2. Methodik……………………………………………………………………18 – 35
2.1.3 Unterstützung der Chloridsekretion
Beta-2-Sympathomimetika aktiveren die Adenylatcyclase und führen somit zu einem intrazellulären Anstieg des cAMP [26, 31], welcher eine Stimulation der Chloridsekretion bei Non-CF-Probanden induziert. CF-Patienten zeigen in der Regel keine Änderung der PD [71]. Als Beta-2-Symphathomemetika wurde bei der nPD-Messung Isoproterenol verwendet.
Alternative Chloridkanäle können durch Perfusion mit ATP zur Sekretion angeregt werden. ATP bindet an einen Purinrezeptor (P2-Rezeptor) in der apikalen Zellmembran und aktiviert die Phospholipase C. Dies führt zu einem intrazellulären Kalziumanstieg und die Ca2+-vermittelten Chloridkanäle werden zur Sekretion
angeregt [76, 81, 82].
Einleitung
20
Neuere Studien befassen sich mit der medikamentösen Beeinflussung der ORCCs, welche im gesunden Gewebe, aber nicht bei CF-Patienten über cAMP aktiviert werden können. Bei in vitro Messungen an Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass die src-like-tyrosinkinase lck56, unabhängig von funktionsfähigem CFTR, ORCCs aktivieren kann. Sowohl CD 95 triggering als auch die Applikation von Ceramid konnten die ORCCs, lck 56 vermittelt, aktivieren [41, 42]. Als second-messenger ist Ceramid bei der Regulierung verschiedener Zellvorgänge, wie z. B. der Zelldifferenzierung, der Zellalterung und der Apoptose beteiligt [83, 84, 85]. ORCCs sind Chloridkanäle in Zellmembranen von Lymphozyten, Fibroblasten und Atemwegsepithelzellen [35, 36, 37]. Eine Aktivierung der ORCCs durch Ceramid am respiratorischen Epithel des Menschen könnte einen neuartigen Chloridsekretionsweg aufzeigen, welcher den Basisdefekt der CF kompensieren könnte [42].
In einer Pilotstudie haben wir die Wirkung von Ceramide auf die Potentialdifferenz des respiratorischen Epithels der Nasenschleimhaut in vivo getestet.
Methodik
21
2.2 Material- und Gerätebeschreibung zur transepithelialen Potenzial-
differenzmessung (nPD)
Folgende Materialien und Zubehör wurden zum Aufbau und zur Durchführung der transepithelialen Potenzialdifferenzmessung verwendet.
2.2.1 Materialien:
-Na- Gluconat, Sigma® G9005, MW= 218,1 -K- Gluconat, Sigma® G4500, MW= 234,25 -Natriumchlorid, Merck® 1.06404, MW= 58,44
-Natriumdihydrogenphosphat NaH2PO4, Merck® 6346, MW= 137,99 -Di- Natriumhydrogenphosphat Na2HPO4, Merck® 1.06586, MW= 358,14 -Kaliumchlorid KCl- , Merck® 4936
-Amiloride, Sigma® A-7410, MW= 266,1 -Isoproterenol, Sigma® I-6379, MW= 211,3
-Adenosid 5`- Triphosphat, Sigma® A-2383, MW= 550,1 -Agarose, electrophoresis grade, GlibcoBRL®
-C6-Ceramide, Sigma® H6524, MW=397,63
2.2.2 Geräte:
-1 hochohmiges Voltmeter (Potenzialdifferenzmessgerät) aus der Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover
-1 Batterie 9 V
-1 Ein- Kanalschreiber L200 der Firma WPI®
-1 Stoppuhr der Firma Junghans®
-1 Infusionspumpe, Typ Injectomat S der Firma Fresenius®
-5 Infusionspumpen , Typ Injectomat c-IS der Firma Fresenius®
-1 Zero Dead Space Manifold (MPP-5) der Firma Warner Instrument Corp®
Methodik
22
-2 Elektroden ITEM Nr. EKV der Firma WPI®
-6 50ml Original- Perfusor Spritzen OPS der Firma Bauer®
-5 Polyethylen Schläuche PE 160/10 150 cm lang, 1,57mm OD x 1,14mm ID der Firma Warner Instrument Corp.®
-1 Original Perfusor- Leitung mit Anschlussstück, 150 cm lang der Firma Braun®
-2 Drei- Wege- Hähne Discofix der Firma Braun®
-1 Nabelgefäßkatheter 5Ch (1,7mm) der Firma Sherwood®
-2 Venenverweilkatheter Typ Surflo 0,67 x 19mm der Firma Terumo®
-1 1ml-Spritze Omnifix 40 der Firma Braun®
-1 Nadel Typ Sterican 0,9 x 40mm der Firma Braun®
-Pflaster, Typ Leukosilk® zur Fixierung -Hautdesinfektionsspray
Abb.4: Photographische Aufnahme der Geräte zur Bestimmung der transepithelialen Potenzialdifferenz aus dem elektrophysiologischen Labor der Medizinischen Hochschule Hannover
Methodik
23
2.2.3 Herstellung der Standardlösungen
Zur Herstellung der Lösungen wurde destilliertes Wasser verwendet. Das PBS und die Chlorid- freie Lösung, jedoch ohne Amilorid, wurden nach dem unten genannten Protokoll gemischt und anschließend für einen Zeitraum von 30 Minuten autoklaviert.
Zu den noch warmen Flüssigkeiten wurde das Amilorid hinzugefügt, so dass die Lösungen 1.-3. fertig und bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden konnten.
Das Isoproterenol und Adenosid 5`- Triphosphat wurden erst 30 Minuten vor Beginn der Messung mit der Chlorid-freien-Lösung gemischt und lichtgeschützt in Alufolie verpackt.
Standardprotokoll:
1.PBS
120 mM NaCl MW= 58,44 = 7,0128 g/l 25 mM Na- Gluconat MW= 218,1 = 5,4525 g/l 5 mM K- Gluconat MW= 234,25 = 1,17125 g/l 0,4 mM NaH2PO4 MW= 137,99 = 0,055196 g/l 2,4 mM Na2HPO4 MW= 358,14 = 0,859536 g/l
2. PBS mit Amilorid
10-4 mM Amilorid MW= 266,1 = 0,02661 mg/ml
3. Chlorid- freie- Lösung
145 mM Na- Gluconat MW= 218,1 =31,6245 g/l 5 mM K- Gluconat MW= 234,25 =1,17125 g/l 0,4 mM NaH2PO4 MW= 137,99 =0,055196 g/l 2,4 mM Na2HPO4 MW= 358,14 = 0,859536 g/l 10-4 mM Amilorid MW=266,1 =0,02661mg/ml
Methodik
24 4. Chlorid- freie- Lösung mit Isoproterenol
10-4 Isoproterenol MW= 211,3 =0,02113mg/ml
5. Chlorid- freie- Lösung mit Isoproterenol und Adenosid 5`- Triphosphat (ATP) 10-3 mM ATP MW= 550,1 = 0,5501 mg/ml
-5 Infusionspumpen , Typ Injectomat c-IS der Firma Fresenius
2.2.4 Herstellung der Ceramidlösungen
Wie eingangs beschrieben wurde, handelt es sich bei Ceramid um ein Sphingolipid.
Aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften musste Ceramid zuerst in Ethanol gelöst werden. 30 Minuten vor Beginn der Messung wurden 5 mg Ceramid in 1,257 ml 98%igem Ethanol gelöst und 50 ml dieser Mischung in 50 ml chloridfreie Lösung gegeben. Die Messung lief nach folgendem Protokoll ab:
1. PBS
2. PBS + 0,1 mM Amilorid 3. chloridfreie Lösung
4. chloridfreie Lösung + 0,01 mM Ceramid 5. chloridfreie Lösung + 0,1 mM Isoproterenol
Um einen möglichen Effekt des Lösungsmittels Ethanol abgrenzen zu können, wurde nach gleichem Protokoll Messungen nur mit Ethanol ohne Ceramid durchgeführt.
2.2.5 Herstellung der Elektroden
Zur Herstellung der Elektroden wurden 2 g Agarose mit 50 ml Wasser und 3 mol/l Kaliumchlorid (KCl) in der Mikrowelle erhitzt. Der flüssige Agar wurde vor dem Erkalten kurz zentrifugiert, um ihn blasen- und luftfrei zu bekommen. Danach wurde der Agar zügig in die Elektrodenkappen aufgezogen. Dabei musste darauf geachtet werden, dass nur die Spitzen gefüllt sind und beim Aufziehen keine erneute
Methodik
25
Blasenbildung entsteht. Die Elektrodenkappen wurden vollständig mit 4 Mol KCl gefüllt und mit den Silber/Silberchloridelektroden (Ag/AgCl-Elektroden) luftdicht verschlossen. Die Elektroden mit den Agargelbrücken wurden zum Erkalten und zur vollständigen Sättigung über Nacht in die PBS-Lösung gestellt und an das Voltmeter angeschlossen. Im Falle ihrer Funktionsfähigkeit zeigte das Voltmeter nur eine geringe Potenzialdifferenz an. Eine hohe Potenzialdifferenz wurde als Verminderung der Leitfähigkeit gedeutet und konnte ein Hinweis für Luftblasen, Risse im Gel oder ein Leck der Elektrode sein.
2.3 Versuchsanordnung zur Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz
Zur Messung der transepithelialen Potenzialdifferenz wurde ein hochohmiges Voltmeter (Potenzialdifferenzmessgerät aus der Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover) mit zwei Silberchloridelektroden verschaltet.
Die Referenzelektrode wurde mit einem 3-Wege-Hahn verbunden und an den Konus einer Venenverweilkanüle (Typ Surflo 0,67 x 19 mm) angeschlossen. Gespült wurde die Referenzelektrode mit PBS, welches aus einer 50 ml Injektionsspritze mittels Perfusor in den 3-Wege-Hahn gepumpt wurde. Das PBS wurde in der Apotheke in der MHH unter sterilen Bedingungen hergestellt. Die Messelektrode war über einen 3-Wege-Hahn mit einem Nabelgefäßkatheter (Polyethylenschlauch (PE 50) Sherwood) und einem Zero-Dead-Manifold (MPP-5 WPI) verbunden. An den Manifold wurden fünf Schläuche (PE 160/10) gesteckt, welche hierbei an eine 50 ml-Injektionsspritze angeschlossen wurden. Jede Spritze wurde in einer Infusionspumpe platziert.
Folglich bildete die Referenzelektrode eine kleinkalibrige Venenverweilkanüle und die Messelektrode ein Nabelgefäßkatheter. Aufgezeichnet wurde die Messung mit einem 1-Kanal-Schreiber (L 200 WPI), welcher mit dem Messgerät verkabelt war.
Verschaltung und Anordnung sowie Lösungen und Elektroden gingen in dieser Form auf die Arbeitsgruppe um Knowles zurück [63, 67, 71].
Methodik
26 .
Abb.5: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Messung der nasalen transepithelialen Potenzialdifferenz.
Methodik
27
2.4 Vorgehen bei der Messung der nasalen transepithelialen PD
Eine kleinkalibrige Venenverweilkanüle wurde auf eine 1-ml-Spritze, welche mit sterilem PBS gefüllt war, gesteckt und einmal durchgespült. Diese Kanüle wurde bei den Probanden subkutan, im Unterhautfettgewebe des rechten Unterarmes platziert und 0,1 bis 0,2 ml PBS wurden subkutan gespritzt. Nach Entfernen der Nadel wurde die Kanüle mit Pflaster fixiert und der Konus mit PBS gefüllt. Auf den Konus wurde der 3-Wege-Hahn mit der Referenzelektrode und einer Infusionsleitung geschraubt, und der Perfusor auf eine Geschwindigkeit von 1ml/h. eingestellt. Dabei wurde darauf geachtet, dass sich in dem System keine Luft befindet. Nacheinander wurde jede Infusionsleitung mit der entsprechenden Lösung gespült und mit dem Manifold verbunden. Die 50 ml Injektionsspritzen wurden in die Infusionspumpen eingespannt und in den Stand-by-modus geschaltet. Die Messelektrode wurde mit einem 3-Wege-Hahn an den Manifold sowie den Nabelgefäßkatheter angeschlossen und die PBS-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1ml/min gestartet.
Der sitzende Patient wurde gebeten, sich in eine bequeme Position zu begeben, mit dem Hinweis, sich möglichst wenig zu bewegen, um ein Verrutschen des Katheters in der Nase möglichst zu verhindern.
Das Messgerät war auf einem Brett oberhalb des Patienten platziert, damit sowohl die Anzeige als auch der Patient sich im Sichtfeld des Untersuchers befanden. Bei leicht rekliniertem Kopf des Patienten wurde der Nabelgefäßkatheter mit der rechten Hand des Untersuchers unterhalb der Concha inferior nach lateral dorsal, circa 3-4 cm tief in die Nase eingeführt. Durch langsames Vorziehen von okcipital nach rostral in Richtung Nasenöffnung wurde die Stelle mit dem höchsten Messwert aufgesucht, welche sich normalerweise ca. 3 bis 4 cm von der Nasenöffnung aus befand.
(Abbildung 5) Die gesamte Messung über wurde der Katheter mit einem Pflaster auf der Stirn des Patienten fixiert (Abbildung 6). Aufgrund intraindividueller Variationen wurden beide Nasenlöcher nach dem genannten Protokoll gemessen.
Methodik
28
Abb.6: Skizze zur Lage der Messelektrode unterhalb der unteren Nasenmuschel (Abbildung modifiziert nach W. F. Thumfort)
Methodik
29
Abb.7: Fixierung des Nabelgefäßkatheters auf der Stirn des Patienten
Methodik
30
2.5 Untersuchungskollektive
2.5.1 Untersuchungskollektiv der transepithelialen Potentialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik
Es wurden 21 Patienten im Alter von 2 bis 59 Jahren (18,89 ± 13,29) untersucht;
davon waren 10 weiblich und 10 männlich. Dieses Kollektiv setzte sich zusammen aus Patienten, die zur Diagnoseabklärung aus der gesamten Bundesrepublik Deutschland an die Medizinische Hochschule kamen. Vor Durchführung der nasalen PD-Messung wurden folgende für die CF-Diagnose wesentlichen Informationen gewonnen und für die weitere Auswertung festgehalten [75]: die klinischen Symptome aus einer ausführlichen Anamnese, das Ergebnis eines aktuell durchgeführten Schweißtests, die Ergebnisse aktuell durchgeführter Rachenabstriche, die Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen sowie die Feststellung der Pankreasfunktion.
Zusätzlich zur nPD wurde aktuell bei allen Patienten eine ICM Messung durchgeführt.
Das Einverständnis der Ethikkommission der MHH lag für alle oben genannten Untersuchungen vor.
2.5.1.1 Anamnese
Ergänzend zu einer ausführlichen klinischen Anamnese wurde der Patient nach dem Vorhandensein von Nasenpolypen gefragt. Weiterhin wurde evaluiert, ob in der Familiengeschichte ein Geschwisterkind mit CF vorliegt
2.5.1.2 Schweißtest
Der Natrium- und Chloridionengehalt im Schweiß wurde bei allen Patienten mit dem bereits beschriebenen Schweißtest nach Gibson and Cooke bestimmt [74].
Methodik
31 2.5.1.3 Rachenabstrich
Eine typische Keimbesiedlung des Respirationstraktes kann diagnostisch hilfreich sein bei Patienten mit Verdacht auf CF. Mittels Rachenabstrich wurde speziell nach Pseudomonas aerugionsa, Staphylococus aureus, Haemophilus influenza und Burkholderia cepacia gesucht, da diese Keime gehäuft bei Patienten mit CF nachzuweisen sind [86, 87].
2.5.1.4 Molekulargenetisches Gutachten
Eine partielle Genotypanalyse am CFTR-Gen wurde bei allen Patienten durchgeführt.
Das Humangenetische Gutachten schloss die häufigsten CF-Mutationen in Mitteleuropa mit ein und wurde an unterschiedlichen Zentren in Deutschland bearbeitet. Nach folgenden Mutationen wurde bei allen Patienten, unabhängig vom Institut, gesucht: F508del, d I507, 1677delTA, R117H, 621+1G>T, R334W, R347P, 1078delT, A445E, 1717-1G-A, G542X, G551D, R553X, 2183AA->G, 3659delC, R11162X, 3849+10kbC->T, S1251N, W1282X, N1303K. Eine komplette Gensequenzierung wurde nicht durchgeführt.
2.5.1.5 Pankreasfunktion
Bei allen Patienten wurde evaluiert, ob eine exokrine Pankreasinsuffizienz vorliegt.
Hierfür wurde neben den klinischen Symptomen das Ergebnis der Pankreaselastasenmessung im Stuhl verwendet.
2.5.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung
Da diese Messmethode im Labor etabliert war und nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, wird sie an dieser Stelle nur zusammenfassend dargestellt
Methodik
32
Die Messung der Ionenströme am Kolonepithel ex vivo in einer Mikro-Ussing-Kammer ist eine weitere Methode zur Diagnose der CF. Mit Hilfe verschiedener Stimulantien der Cl-Sekretion kann diese bei gesunden Probanden, im Gegensatz zu CF-Patienten, induziert werden.
Bei allen Patienten wurde am Untersuchungstag eine Rektumschleimhautbiopsie entnommen und in eine Mikro-Ussing-Kammer eingespannt [88]. Den gesamten Versuch über wird das Gewebe mit Meyler-Pufferlösung gespült und die Potenzialdifferenz als Kurzschluss-Strom längs des Gewebes gemessen. In Anwesenheit von Glucose wird zuerst gewartet, bis sich der Basiswert stabilisiert hat und dann in nachstehender Reihenfolge die Substanzen zugegeben: Amilorid, Indomethacin, Carbachol, cAMP, DIDS (4,4`- diisothiocyanostilbene-2,2`-disulfonische Säure), und Histamin.
Wie bei der nPD Messung blockiert Amilorid die ENaC abhängigen Natriumkanäle [89, 90]. Die Zugabe von Indomethacin hemmt die endogene Prostaglandinsynthese, um eine cAMP-Produktion und cAMP vermittelte Cl-Sekretion zu verhindern [91, 92]. Beides führt zu einer Erniedrigung des Kurzschluss-Stroms. Carbachol induziert ein Ca2+- abhängiges Öffnen von apikalen und basolateralen K+-Kanälen. Der Kaliumausstrom von intrazellulär nach extrazellulär erhöht den elektrochemischen Gradienten und führt zu einem Auswärtsstrom von Chloridionen.
Zusätzlich aktiviert Carbachol direkt CFTR-Chloridkanäle durch Stimulierung des Proteinkinase C- abhängigen Signalwegs.
Alternative Chloridkanäle, wie ORCCs, werden ebenfalls zur Chloridsekretion angeregt [93, 94, 95, 96, 97]. Am Non-CF- Gewebe ist der Auswärtsstrom von Chloridionen zu messen, welcher eine Zunahme des Kurzschlußstroms nach sich zieht, während am CF-Gewebe der Auswärtsstrom von K+-Ionen zu einem entgegen- gesetzten Amplitudenausschlag führt. Forskolin und cAMP stimulieren direkt die CFTR-Cl—Kanäle im Non-CF-Gewebe, während im CF-Gewebe ohne Chloridrestfunktion keine Antwort auf cAMP erfolgt [98]. Um eine Restfunktion der CFTR Cl—Kanäle zu bestimmen, werden durch die Zugabe von DIDS die alternativen Chloridkanäle irreversibel gehemmt und eine Reaktivierung der Ca2+-und PKA/PKC vermittelten Chloridsekretion durch Histamin induziert [99, 100, 101].
Methodik
33
Mit diesem Protokoll lässt sich nicht nur die Diagnose CF stellen, sondern darüber hinaus können auch Aussagen über eine residuelle intestinale Cl-Sekretion getroffen werden [102].
2.5.2 Untersuchungskollektiv der Ceramid-Pilotstudie
Die Untersuchungen der Wirkungen von Ceramid auf die respiratorische Nasenschleimhaut wurden mit 9 CF-Patienten und 8 gesunden Probanden durchgeführt. Die Gruppe der CF-Patienten setzte sich aus 6 weiblichen und 3 männlichen Teilnehmern im Alter von 17 bis 26 Jahren (21,14±3,44) zusammen. Alle Patienten sind homozygot für die Mutation F508del. Klinische Kriterien spielten bei der Selektion der Patienten keine Rolle, jedoch galten eine akute Rhinitis, eine Polyposis nasi, anamnestisch eine Polypektomie oder Schwangerschaft bei weiblichen Probanden als Ausschlusskriterien. Das Vergleichskollektiv bildeten 6 weibliche und 2 männliche Probanden im Alten 24 bis 45 Jahren (29,38±6,32), die aus gesunden Mitgliedern der CF-Forschungsgruppe der MHH rekrutiert wurden. Alle Teilnehmer waren über den Sinn der Untersuchung aufgeklärt und die PD-Messungen geschahen mit dem Einverständnis der Probanden und gegebenenfalls ihrer Eltern. Das Einverständnis der Ethikkommission der MHH zur Durchführung der Studie lag vor.
2.5.3 Untersuchungskollektiv der transepithelialen PD bei Patienten mit
seltenen/milden CF-Mutationen
Zu diesem Untersuchungskollektiv zählten insgesamt 5 CF-Patienten. Drei dieser Patienten waren Geschwister, die alle homozygot für die Mutation M1101K sind. Die beiden Töchter sind 12 und 11 Jahre alt gewesen und der Sohn zum Zeitpunkt der Messung 6 Jahre alt. Die älteste Tochter und der Sohn leiden an einer Pankreasinsuffizienz, welche durch Bestimmung der Elastase im Stuhl überprüft wurde. Die jüngere Tochter hat Elastasewerte im Normbereich und somit eine intakte exokrine Pankreasfunktion. Es wurde sowohl die Messung der nasalen PD als auch die
Methodik
34
ICM-Messung am Rektumbiopsat dieser Patienten durchgeführt, um zu überprüfen, ob ein Unterschied in der respiratorischen und intestinalen CFTR-Funktion vorliegt.
Die zwei weiteren Patienten sind Brüder im Alter von 62 und 64 Jahren mit einem Genotyp F508del/2789+5G>A. Die Diagnose wurde im Alter von 45 bzw. 43 Jahren durch Bestimmung der Chloridionen im Schweiß gestellt und im später durchgeführten molekulargenetischen Gutachten bestätigt. Highsmith et all wiesen 1997 bei Patienten mit dem Genotyp F508del/2789+5G>A circa 4 % intaktes CFTR in der Nasenschleimhaut nach [103]. Wir führten bei diesen Patienten eine nPD-Messung in beiden Nasenlöchern durch um herauszufinden, ob diese kleine Menge an intaktem CFTR sich in einer messbaren Restfunktion widerspiegelt.
2.6 Statistische Methoden
Die in dieser Arbeit eingesetzte Statistik dient lediglich der Beschreibung, Darstellung und Strukturierung der in dieser Arbeit erbrachten Ergebnisse. Dabei gibt n den Stichprobenumfang, d.h. die Anzahl der nPD- Messungen der Patienten bzw. der Probanden, an. Die Daten werden, soweit nicht anders angegeben, als Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD) aufgelistet. Tabellarisch wurden die jeweiligen Zielgrößen, wie z.B. die Veränderung der PD nach Applikation von Amilorid, anhand von Mittelwert, Median, Standardabweichung sowie der kleinsten (min) und größten (max) Merkmalsausprägung dargestellt.
Zusätzlich wurde bei den vergleichenden Referenzuntersuchungen der U-Test von Wilcoxon, Mann and Whitney, ein verteilungsunabhängiger Test für unabhängige Stichproben, angewendet. Dieser Test prüft zwei unabhängige Stichproben auf Gleichverteilung. Die statistischen Analysen wurden alle mit der SPSS® Statistik Software berechnet.
Ergebnisse
35
3. Ergebnisse
3.1 Ergebnisse aus dem Untersuchungskollektiv der transepithelialen Potentialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik
3.1.1 Anamnese
Bei keinem der 20 Patienten war ein Geschwisterkind an Cystischer Fibrose erkrankt.
An einer Polyposis nasi litten zum Zeitpunkt der Untersuchung 7/20 Patienten.
3.1.2 Schweißtest
Bei dem Schweißtest von Gibbson und Cooke [74], der am gleichen Tag wie die nPD Messung an der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt wurde, zählten Werte von <40 mmol/l Chlorid als Normwerte und ein Chloridgehalt des Schweißes von >60mmol/l als pathologischer Wert, welcher mit einer CF vereinbar ist. Als grenzwertig werden die Werte zwischen 40-60 mmol/l Chlorid im Schweiß bezeichnet. Wie aus der Tabelle 3 zu entnehmen ist, wiesen 2 einen pathologischen Schweißtest auf, 5 einen grenzwertigen und 13 hatten einen Chloridgehalt des Schweißes, welcher mit Gesunden übereinstimmt.
3.1.3 Rachenabstrich
Eine Keimbesiedlung mit Keimen der Normalflora konnte bei 6 Personen nachgewiesen werden. Von den 14 Patienten mit pathologischer Keimbesiedelung handelte es sich in 5 Fällen um PS, 9 Fällen St. aureus und in 6 Fällen um Hib. Bei einigen Patienten konnten mehrere der aufgezählten Keime gleichzeitig nachgewiesen werden. Eine Besiedelung mit Burkholderia cepacia lag bei keinem der Patienten vor.
Ergebnisse
36 3.1.4 Molekulargenetisches Gutachten
Von den 20 bereits aufgelisteten Mutationen konnte bei 3 Patienten eine Heterozygotie für die Mutation F508del nachgewiesen werden.
3.1.5 Pankreasfunktion
Die Pankreaselastase im Stuhl wurde bei allen Patienten gemessen, um Hinweise auf die exokrine Pankreasfunktion zu erlangen. Weniger als 100 µg Pankreaselastase pro Gramm Stuhl (<100µg/g Stuhl) galten als pathologisch. Eine intakte exokrine Pankreasfunktion lag vor, wenn die Pankreaselastase mehr als 200 µg/g Stuhl betrug.
Ein Patient der insgesamt 20 untersuchten Patienten wies mit einer Pankreaselastasemenge von 47 µg/g Stuhl eine exokrine Pankreasinsuffizienz auf.
Alle weiteren Patienten zeigten Werte über 200 µg/g Stuhl.
3.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung
Bei 18 der Patienten konnten 2 interpretierbare Messungen nach dem bereits beschriebenen Protokoll ausgewertet werden. Beide Biopsien zeigten hier dasselbe intraindividuelle ICM-Muster. Nur eine der beiden Biopsien konnte bei 2/20 Patienten interpretiert werden, was auf technische Gründe wie unzureichende Größe und Dicke der Biopsien zurückzuführen ist. Bei der ICM-Messung sind die Ionenströme nach Stimulation der Chloridsekretion mit Carbachol, cAMP und Histamin die Zielgrößen.
17 der insgesamt 20 Patienten zeigten eine positive Carbacholreaktion und eine deutliche Reaktion nach Zugabe von cAMP/Forskolin (non-CF-typisch), wohingegen drei Patienten einen Carbacholausschlag in die entgegengesetzte Richtung zeigten und eine geringe Reaktion nach Zugabe von cAMP/Forskolin (CF-typisch).
Ergebnisse
Ergebnisse
38
3.1.7. Transepitheliale Potenzialdifferenz des respiratorischen Epithel
Bei 21 Personen wurde versucht, die nPD-Messung nach dem Standardprotokoll in beiden Nasenlöchern durchzuführen. Bei 6 von 20 Patienten konnten aufgrund von einseitigen Nasenpolypen oder nach einseitigen Operationen im Nasenbereich oder weil die Patienten die Messung sehr schlecht tolerierten oder aufgrund des jungen Alters nicht lange genug still sitzen konnten, nur eine Messung in einem Nasenloch ausgewertet werden. Aufgrund eines Batterieausfalls des hochohmigen Voltmeters (Potenzialdifferenzmessgerät) konnte bei einem Patienten keine Messung dokumentiert und mit dem 1-Kanal-Schreiber aufgezeichnet werden.
Bedauerlicherweise konnte die Messung nicht wiederholt werden. Zwei interpretierbare Messungen des rechten und linken Nasenloch waren bei n = 14 Patienten möglich.
Folglich lagen von n=20 Patienten 34 auswertbare Messungen vor.
Nach Interpretation der klinischen Daten, der ICM-Messung und der nPD-Messung konnte bei 16 Patienten die klinische Verdachtsdiagnose einer Cystischen Fibrose ausgeschlossen werden (Tabelle 3 Patient 1-16), wohingegen sich bei 4 Patienten (Tabelle 3 Patient 17-20) die Verdachtsdiagnose bestätigte. Die 16 non-CF Patienten (n = 27 Messungen) hatten einen Basalwert von -24,17 ± 6,12 mV. Ein deutlich höherer Basalwert von -51,88 ± 14,58 mV wurde bei den 4 CF Patienten (n = 7) gemessen. Diese 4 CF Patienten wiesen eine Amiloridantwort von 28,85 ±13,18 mV auf, was einem Abfall von 55,6 % des Basalwertes entspricht, wohingegen die Amiloridantwort der 16 non-CF Patienten (n = 27) mit 6,84 ± 3,42 mV und einem Prozentsatz von 28,12 % deutlich niedriger ausfällt.
Die chloridfreie Lösung führte bei den 16 non-CF Personen zu einer Hyperpolarisation von -19,6 ± 7,94 mV, was einer Negativierung von 81,05 %
Die chloridfreie Lösung führte bei den 16 non-CF Personen zu einer Hyperpolarisation von -19,6 ± 7,94 mV, was einer Negativierung von 81,05 %