2. Methodik……………………………………………………………………18 – 35
2.5 Untersuchungskollektive
2.5.1 Untersuchungskollektiv der transepithelialen Potentialdifferenz als CFTR-Funktionsdiagnostik
Es wurden 21 Patienten im Alter von 2 bis 59 Jahren (18,89 ± 13,29) untersucht;
davon waren 10 weiblich und 10 männlich. Dieses Kollektiv setzte sich zusammen aus Patienten, die zur Diagnoseabklärung aus der gesamten Bundesrepublik Deutschland an die Medizinische Hochschule kamen. Vor Durchführung der nasalen PD-Messung wurden folgende für die CF-Diagnose wesentlichen Informationen gewonnen und für die weitere Auswertung festgehalten [75]: die klinischen Symptome aus einer ausführlichen Anamnese, das Ergebnis eines aktuell durchgeführten Schweißtests, die Ergebnisse aktuell durchgeführter Rachenabstriche, die Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen sowie die Feststellung der Pankreasfunktion.
Zusätzlich zur nPD wurde aktuell bei allen Patienten eine ICM Messung durchgeführt.
Das Einverständnis der Ethikkommission der MHH lag für alle oben genannten Untersuchungen vor.
2.5.1.1 Anamnese
Ergänzend zu einer ausführlichen klinischen Anamnese wurde der Patient nach dem Vorhandensein von Nasenpolypen gefragt. Weiterhin wurde evaluiert, ob in der Familiengeschichte ein Geschwisterkind mit CF vorliegt
2.5.1.2 Schweißtest
Der Natrium- und Chloridionengehalt im Schweiß wurde bei allen Patienten mit dem bereits beschriebenen Schweißtest nach Gibson and Cooke bestimmt [74].
Methodik
31 2.5.1.3 Rachenabstrich
Eine typische Keimbesiedlung des Respirationstraktes kann diagnostisch hilfreich sein bei Patienten mit Verdacht auf CF. Mittels Rachenabstrich wurde speziell nach Pseudomonas aerugionsa, Staphylococus aureus, Haemophilus influenza und Burkholderia cepacia gesucht, da diese Keime gehäuft bei Patienten mit CF nachzuweisen sind [86, 87].
2.5.1.4 Molekulargenetisches Gutachten
Eine partielle Genotypanalyse am CFTR-Gen wurde bei allen Patienten durchgeführt.
Das Humangenetische Gutachten schloss die häufigsten CF-Mutationen in Mitteleuropa mit ein und wurde an unterschiedlichen Zentren in Deutschland bearbeitet. Nach folgenden Mutationen wurde bei allen Patienten, unabhängig vom Institut, gesucht: F508del, d I507, 1677delTA, R117H, 621+1G>T, R334W, R347P, 1078delT, A445E, 1717-1G-A, G542X, G551D, R553X, 2183AA->G, 3659delC, R11162X, 3849+10kbC->T, S1251N, W1282X, N1303K. Eine komplette Gensequenzierung wurde nicht durchgeführt.
2.5.1.5 Pankreasfunktion
Bei allen Patienten wurde evaluiert, ob eine exokrine Pankreasinsuffizienz vorliegt.
Hierfür wurde neben den klinischen Symptomen das Ergebnis der Pankreaselastasenmessung im Stuhl verwendet.
2.5.1.6 Intestinale Kurzschlussmessung
Da diese Messmethode im Labor etabliert war und nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, wird sie an dieser Stelle nur zusammenfassend dargestellt
Methodik
32
Die Messung der Ionenströme am Kolonepithel ex vivo in einer Mikro-Ussing-Kammer ist eine weitere Methode zur Diagnose der CF. Mit Hilfe verschiedener Stimulantien der Cl-Sekretion kann diese bei gesunden Probanden, im Gegensatz zu CF-Patienten, induziert werden.
Bei allen Patienten wurde am Untersuchungstag eine Rektumschleimhautbiopsie entnommen und in eine Mikro-Ussing-Kammer eingespannt [88]. Den gesamten Versuch über wird das Gewebe mit Meyler-Pufferlösung gespült und die Potenzialdifferenz als Kurzschluss-Strom längs des Gewebes gemessen. In Anwesenheit von Glucose wird zuerst gewartet, bis sich der Basiswert stabilisiert hat und dann in nachstehender Reihenfolge die Substanzen zugegeben: Amilorid, Indomethacin, Carbachol, cAMP, DIDS (4,4`- diisothiocyanostilbene-2,2`-disulfonische Säure), und Histamin.
Wie bei der nPD Messung blockiert Amilorid die ENaC abhängigen Natriumkanäle [89, 90]. Die Zugabe von Indomethacin hemmt die endogene Prostaglandinsynthese, um eine cAMP-Produktion und cAMP vermittelte Cl-Sekretion zu verhindern [91, 92]. Beides führt zu einer Erniedrigung des Kurzschluss-Stroms. Carbachol induziert ein Ca2+- abhängiges Öffnen von apikalen und basolateralen K+-Kanälen. Der Kaliumausstrom von intrazellulär nach extrazellulär erhöht den elektrochemischen Gradienten und führt zu einem Auswärtsstrom von Chloridionen.
Zusätzlich aktiviert Carbachol direkt CFTR-Chloridkanäle durch Stimulierung des Proteinkinase C- abhängigen Signalwegs.
Alternative Chloridkanäle, wie ORCCs, werden ebenfalls zur Chloridsekretion angeregt [93, 94, 95, 96, 97]. Am Non-CF- Gewebe ist der Auswärtsstrom von Chloridionen zu messen, welcher eine Zunahme des Kurzschlußstroms nach sich zieht, während am CF-Gewebe der Auswärtsstrom von K+-Ionen zu einem entgegen- gesetzten Amplitudenausschlag führt. Forskolin und cAMP stimulieren direkt die CFTR-Cl—Kanäle im Non-CF-Gewebe, während im CF-Gewebe ohne Chloridrestfunktion keine Antwort auf cAMP erfolgt [98]. Um eine Restfunktion der CFTR Cl—Kanäle zu bestimmen, werden durch die Zugabe von DIDS die alternativen Chloridkanäle irreversibel gehemmt und eine Reaktivierung der Ca2+-und PKA/PKC vermittelten Chloridsekretion durch Histamin induziert [99, 100, 101].
Methodik
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Mit diesem Protokoll lässt sich nicht nur die Diagnose CF stellen, sondern darüber hinaus können auch Aussagen über eine residuelle intestinale Cl-Sekretion getroffen werden [102].
2.5.2 Untersuchungskollektiv der Ceramid-Pilotstudie
Die Untersuchungen der Wirkungen von Ceramid auf die respiratorische Nasenschleimhaut wurden mit 9 CF-Patienten und 8 gesunden Probanden durchgeführt. Die Gruppe der CF-Patienten setzte sich aus 6 weiblichen und 3 männlichen Teilnehmern im Alter von 17 bis 26 Jahren (21,14±3,44) zusammen. Alle Patienten sind homozygot für die Mutation F508del. Klinische Kriterien spielten bei der Selektion der Patienten keine Rolle, jedoch galten eine akute Rhinitis, eine Polyposis nasi, anamnestisch eine Polypektomie oder Schwangerschaft bei weiblichen Probanden als Ausschlusskriterien. Das Vergleichskollektiv bildeten 6 weibliche und 2 männliche Probanden im Alten 24 bis 45 Jahren (29,38±6,32), die aus gesunden Mitgliedern der CF-Forschungsgruppe der MHH rekrutiert wurden. Alle Teilnehmer waren über den Sinn der Untersuchung aufgeklärt und die PD-Messungen geschahen mit dem Einverständnis der Probanden und gegebenenfalls ihrer Eltern. Das Einverständnis der Ethikkommission der MHH zur Durchführung der Studie lag vor.
2.5.3 Untersuchungskollektiv der transepithelialen PD bei Patienten mit
seltenen/milden CF-Mutationen
Zu diesem Untersuchungskollektiv zählten insgesamt 5 CF-Patienten. Drei dieser Patienten waren Geschwister, die alle homozygot für die Mutation M1101K sind. Die beiden Töchter sind 12 und 11 Jahre alt gewesen und der Sohn zum Zeitpunkt der Messung 6 Jahre alt. Die älteste Tochter und der Sohn leiden an einer Pankreasinsuffizienz, welche durch Bestimmung der Elastase im Stuhl überprüft wurde. Die jüngere Tochter hat Elastasewerte im Normbereich und somit eine intakte exokrine Pankreasfunktion. Es wurde sowohl die Messung der nasalen PD als auch die
Methodik
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ICM-Messung am Rektumbiopsat dieser Patienten durchgeführt, um zu überprüfen, ob ein Unterschied in der respiratorischen und intestinalen CFTR-Funktion vorliegt.
Die zwei weiteren Patienten sind Brüder im Alter von 62 und 64 Jahren mit einem Genotyp F508del/2789+5G>A. Die Diagnose wurde im Alter von 45 bzw. 43 Jahren durch Bestimmung der Chloridionen im Schweiß gestellt und im später durchgeführten molekulargenetischen Gutachten bestätigt. Highsmith et all wiesen 1997 bei Patienten mit dem Genotyp F508del/2789+5G>A circa 4 % intaktes CFTR in der Nasenschleimhaut nach [103]. Wir führten bei diesen Patienten eine nPD-Messung in beiden Nasenlöchern durch um herauszufinden, ob diese kleine Menge an intaktem CFTR sich in einer messbaren Restfunktion widerspiegelt.