3. Ergebnisse…………………………………………………………………..35 – 49
3.3 Ergebnisse der transepithelialen PD bei Patienten mit seltenen/
CF- Mutation
Bei den drei Geschwistern im Alter von 12, 11 und 6 Jahren, homozygot für die Mutation M1101K, wurde versucht, beide Nasenlöcher mit dem bereits geschilderten Standardprotokoll zu messen. Leider war bei der älteren Tochter aufgrund technischer Probleme nur eine Messung möglich. Der Basalwert von –49,58 ± 10,8 mV und die Depolarisation der PD mittels Amilorid 49,62 % (+24,6 ± 8,6 mV) unterscheiden sich nicht signifikant (p= 0,67 und p=0,98) von den Werten, die bei CF-Patienten, homozygot für die Mutation F508del, gemessen wurden. Signifikant ist der Unterschied zu Non-CF-Probanden sowohl für den Basalwert (p=0,005) als auch für die Reaktion auf Amilorid (p=0,005). Die chloridfreie Lösung induzierte eine Chloridsekretion, welche sich in einer Hyperpolarisation von –11,82 ± 2,94 mV (23,84
%) widerspiegelt und signifikant größer ist (p<0,01) als bei CF-Patienten. Ein signifikant unterschiedlicher Effekt (p<0,01) von 2,75 % (-1,36 ± 1,96 mV) im Vergleich zu klassischen CF-Patienten war bei der Spülung des Nasenepithels mit Isoproterenol zu beobachten. Zum Schluss der Messung führte ATP zu einer Hyperpolarisation von –2,70 ± 3,64 mV (5,4 %). Veranschaulicht sind diese zusammengefassten Werte in der Tabelle 6.
Tabelle 6:
Ergebnisse der transepithelialen Potenzialdifferenzmessung bei drei Patienten mit der Mutation M1101K homozygot.
Basalwert ∆Amilorid ∆Cl- freie Lsg ∆Isoproterenol ∆ATP
1. Kind -59,3 33,9 -13,9 -1,5 0,4
2. Kind re Nl -52,6 31,1 -15,8 -1,7 -4,5
li Nl -59,7 25,8 -10,8 -3,8 -1,4
3. Kind re Nl -40,1 19,4 -9,9 1,7 0,2
li Nl -36,2 12,8 -8,7 -1,5 -8,2
MW ± SD -49,58 ± 10,8 24,6 ± 8,6 -11,82 ± 2,94 -1,36 ± 1,96 -2,7 ± 3,64
Ergebnisse
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Jeweils ein Nasenloch wurde bei den 62 bzw. 64 Jahre alten CF-Patienten mit der Mutation F508del/2789+5G>A gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst und die graphische Dokumentation der nPD-Messung des älteren Patienten veranschaulicht die Abbildung 13.
Tabelle 7:
Ergebnisse der transepithelialen Potenzialdifferenzmessung bei zwei Patienten mit der Mutation F508del/2789+5G>A
Basalwert ∆Amilorid ∆Cl- freie Lsg ∆Isoproterenol ∆ATP
1.Bruder (64 J.) -34,8 21,7 -12,8 -3 -2,3
2.Bruder (62 J.) -52,33 33,6 -13,8 -2,6 -3,7
Abbildung 13:
Exemplarische Dokumentation der nPD- Messungen bei einem CF-Patienten (F508del/2789+5G>A) mit einem erhöhten Basalwert, einer mittleren Amiloridantwort, einer starken Antwort auf die Chlorid-Freie Lsg. (Cl-frei), Isoproterenol (Iso) und ATP
Diskussion
50
4. Diskussion
Ziel dieser Arbeit ist es, bei Personen mit CF- phänotypischen Symptomen, einem normalen oder grenzwertigen Schweißtest und ohne Nachweis von 2 CF- verursachenden Mutationen die Diagnose CF mittels nPD-Messsung als CFTR-Funktionstest zu bestätigen bzw. sicher auszuschließen. Die Problematik der Diagnose atypischer/milder CF gestaltet sich schwierig, weil die Patienten häufig pankreassuffizient sind und unter milden bronchopulmonalen Symptomen leiden.
Einige dieser Patienten weisen CF-phänotypische Symptome nur in einem Organsystem [106] auf und wecken daher den Anschein, nicht „krank genug“ zu sein oder passen so nicht in das CF-typische Erscheinungsbild [108]. In den USA beträgt der Anteil der atypischen CF an der Gesamtheit der CF-Patienten lediglich 2 %, da ein großer Teil der Patienten nicht diagnostiziert wird [61].
In unserem Studienkollektiv konnte bei 4/20 Patienten die Verdachtsdiagnose CF in der nPD-Messung sicher bestätigt werden. Bereits der Basalwert, als Parameter für die massiv gesteigerte Natriumabsorption und die gestörte Chloridsekretion, war wesentlich negativer als bei gesunden Personen. Wie bereits beschrieben wurde, kann die basale Potenzialdifferenz z. B. durch Infektionen mit Rhinoviren [71] stark verändert sein, so dass die alleinige Bestimmung des Basalwertes zur Diagnosefindung nicht ausreicht. Die Superfusionen mit dem Natriumkanalblocker Amilorid, der GluconatfreienLösung, Isoproterenol und ATP zeigten eine Cl -Sekretions-Restfunktion, welche im Vergleich zu Patienten mit typischer CF deutlich stärker ausgeprägt ist. Wie der Tabelle 3 zu entnehmen ist, zeigen die Veränderungen der Potenzialdifferenz nach Applikation der unterschiedlichen Lösungen, in mV gemessen, deutliche Überlappungen. Erst die Interpretation des gesamten Protokolls spiegelt die komplexen Ionentransportstörungen am respiratorischen Epithel von CF-Patienten wider und bestätigt die Diagnose. Aus ethischen Gründen wurde die Nasenpotenzialmessung in beiden Nasenlöchern nur an einem Tag durchgeführt, da frühere Untersuchungen bereits nachgewiesen haben, dass wiederholte Messungen an
verschiedenen Tagen zum gleichen Ergebnis führen [62, 63, 65, 67].
Diskussion
51
Ein weitere Bestandteil der ausführlichen Diagnostik der CF an der MHH ist die ICM, welche bei allen Personen am gleichen Tag wie die nPD-Messung durchgeführt wurde und bei 4/20 Patienten die Diagnose CF zusätzlich bestätigte.
Mehrere Studien haben unabhängig voneinander gezeigt, dass eine frühe Behandlung und eine Betreuung durch ein CF-Zentrum die Prognose positiv beeinflussen [109, 110, 111, 112, 113]. Es ist daher wichtig, Patienten mit einem milden Phänotyp so früh wie möglich zu diagnostizieren, um eine suffiziente Therapie, welche die Lebenserwartung verlängert, zu beginnen.
Bereits 1997 wiesen Highsmith et all bei Patienten mit dem Genotyp F508del/2789+5G>A circa 4 % intaktes CFTR- Protein in der Nasenschleimhaut nach [42]. Die bei zwei Patienten mit dem Genotyp F508del/2789+5G>A durchgeführten nPD-Messungen wiesen eine messbare Restfunktion auf, welche auf die geringe Menge funktionstüchtigem CFTR zurückzuführen ist.
Ein Zusammenhang zwischen Cl- - Sekretions-Restfunktion, bestimmt mittels nPD und ICM, sowie dem klinischen Phänotyp wurde bereits in früheren Studien untersucht. Bronsveld et al. fanden bei erstmals gleichzeitiger Anwendung beider Methoden am gleichen Patienten im Rahmen der Europäischen Zwillings- und Geschwisterstudie heraus, dass bei F508del homozygoten Zwillingen und Geschwistern das Vorhandensein einer positiven Gluconat-Antwort im Respirationsgewebe und einer DIDS-insensitiven Cl- -Sekretions-Restfunktion im intestinalen Gewebe mit einem milderen Phänotyp korrespondieren [47]. Wir führten daher am gleichen Tag die nPD- als auch die ICM-Messung bei drei Geschwistern, alle M1101K homozygot, durch um zu überprüfen, ob der phänotypische Unterschied (Pankreassuffizenz vs Pankreasinsuffizienz) bei gleichem Genotyp mittels CFTR-Funktionstest zu quantifizieren ist. Bei allen 3 Kindern konnte eine Cl- -Sekretions-Restfunktion sowohl mittels Nasenpotentialmessung am respiratorischen Epithel als auch in der ICM- Messung der Rektumbiopsien bestätigt werden.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die nPD Messung ein geeignetes Verfahren ist, mögliche pharmakologische Interventionen zur Kompensation des Basisdefekts der CF zu überprüfen. So konnte bei CF Patienten mit Stopcodon-Mutation die nasale Applikation von Gentamycin eine Expression von intaktem CFTR-Protein
Diskussion
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herbeiführen [120]. Bewiesen werden konnte dies in der im Anschluss an die Gentamycinapplikation durchgeführten nPD Messung, in der die CFTR-Chloridsekretion zu einem wesentlich niedrigeren Basalwert sowie zu einer Hyperpolarisation nach Superfusion mit Cl- -freier Lösung und Isoproterenol führte.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist es, mittels nPD-Messung zu überprüfen, ob Ceramid am respiratorischen Epithel von Menschen alternative Chloridkanäle wie die ORCCs, unabhängig von intaktem CFTR, aktivieren kann, um so den Basiseffekt der CF zu kompensieren. In-vitro Studien an Lymphozyten haben mittels patch-clamp Methode bewiesen, dass Ceramid die src-like tyrosinkinase p56lck stimuliert und unabhängig von intaktem CFTR ORCCs aktivieren kann.
In unserem Studienkollektiv konnte der erhoffte Effekt in der nPD-Messung, nämlich eine Hyperpolarisation aufgrund einer Chloridsekretion, weder bei Non-CF-Probanden noch bei CF-Patienten dargestellt werden. Mögliche Erklärungen für diese fehlende Aktivierung sind die unterschiedlichen Messmethoden (patch-clamp vs nPD, in-vitro vs in-vivo, einzelne Zellen vs Zellverband), sowie die Tatsache, dass in den in-vitro Studien eine Aktivierung der ORCCs via Ceramid lediglich bei 53% der Lymphozyten gezeigt werden konnte [41, 42]. Selbstkritisch angemerkt werden muss hier, dass es keine Studien darüber gibt, ob Ceramid ORCCs, eine Bezeichnung für eine Klasse von Chloridkanälen, welche in Zellmembranen von Lymphozyten, Fibroblasten und Atemwegsepithelzellen vorhanden sind [35, 36, 37], auch in Atemwegsepithelzellen aktivieren kann.
Zusammenfassend konnte die Applikation von Ceramid auf das respiratorische Flimmerepithel in vivo leider nicht zu einer Kompensation des Basisdefekts der CF führen.
Kein einzelnes klinisches Symptom ist pathogonomisch für eine CF. Erst die Kombination pulmonaler und enteraler Symptome prägt das typische Krankheitsbild, das sich dann vielfach erst im Laufe von Monaten und Jahren entwickelt. Um die klinische Verdachtsdiagnose zu bestätigen, werden in den meisten Fällen eine Schweisselektrolytbestimmung und eine partielle Genotypanalyse am CFTR-Gen durchgeführt. Die weltweit häufigste unter den mehr als 1400 bekannten CFTR-Mutationen ist die Deletion von 3 Basenpaaren F508del, die in Nord- und
Diskussion
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Mitteleuropa auf durchschnittlich 70% der CF-Chromosomen vorkommt. Folglich wird bei dem Grossteil der CF-Patienten die klinische Verdachtsdiagnose CF durch den Schweißtest und die partielle Genotypanalyse bestätigt. Schwierig wird die Diagnose bei Patienten mit atypischer/milder CF, die eine normale oder grenzwertige Schweißelektrolytbestimmung und in der partiellen Genotypanalyse keine Mutation im CFTR-Gen aufweisen. Ein weiteres Problem sind Säuglinge, bei denen trotz Stimulation der Schweißproduktion, die Schweißmenge für eine Schweißelektrolytbestimmung nicht ausreicht und in der partiellen Genotypanalyse keine Mutation im CFTR-Gen gefunden wurde.
Hier hat die Bestimmung der nPD-Messung, als CFTR-Funktionstest, erheblich an Bedeutung gewonnen. Sie stellt eine gut reproduzierbare, nicht invasive und kostengünstige in-vivo Messmethode zur Objektivierung der Ionentransportstörungen bei CF dar. Eine frühe Diagnose ermöglicht eine frühe Behandlung und Anbindung an ein CF-Zentrum, was zu einer deutlich erhöhten Lebenserwartung führt [109, 110, 111, 112, 113].
Zusätzlich zur nPD-Messung findet seit einiger Zeit die intestinale Kurzschlussmessung (ICM) eine ergänzende Anwendung in der CF-Diagnostik [76, 77]. Beide Messungen sind darüber hinaus geeignete Verfahren, mögliche pharmakologische Interventionen zur Kompensation des Basisdefekts der CF zu überprüfen. Vorteilhaft ist, dass mit der ICM auch toxische Substanzen (z.B. DIDS) verwendet werden können.
Zusammenfassung
54
5. Zusammenfassung
Seit mehreren Jahren wird die Bestimmung der nPD an einigen CF-Zentren zur Diagnosestellung der CF eingesetzt. Eine häufigere und flächendeckende Nutzung scheiterte bisher an den aufwendigen und wartungsintensiven Messvorrichtungen. In mehreren Studien wurde unabhängig von einander bewiesen, dass eine frühe Diagnose und die daraus resultierende Behandlung durch ein CF-Zentrum die Prognose dieser letalen Krankheit positiv beeinflusst. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Diagnostik der CF zu verbessern. Die Patienten mit einer atypischen CF, welche aufgrund CF- phänotypischer Symptome, eines normalen oder grenzwertigen Schweißtests und ohne Nachweis von 2 CF- verursachenden Mutationen bisher nicht diagnostiziert wurden, sollten eine ausführliche, die nPD-Messung als CFTR-Funktionstest einschließende Diagnostik erhalten. Bei 4/20 Patienten, die im Zeitraum von Januar 2001 bis Mai 2002 aufgrund CF phänotypischer Symptome in die Kinderklinik der MHH kamen, konnte mittels nPD- Messung und ICM die Diagnose CF gestellt werden und eine die Prognose verbessernde Therapie begonnen werden.
Aufgrund dieser lebenslangen Therapie sowie einer genetischen Beratung aller CF Patienten ist der Ausschluss dieser letalen, hereditären Krankheit bei den 16 weiteren Patienten ebenfalls entscheidend. Bei einem Patienten konnte aus technischen Gründen weder die Diagnose bestätigt, noch ausgeschlossen werde.
Da die Bestimmung der transepithelialen Potentialdifferenz auch ein Verfahren zur Überprüfung der Effizienz pharmakologischer Interventionen zur Kompensation des Basisdefekts ist, wurde in einer Pilotstudie die Wirkung von Ceramid auf das respiratorische Epithel der Nase überprüft. Hierfür wurde bei 9 CF-Patienten (n=17 Messungen), alle homozygot für die Mutation F508del, und 8 gesunden Probanden (n=8 Messungen) das Flimmerepithel im Anschluss an die chloridfreie Lösung für 30 Minuten mit Ceramid gespült.
Sowohl bei den CF-Patienten (4,47 ± 6,76 mV) als auch bei den Non-CF-Probanden (1,19 ± 9,28 mV) führte dies zu einer Depolarisation. Der erhoffte Effekt, nämlich eine Hyperpolarisation aufgrund einer Chloridsekretion stellte sich weder bei den Non-CF-Probanden noch bei den CF-Patienten ein. Eine Aktivierung von ORCCs durch Ceramid konnte in cell-attached patch clamp Versuchen an Lymphozyten, unabhängig von intaktem CFTR, aber nicht am respiratorischen Epithel in vivo gezeigt werden.
Zusammenfassung
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Bevor sich jedoch neue Therapieansätze für den Patienten auftun, muss die Wirksamkeit am Zellverband in vivo bewiesen werden.
Darüber hinaus lassen sich mit dem Standardprotokoll zur Messung der nasalen PD Aussagen über eine mögliche Restfunktion des CFTR-Chloridkanals machen. Um dies aufzuzeigen, wurden insgesamt 5 Patienten mit milder/ atypischer CF gemessen. Der Basalwert und die Depolarisation der PD mittels Amilorid zeigen das von klassischen CF-Patienten zu erwartende Bild. Die chloridfreie Lösung sowie das β-2- Sympathomimetikum Isoproterenol konnten bei allen 5 Patienten eine Chloridsekretion induzieren, welche signifikant unterschiedlich ist zu denen von Patienten mit klassischer CF. Dies spricht für eine deutliche Restfunktion des CFTR-Proteins bei diesen Patienten.
Durch die Messung der nasalen Potenzialdifferenz mit dem vollständigen Standardprotokoll lassen sich CF-Diagnosen stellen oder weitgehend ausschließen, Aussagen über mögliche Restfunktionen des CFTR-Chloridkanals machen sowie die Effizienz neuer pharmakologischer Interventionen zur Kompensation des Basisdefekts überprüfen.
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