Abs chlußarbeit

(1)

Abs chlußarbeit

zum PostgradualStudium "Medizinische Toxikologie/Toxikologische Chemie" an der Universität Leipzig

Ilranunchemischer Drogennachweis mittels EMIT und FPIA in der forensischen Chemie

vorgelegt von: Sabine Henschel

Jena, den 25. August 1992

(2)

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1. Allgemeine Gesichtspunkte zur Drogensituation 1.2. Definition und Einteilung der Drogen

1.3. Aufgaben der forensischen Betäubungsmittelanalytik

2. Immunoassays als Möglichkeit des schnellen Drogen- nachweises

2.1. Allgemeine Prinzipien immunchemischer Nachweisver- fahren

2.2 Drogennachweis mit Hilfe des Fluoreszenspolarisations- immunoassays (FPIA)

2.2.1. Probenmaterial und Durchführung 2.2.2. Testkits

2.3. Drogennachweis mit Hilfe der Enzyme-Multiplied- Immunoassay-Technique (EMIT)

2.3.1. Probenmaterial und Durchführung 2.3.2. Testkits

2.4. Beeinflussung und Interpretation immunchemisch ge wonnener Untersuchungsergebnisse

3. Zusammenfassung

(3)

l. Einleitung

1.1. Allgemeine Gesichtspunkte zur Drogensituation

Seit den Anfängen in den sechziger Jahren hat sich der Mißbrauch psychotroper Substanzen von einer Randerscheinung zu einem

gesamtgesellschaftlichen Problem unserer Zeit entwickelt. 1991 verstarben in Deutschland 2125 Menschen infolge ihres

Drogenkonsums und die Zahl der intravenös Drogenabhängigen (IVDA) wird derzeit auf ungefähr 100000 geschätzt (die Dunkelziffer liegt vermutlich wesentlich höher). Seit 1987 ist ein rapider Anstieg der Zahl der Erstkonsumenten (1991 ca. 130000) zu verzeichnen; die Drogenkonsumenten gehören heute nicht mehr nur den sozialen

Randgruppen an, sondern kommen aus allen Bevölkerungsschichten.

Als Haupteinstiegsdroge gilt Haschisch, wobei die Grenzen zum Medikamenten- und/oder Alkoholmißbrauch zunehmend unschärfer werden. Die Mehrheit der Drogenabhängigen verhält sich heute polyvalent, d.h. sie konsumieren mehrere Drogen ohne Festlegung auf eine Hauptdroge. Seit Ende der achtziger Jahre zeichnet sich der Trend ab, daß neben den schon lange mißbrauchten Drogen wie Cannabis-Produkten oder Opiaten eine deutliche Zunahme des

Verbrauchs sogenannter synthetischer Drogen (Halluzinogene, Amphetamine, Designer Drugs) erkennbar ist, verbunden mit einer gesteigerten Risikobereitschaft und Experimentierfreudigkeit der Konsumenten [9, 16].

Der fortgesetzte Drogenmißbrauch führt neben dem seelischen und körperlichen Verfall (unter anderem haben sich BTM-Fixer zu einer Risikogruppe der HIV-Träger entwickelt) fast zwangsläufig zum Abgleiten der Betroffenen in die kriminelle Szene (sogenannte Beschaffungs -und Folgekriminalität), da die enormen Geldmittel zur Finanzierung der Sucht in der Regel nicht mit Hilfe

lohnabhängiger Arbeit verdient, sondern durch Straftaten und Prostitution beschafft werden müssen.

Hieraus wird deutlich, daß der Drogenmißbrauch nicht nur ein gesundheitliches, sondern auch ein soziales und juristisches

Problem von immer größer werdender Brisanz darstellt. Es ist daher erforderlich, daß im Rahmen einer umfassenden Drogenbekämpfung ein enges Zusammenarbeiten von Pädagogen, Sozialarbeitern,

Psychologen, Medizinern, sowie Ermittlungs -und Strafverfolgungsbehörden erfolgen muß.

1.2. Definition und Einteilung der Drogen

"Drogen bzw. Suchtmittel sind auf das Zentralnervensystem wirkende natürliche, halb- oder vollsynthetische Verbindungen, die bewußt zur Herbeiführung einer Erlebnis- und/oder Bewußtseinsänderung aufgenommen werden" [12].

Dem Inhalt dieser Definition entsprechen auch Stoffe, die nicht unter das Betäubungsmittelgesetz (BtMG) fallen bzw. der

Rezeptpflicht unterliegen wie beispielsweise Nicotin, Alkohol, Schnüffelstoffe usw.. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll aber

(4)

auf diese Substanzen nicht weiter eingegeangen, sondern nur auf Drogen im Sinne des BtMG Bezug genommen werden.

Die Einteilung der Drogen ist nach verschiedenen Gesichtspunkten möglich, in der folgenden Übersicht soll eine Differenzierung in Wirkklassen mit ihren wichtigsten Vertretern und deren Herkunft vorgenommen werden (s. Abb. 1).

Abbildung 1: Einteilung der Drogen anhand ihres Wirkungsspektrums [3, 6, 16]

Drogen

-Halluzinogene

- Haschisch, Marihuana (aus Cannabis sativa) - LSD

(synthetisch) - Meskalin, Peyote

(aus Lophophora Williamsii, synthetisch) - Psilocybin

(aus Psilocybe mexicana, synthetisch) -Narkotika

- Opium

(aus Papaver somniferum) - Morphium

(aus Papaver somniferum) - Heroin

(halbsynthetisch) -Stimulantien

- Amphetamin und Strukturanaloga (synthetisch)

- Kokain

(aus Erythroxylum coca) - Crack

(halbsynthetisch)

Zu den ebenfalls in der Drogenszene häufig mißbrauchten und

teilweise auch dem BtMG unterliegenden Stoffen zählen Arzneimittel aus den Gruppen der Sedativa/Hypnotika (Benzodiazepine, Barbitu- rate) bzw. der Analgetika (synthetische Morphinabkömmlinge wie Levorphanol, Ketobemidon, Pethidin).

(5)

1.3. Aufgaben der forensischen Betäubungsmittelanalytik

Die forensische Betäubungsmittelanalytik, die im Auftrag der Strafverfolgungsbehörden und Gerichte zur Wahrung rechtsstaat- licher Normen notwendig wird, hat sich infolge der Kriminali- sierung der Drogenszene in den letzten 20 Jahren zu einem eigen- ständigen Zweig der forensischen Toxikologie entwickelt [5]. Es werden hohe Anforderungen an Zuverlässigkeit und Schnelligkeit der analytischen Befunde gestellt, die dann als Sachbeweise Eingang in Verwaltungs- und Strafverfahren finden und für den Klienten

mitunter sehr schwerwiegende Konsequenzen haben können.

Die Hauptaufgaben der Betäubungsmittelanalytik können in folgende drei Bereiche gegliedert werden:

1. Identifizierung von Betäubungsmitteln

2. Quantifizierung und vergleichende Begutachtung von Betäubungs mitteln (z.B. Differenzierung in "Kleinmenge" und "nicht geringe Menge" nach BtMG )

3. Nachweis und gegebenenfalls Quantifizierung von Betäubungs mitteln in biologischem Material.

Den unter Punkt drei angeführten Analysen kommt neben dem strafrechtlichen Aspekt, wie z.B.

- Begutachtung von Drogentodesfällen,

- Drogenabstinenzkontrolle im Rahmen des Strafvollzugs

- Nachweis oder Ausschluß einer Beeinflussung durch Betäubungs mittel im Straßenverkehr bzw. bei Begehung einer Straftat, noch eine andere Bedeutung zu. Derartige Untersuchungen sind ebenfalls in Therapiekonzepte zur Schaffung eines drogenfreien Raumes um den Abhängigen bzw. zur Überwachung seiner Drogenabstinenz außerhalb von Drogeneinrichtungen integriert. Häufig werden Drogenanalysen unter dieser Fragestellung auch an anderen medizinischen bzw. sozialen Einrichtungen durchgeführt.

2. Immunoassays als Möglichkeit des schnellen Drogennachweises

Die im Rahmen des Drogenscreenings immer größer werdenden Proben- zahlen, häufig versehen mit der Auflage einer schnellen Befund- erhebung, machen eine Automatisierung des Analysenablaufs uner- läßlich.

Dieser Forderung kommen heute immunchemische Methoden wie Radio-, Enzym- oder Fluoreszenspolarisations- Immunoassay schon weitgehend entgegen. Vorteile dieser Methoden sind:

- einfache Handhabung (eine Abtrennung störender Matrixbestand teile ist in der Regel nicht nötig)

- Wirtschaftlichkeit

- schneller qualitativer Nachweis

- rationeller Ausschluß negativer Proben und damit Einengung des spezifischer zu untersuchenden Probenaufkommens.

Bei forensischen Fragestellungen ist es immer notwendig, positive Befunde mit Hilfe eines zweiten, auf einem anderen Meßprinzip basierenden Analysenverfahrens (z.B. GC/MS, GC, HPLC ) abzu-

(6)

sichern. Diese Forderung scheint bei immunchemisch gewonnenen Ergebnissen generell angebracht, da die Spezifität der Testsysteme im Drogenscreening (es handelt sich vorwiegend um Gruppenteste) stark differiert.

2.1. Allgemeine Prinzipien immunchemischer Nachweisverfahren

Immunchemische Nachweisverfahren basieren auf einer Antigen-Anti- körper-Reaktion, wobei der in der Matrix zu bestimmende Wirkstoff mit gleichzeitig zugesetztem markierten Wirkstoff um freie Bin- dungsstellen an dem gegen diesen Wirkstoff gerichteten Antikörper konkurriert.

Viele Xenobiotika stellen jedoch niedermolekulare Wirkstoffe dar und sind somit zu klein, um eine Antikörperproduktion in einem ge- eigneten Versuchstier zu induzieren. Werden sie aber an ein immun- tolerables Makromolekül gebunden, erhalten sie selbst immunogene Eigenschaften und führen als sogenanntes Hapten ebenfalls zur Bil- dung (klonale Vermehrung) spezifischer Antikörper. Mit Hilfe der auf diesem Wege gewonnenen spezifischen Antikörper lassen sich dann die in der zu analysierenden Probe vorhandenen Antigene nachweisen. Zum Teil werden hierbei monoklonale Antikörper oder Gemische von diesen verwendet, wobei Testverfahren erhalten werden, die entweder hochspezifisch sind oder eine bestimmte Gruppenspezifität aufweisen. Der Einsatz der jeweiligen Be-

stimmungsmethode richtet sich nach der aktuellen Problemstellung, so können mit hochspezifischen Tests im Rahmen des therapeutischen Drug monitoring sehr zuverlässig Medikamentenspiegel bestimmt

werden. Für Screeninguntersuchungen (also auch für die

immunchemische Drogenanalyse) ist der Einsatz gruppenspezifischer Tests sinnvoller, da sich unter Ausnutzung der Kreuzreaktivitäten möglichst viele Vertreter einer bestimmten Substanzgruppe erfassen lassen.

Um die oftmals geringen Mengen an Xenobiotika (ug/1) bestimmen zu können, ist es notwendig, mit Hilfe der Tracer-Technik eine Sig- nalverstärkung vorzunehmen. Hierbei erfolgt der Einsatz verschie- denster Markierungstechniken in Abhängigkeit von den einzelnen Immunoassays, so werden beim Radioimmunoassay (RIA) Radioisotope, beim Enzymimmunoassay (EMIT) Enzyme, beim Chemilumineszensassay (CLA) Luminogene und beim Fluoreszenspolarisationsassay (FPIA) Fluophore als Tracer verwendet. Bei allen diesen Testverfahren führt die Bindung des markierten Antigens an den Antikörper kon- zentrationsabhängig zu einer Signaländerung bzw. zu Folgereak- tionen, die als Meßparameter dienen.

Anhand von Entscheidungsgrenzen (z.B. "cut off", matrixbereinigte Nachweisgrenze) werden die prinzipiell quantitativen Meßsignale in Aussagen ">" bzw. "<" umgewandelt [l, 7].

Quantitative Abschätzungen im Serum, insbesondere ohne Kenntnis der Natur der vorliegenden Xenobiotika, sind bei immunchemischen Screeninguntersuchungen nicht zulässig, da die einzelnen Vertreter einer Stoffgruppe sehr unterschiedliche Kreuzreaktivitäten aufweisen bzw. auch chemisch ähnliche Substanzen miterfaßt werden können. Die Ergebnisinterpretation ist also bei derartigen Ana- lysen sehr vorsichtig und gewissenhaft vorzunehmen und positive Resultate bedürfen stets einer Bestätigung durch ein zweites, un- abhängiges Meßverfahren.

(7)

Im folgenden soll auf die in unserem Labor im Rahmen des Drogen- screenings praktizierten Analysenverfahren des

- Fluoreszenspolarisationsimmunoassays mit Hilfe des ADX-Gerä tes der Firma ABBOTT und des

- Enzymimmunoassays d.a.u. mit Hilfe des Auto-lab-system der Firma SYVA

etwas differenzierter eingegangen werden.

2.2. Drogennachweis mit Hilfe des Fluoreszenspolarisationsimmuno- assays (FPIÄ)

Der FPIA stellt einen homogenen Immunoassay dar, d.h. es wird kein Trennungsschritt zwischen ungebundenem und antikörpergebundenem Tracer benötigt.

Als Tracer findet überwiegend ein fluoresceinmarkiertes Antigen Verwendung, welches mit dem Proben-Antigen um ein beschränktes Angebot an Antikörper-Bindungsstellen konkurriert. Wird der Tracer durch linear polarisiertes Licht angeregt, sendet er eine

Fluoreszens aus, deren Polarisationsgrad umgekehrt proportional zu seiner Drehgeschwindigkeit ist. Daher ist es verständlich, daß die Polarisation der Fluoreszens des freien, relativ kleinen Tracers aufgrund seiner Beweglichkeit sehr gering sein muß. Bindet er sich aber an den spezifischen Antikörper, so nimmt er die geringere Drehgeschwindigkeit des größeren Antikörpermoleküls an, was zur Folge hat, daß die Polarisation des ausgestrahlten Lichtes an Betrag gewinnt.

Die genaue Beziehung zwischen Polarisation und Konzentration der nichtmarkierten Probe wird bestimmt, indem die Fluoreszenspolari- sationswerte von Kalibrierstandards gemessen werden und eine Kali- brierkurve im Meßgerät ADx (Firma ABBOTT) gespeichert wird. Die Berechnung der Patientenresultate erfolgt durch den Mikroprozessor des Analysensystems anhand der gespeicherten Kalibrationskurve, die bei ständig kühler Lagerung der Arbeitsreagentien mindestens 14 Tage stabil bleibt. Die Ergebnisse können entweder in qualitativer Form als "über" bzw. "unter" einem definierten Schwellenwert (cut off) oder in semiquantitativer Form als numerische Kon-

zentrationswerte angegeben werden.

Die gespeicherte Kalibrierkurve wird durch mindestens eine in je- der Analysenserie mitgeführte Kontrolle ("Low", "Medium", "High") gegen einen zulässigen Bereich überprüft; das Mitführen einer Ne- gativ-Kontrolle ist in der Regel nicht erforderlich [2, 3].

2.2.1. Probemaaterial und Durchführung

Auf Grund der Tatsache, daß im Urin die Konzentration von Drogen bzw. Drogenmetaboliten signifikant höher ist als im Serum, der Nachweiszeitraum länger ist und die Probengewinnung auf nicht- invasiven Wege erfolgen kann, stellt er das bevorzugte Untersu- chungsmaterial zum Drogenscreening dar. Die kommerziell angebote- nen Drogenassays sind auf Urin geeicht, es besteht aber grundsätz- lich auch die Möglichkeit, andere biologische Matrizes wie Magen- spülflüssigkeit oder Blut nach entsprechenden Aufarbeitungspro-

(8)

a

zeduren (Antikoagulantien, Heparin, EDTA, Oxalat stören dabei nicht) mit diesen Reagentiensätzen zu analysieren [5, 21]. Setzt man Urin ein, so ist in der Regel keine Probenvorbereitung nötig (gegebenenfalls Zentrifugation trüber Urine bzw. Kontrolle, ob Proben-pH zwischen 5,5 und 8,0 liegt) und er kann sofort auf die Anwesenheit von Drogen untersucht werden.

Das Drogenscreening mittels FPIA wird in unserem Labor mit dem ADx -Gerät der Firma ABBOTT durchgeführt. Dies ist entweder im Single- run-Verfahren, das heißt, es werden aus der Probe jeweils die einzelnen Parameter nacheinander untersucht, oder im sogenannten Panel-run-Verfahren möglich. Das ADX -Gerät gestattet im Panel-run die parallele Bestimmung mehrerer Drogenparameter aus derselben Probe während eines Analysenlaufs. Dieses Verfahren ist allerdings nur für Urin- und nicht für Serum-Teste (diese existieren für

Barbiturate und Benzodiazepine) geeignet. Im Rahmen dieser Arbeit soll auf eine detaillierte Durchführungsvorschrift verzichtet und auf die Kurzbedienungsanleitung bzw. das ausführliche

Gerätehandbuch der Firma ABBOTT verwiesen werden [2, 3] -

2.2.2. Testkits

Derzeit sind für das Drogenscreening im Urin von der Firma ABBOTT folgende Testkits erhältlich:

Amphetamin/Methamphetamin Barbiturate

Benzodiazepine Cannabinoide

Kokain-Metabolite Methadon

Opiate

Phencyclidin.

Zur Bestimmung im Serum stehen Testkits für Barbiturate und Benzo diazepine zur Verfügung [2].

Im Folgenden sollen die einzelnen Testkits etwas genauer charakterisiert werden.

Aoiphe tamin/Me thamphe tamin

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin im Humanurin.

Außerdem werden strukturmäßig verwandte Substanzen wie MDA (3,4- methylendioxyamphetamin), MDMA (Methylendioxymethamphetamin), Pholedrin, Phentermin und Propylhexedrin miterfaßt. Ephedrin und Cathin entziehen sich einem Nachweis mit diesem Testsystem. Zur genauen Differenzierung und Absicherung des Resultates ist unbedingt eine Bestätigungsanalyse mit einer unabhängigen Methode angezeigt .

(9)

9

BarJbiturate

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Barbituraten im Humanurin.

Die Ansprechbarkeit des Tests auf die einzelnen Barbiturate differiert stark, was eine Beurteilung des Ergebnisses recht problema- tisch macht. So werden z.B. Secobarbital, Brallobarbital oder But- albital sehr empfindlich angezeigt, wohingegen Thiopental, Hexo- barbital bzw. Barbital nicht oder nur in sehr hohen Konzentratio- nen erfaßt werden. Es ist also auch bei negativem Analysenergebnis eine Aufnahme von therapeutischen Dosen, insbesondere der

letztgenannten Barbiturate nicht auszuschließen.

Benzodiazepine

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Benzodiaz- epinen und einigen ihrer Metabolite im Humanurin. Auch dieses System ist ein Gruppentest mit stark variierender

Ansprechempfindlichkeit; Diazepam, Prazepam oder Alprazolam werden gut erfaßt, während Chlordiazepoxid, Clonazepam oder Lorazepam nur unzureichend nachgewiesen werden können. Niedrige therapeutische Dosierung einiger neuerer Derivate, eine unterschiedliche, teilweise sogar erhebliche Konjugatbildung (Oxazepam, Lorazepam}, sowie die schlechte Erfassung einiger Metabolite stellen weitere Probleme des Benzodiazepinassays dar. Aus den genannten Gründen kann es unter Umständen nützlich sein, eine Benzodiazepin-Be- stimmung vor und nach enzymatischer Hydrolyse der Urinproben durchzuführen [4].

Cannabinoide

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Cannabinoiden in humanen Urinproben.

Der Test ist auf die Bestimmung von 11-Nor-^9-THC-9-Carbonsäure (dies ist der Hauptmetabolit im Urin) ausgerichtet, erfaßt aber auch THC selber bzw. weitere THC-Metabolite.

Kokain -Me tabol i te

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Benzoylecgo- nin, dem primären Kokainmetaboliten in Humanurin. Aufgrund der erheblich geringeren Empfindlichkeit werden Kokain selbst bzw.

Ecgonin in der Regel nicht erfaßt. Die Nachweisgrenze dieses Assays liegt weit unter den bei Kokaingenuß üblicherweise auftretenden Konzentrationen.

Methadon

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Methadon im Humanurin.

Dieser Assay spricht in erster Linie auf nicht metabolisiertes Methadon an, seine Empfindlichkeit reicht jedoch nicht aus, um therapeutische Konzentrationen sicher zu erfassen. Die Urinspiegel von Personen unter Methadon-Maintenance werden im allgemeinen aber eindeutig nachgewiesen.

(10)

10

Opiate

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Opiaten und deren Metaboliten in humanen Urinproben.

Dieser Assay ist ein Gruppentest und eignet sich nur zum allgemeinen Screening auf Opiate, da neben den Opiat-Drogen auch opiat- haltige Pharmaka (z.B. mit Codein oder Dihydrocodein) erfaßt werden. Auch der Genuß von Mohnsamen (z.B. in Form von Kuchen) kann unter Umständen zu einem positiven Resultat führen, während synthetische Opioide wie z.B. Methadon und Pethidin mit diesem Test nicht reagieren.

Phencyclidin

Semiquantitatives Reagentiensystem zum Nachweis von Phencyclidin in humanen Urinproben.

Neben Phencyclidin werden auch PCP-analoge Substanzen erfaßt.

Allerdings spielt diese synthetische Droge auf dem deutschen Markt bisher noch keine nennenswerte Rolle.

Für die Serum/Barbiturat- bzw. Serum/Benzodiazepinassays gelten dieselben Aussagen wie für ihre analogen Urin-Testkits. Die auf dem Ergebnisausdruck erscheinenden numerischen Konzentrationsan- gaben müssen unter Berücksichtigung der stark differierenden Nach- weisempfindlichkeit bzw. Kreuzreaktivität ebenfalls sehr vorsichtig interpretiert werden.

2.3. Drogen-Nachweis mit Hilfe der Enzyme-Multiplied-Immunoassay- Technique (EMIT)

Der EMIT-Test gehört ebenfalls zu den homogenen Analysenverfahren und somit entfällt eine Trennung zwischen ungebundenem und anti- körpergebundenem Tracer.

Als Tracer wird ein enzymmarkierter Analyt eingesetzt, der mit dem freien Analyten aus dem Untersuchungsmaterial um ein beschränktes Angebot an Antikörper-Bindungsstellen konkurriert. Bei der Bindung des enzymmarkierten Tracers an den spezifischen Antikörper wird die Aktivität des Markerenzyms Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase weitgehend gehemmt. Nur der freie enzymmarkierte Tracer bleibt enzymatisch wirksam und seine Aktivität wird anhand der Reaktion NAD ---- s- NADH photometrisch bei 340 nm bestimmt. Die Enzym aktivität ist hierbei der Wirkstoffkonzentration in der Probe proportional.

Durch Vergleich der Stärke des Meßsignals (Extinktion) der Probe mit den Ergebnissen gleichzeitig analysierter Kalibratoren ("0" = Negativ-Kalibrator; "Low" = Cut-Off-Kalibrator; "Medium" =

Kalibrator mit mittlerer Konzentration) wird eine Aussage anhand einer Entscheidungsgrenze ("Cut-Off") getroffen [14].

(11)

11 2.3.1. Probenmaterial und Durchführung

Betreffs Probenmaterial bzw. Probenvorbereitung gelten dieselben Bedingungen wie bereits im Abschnitt 2.2.1. erwähnt. Das

Drogenscreening mittels EMIT d.a.u. wird in unserem Labor mit dem EMIT^R Auto Lab 5000 System der Fa. SYVA durchgeführt. Bei dieser Geräteausstattung besteht nicht die Möglichkeit, Kalibra-

tionskurven für Drogenassays zu speichern, so daß an jedem Unter- suchungstag eine erneute Kalibration durchgeführt werden muß. Die Bestimmung der Proben kann nur im single run-Verfahren erfolgen, d. h. es werden die einzelnen Drogenparameter nacheinander aus der zu untersuchenden Probe analysiert. Neuere Gerät bieten allerdings die Möglichkeit der Speicherung von Kalibrationskurven bzw. der Simultanbestimmung mehrerer Drogenparameter aus der Probe während eines Analysenlaufs (z. B. ETS der Fa. SYVA; Cobas Bio der Fa.

HOFFMANN LA RÖCHE; EPOS-Analyzer 5060 der Fa. EPPENDORF).

Zur genauen Arbeitsvorschrift sei auf die Arbeitsblätter EMIT LAB SYSTEM der Fa. SYVA verwiesen [19].

2.3.2. Testkits

Derzeit sind für das Drogenscreening mittels EMIT d.a.u. von der Fa. SYVA folgende Testkits erhältlich:

Amphetamin polyklonal

Amphetamin/Methamphetamin monoklonal Barbiturate

Benzodiazepine

Cannabinoide -20, -50,-100 Kokain-Metabolite

Methadon Methaqualon Opiate

Phencyclidin Propoxyphen.

Zur Bestimmung im Serum stehen Testkits für Barbiturate und Benzodiazepine zur Verfügung.

Amphetamin polyklonal

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Amphetamin und amphetaminähnlichen Substanzen in humanen Urinproben. Dieser Test ist ein ausgesprochener Gruppentest, kann also nur zum generellen Screening auf Amphetamin bzw. amphetaminähnliche Substanzen

(Cathin und Ephedrin werden miterfaßt) verwendet werden und beweist bei positivem Resultat keinesfalls eine Amphetamin-

Aufnähme. Die Empfehlung, positive Untersuchungs-ergebnisse mit einer anderen, unabhängigen Methode zu erhärten, gilt hier in besonderem Maße.

(12)

12

Amphetamin/Methamphetamin monoklonal

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin in humanem Urin.

Durch die Kombination zweier monoklonaler Antikörper für D- Amphetamin und D-Methamphetamin wurde die Spezifität des

Nachweises erheblich verbessert. Amphetaminähnliche Substanzen wie Ephedrin, Phendimetrazin, Phenmetrazin, Norpseudoephedrin oder Pseudoephedrin, werden nicht mehr erfaßt. Aufgrund der

verbesserten Empfindlichkeit des Testsystems gelingt der Nachweis synthetischer Amphetamindrogen wie MDA oder MDMA bereits bei

niedrigeren Konzentrationen mit dem polyklonalen Test.

Barbiturate

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Barbituraten in humanem Urin.

Für diesen Test können analoge Aussagen wie für das FPIA-Reagenz- pack der Fa. ABBOTT getroffen werden.

Benzodiazepine

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Benzodiazepinen und einigen ihrer Metaboliten in humanem Urin.

Cannabinoide -20, -50, -100

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Cannabinoiden in Humanurin.

In Abstimmung mit den Anforderungen an die Nachweisempfindlichkeit kann zwischen drei Testsätzen mit den "Cut-Off"-Werten von

20 ng/ml, 50 ng/ml bzw. 100 ng/ml gewählt werden.

Kokain-Metaboli te

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Benzoylecgonin, dem primären Kokain-Metaboliten in humanem Urin.

Methadon

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Methadon im Humanurin.

(13)

13

Methaqualon

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Methaqualon im Humanurin.

Das Sedativum und seine Metabolite können mit diesem Test hochspezifisch nachgewiesen werden.

Opiate

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Opiaten und deren Metaboliten in humanen Urinproben.

Phencyclidin

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Phencyclidin in humanen Urinproben.

Propoxyphen

Reagentiensystem zum qualitativen Nachweis von Propoxyphen in humanen Urinproben.

Dieser Test gestattet die hochspezifische Erfassung von Propoxyphen und seinen Hauptmetaboliten.

Für die Serum/Barbiturat- bzw. Serum/Benzodiazepinassays kann ebenfalls auf die zu den entsprechenden FPIA-Reagentiensätzen gemachten Angaben verwiesen werden.

In der folgenden Übersicht sollen nochmals die von den Firmen ABBOTT und SYVA kommerziell erhältlichen Drogenassays, die Substanzen, die auf die entsprechenden Testkits geeicht sind, sowie die von den Herstellerfirmen angegebenen "Cut-Off"-Werte aufgelistet werden (s. Tab. 2).

(14)

Tabelle 2: Übersicht über Art, Eichsubstanzen und "Cut-Off"-Werte der Testkits der Firmen ABBOTT und SYVA

S Y V A A B B O T T

Testkit E i c h s u b s t a n z C u t - O f f * Testkit Eichsubstanz Cut-Off*

Ämphetamin (polyklonal)

D/L-Amphetamin 300 Ämphetamin/

Methamphetamin

D-Amphetamin 300

Amphetamin (monoklonal)

D-Methamphetatnin 1000

Barbiturate Secobarbital 300 Barbiturate Secobarbital 200 Benzodiazepine Oxazepam 300 Benzodiazepine Nordiazepam 200 Cocain-Metabolite Benzoylecgonin 300 Cocain-Metabolite Benzoylecgoniri 300

Methadon Methadon 300 Methadon Methadon 250

Methaqualon Methaqualon 300 - - -

Opiate Morphin 300 Opiate Morphin 200

Phencyclidin Phencyclidin 75 Phencyclidin Phencyclidin 25

Propoxyphen Propoxyphen 300 - - -

Cannabinoide ll-nor-49-THC- 9-Carbonsäure

20/50/100 Cannabinoide ll-nor-A9-THC- 9-Carbonsäure

25

- Der Schwellenwert ("Cut-Off") ist die Konzentration, die zur Trennung eindeutig positiver und negativer Befunde im Drogen- screening herangezogen wird. Er ist nicht zu verwechseln mit der Nachweisgrenze des Analysenverfahrens, die lediglich die geringste, gerade noch meßbare Konzentration einer einheit- lichen Substanz angibt. Angabe der "Cut-Off"-Werte in ng * ml-¹

2.4. Beeinflussung und Interpretation immunchemisch gewonnener Untersuchungsergebnisse

Wie bereits in den vorhergehenden Abschnitten erwähnt, muß die In- terpretation von Resultaten, die im Rahmen des immunchemischen Drogenscreenings ermittelt wurden, mit Sorgfalt und Sachverstand vorgenommen werden. Bei der Befunderhebung sollte immer berück- sichtigt werden, daß das Untersuchungsergebnis durch eine Vielzahl von Faktoren sowohl positiv als auch negativ beeinflußt werden kann. Diese Parameter können subjektiver Natur oder Methodenbzw.

Reagenssystemabhängig sein. Auch die Möglichkeit einer Mani-

pulation am Untersuchungsmaterial durch die betroffenen Personen (vorgenommen, um ihren Drogenkonsum einem Nachweis zu entziehen), sollte mit beachtet werden [14, 15].

(15)

15

Subjektive Einflüsse auf die Drogenkonzentration im Urin bestehen unter anderem in der Art, Menge und Häufigkeit des Drogenkonsums, dem Applikationsweg, der körperlichen Verfassung der betreffenden Person (Gesundheitszustand, Körpergewicht, Ernährungssituation) oder auch im Umfang der Flüssigkeitsaufnahme bzw. der Variabilität der Urinproben. Eine wichtige Rolle spielt in diesem Zusammenhang auch die Tatsache, daß der Drogenabbau und damit das Ausschei- dungsmuster von Metaboliten sehr stark individuell geprägt ist.

Gerade dieser letztgenannte Einflußfaktor wirkt sich besonders gravierend nach dem Konsum von Haschisch oder Marihuana aus, so konnte in neueren Studien aufgezeigt werden, daß aufgrund individuell sehr unterschiedlicher Ausscheidungsmuster gleichbleibend negative Analysenresultate erst mehrere Tage bis über einen Monat nach der Drogenaufnahme zu ermitteln sind [8, 18]. Eine Ursache für das individuell doch sehr stark variierende Metabolisierungs- und Eliminationsverhalten von Cannabinoiden ist darin zu sehen, daß das Tetrahydrocannabinol (THC) im Fettgewebe des Organismus

gespeichert und von dort im Laufe der Zeit wieder an den Kreislauf abgegeben wird, wobei diese THC-Freisetzung wiederum aktuellen Einflüssen, wie z.B. Veränderung der Ernährungsgewohnheiten (Diät) oder StoffWechselerkrankungen unterliegt.

In der folgenden Übersicht sind ungefähre Verweilzeiten verschie- dener Drogen im Urin dargestellt, wobei es sich dabei natürlich nur um Richtwerte handeln kann (s. Tab. 3).

Tabelle 3: Verweilzeit der Drogen im Urin

Droge ungefähre Verweilzeit

Amphetamine 48 Stunden

Barbiturate 24 Stunden (kurz wirksame Substanzen) 2 bis 3 Wochen (lang wirksame Substanzen) Benzodiazepine 3 Tage (nach kurzzeitiger therapeutischer

Aufnahme)

4 bis 6 Wochen (nach Langzeiteinnahme über Jahre) Cannabinoide 5 Tage (mäßiger Raucher: zirka 4 x /Woche)

10 Tage (starker Raucher: täglich)

bis zu einem Monat (bei chronischen, starken Konsum)

Kokain 2 bis 4 Tage

Methadon ca. 3 Tage

Methaqualon 2 Wochen

Opiate ca. 2 Tage

Phencyclidin ca. 8 Tage

Propoxyphen 6 bis 48 Stunden

Um ihren Drogenkonsum einem sicheren analytischen Nachweis entziehen zu können, werden mitunter von den betroffenen Personen Mani- pulationen an ihrem Untersuchungsmaterial vorgenommen. Damit hoffen sie, den sich aus einem positiven Befund eventuell ablei- tenden strafrechtlichen und gesundheitspolitischen Konsequenzen entgehen zu können. Durch Einnahme von Diuretika bzw. literweises

(16)

16

entgehen zu können. Durch Einnahme von Diuretika bzw. literweises Trinken von Flüssigkeit kann der Urin derartig verdünnt werden, daß ein Nachweis der betreffenden Droge unter die Erfassungsgrenze des Testsystems fällt. Außerdem können dem Urin Stoffe zugesetzt

werden, die zum Teil ein beträchtliches Verfälschungspotential besitzen, beispielsweise Kochsalz, Hypochlorit (aus Bleichlö- sungen, WC-Reiniger), Flüssigseife, Backpulver, Salzsäure oder auch die Augentropfen Visine^R (Inhaltsstoffe: Tetryzolin, Benz- alkoniumchlorid). Auf derartige Stoffe sprechen zum einen die jeweiligen Drogenassays selbst verschieden stark an, zum anderen gibt es auch Unterschiede zwischen beiden Meßprinzipien, wobei im allgemeinen der FPIA robuster gegenüber Manipulationen einzu-

schätzen ist als der EMIT [10].

Um eine Verfälschung von Urinproben möglichst auszuschließen, ist der "Proband" vor und während der Probenahme (nur laboreigene Gefäße verwenden!) zu überwachen und in strittigen Fällen sind Ergänzungsuntersuchungen wie Aussehen, Geruch, pH-Messung und Dichtebestimmung durchzuführen.

Auf die assayspezifischen Einflußgrößen ist in den vorangegangenen Abschnitten bereits ausführlicher eingegangen worden. Bei der Ein- schätzung eines Analysenergebnisses sollte also immer die Spezifi- tät (Gruppentest/Einzeltest), Empfindlichkeit und Kreuzreaktivität (Interferenzen mit anderen Drogen oder Arzneimitteln) des be-

treffenden Reagentiensystems berücksichtigt und positive Resultate stets durch eine zweite, auf einem anderen Meßprinzip basierende Analysentechnik bestätigt werden.

Die quantitative Untersuchung von Urinproben auf Drogenmißbrauch hat in Anbetracht so vieler variabler Faktoren nur geringen Wert für Screening-Programme, deren vorrangiges Ziel in der Identifi- zierung der eingenommenen Drogen besteht. Die sich aus quantitativen Urinanalysen ergebenden Konzentrationsangaben sind

unbrauchbar zur Ermittlung von Aufnahmezeitpunkt, Dosierung oder Applikationsweg der Droge. Existierende pharmakokinetische Daten basieren auf quantitativen Messungen von Serumproben und können nicht auf Urinproben übertragen werden.

Der Aussagewert immunchemisch gewonnener Drogenergebnisse liegt vorrangig darin, daß schnell und zuverlässig qualitative Hinweise auf einen eventuellen Drogenabusus gegeben werden können, die bei forensischen Fragestellungen bzw. schweren Therapieentscheidungen mit anderen Methoden verifiziert werden müssen.

(17)

17

3. Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat der Mißbrauch von Drogen immer mehr an Bedeutung gewonnen und inzwischen Ausmaße erreicht, die sowohl für die Betroffenen selbst, als auch für die Gesellschaft ein sehr ernstzunehmendes Problem darstellen. Infolge der Kriminalisierung der Drogenszene hat sich auch die forensische Betäubungsmittel- analytik in zunehmender Weise weiterentwickelt, um die hohen Maß- stäbe, die an Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit der analytischen Befundung gelegt werden, erfüllen zu können. Eine Methode, die sich im Drogenscreening bereits gut bewährt hat und den Anforderungen durch die steigenden Probenzahlen gerecht wird, ist der immunchemische Drogennachweis. Mit dieser Technik ist es möglich, in kurzer Zeit und mit wenig Arbeitsaufwand das

Probenaufkommen zuverlässig auf Drogen zu untersuchen, die positiven Befunde herauszufiltern und somit das spezifischer zu analysierende Untersuchungsgut einzuengen. Die so erhaltenen positiven, qualitativen Aussagen haben aufgrund von vielfältigen Einflußfaktoren (Interferenzen mit anderen Drogen oder Arznei- mitteln, Spezifität des Reagenssystems usw.) mehr orientierenden Charakter und es ist bei forensischen Fragestellungen bzw. gra- vierenden Therapieentscheidungen unbedingt angezeigt, diese Resul- tate mit einer zweiten, auf einem anderen Meßprinzip basierenden Methode (GC, GC/MS, HPLC) abzusichern.

(18)

18

Literaturverzeichnis

1. Aderjan, R.;

Grundlagen immunchemischer Nachweismethoden.

Symposium Forensische Probleme des Drogenmißbrauchs, Mosbach, 26./27. April 1985

2. ADx-Assay manual; ABBOTT Laboratories, 1989 3. ADx-Operator's guide; ABBOTT Laboratories, 1989 4. Beyer, K.-H.;

Vergleichende Untersuchungen zur Bewertung des FPIA als Screening-Methode für Drogen und Medikamente im Urin am Beispiel von Benzodiazepinen.

In: Beiträge zur Toxikologischen Chemie, Leipzig, 3.-5. Juli 1990

5. Daldrup, Th. ;

Zur Bewertung der THC- bzw. THC-Metaboliten-Spiegel im Blut und Urin.

Symposium Forensische Probleme des Drogenmißbrauchs, Mosbach, 26.727. April 1985

6. Drogenhandbuch für Klinik und Praxis.

Daunderer, H. (Ed.); ECOMED Landsberg, München, Zürich 1990 7. Einsatz von immunchemischen Testen in der Suchtmittelanalytik.

DFG, Empfehlungen zur klinisch toxikologischen Analytik;

VCH Weinheim 1988

8. Ellis, G., H. Mann, B. Judson, et al. ;

Excretion patterns of cannabinoid metabolites after last use in a group of chronic users.

Clin. Pharmacol. Ther. 38, 572-578 (1985) 9. Gerchow, J.;

Drogenkarriere und Therapiemöglichkeiten.

Symposium Forensische Probleme des Drogenmißbrauchs, Mosbach, 26.727. April 1985

10. Hagemann, P., M. Siegrist;

Verfälschungsstoffe beim Drogennachweis.

Lab. Med. 14, 116-120 (1990) 11. Katzung, W.;

Drogen: Informationen in Übersichten (II); Juristische Aspekte.

Med. Aktuell 16, (1990) 12. Katzung, W.;

Legale und illegale Drogen - Stand, ausgewählte Probleme, Trends.

Z. Ärztl. Fortbild. 86, 689-699 (1992)

(19)

19

13. Megges, G.;

Zum Stand der forensischen Betäubungsmittelanalytik. In:

Beiträge zur Toxikologischen Chemie, Leipzig, 3.-5. Juli 1990 14. Möller, M. R.;

Bewertung immunologischer Befunde.

Symposium Forensische Probleme des Drogenmißbrauchs, Mosbach, 26./2l. April 1985

15. Obst, J.;

Immunologische Drogentestung.

In: Beiträge zur Toxikologischen Chemie, Leipzig, 3.-5. Juli 1990

16. Polizei. Dein Partner: Drogen und Kriminalität.

Verlag Deutsche Polizeiliteratur GmbH, 1990 17. Schmidt, K., H. W. Randonat;

Untersuchungen zum immunologischen Barbiturat-Nachweis im Urin.

In: Beiträge zur Toxikologischen Chemie, Leipzig, 3.-5. April 1990

18. Schwartz, R., G. Hayden, M. Riddile;

Laboratory detection of marihuana use. Experience with a photometric immunoassay to measure urinary cannabinoids.

Am. J. Dis Child 139, 1093-1096 (1985)

19. Syva Diagnostica: Arbeitsblätter EMIT Lab System II.

SYVA Diagnostica, Darmstadt, 1990

20. Syva Diagnostica: Häufig gestellte Fragen zu den Syva-Drogen- tests.

SYVA Diagnostica, Darmstadt, 1990 21. Von Meyer, L.;

Zum enzymatisch-immunochemischen Nachweis des Haschischkonsums und seiner dünnschichtchromatographischen Absicherung. Z.

Rechtsmed. 94, 219-225 (1985)