnte bei 16 Patienten die klinische Verdachtsdiagnose einer Cystischen Fibrose ausgeschlossen werden (Tabelle 3 Patient 1-16), wohingegen sich bei 4 Patienten (Tabelle 3 Patient 17-20) die Verdachtsdiagnose bestätigte. Die 16 non-CF Patienten (n = 27 Messungen) hatten einen Basalwert von -24,17 ± 6,12 mV. Ein deutlich höherer Basalwert von -51,88 ± 14,58 mV wurde bei den 4 CF Patienten (n = 7) gemessen. Diese 4 CF Patienten wiesen eine Amiloridantwort von 28,85 ±13,18 mV auf, was einem Abfall von 55,6 % des Basalwertes entspricht, wohingegen die Amiloridantwort der 16 non-CF Patienten (n = 27) mit 6,84 ± 3,42 mV und einem Prozentsatz von 28,12 % deutlich niedriger ausfällt.
Die chloridfreie Lösung führte bei den 16 non-CF Personen zu einer Hyperpolarisation von -19,6 ± 7,94 mV, was einer Negativierung von 81,05 % entspricht. Die Chloridsekretion der 4 CF Patienten, hervorgerufen durch die Spülung mit der chloridfreien Lösung, führte zu einer Hyperpolarisation von -7,82 ± 7,81 mV (15,1%) und ist statistisch signifikant (p<0,01).
Im Anschluss an die Chlorid-Freie Lösung erfolgte die Applikation von Isoproterenol.
Dieses Medikament aktiviert die Adenylatcyclase und führt zu einen intrazellulären Anstieg des cAMP, was eine Stimulation der Chloridsekretion induziert. Bei den
Ergebnisse
39
bereits erwähnten 4 CF Patienten führte dies zu einem Anstieg der Potenzialdifferenz um –1,57 ± 4,84 mV, bei den 16 non-CF Patienten zu einem Anstieg von –3,54 ± 6,21 mV, was im Hinblick auf das Ausgangspotential statistisch nicht signifikant ist (p=0,45).
Obwohl die durch ATP induzierte Chloridsekretion Überlappungen zwischen den Patientengruppen zeigt, sind die Mittelwerte von –4,64 ± 3,86 mV bei den 4 non-CF Patienten im Vergleich zu den –0,89 ± 5,13 mV bei den 16 übrigen signifikant unterschiedlich (p=0,021).
In der Abbildung 8 sind diese Ergebnisse graphisch dargestellt und in der Tabelle 4 sind die statistischen Daten zusammengefasst.
Jede Messung wird mit einem 1-Kanal-Schreiber, welcher mit dem Messgerät verkabelt ist, aufgezeichnet. Die Abbildung 9 ist die graphische Dokumentation der nPD-Messung von einem der 16 non-CF Patienten und zeigt den typischen Verlauf eines Non-CF-Probanden. Vergleichend zeigt die Abbildung 10 den Verlauf eines CF- Patienten mit der Mutation F508 del.
