Biologische Wirksamkeit von gepulster

Biologische Wirksamkeit von gepulster inkohärenter optischer Strahlung

Beate Volkmer und Christin Starzonek

Labor für Molekulare Zellbiologie Elbeklinikum Buxtehude

Informationsveranstaltung "Optische Strahlung am Schweißarbeitsplatz"

Dortmund 6. Juni 2018

Forschungsprojekt der Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin

UV-Strahlungsbelastung beim Schweißen (Teilprojekt 2)

Forschungsprojekt F 2377

„Biologische Wirksamkeit von

intermittierender und gepulster inkohärenter optischer Strahlung“

Spektren der Bestrahlungsquelle

UV

CPD-Induktion Reparatur

Apoptose

0 h 24 h

Bestrahlung von Hautbiopsien als beste in-vivo Simulation

Moll, I. (2010). Duale Reihe Dermatologie (7. Auflage). Stuttgart: Georg Thieme Verlag.

CPD-Immunfluoreszenz, Probe 32/17. A: Unbestrahlte Kontrolle nach null Stunden. B: Unbestrahlte Kontrolle nach 24 h. C: Probe direkt nach Bestrahlung mit 900 J/m². D: Probe 24 h nach Bestrahlung mit 900 J/m². Markiert sind die Epidermis (weiße Linien) sowie die Teilung in basale und suprabasale Zellschichten (orange Linie).

Immunhistochemischer Nachweis von Cyclobutan-Pyrimidindimeren in Hautschnitten

Apoptose-Färbung, Probe 32/17. DAPI-Kernfärbung und Caspase-3-Färbung 24 h nach Bestrahlung mit 900 J/m².

Immunhistochemischer Nachweis von apoptotischen Zellen in Hautschnitten

Vorversuch „Dynamikbereich der Haut“

Bestrahlungsparameter:

Bestrahlungs- stärke E_rad

Dosis H_rad Bestrahlungsdauer t

Reparaturzeit nach der Bestrahlung

3 W/m²

300 J/m² 01:40 min

0 h / 24 h 600 J/m² 03:20 min

900 J/m² 05:01 min 1200 J/m² 06:41 min 1500 J/m² 08:21 min 3000 J/m² 16:42 min

Induktion von DNA-Schäden in der gesamten Epidermis Mittelwert der vier Spenderhäute

E_rad [W/m²]

H_rad [J/m²]

t

3

300 01:40 min 600 03:20 min 900 05:01 min 1200 06:41 min 1500 08:21 min 3000 16:42 min

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

Fluoreszenzintensität [a.u.]

Dosis [J/m²]

R² = 0,9718

0 10 20 30 40 50

0 300 600 900 1200 1500

Fluoreszenzintensität [a.u.]

Dosis [J/m²]

Prozentualer Anteil an reparierten Schäden in der gesamten Epidermis 24 h nach Bestrahlung

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

reparierte Schäden [%]

Dosis [J/m²]

30/17 31/17 32/17 33/17

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

reparierte Schäden [%]

Dosis [J/m²]

Mittelwert

Apoptose 24 Stunden nach Bestrahlung

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

apoptotische Zellen/Bildausschnitt*mm

Dosis [J/m²]

30/17 31/17 32/17 33/17

0 5 10 15 20 25 30 35

apoptotische Zellen/Bildausschnitt*mm

Dosis [J/m²]

Mittelwert

Ergebnisse I Dosiseffekt

• Induktion: Linearer Dosiseffekt für CPD- Induktion im Bereich von 0 bis 1500 J/m²

• Reparatur: Reparaturkapazität sinkt mit steigender Dosis, interindividuelle

Unterschiede treten auf

• Apoptose: die Zahl apoptotischer Zellen steigt mit der Dosis, interindividuelle Unterschiede treten auf

Überprüfung des Bunsen-Roscoe-Gesetzes kontinuierlich vs. gepulst

Bestrahlungsparameter:

gepulst: 50 Hz, 10 ms

Dosis H_rad Bestrahlungsstärke E_rad

Bestrahlungsdauer t (cw)

Experimentdauer t (pulse)

Reparaturzeit nach der Bestrahlung

900 J/m²

0,125 W/m² 02:00:44 h 04:01:28 h

0 h / 24 h 0,3 W/m² 50:08 min 01:40:17 h

1 W/m² 14:58 min 29:56 min

3 W/m² 05:01 min 10:01 min

Induktion von DNA-Schäden in der gesamten Epidermis

0 5 10 15 20 25 30 35

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Fluoreszenzintensität [a.u.]

Bestrahlungsstärke [W/m²]

cw pulse H_rad

[J/m²]

E_rad [W/m²]

t (cw) t (pulse)

900

0,125 02:00:44 h 04:01:28 h 0,3 50:08 min 01:40:17 h 1 14:58 min 29:56 min 3 05:01 min 10:01 min

Prozentualer Anteil an reparierten Schäden 24 h nach Bestrahlung in der gesamten Epidermis

H_rad [J/m²]

E_rad [W/m²]

t (cw) t (pulse)

900

0,125 02:00:44 h 04:01:28 h 0,3 50:08 min 01:40:17 h 1 14:58 min 29:56 min 3 05:01 min 10:01 min

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

reparierte Schäden [%]

Bestrahlungsstärke [W/m²]

cw pulse

Apoptose 24 h nach Bestrahlung in der gesamten Epidermis Mittelwert der vier Spenderhäute

H_rad [J/m²]

E_rad [W/m²]

t (cw) t (pulse)

900

0,125 02:00:44 h 04:01:28 h 0,3 50:08 min 01:40:17 h 1 14:58 min 29:56 min 3 05:01 min 10:01 min

0 10 20 30 40 50 60

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

apoptotische Zellen/Bildausschnitt*mm

Bestrahlungsstärke [W/m²]

cw pulse

Ergebnisse II

• Keine Unterschied zwischen gepulster und

kontinuierlicher Bestrahlung für CPD-Induktion, CPD- Reparatur und Apoptose

• BRG gilt für die CPD-Induktion, erst lange

Experimentalzeiten (ab ca. 2h) führen zu einer

geringfügig erhöhten Induktion (Überlagerung der

photochemischen/photophysikalischen Prozesse durch zelluläre Strahlenantwort: DNA-Reparatur,

Chromatinveränderung…)

• BRG gilt nicht, wenn dem betrachtete Endpunkt (DNA- Reparatur, Apoptose) zelluläre Prozesse als

Strahlenantwort zugrunde liegen .

Impulsbetrieb

Bestrahlungsparameter:

Dosis H_rad

Bestrahlungs- stärke E_rad

Impulswieder- holfrequenz f_P

Impulsdauer

 Aperturen N

an Chopper- scheibe

Experiment- dauer t

Reparatur- zeit nach der Bestrahlung

900

J/m² 3 W/m²

50 Hz 1 ms 2 01:40:12 h

0 h / 24 h

50 Hz 5 ms 10 20:02 min

50 Hz 10 ms 20 10:01 min

250 Hz 1 ms 10 20:02 min

500 Hz 1 ms 20 10:01 min

Induktion von DNA-Schäden in der gesamten Epidermis Impulsdauer τ (konst.) = 1 ms

0 5 10 15 20 25 30 35

0 100 200 300 400 500

Fluoreszenzintensität [a.u.]

Impulswiederholfrequenz f_p [Hz]

0 5 10 15 20 25 30 35

t0 | t24 t0 | t24 t0 | t24

50 Hz 250 Hz 500 Hz

01:40:12 h 20:02 min 10:01 min

Fluoreszenzintensität [a.u.]

H_rad [J/m²]

E_rad [W/m²]

f_P [Hz]



[ms] t

900 3

50 1 01:40:12 h 50 5 20:02 min 50 10 10:01 min 250 1 20:02 min 500 1 10:01 min

Induktion von DNA-Schäden in der gesamten Epidermis Impulswiederholfrequenz f_P (konst.) = 50 Hz

H_rad [J/m²]

E_rad [W/m²]

f_P [Hz]



[ms] t

900 3

50 1 01:40:12 h 50 5 20:02 min 50 10 10:01 min 250 1 20:02 min 500 1 10:01 min

0 5 10 15 20 25 30 35

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fluoreszenzintensität [a.u.]

Impulsdauer τ [ms]

0 5 10 15 20 25 30 35

t0 | t24 t0 | t24 t0 | t24

1 ms 5 ms 10 ms

01:40:12 h 20:02 min 10:01 min

Fluoreszenzintensität [a.u.]

Ergebnisse II

• Kein Einfluss der Impulswiederholfrequenz auf CPD-Induktion und Reparatur

• Kein Einfluss der Impulsdauer auf CPD- Induktion und Reparatur

Ausblick I

• Die Untersuchung der Effekte in Hautbiopsien erlaubt die Darstellung der individuellen

Unterschiede der Probanden, die im Sinne des Arbeitsschutzes wichtig sind.

• Es haben sich Hinweise darauf ergeben, dass die Bestrahlungsstärke eine großen Effekt auf DNA-Reparatur und auf Apoptose-Induktion haben kann. Diese Effekte sollten genauer untersucht werden.

Ausblick II

• Um die individuelle Variabilität von primärem Material zu vermeiden, können solche

Untersuchungen in Zellkulturen menschlicher Keratinozyten-Zelllinien (z. B. HaCaT)

durchgeführt werden.

• Um die menschliche Haut zu simulieren, können die Untersuchungen abschließend in

organotypischen Hautkulturen, die aus HaCaT angezüchtet werden können, durchgeführt werden.

Vielen Dank!