Untersuchungen zur funktionellen Rolle des Prionproteins unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen

Untersuchungen zur funktionellen Rolle des Prionproteins unter

physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen

Dissertation

zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften des Fachbereichs Biologie, der Fakultät für Mathematik, Informatik

und Naturwissenschaften, der Universität Hamburg

vorgelegt von

Kathrin Hoffmann aus Hamburg

Gutachter

Prof. Dr. Melitta Schachner Camartin

PD Dr. Edgar Kramer

1 INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG

1.1 Prion-Protein ... 4

1.1.1 Struktur des PrPC ... 5

1.1.2 Funktionelle Rolle des PrPC ... 7

1.2 Reaktive-Sauerstoff-Spezies... 9

1.3 GSH/GSSG-System ... 10

1.4 Exzitatorische-Aminosäure-Transporter (EAAT) ... 11

1.5 Zelluläre Antwort auf Hypoxie ... 13

1.6 Na+ / K+ -ATPase ... 14

1.7 Rolle des Prion-Proteins im serotonergen System ... 15

1.7.1 Glycoprotein-gekoppelte Aminosäuretransporter ... 16

1.8 Exosomen ... 17

1.9 Zielsetzung………19

3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Molekularbiologische Methoden 3.1.1 Ligation von DNA-Fragmenten ... 20

3.1.2 Transformation kompetenter Bakterien ... 20

3.1.3 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien (DH5α) ... 21

3.1.4 Plasmidisolierung aus 2 ml E. coli Bakterienkultur (Qiaspin MiniPrep Kit) ... 21

3.1.5 Plasmidisolierung aus 200 ml E. coli Bakterienkultur (Qiagen MidiPrep Kit) ... 21

3.1.6 Restriktionsverdau von DNA ... 22

3.1.7 Gelelektrophorese von DNA ... 22

3.1.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen (QiaQuick Gel Extraction Kit) ... 23

3.2 Biochemische Methoden 3.2.1. Herstellung von Homogenaten aus Gewebe ... 24

3.2.2 Herstellung von Homogenaten aus kultivierten Zellen ... 24

3.2.3 Biotinylierung von Proteinen ... 24

3.2.4 Bestimmung der Proteinkonzentration ... 25

3.2.5 Ko-Immunopräzipitation ... 25

3.2.6 Ermittlung potentieller Bindungspartner durch Pulldown-Experimente ... 25

3.2.7 SDS-Polyacrylamidgel Elektophorese ... 26

3.2.8 Coomassie-Färbung ... 26

3.2.9 Immunoblot (Westernblot, WB) ... 27

3.2.10 Entfernung der Detektionsantikörper vom Immunoblot ... 28

3.2.11 Bindungsstudien ... 28

3.2.12 Immunofärbung ... 29

3.2.13 Serotonin- ELISA (Enzyme linked immunosorbent Assay) ... 29

3.2.14 Colorimetrischer Glutathion-Versuchsansatz ... 29

3.2.15 Glutathion-Bestimmung im Astrozytenmedium (GSH/GSSG-Glo, Promega) ... 30

3.2.16 Bestimmung der Glutathionreduktase-Aktivität (Cayman) ... 31

2 3.3 Methoden der Zellkultur

3.3.1 Kultivierung von CHO (chinese hamster ovary)-Zellen ... 31

3.3.2 Auftauen von CHO-Zellen ... 32

3.3.3 Langzeitlagerung der CHO-Zellen ... 32

3.3.4 Transiente Transfektion von CHO-Zellen ... 33

3.3.5 Präparation von Kleinhirnneuronen ... 33

3.3.6 Präparation von Astrozyten ... 34

3.3.7 Ko-Kultur von Astrozyten und Kleinneuronen ... 34

3.3.8 Neutralrotfärbung ... 34

3.3.9 Beschichtung von Deckgläschen mit Poly-L-Lysin ... 35

3.3.10 Isolation von Exosomen ... 35

3.3.11 Kultivierung von Kleinhirnneuronen in konditioniertem Medium ... 35

3.3.12 Behandlung von kultivierten Zellen mit Hypoxie/Reoxigenierung ... 36

3.4 Untersuchungen an lebenden Zellen 3.4.1 Studien zum Transport von Aminosäuren ... 36

3.4.2 γ-Glutamyltranspeptidase Aktivitätsbesimmung (abgewandelt nach Morgenstern et al., 1990)37 4 ERGEBNISSE 4.1 Expression von PrPC in Astrozyten ist ausschlaggebend für erhöhtes Überleben von Astrozyten von wildtypischen Kleinhirnneuronen bei oxidativem Stress. ... 38

4.1.1 Das durch Exosomen gesteigerte Überleben von Kleinhirnneuronen wird durch PrPC vermittelt. ... 41

4.1.2 Exosomen von Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten unterscheiden sich in ihrer Proteinzusammensetzung nach Hypoxie-Behandlung... 45

4.2 Dysregulation in der Bereitstellung von interzellulärem Glutathion und Cystein bei Abwesenheit des PrPC ... 51

4.2.1 Die Konzentrationen an reduziertem und oxidiertem Glutathion in Gehirnen von adulten Wildtyp- und PrP-defizienten Mäusen sind gleich. ... 51

4.2.2 Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an reduziertem Glutathion nimmt in PrP-defizienten Astrozyten nach H2O2-Behandlung stark ab... 52

4.2.3 H2O2-Behandlung führt zur Akkumulation von rGSH im Medium von PrP-defizienten Astrozyten. ... 53

4.2.4 Die Aktivität der Glutathion-Reduktase und der Glutathion-Peroxidase ist in PrP-defizienten Astrozyten und Wildtyp-Astrozyten gleich. ... 55

4.2.5 Dysregulation der γ-Glutamyltranspeptidase-Aktivität in PrP-defizienten Astrozyten . 56 4.3 PrPC reguliert die Aufnahme von Glutamat und Cystein über den Extitatorischen-Aminosäure-Transporter EAAC1 und beeinflußt dessen Aktivität bei oxidativem Stress ... 58

4.3.1 PrPC wird mit GLT-1 und EAAC1 präzipitiert. ... 58

4.3.2 Entfernen der Octarepeatregion aus PrPC ... 58

4.3.3 Glutamat-Transport durch EAAC1 wird von PrPC reguliert ... 61

4.3.4 PrPC reguliert die Cystein-Aufnahme durch EAAC1 ... 62

4.4 Die extrazelluläre Schleifen 1 und 4 der α2-Na+ /K+-ATPase binden an PrPC... 65

3 4.6 Unterschiede in der Aktivierung von Astrozyten aus Wildtyp- Mäusen und

PrP-defizienten Mäusen ... 69

5 Diskussion ... 73

5.1 PrPC erhöht das Überleben von Neuronen ... 73

5.2 PrPC hat einen regulatorischen Einfluss auf das interzelluläre Glutahion-System... 78

5.3 Geringere Aktivierung von PrP-defizienten Astrozyten nach Hypoxie und durch die Kompression des Rückenmarks induzierter Hypoxie ... 82

5.4 Aufnahme von Tryptophan und Tyrosin in PrP-defizienten Astrozyten ist nicht verändert ... 82

Zusammenfassung ... 86

Abkürzungen ... 90

Anhang: Sequenz und Primer von ∆octa ... 92

4

1 Einleitung

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der physiologischen Rolle des Prion-Proteins (PrPC) im Hinblick auf Schutzmechanismen gegen oxidativen Stress.

1.1 Prion-Protein

Das zelluläre Prion-Protein (cellular prion-related protein = PrPC) wurde durch die übertragbaren Spongiformen Enzephalopathien (TSE) bekannt, welche durch die als Scrapie PrP (PrPSC)-Form bezeichnete Konformation des PrPC ausgelöst werden (Prusiner, 1982). Neben Scrapie bei Schafen sind besonders BSE („Rinderwahnsinn“, mad cow disease) bei Rindern, sowie die Creutzfeldt-Jakob Erkrankung und Kuru beim Menschen bekannt. Lange Zeit wurde vermutet, das TSE durch Viren ausgelöst werden; es konnten jedoch nie Viren in den erkrankten Tieren nachgewiesen werden. Stanley Prusiner beschrieb 1982 schließlich mit der „Prionhypothese“ die eigentliche Ursache der TSE und erhielt hierfür 1997 den Nobelpreis. Der Name Prion beschreibt die Eigenart der missgefalteten Form des Proteins, zugleich Protein und infektiös (Proteinaceous Infectious particle) zu sein (Prusiner et al., 1982; Weissmann und Flechsig, 2003). Die Änderung der Konformation des PrPC führt zu einer Erhöhung des Anteils an β-Faltblattstrukturen und einer Reduzierung von alpha-helicalen Strukturen (Pan et al., 1993, Cohen and Prusiner, 1998). Das aus der Umfaltung entstandene unlösliche PrPSc ist im Gegensatz zum Proteinase-sensitiven PrPC resistent gegenüber dem Abbau durch Proteinasen und hat zudem die Eigenschaft Aggregate zu bilden (Prusiner, 1998). Die Infektiosität des PrPSc zeichnet sich durch die Eigenschaft aus bei einer Bindung von PrPSc an PrPC eine Konformationsänderung auch im PrPC herbeizuführen und dies setzt sich fort bis aus einem einzelnen PrPSc-Keim ganze Aggregate entstanden sind, die den Plaques von Amyloid-β-Peptid bei der Alzheimer Erkrankung ähneln. Die entstandenen PrP-Plaques und die dadurch induzierte Astrogliose führen letztendlich zur Einleitung neurodegenerativer Prozesse (Prusiner et al., 1998; Hegde et al., 1999).

Die Bildung von PrPSc kann spontan erfolgen wie bei der sporadisch auftretenden Creutzfeld-Jakob-Erkrankung oder auf Grund von Austauschmutationen an den Stellen D178N, E200K

5 und P102L genetisch bedingt sein. Durch diese Austauschmutationen kommt es zur familiären Anhäufung von Prionerkrankungen, wie der familiären Form der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (fCJK (D178N und E200K)), dem Gerstman-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS, (P102L)) und der fatalen familiären Insomnie (FFI(D178N)) (Kingsbury et al., 1983; Hsiao et al., 1992; Prusiner und Scott 1997; Collinge, 2001). Die Übertragung von PrPSc kann durch Bluttransfusionen oder durch die Aufnahme von Fleischprodukten infizierter Tiere erfolgen. Dies spiegelt sich besonders an der durch Kannibalismus übertragenen neurologischen Erkrankung Kuru und an dem Anstieg der Anzahl von Creutzfeld-Jakob Erkrankungen in den neunziger Jahren wieder bei denen PrPSc durch Einsatz von Tiermehl aus an Scrapie erkrankten Schafen als Futtermittel für Rinder, zunächst die Rinder infizierte und letztendlich auf den Menschen übertragen wurde (Chandler, 1961; Gajdusek et al., 1966; Bruce et al., 1997; Hunter et al., 2002; Houston et al., 2008). Infektionen mit PrPSc verlaufen immer tödlich und sind gekennzeichnet durch eine längere symptomfreie Inkubationszeit von mehreren Jahren und einer relativ kurzen aber starken klinischen Phase von wenigen Wochen bis zu mehreren Monaten, die durch Symptome wie Demenz, Erblindung, Persönlichkeitsveränderungen, Ataxie, Lähmungen, Chorea, Schlaflosigkeit, Halluzinationen bis hin zum Koma geprägt ist (Heppner et al., 2001).

Durch die Entfernung des PrPC kann in jungen Mäusen kein entsprechender Phänotyp beobachtet werden, jedoch kommt es in gealterten Mäusen vermehrt zu Ataxien und Verschlechterung des Erinnerungsvermögens (Büeler et al., 1992; Shmerling et al., 1998; Valenti et al., 2001).

1.1.1 Struktur des PrP

C

Das PrPC ist mittels eines Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankers extrazellulär an die Membran gebunden. Wie viele andere GPI-verankerte Proteine auch ist es vor allem in Cholesterol- und Glycolipid-reichen Membran-Mikrodomänen, sogenannten “lipid rafts“, zu finden (Gorodinsky et al, 1995; Walmsly et al., 2003; Taylor und Hooper; 2006). Die globuläre C-terminale Region des PrPC besteht aus drei α-helikalen Strukturen und zwei kleineren β-Faltblatt Strukturen.

Das für PrPC kodierende Gen (PRNP) ist auf dem humanen Chromosom 20 und auf dem murinen Chromosom 2 lokalisiert (Robakis et al., 1986). Die PRNP Sequenz befindet sich auf einem Exon und kodiert ein Protein mit einer Gesamtlänge von 253 Aminosäuren. Die ersten 22 Aminosäuren des Signalpeptids (SP) werden posttranslational entfernt, die letzten 23 Aminosäuren am C-Terminus werden nach dem Anhängen des GPI-Ankers entfernt (Stahl

6 et al, 1987). Zwei Konsensussequenzen erlauben eine N-Glykolysierung an den Asparaginen N181 und N197: es liegen daher sowohl einfach- wie auch zweifach-glykosylierte und unglykosylierte Formen gemeinsam an der Zellmembran vor. Zwischen den ersten zwei α-Helices befindet sich eine Disulfidbrücke, die durch Cys178 und Cys213 gebildet wird (Donne et al., 1997; Lopez- Garcin et al., 2000; Zahn et al., 2000). Im Gegensatz zum globulären C-Terminus ist der N-Terminus des PrPC strukturell flexibel (Donne et al., 1997). An den globulären C-Terminus schließt sich N-terminal eine in vielen Spezies hochkonservierte hydrophobe Domäne (HC) von 22 Aminosäuren an, welche auch als Transmembranregion bezeichnet wird. An die HC schließt eine Region mit 15 geladenen Aminosäuren (CC) an.

Abb. 1.1: Struktur des PrPC. Das PrPC besteht aus einer unflexiblen C-terminalen Struktur mit drei α-Helices und zwei ß-Faltblattstrukturen. Der N-Terminus ist flexibel und besitzt eine hoch konservierte Octarepeatregion, die die Fähigkeit besitzt über Histidin Kupferionen (Cu2+) zu binden. Eine weitere Cu2+-Bindungsstelle befindet sich außerhalb des Octarepeats. PrPC ist extrazellulär über einen GPI-Anker an die Zellmembran gebunden.

Zwischen HC und CC befindet sich zwischen Lysin L110 und Histidin H111 eine mögliche Protease-Schnittstelle (α-Schnittstelle). Schneidet die Metalloprotease (ADAM8) an dieser Stelle, entsteht ein 11 kDa N-terminales Fragment (N1) und ein GPI verankertes 18 kDa großes C-terminales Fragment (C1) (Liang et al., 2012). Die Aminosäuren 50 bis 91 bilden die hochkonservierte sogenannte Octarepeatregion mit fünf Wiederholungen der Sequenz PHGGGWGQ (Viles et al., 1999; Burns et al., 2002; Hornshawe et al., 1995). C-termial an die Octarepeatregion befindet sich eine Region mit 8 positiv geladenen Aminosäuren (PC). In Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wird vermehrt ein 20 kDa großes C-terminales Fragment (C2) gefunden, was für das Vorhandensein einer weiteren Schnittstelle

7 (β-Schnittstelle) am Ende der Octarepeatregion spricht. Durch diesen Schnitt, der von Cu2+

-Ionen abhängig ist, entsteht zudem ein 9 kDa großes N-terminales Fragment (N2) (Watt et al., 2005).

Yusa et al., 2012

Abb. 1.2: Aufbau des Prion-Proteins. PrPC ist über einen GPI-Anker am C-Terminus mit der Membran verbunden. C-terminal befindet sich eine globuläre Domäne, in welcher sich zwei Glykosylierungsstellen befinden. N-terminal befindet sich eine hydrophobe Domäne (HC), eine α-Schnittstelle und eine Region mit geladenen Aminosäuren (CC). Zwischen einer weiteren Region mit positiv geladenen Aminosäuren (PC) befindet sich die Octarepeatregion. Das Signalpeptid (SP) wird beim Transport des gereiften PrP zur Membran entfernt.

1.1.2 Funktionelle Rolle des PrP

C

Obwohl PrPC mit einem GPI-Anker an der Zellmembran verankert ist und somit nur extrazellulär vorliegt, konnte eine Beteiligung von PrPC an der intrazellulären Signaltransduktion, die über Interaktion mit Transmembranproteinen erfolgt, nachgewiesen werden. PrPC-Dimerisierung durch Antikörperzugabe führt über die p59fyn Rezeptor-Tyrosinkinase (Fyn)-vermittelte Aktivierung der Proteinkinase C zu einer Aktivierung der NADPH-Oxidase und somit zum Entstehen von reaktiven Sauerstoffspezies, welche als Signalmoleküle zur Phosphorylierung von ERK1/2 führen und es somit zur Induktion der MAP-Kinase Signalwegs kommt (Schneider et al., 2003). Eine physiologische Aktivierung von Fyn entsteht durch die Interaktion von PrPC mit dem neuralen Zelladhäsionsmolekül NCAM (Schmitt-Ulms et al., 2001). PrPC interagiert direkt über cis- und trans- Interaktionen mit NCAM und rekrutiert dieses in „lipid rafts“ wodurch Fyn aktiviert wird. (Beggs et al., 1994; Beggs et al., 1997; Mouillet-Richards et al., 2000; Santuccione et al., 2005). PrPC ist somit über NCAM an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt und stimuliert so über NCAM das Neuritenwachstum (Kolkova et al., 2000). PrPC interagiert zudem mit Synapsin 1b, einem Membranprotein welches wichtig ist bei der Bildung und Aufnahme von synaptischen Vesikeln und bei der Ausbildung von Synapsen (Spielhaupter und Schatzl, 2001). Des Weiteren interagiert PrPC mit dem 67 kDa Laminin-Rezeptor, dem 37 kDa Laminin-Rezeptor-Vorläufer (LRP) und Laminin (Rieger et al., 1997; Graner et al., 2000; Gauczynski et al., 2001, Hundt et al., 2001).

8 PrPC hat zudem regulatorische Eigenschaften auf den astroglialen Laktattransport, der durch Monokarboxylattransporter MCT1 vermittelt und durch das Zelladhäsionsmolekül Basigin, den Glutamat-Rezeptor GluR2 und die α2/β2 Na+

/K+-ATPase reguliert wird (Kleene et al., 2007). PrPC bindet direkt an die β2-Untereinheit der Na+/K+-ATPase und an GluR2. Die β2-Untereinheit interagiert darüber hinaus mit dem an MCT1 bindenden Basigin. PrPC sorgt somit für eine funktionelle Kopplung von Glutamat-Bindung an GluR2 und dem Laktattransport durch MCT1. Dies äußert sich durch einen höheren Laktatefflux bei PrP-defizienten Astrozyten in der Abwesenheit von extrazellulärem Glutamat, während in Wildtyp-Astrozyten der Laktatefflux durch Glutamat gesteuert wird(Kleene et al., 2007). Des Weiteren bindet PrPC an das Adhäsionsmolekül Contactin-assoziiertes Protein (Caspr) welches eine inhibitorische Wirkung auf das Neuritenwachstum hat (Peles et al., 1997; Davanathan et al., 2010). Durch die Interaktion mit PrPC wird das proteolytische Schneiden von Caspr durch das extrazelluläre Matrixprotein Reelin verhindert und somit die inhibitorische Wirkung von Caspr auf das Neuritenwachstum unterstützt (Davanathan et al., 2010). PrPC bindet zudem das Stress-induzierte Protein 1 (stress-inducible protein 1=STI1), das über die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) den Schutz vor Stress erhöht (Zanata et al., 2002; Arantest et. al., 2009).

Bei erhöhten PrPC-Mengen bzw. nach Zugabe von PrPC werden weitere Signalwege, die antiapoptotische Effekte haben, aktiviert. Unter anderem werden Src-ähnlichen Tyrosinkinasen, Phosphatidylinositol-3-Kinase, Akt und MAPK/ERK-Kinasen induziert (Chen et al., 2003). Diese Signalwege führen zu einer erhöhten Menge des antiapoptotischen Proteins B-Zell Lymphoma 2 (Bcl-2) und einer Verringerung der Menge des Apoptose induzierenden Bcl-2 assoziierten X Protein (Bax). Es wurde darüber hinaus auch eine Ähnlichkeit zwischen der Octarepeatregion und der BH2-Domäne der Bcl-2 Proteine festgestellt. Sowohl die Transfektion mit Bcl-2 als auch die Transfektion mit PrPC schützen PrP-defiziente Neuronen vor Apoptose, was auf einen gleichen Wirkmechanismus schließen lässt (Bounhar et al., 2001; Bounhar et al., 2006).

Die Octarepeatregion scheint besondere Funktionen des Prion-Proteins zu vermitteln, denn sie ist in der Lage über Histidin vier Cu2+-Ionen zu binden und diese Cu2+-Bindung induziert die Endozytose von PrPC (Lehmann et al., 2002; Brown, 2003). Daher wird davon ausgegangen, dass eine Funktion des PrPC der Transport von Cu2+ in die Zelle ist (Pauly und Harris, 1998). Nach Cu2+-Bindung weist PrPC zudem eine Superoxid-Dismutase-Aktivität auf und PrPC kann in Anwesenheit von Cu2+ Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid umwandeln (Brown et al., 1999).

9 Zudem spielt die Octarepeatregion eine Rolle bei der Verbreitung von PrPSc. Daher führt eine Entfernung der Octarepeatregion folglich zu einer Verlangsamung der PrPSc-Verbreitung und eine Vervielfachung der Octarepeatregion mit bis zu 14 Wiederholungen führt zum Ausbruch von fCJK oder GSS (Campbell et al., 1996). Bindung von Cu2+ kann wahrscheinlich die Entstehung von Prion-Erkrankungen begünstigen, da Cu2+ die Proteinase-resistente Form des PrPC induzieren kann (Quaglio et al., 2001). Es wurde gezeigt, dass PrPC Cu(II) zu Cu(I) reduziert und das Cu(I) somit den Zielproteinen zugänglich gemacht wird. Im Gegensatz dazu wurden Schädigungen des PrPC durch Cu2+ induzierte Redoxreaktionen bei Prion-Erkrankungen beschrieben (Requena et al., 2001; Ruiz et al., 2000).

1.2 Reaktive-Sauerstoff-Spezies

Oxidativer Stress entsteht, wenn die Menge der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS = Reactive Oxygen Species) das antioxidative Potential der Zelle übersteigt. Im Gehirn werden 20% des aufgenommenen Sauerstoffs verbraucht, daher ist das Gehirn besonders anfällig für oxidativen Stress. Neben Hydrogenperoxid (H2O2) zählen auch Superoxidanionen (O2-) und Hydroxylradikale (OH-) zu den ROS. Das hoch reaktive O2- entsteht bei der enzymatischen Reduktion von Sauerstoff durch die NADPH-Oxidase oder durch Enzyme der Atmungskette und kann durch die Superoxid-Dismutase (SOD) in H2O2 umgewandelt werden. In der spontanen Fenton-Reaktion wird H2O2 vor allem durch Eisensalze zu dem hoch reaktiven OH- umgewandelt. Wenn ROS in der Zelle akkumulieren führen sie zur Lipidperoxidation, Proteinoxidation, Schädigung der DNA und schlussendlich zum Zelltod. Um einer Akkumulation von ROS entgegenzuwirken, besitzt die Zelle eine Anzahl von Redoxsystemen und Enzymen, welche ROS unschädlich machen. Das in der Atmungskette gebildete H2O2 wird durch die Enzyme Katalase und Glutathionperoxidase zu H2O und O2 abgebaut.

Es wurde gezeigt, dass PrPC in Zellen und in Gehirnen von Mäusen, die oxidativem Stress ausgesetzt wurden, vermehrt exprimiert wird (Brown et al., 1997; Sauer et al., 1999; McLennan et al.; 2004, Liang et al., 2007). Zudem sind Kleinhirnneurone von PrPC -defizienten Mäusen anfälliger gegenüber oxidativem Stress als Kleinhirnneurone von Wildtypmäusen und das Überleben bei oxidativem Stress bei PrPSc Infektion ist erniedrigt (White et al., 1999; Milhavet et al., 2000; Brown and Sasson, 2002). Des Weiteren zeigen PrPC-defiziente Mäuse erhöhte Mengen an Markern für oxidativen Stress als Wildtypmäuse (Klamt et al., 2001; Wong et al., 2001).

10

1.3 GSH/GSSG-System

Glutathion (GSH) ist ein Tripeptid bestehend aus Glutamat, Cystein und Glyzin. Intrazellulär wird durch die Glutamyl-Cystein-Ligase (GCL) Glutamat an Cystein gebunden, danach wird durch die GSH-Synthetase Glyzin angehängt. Astrozyten bilden mehr GSH als Neuronen und sezernieren GSH in großen Mengen. Durch Export von GSH werden somit auch umgebende Neuronen durch das GSH der Astrozyten vor ROS geschützt. GSH wird durch die „multidrug-resistant“ Transporter (MRP), vor allem vom MRP1, exportiert. Extrazelluläres GSH kann durch die membranständige γ-Glutamyltranspeptidase, die sich auschließlich auf Astrozyten befindet, und darauf folgend durch die neurale Dipeptidase abgebaut werden (Ayoma et al., 2008). Die durch den Abbau frei werdenden Aminosäuren Glutamat und Cystein werden über Exzitatorische-Aminosäure-Transporter (s.u.) in die Zellen transportiert und stehen somit wieder für die Synthese von GSH zu Verfügung. Bei der GSH-Synthese sind die Aminosäure Cystein und das Enzym GCL die limitierenden Faktoren. Neuronen können das von Astrozyten exportierte GSH nicht aufnehmen und sind somit abhängig von Cystein, welches durch den Abbau des extrazellulären GSH frei wird (Ayoma et al., 2008).

Abb. 1.3: Glutathion-Synthese. Glutathion wird intrazellulär durch die Enzyme Glutamat-Cystein-Ligase und

GSH-Synthetase gebildet. Exportiert werden GSH und GSH-gekoppelte Stoffe u.a. durch das „multidrug resistance-associated protein 1“ (MRP1), welches zu den ABC-Transportern gehört. Extrazellulär werden GSH und GSH-Derivate durch die γ-Glutamyltranspeptidase und die neuronale Dipeptidase abgebaut. Neuronen sind auf das freiwerdende Cystein für die eigene GSH Synthese angewiesen und nehmen diese durch den Exzitatorischen-Aminosäure-Transporter EAAC1 auf.

Der Schutz vor ROS erfolgt über eine Redoxreaktion, bei der durch die Glutathionperoxidase zwei Glutathionmoleküle in Anwesenheit von H2O2 zu einem Molekül GSSG oxidiert

11 werden. Durch die Glutathionreduktase wird unter Verbrauch von NADPH GSSG zu GSH reduziert und das entstehende GSH steht den Zellen wieder zur Verfügung.

Abb. 1.4: Das GSH/GSSG-System.

Das durch die NADPH-Oxidase, Xanthine-Oxidase und durch Enzyme der Atmungskette (Ubiqunone III) entstehende O2- wird durch die SOD zu Hydrogenperoxid reduziert. Durch die Glutathionperoxidase wird GSH oxidiert, wobei Hydrogenperoxid zu H2O umgewandelt wird. Unter NADPH-Verbrauch wird durch die GSH-Reduktase reduziertes GSH regeneriert.

1.4 Exzitatorische-Aminosäure-Transporter (EAAT)

Wie im vorherigen Kapitel beschrieben, werden die für die GSH-Synthese wichtigen Aminosäuren über EAAT transportiert (Dringen et al., 1999). Die Aufnahme von Glutamat aus dem extrazellulären Raum ist ebenfalls wichtig, um die vom Glutamat ausgehende Toxizität zu reduzieren (Rae et al., 2000; Amara und Fintana, 2002). Daher ist erwähnenswert, dass Veränderungen im Glutamattransport in Astrozyten von PrP-defizienten Mäusen festgestellt wurden (Brown and Mohn, 1999).

Bis heute sind fünf EAAT bekannt: EAAT1 (GLT-1) und EAAT-2 (GLAST) kommen vor allem in Gliazellen vor, EAAT3 (EAAC1) wird vor allem in Neuronen exprimiert und EAAT4 ist sogar nur in Purkinje Zellen zu finden und EAAT5 wird nur in Retinazellen exprimiert (Danbolt, 2001; Kanai und Hedinger, 2004). EAAT liegen als Homotrimere vor, jede Untereinheit besitzt acht Transmembrandomänen und zwei Schleifen die in die Membran integriert sind (Abb.1.5). Durch die EAAT werden drei Na+ und ein H+ zusammen mit Glutamat, Aspartat und Cystein in die Zelle transportiert, während ein K+ aus der Zelle transportiert wird (Danbolt, 2001; Kanai und Hedinger, 2003; Shigeri et al., 2004). Die

12 EAAT zeigen unterschiedliche Verteilungen in der Zelle, so liegen 80% des exprimierten GLT-1, aber nur 20% des exprimierten EAAC1 an der Zellmembran vor (Sheldon et al., 2006). EAAC1 ist besonders wichtig im Zusammenhang mit oxidativem Stress, da EAAC1 eine 20-fach höhere Affinität für Cystein als GLAST und GLT-1 hat. Weiterhin wurde die Bedeutung von EAAC1 für die Aufnahme von Cystein durch eine 20% niedrigere Cysteinaufnahme und eine wesentlich geringere GSH-Konzentration in Neuronen nach dem Entfernen von EAAC1 eindrucksvoll dargestellt (Sheldon et al., 2006). EAAC1-defiziente Mäuse haben zudem eine 40% niedrigere Konzentration an Glutathion und weisen eine deutliche Neurodegeneration im Alter auf (Sheldon et al., 2006).

Eine Mutation von Arg447 am C-Terminus von EAAC1 führt zur Verhinderung des Transports von Glutamat und Aspartat, jedoch nicht zur Beeinträchtigung des Transports von Cystein (Sheldon et al., 2006).

Die Translokation von EAAC1 an die Plasmamembran wird durch Phosphorylierung an Ser465 durch die Proteinkinase C induziert. Die Proteinkinase ε führt allerdings zu einer erhöhten Aktivität von EAAC1, ohne jedoch einen Einfluss auf die Translokation des EAAC1 zu haben. Durch Entfernung des C-Terminus von EAAC1 kommt es zur kompletten Hemmung der Translokation und das Einfügen des C-Terminus von GLT-1 führt nicht zur Aufhebung dieser Hemmung. Die Translokation von EAAC1 an die Zellmembran ist somit abhängig vom C-terminus und geschieht anders als bei GLT-1.

Seal et al., 2000

Abb. 1.5: Na+-abhängige Glutamat-Transporter.

Die EAAT besitzen acht Transmembran-domänen und zusätzlich zwei in die Membran integrierte Schleifen. N und C-Terminus sind intrazellulär.

EAATs spielen eine Rolle bei vielen neurologischen Erkrankungen, wie z.B. an der Amyotropher Lateralsklerose (ALS), Epilepsie, der Huntington-Erkrankung, der Alzheimer-Erkrankung, Schlaganfall, Glaukom und neuropsychatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, bipolarer Störung und Depression (Rothstein et al., 1990; Arzberger et al.,

13 1997; Mallolas et al., 2006; Dreyer et al., 1996; Smith et al., 2001; Nakagawa und Kaneko, 2013). Beim Schlaganfall, kann ein Polymorphismus in GLT-1 vorliegen, der zu einem Anstieg von Glutamat führt (Mallolas et al., 2006). Nach Hypoxie ist die Expression von GLT-1 und EAAC1 im Tiermodell erniedrigt (Martin et al., 1997).

1.5 Zelluläre Antwort auf Hypoxie

Unter Hypoxie versteht man einen Mangel an Sauerstoff im Gewebe. In vivo entsteht eine Hypoxie u.a. durch Minderdurchblutung, welche z.B. durch partielle Verengung der Kapillaren entsteht. Kommt es zum Verschluss von Kapillaren oder sogar zum Verschluss der Hauptarterie, spricht man hingegen von einer partiellen bzw. globalen Ischämie, hier besteht neben dem Sauerstoffmangel auch ein Nährstoffmangel, vor allem ein Mangel an Glukose. Durch den Sauerstoffmangel kann die Atmungskette nicht mehr vollständig ablaufen. Um dennoch ATP zu generieren, schaltet der Stoffwechsel auf anaerobe Glykolyse um. Pyruvat wird hierbei unter Oxidation von NADH zu Laktat verstoffwechselt, dadurch steht NAD+ wieder für die Glykolyse zur Verfügung. Durch die Anhäufung von Laktat kann es zu einer Azidose kommen.

Neben der Umstellung der Glykolyse, werden verschiedene Signalwege durch Hypoxie bzw. Ischämie aktiviert. Dies sind zum Teil durch die Transkriptionsfaktoren Hypoxie-induzierte Faktoren 1α uns 2α (HIF-1α und HIF-2α) regulierte Proteine, welche zum einen die Glykolyse und die Angiogenese erhöhen, sowie die Funktion der Mitochondrien verändern und zum anderen die Expression der proapototitischen Proteine der Bcl-2 Familie erhöhen (Sharp et al., 2001; Chaves et al., 2006; Cai et al., 2007). Des Weiteren wird durch HIF-1α die extrazelluläre Konzentration des neuroprotektiven Adenosins durch Steigerung der Expression der ATP abbauenden Enzyme erhöht. Durch Hypoxie konditioniertes Medium von Astrozyten hat einen protektiven Effekt auf Neurone, vor allem auf Grund seines hohen Adenosingehalts (Wardas, 2002). Zudem sorgt vor allem HIF-2α für vermehrte Expression von Erythropoetin (EPO), welches stark neuroprotektiv bei OGD, Glutamattoxizität und Stickstoffmonoxid (NO)-induzierter Toxizität wirkt (Chaves et al., 2006). Außerdem induziert HIF-1α die Expression von VEGF (Vascular epithelian growth factor), welches ebenfalls einen neuroprotektiven Effekt hat. In vivo hängt es jedoch davon ab, wann VEGF heraufreguliert wird, da es auch für eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke sorgt und somit eine Entzündung begünstigen kann. Zu einem späteren Zeitpunkt stimuliert VEGF die Neo-Angiogenese und es sorgt somit für die Wiederversorgung der betroffenen

14 Hirnareale mit Nährstoffen (Jin et al., 2000; Hua et al., 2006; Zhao et al., 2006; Baranova et al., 2007).

Weiterhin wird der Transkriptionsfaktor NF-kB aktiviert, der für eine Erniedrigung der Expression der Glutamattransporter GLAST und GLT-1 verantwortlich ist (Miralles et al., 2001; Dallas et al., 2007). Dadurch steigt die extrazelluläre Konzentration von Glutamat, welche noch durch eine vermehrte Cystin-Aufnahme durch den Glutamat/Cystin-Antiporter erhöht wird (Fogal et al., 2007). Die vermehrte Aktivität des Glutamat/Cystin-Antiporters wird durch Interleukin 1β (IL-1β) vermittelt, welches unter Hypoxie vermehrt exprimiert wird (Fogal et al., 2007). Durch steigende Mengen an extrazellulärem Glutamat kann es daraufhin zur Glutamat-vermittelten Exzitotoxizität kommen.

Obwohl während der Hypoxie weniger Sauerstoff zur Verfügung steht, kommt es zur Erhöhung von ROS (Abramov et al., 2007). Dies geschieht durch eine unvollständig ablaufende Atmungskette wodurch es zum Ausstrom von Elektronen kommt. Die so entstehenden ROS stabilisieren HIF-1α (Bell and Chandel, 2007) und dadurch die Transkription der HIF-1α induzierten Gene. Wird die Nährstoffversorgung wiederhergestellt (Reperfusion, Reoxigenierung), kommt es durch vermehrt ablaufende Stoffwechselvorgänge und erhöhte Aktivität der Enzyme der Atmungskette zur Akkumulation von ROS. Nach einem Schlaganfall ist die neuronale Schädigung durch die ROS nach der Reperfusion häufig Grund für starke Gehirnschädigungen und das Auftreten neurologischer Symptome wie Lähmung, Ataxie ,Verwirrung und Wortfindungsstörungen; daher ist es wichtig nach einem Schlaganfall die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen möglichst schnell wiederherzustellen.

1.6 Na

+

_{/ K}

+

_-ATPase

Wie schon in Kapitel 1.1.1 beschrieben hat PrPC über die Interaktion mit der β-Untereinheit der Na+/K+- ATPase Einfluss auf den ATP-abhängigen Ionentransport. Die Na+/K+-ATPase ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, einer 113 kDa großen α-Untereinheit (α1, α2 oder α3) die 10 Transmembranregionen besitzt und der schon erwähnten 55 kDa großen β-Untereinheit (β1, β2 oder β3), die mittels eines großen extrazellulären C-Terminus mit der vierten extrazellulären Schleife der α-Untereinheit interagiert (Lemas et al., 1994; Taniguchi et al., 2001). Die β-Untereinheit erleichtert den Transport der Na+

/K+-ATPase zur Membran und stabilisiert die α-Untereinheit dort (McDonough et al., 1990). Die Na+

/K+-ATPase sorgt durch den aktiven Transport für die Aufrechterhaltung der hohen intrazellulären K+

-15 Konzentration. Für den Transport erfolgt die Phosphorylierung eines Aspartats in der intrazellulären Schleife zwischen Transmembranregion 4 (M4) und Transmembranregion 5 (M5) der α-Untereinheit, es werden dann im Austausch mit drei Na+

zwei K+ in die Zelle transportiert (Schneider und Scheiner-Bobis, 1997).

Abb. 1.6: Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase ist aus einer großen, 10-mal die Zellmembran durchspannenden α-Untereinheit und einer β-Untereinheit mit einer Transmembranregion aufgebaut. Der Ionentransport und die Phosphorylierung erfolgen an der Untereinheit. Die β-Untereinheit stabilisiert die Untereinheit und bindet mit dem extrazellulären C-Terminus an die vierte extrazelluläre Schleife der α-Untereinheit.

1.7 Rolle des Prion-Proteins im serotonergen System

TSE infizierte Labortiere zeigen eine Reduktion in der Menge von Serotonin (5-Hydroxytryptamin = 5-HT) und eine Verringerung der Aktivität und Menge von 5-HT Rezeptoren. Die Menge des Serotonin-Metaboliten 5-Hydroxyindolylessigsäure (5-HIAA) ist in infizierten Tieren erhöht und die Menge der 5-HT-Transporter an der Zellmembran verringert (Rohwer et al., 1981; Bassant et al., 1984; Pocchiari et al., 1985; Bassant et al., 1986; Klöppel et al., 2002; Ledoux, 2005). Des Weiteren wurden in diesen Tieren eine höhere Aktivität des 5-HT aufbauenden Enzyms Tryptophanhydrolase und des 5-HT abbauenden Enzyms Monoaminoxidase (MAO) festgestellt (Lee et al., 1999; Wanschnitz et al., 2000; Fraser et al., 2003). Zu einer höheren Aktivität der MAO kommt es auch durch Überexpression von PrPC (Lee et al., 1999). Über Antikörper-vermitteltes „Mimikry“ einer trans-Interaktion von PrPC konnte eine Beteiligung von PrPC an den von den

5-HT-16 Rezeptoren 5-HTR1B, 5-HTR2A und 5-HTR2B induzierten Signalwegen gezeigt werden. Dies beruht wahrscheinlich nicht auf einer direkten Interaktion von PrPC mit den 5-HT-Rezeptoren, sondern wird über Calveolin, einem Membranprotein, welches hauptsächlich in Caveolae zu finden ist, vermittelt (Mouliett-Richard et al., 2005).

Die Vorstufe von Serotonin ist die Aminosäure Tryptophan, welche über die Glykoprotein-gekoppelten Aminosäuretransporter des L-Systems (LAT) in die Zelle gelangt. Die Aktivität der LAT ist somit entscheidend für die Serotoninsynthese und somit auch für die Funktion des serotonergen Systems.

1.7.1 Glycoprotein-gekoppelte Aminosäuretransporter

LAT sind 36 kDa große Transportproteine mit 12 Transmembranregionen. Für die volle Funktionalität muss LAT über eine Disulfidbrücke zwischen Transmembranregion 3 und der Transmembranregion 4 des LAT an den C-Terminus des Glykoproteins CD98hc gebunden sein (Pfeiffer et al., 1998; Pineda et al., 1999). CD98hc kann an unterschiedliche Mitglieder der LAT-Transporter-Familie binden. Die Substratspezifität wird über die LAT hergestellt.

Abb. 1.7. Aminosäuretransporter des L-Systems.

Aminosäuretransporter des L-Systems sind Heterodimere aus einer schweren Untereinheit (CD98hc) und einer leichten Untereinheit (LAT1, LAT2 oder xCT). CD98hc und die leichte Untereinheit sind über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Die kleine Untereinheit ist die katalytische Einheit und sorgt für die Spezifität. CD98hc beeinflusst die Aktivität des Transporters.

17 Sowohl LAT1 als auch LAT2 transportieren Na+-unabhängig Tryptophan in die Zelle. LAT1 transportiert zudem noch Leucin, Histidin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin und Valin in die Zelle und kann Leucin aus der Zelle heraus transportieren. LAT2 transportiert zu den bei LAT1 genannten Aminosäuren noch Threonin, Cystein, Serin, Glutamin, Alanin, Methionin und Asparagin (Mastroberardino et al., 1998; Verrey et al., 2003). xCT ist ein Cystin/Glutamat-Antiporter der ebenfalls mit CD98hc ein Heterodimer bildet (Sato et al., 1999).

1.8 Exosomen

Es wurde gezeigt, das PrPC in Exosomen vorkommt und auch durch diese in andere Zellen gelangt (Fevrier et al., 2004). Eine Ausbreitung von PrPSc mittels Exosomen konnte ebenfalls nachgewiesen werden (Porto-Carreiro et al., 2005). Exosomen sind 50-100 nm große Vesikel, die eine vom Spenderzelltyp abhängige Protein- und mRNA-Zusammensetzung enthalten und die für die Entfernung von Membranproteinen aus der Zelle sorgen. Außerdem nimmt man an, dass Exosomen der interzellulären Kommunikation dienen (Rieu et al., 2000; Johnstone, 2006). Die Bildung von Exosomen erfolgt über den lysosomalen Weg, bei dem es durch Invagination (Einstülpung) und Abschnürungen der Endosomenmembran zur Anhäufung von intraluminalen Vesikeln (ILV) in den späten Endosomen kommt. Diese endosomalen Kompartimente werden daher auch als „multi-vesicular bodies“ (MVB) bezeichnet. Die ILV weisen die gleiche Membrantopologie wie die Plasmamembran auf und die Komponenten des Zytosols befinden sich innerhalb (im Innern) der ILV (Fevrier und Raposo, 2004). Die MVB verschmelzen nicht mit Lysosomen, sondern mit der Zellmembran, wodurch die ILV in den extrazellulären Raum gelangen. Diese ILV werden dann als Exosomen bezeichnet (Gruenberg und Stenmark, 2004; Fevrier und Raposo, 2004). Exosomen können mit der Zielzelle verschmelzen oder über Endozytose aufgenommen werden. Proteine die sich auf der Exosomenmembran befinden, können außerdem über trans-Interaktionen an Proteine der Zielzelle binden.

Die Identifizierung von Proteinen in Exosomen wurde bisher insbesondere an Exosomen von Immunzellen und Tumorzellen durchgeführt (Bard et al., 2004; Admyre et al., 2007; Ichim et al., 2008; Park et al., 2010). In Exosomen von Tumorzellen, die durch das Tumorwachstum einer andauernden Hypoxie ausgesetzt sind, kommen vor allem Proteine vor, welche die Neo-Angiogenese fördern (Yang und Robbins et al., 2011; Kucharzewska et al., 2013). Exosomen befinden sich auch in Körperflüssigkeiten wie Urin und Blut und aufgrund der zellspezifischen und krankheitsbedingten Zusammensetzung dienen Exosomen auch als biologische Marker für Krankheiten (Pisitkun et al., 2004; Caby et al., 2005). Weiterhin

18 werden Exosomen für den Einsatz als therapeutisches Mittel untersucht, da Exosomen sogar die Aktivität der Zielzelle beeinflussen können (Zhang et al., 2006; Zech et al., 2012).

Thery, 20011

Abb. 1.8: Bildung und Freisetzung von Exosomen.

1. Durch Membran-Invagination entstehen im späten Endosomen „multi-vesicular bodies“ (MVB). Durch Abschnürungen der MVB-Membran entstehen neue intraluminale Vesikel (ILV) mit gleicher Membrantopologie wie die Plasmamembran. 2. Die MVB verschmelzen mit der Plasmamembran und setzen die ILV, die jetzt als Exosomen bezeichnet werden, frei. 3. Alternativ verschmilzt der MVB mit dem Lysosom und die Proteine im MVB werden abgebaut. 4. Exosomen binden an die Zielzelle und werden über Endozytose aufgenommen oder 5. Exosomen verschmelzen mit der Plasmamembran der Zielzelle.

19

1.9 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des PrPC auf die Regulation von zellulären Abwehrmechanismen gegen oxidativen Stress zu untersuchen. Dies sollte insbesondere in Bezug auf die Neuron-Astrozyten-Wechselwirkung betrachtet werden, da Astrozyten in der Abwehr von oxidativem Stress eine wichtige Rolle spielen. Hierfür sollten Ko-Kulturen von Astrozyten und Neuronen etabliert werden und mittels Hypoxie und Applikation von ROS oxidativer Stress induziert werden. Neueste Erkenntnisse zeigen, dass die Zusammensetzung von Exosomen durch Hypoxie stark reguliert ist. Daher sollte insbesondere untersucht werden wie die Exosomen von Astrozyten das Überleben von Neuronen bei oxidativem Stress beeinflussen. In diesem Zusammenhang war es von Interesse zu sehen, ob das Fehlen von PrPC Auswirkungen auf die Proteinzusammensetzung der Exosomen hat.

Des Weiteren sollte das GSH/GSSG-System auf Regulation durch PrPC untersucht werden. Besonders interessant hierbei sind die Exzitatorischen-Aminosäure-Transporter, vor allem EAAC1. Es sollte sowohl der Glutamat- als auch der Cysteintransport in An- und Abwesenheit von PrPC untersucht werden.

Da bei TSE Dysregulationen des serotonergen Systems vorliegen, sollte außerdem untersucht werden, ob die Synthese von Serotonin durch eine PrPC-regulierte Aufnahme von Tryptophan verändert ist.

20

3 Material und Methoden

Sofern es nicht anders bezeichnet wurde wurden die Chemikalen von der Firma Sigma-Aldrich (Taufkirchen) bezogen. Isopropanol, Ethanol und Methanol wurden zudem auch von der Firma Greiner (Frickenhausen) bezogen. Laborplastikwaren wurden von der Firma Sarstedt (Nümbrecht) bezogen.

3.1 Molekularbiologische Methoden

3.1.1 Ligation von DNA-Fragmenten

Ligationen wurden mit der T4-Ligase (Invitrogen, Darmstadt) durchgeführt. In einem 10 µl Ligationsansatz wurde 50 ng dephosphorylierte und geschnittene Vektor-DNA mit dem 5-fachen molaren Überschuss an Insert-DNA, 1 µl 10 x T4 Ligase-Puffer und 1 U T4-DNA-Ligase versetzt. Der Ansatz wurde entweder für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubiert. 5 µl des Ansatzes wurde anschließend zur Transformation eingesetzt.

3.1.2 Transformation kompetenter Bakterien

Zunächst wurde eine Aliquot kompetenter Bakterien langsam auf Eis aufgetaut und mit Plasmid-DNA (10-100 ng) versetzt und weitere 20 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 2 Minuten bei 42°C wurden 900 µl eiskaltes LB-Medium zugegeben und der Ansatz für eine Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Danach wurden 100 µl des Ansatzes mittels einer Glaspipette auf einer LB-Agar-Platte ausgestrichen; der Rest wurde bei 5.000×g zentrifugiert, in 100 µl LB-Medium resuspendiert und anschließend ebenfalls auf einer LB-Agar-Platte ausgestrichen.

21

3.1.3 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien (DH5α)

TSS-Puffer: 5 g Polyethylenglykol 4000 0,5 g MgCl2 x 6 H2O

50 ml LB-Medium

Für die Herstellung von chemisch kompetenten Bakterien wurden 50 ml LB-Medium ohne Antibiotika mit DH5α aus einem Glyzerolstock angeimpft und bei 37°C auf dem Schüttler kultiviert bis eine OD600 von 0,3-0,4 erreicht war. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000×g und 4°C sedimentiert und in eiskaltem TSS-Puffer resuspendiert. Die Bakterien wurden dann in 100 µl Aliquots bei -80°C eingefroren

3.1.4 Plasmidisolierung aus 2 ml E. coli Bakterienkultur

(Qiaspin MiniPrep Kit)

Die Plasmidisolierung aus einer 2 ml Kultur erfolgte mit dem MiniPrep Kit der Firma Qiagen (Hilden). Alle hier verwendeten Puffer und Reagenzien waren in diesem Kit enthalten. Hierfür wurden zunächst 2 ml einer 5 ml Übernachtkultur in einem 2 ml Reaktionsgefäß durch Zentrifugation bei 5.000×g sedimentiert. Das Pellet wurde in 150 µl Resuspensionspuffer gelöst und mit 150 µl Lysispuffer lysiert. Anschließend wurde der Ansatz mit 300 µl Neutralisationspuffer neutralisiert und ausgefallene, denaturierte Proteine wurden durch Zentrifugation präzipitiert und der Überstand wurde auf eine Säule gegeben. Nach einminütiger Zentrifugation wurde der Durchlauf verworfen und die Säule mit 500 µl PE-gewaschen und erneut für eine Minute zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule zur Entfernung von Ethanolresten erneut zentrifugiert. Die DNA wurde anschließend mit 50 µl Wasser oder TE-Puffer gelöst und mittels einminütiger Zentrifugation eluiert.

3.1.5 Plasmidisolierung aus 200 ml E. coli Bakterienkultur

(Qiagen MidiPrep Kit)

Die Plasmidisolierung aus einer 2 ml Kultur erfolgte mit dem MidiPrep Kit der Firma Qiagen (Hilden). Alle hier verwendeten Puffer und Reagenzien stammten aus diesem Kit. Um größere Mengen Plasmid-DNA zu gewinnen wurden Bakterien einer 200 ml Übernachtkultur durch Zentrifugation bei 6.000×g und 4°C für 15 Minuten sedimentiert. Das Pellet wurde in 10 ml Resuspensionspuffer P1 resuspendiert und durch Zugabe von 10 ml Puffer P2, 5-maligem Invertieren und 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur lysiert. Anschließend wurde der Ansatz mit 10 ml Neutralisationspuffer P3 neutralisiert. Das Lysat wurde dann in

22 eine QIAfilter Spritze, die unten verschlossen wurde, gegeben und nach 10 Minuten auf eine Qiagen Säule, die zuvor mit 10 ml QBT äquilibriert wurde, gefiltert. Nachdem die Lösung durchgelaufen war, wurde zweimal mit jeweils 30 ml QC Puffer gewaschen und die DNA mit 15 ml QF Puffer in ein 50 ml Zentrifugationsröhrchen eluiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 10,5 ml Isopropanol und anschließender 30 minütiger Zentrifugation bei 4°C und 15.000×g gefällt. Das DNA-Pellet wurde mit 5 ml 70%igem Ethanol gewaschen und nach erneuter Zentrifugation in 100-300 µl TE-Puffer oder dH2O gelöst.

3.1.6 Restriktionsverdau von DNA

Für die Reaktionen wurden die vom Hersteller (NEB, Ipswich) mitgelieferten Puffer benutzt. Bei gleichzeitigem Verdau mit mehreren Enzymen wurden die vom Hersteller vorgeschlagenen Pufferbedingungen gewählt oder bei Inkompatibilität ein sequentieller Verdau durchgeführt und das Enzym der ersten Reaktion durch Erhitzen für 20 Minuten bei 65°C inaktiviert.

Für einen analytischen Restriktionsverdau wurden 50-500 ng DNA mit 1 µl 10 x Restriktionspuffer, 1 µl 10 x BSA und 1-5 U Enzym in einem Ansatz von 10 µl zusammengegeben und bei der für das Enzym optimalen Temperatur für 30-60 Minuten inkubiert.

Für einen präparativen Restriktionsverdau wurden 1-7 µg DNA mit 5-20 U Enzym und dem Gesamtvolumen von 30-50 µl entsprechenden Mengen 10 x Puffer und 10 x BSA versetzt. Der Restriktionsverdau wurde für 2-3 Stunden bei der entsprechenden Temperatur inkubiert und nach gelelektrophoretischer Auftrennung aus dem Gel eluiert.

3.1.7 Gelelektrophorese von DNA

(50 x) TAE-Puffer: 242 g Tris Base 57,1 ml Eisessig

100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)

auf 1 l mit ddH2O auffüllen und autoklavieren

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden horizontale Agarosegele in 1 x TAE Puffer genutzt. Hierfür wurde die DNA mit der entsprechenden Menge 5 x DNA-Probenpuffer versetzt und in die Taschen eines 1,5% (w/v) Agarosegels pipettiert. Zusätzlich wurde ein angemessener Längenstandard mit aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 80-120 V in 1 x TAE-Puffer durchgeführt. Anschließend wurden die Gele 30 Minuten in

23 Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml in 1 x TAE-Puffer) gefärbt und die DNA-Banden mittels UV-Licht sichtbar gemacht.

3.1.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen (QiaQuick Gel Extraction Kit)

Alle Zentrifugationsschritte wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge bei 13.000×g für eine Minute bei Raumtemperatur durchgeführt. Unter UV-Licht wurden die entsprechenden Banden aus dem Agarosegel geschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Das Gelstück wurde bei 50°C im dreifachen Gelvolumen in Gelsolubilisierungspuffer QG für 10 Minuten aufgelöst und anschließen mit einfachen Gelvolumen Isopropanol versetzt und auf eine minElute-Säule pipettiert. Die Säule wurde zentrifugiert und mit 700 µl PE-Puffer gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und der restliche Puffer durch erneute Zentrifigation entfernt. Die DNA wurde dann mit 30 µl TE-Puffer eluiert.

3.1.9 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR wurde mit der Pfu-Polymerase oder der GoTaq-Polymerase von Promega (Mannheim) durchgeführt. Ansatz: 1 µl Polymerase (2 U) 1 µl DNA (100 ng) 4 µl dNTP (2 mM) 5 µl Primer 1 (20 µM) 5 µl Primer 2 (20 µM) 5 µl Puffer 29 µl ddH2O 50 µl Endvolumen

Das PCR Programm richtete sich nach der für das Annealing benötigten Temperatur und ergab sich aus der Primersequenz.

Eingesetzte Primer:

Fragment 1

ForwardI: aatctagaa tcagtcatca tggcgaac ReverseI: tgggtaacg gttgcctcca ggg

24 ForwardII: ggagggggt acccataatc agtg

ReverseII: aagggccca tcagtgccag gggt

Fragment 1+2

ForwardIII: ggaggcaac cgttacccag gagggggtac ccataatcag tg ReverseIII: cactgatta tgggtacccc ctcctgggta acggttgcct ccaggg

3.2 Biochemische Methoden

3.2.1. Herstellung von Homogenaten aus Gewebe

RIPA-Puffer: 50 mM Tris, pH 7,4 180 mM NaCl 1% NP-40

1 mM Na4P2O7

Das Gehirn, beziehungsweise die Gehirnregion, wurde isoliert und das Blut mit PBS (PAA, Cölbe) abgewaschen. Das isolierte Gewebe wurde anschließend im Glashomogenisator in PBS oder RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Complete; Roche, Penzberg) homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat 10 Minuten bei 1.000×g und 4°C zentrifugiert um Zelltrümmer und Zellkerne zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde dann zur Proteinanalyse, Ko-Immunopräzipitation oder für Pull-down Experimente verwendet.

3.2.2 Herstellung von Homogenaten aus kultivierten Zellen

Zellen wurden mit PBS+ (PBS mit Calcium und Magnesium; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gewaschen und mit RIPA-Puffer lysiert. Die Zellen wurden dann mittels eines Zellschabers (Sarstedt, Nümbrecht) von der Kulturschale abgeschabt und mit einer 27G Sterican Kanüle (Braun, Melsungen) homogenisiert. Das Homogenat wurde dann bei 1,000×g, 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert um Zelltrümmer und Zellkerne zu entfernen.

3.2.3 Biotinylierung von Proteinen

Die Zellen wurden mit PBS+ gewaschen und 20 Minuten mit 0,5 mg/ml EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (ThermoFischer Scientific, Bonn) auf Eis inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit PBS+ wurde die Biotinylierung beendet und die Probe fünf Minuten mit 20

25 mM Glyzin in PBS+ inkubiert. Danach wurde zweimal mit PBS+ gewaschen und mit RIPA Puffer lysiert.

Biotinylierte Proteine wurden mittels magnetischen Streptavidin-gekoppelten Beads aus dem Lysat gezogen. Hierfür wurden 25 µl Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen mit dem Lysat über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurden die Kügelchen ein Mal mit RIPA-Puffer und drei Mal mit PBS gewaschen. Die Proteine wurden dann mit 5 x Probenpuffer (62,5 mM Tris/HCl pH 6,8, 175 mM SDS, 20% Glyzerol, 50 mg/ml DTT, Bromphenolblau) bei 95°C von den Beads gelöst und mittels SDS-Gelelektrophorese und anschließendem Immunoblot analysiert.

3.2.4 Bestimmung der Proteinkonzentration

Proteinkonzentrationen wurden mittels des BC Assay von Uptima (VWR, Darmstadt) ermittelt. Hierfür wurde 10µl Probe (in einer 1:10-1:100 Verdünnung) eingesetzt. Reagenzien A und B wurden 1:50 gemischt und 200 µl für die Bestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt. Nach 30 Minuten bei 37°C wurde die Absorption bei 540 nm im Spektrometer (BIOTEK, µQuant)gemessen.

3.2.5 Ko-Immunopräzipitation

Für die Ko-Immunopräzipitation wurde Gehirnhomogenat oder Homogenat von Astrozyten in einer Konzentration von 0,75 mg/ml – 1 mg/ml eingesetzt. Das Homogenat wurde zunächst vorgereinigt, indem es mit magnetischen Protein A bzw. G Kügelchen (ThermoFischer Scientific, Bonn) 1 h bei 4°C auf dem Rotor inkubiert wurde, wodurch in der darauffolgenden Präzipitation unspezifische Bindungen an die magnetic Beads oder an das Protein A bzw. G verringert werden. Das vorgereinigte Homogenat wurde dann mit dem Antikörper zwei Stunden bis über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurden mit 25 µl magnetischen Protein A- bzw. G-Kügelchen die Antikörper mit den daran bindenden Proteinen herausgezogen. Nach 1-2 Waschschritten mit RIPA-Puffer und 2-3 Waschschritten mit PBS wurden die Beads mit 10 µl 5x Probenpuffer und 10 µl H2O fünf Minuten bei 95°C erhitzt. Der Überstand konnte dann mittels SDS-Gelelektrophorese und anschließendem Immunoblot analysiert werden.

3.2.6 Ermittlung potentieller Bindungspartner durch Pulldown-Experimente

Zur Ermittlung von Interaktionspartnern von PrPC wurde rekombinantes PrPC mit Fc-Tag als Köderprotein eingesetzt. 0,5 µg/ml Köderproteins wurden mit 1 mg/ml Gehirnhomogenat

26 inkubiert und anschließend mittels magnetischen Protein A/G Beads (ThermoFischer Scientific, Bonn) zusammen mit den gebundenen Proteinen aus dem Homogenat gezogen. Nach dreimaligem Waschen der Beads mit Ripa-Puffer und PBS, wurden die Beads in Probenpuffer aufgenommen und fünf Minuten bei 95°C erhitzt. Die Proteine im Überstand wurden mittels eines SDS-Gels aufgetrennt und Bindungspartner im Immunoblot detektiert.

3.2.7 SDS-Polyacrylamidgel Elektophorese

5 x Probenpuffer: 250 mM Tris (pH 6,8) 175 mM SDS 37,5% Glyzerol 50 mg/ml DTT Bromphenolblau 10 x SDS-Laufpuffer: 30,3 g Tris 144,15 g Glyzine 200 ml 10% SDS

Zur Denaturierung wurden die Proteinproben vor dem Beladen des SDS-Polyacrylamidgels mit 5 x Probenpuffer versetzt und fünf Minuten bei 95°C erhitzt. Zur Größenbestimmung wurde ein vorgefärbter Marker mit dem Molekulargewichten 10-250 kDa (Fermentas, St. Leon-Roth) eingesetzt. Die Elektrophorese erfolgte mittels der Mini Protean II Zelle (BioRad, München) in SDS- Laufpuffer bei anfangs 75 Volt für das Sammelgel und 180 Volt für das Trenngel, bis die einzelnen Banden des Markers deutlich getrennt waren bzw. das Bromphenolblau des Probenpuffers aus dem Gel gelaufen war.

3.2.8 Coomassie-Färbung

Coomassie-Blau: 60 ml H2O 20 ml Methanol

20 ml 5 x Roti-Blue Kolloidale Coomasie-Färbelösung (Roth, Karlsruhe)

Entfärbe-Lösung: 80 ml H2O 20 ml Methanol

27 Nach der Elektrophorese wurde das SDS-Polyacrylamidgel über Nacht in Coomassie-Blau Lösung gefärbt. Anschließend wurde das Gel mit Entfärbe-Lösung entfärbt, bis deutliche Banden zu erkennen waren.

3.2.9 Immunoblot (Westernblot, WB)

10 x Blotpuffer (1 L): 30,3 g Tris 144,15 g Glyzin 1x Blotpuffer (1 L): 100 ml 10 x Blotpuffer 700 ml ddH2O 200 ml Methanol 10 x TBS (1 L) : 12,1 g Tris (pH7,5) 87,65 g NaCl 10 x PBS (1 L): 80 g NaCl 11,4 g Na2HPO4 2 g KH2PO4

Die Proteine wurden mittels des Tankblot-Verfahrens mit den Trans-Blot-Modulen der Mini Protean II Zelle (BioRad, München) auf 0,45 µM Protran Nitrozellulose Transfermembran (Whatman, Dassel) transferiert. Der Transfer erfolgte in Blotpuffer für 2-3 h bei 80-90 V auf Eis oder im 4°C Raum. Nach dem Transfer wurde die Membran in MPBS-T (1 x PBS, 0,05% Tween20 bzw. TBS-T (1 x TBS, 0,05% Tween20) mit 4% entfettetem Milchpulver (Sigma Aldrich, München)) für eine Stunde blockiert. Anschließend wurde die Membran über Nacht mit dem in MP(T)BS-T angesetzten Erstantikörper bei 4°C inkubiert (Liste der verwendeten Antikörper Tabelle 3.1).

Vor der Inkubation mit dem HRP-gekoppelten Zweitantikörper wurde 3-5 x für fünf Minuten mit PBS-T bzw. TBS-T gewaschen. Die Inkubation mit dem Zweitantikörper erfolgte für eine Stunde bei Raumtemperatur in MP(T)BS-T. Danach wurde die Nitrozellulosemembran 3-5 x mit PBS-T bzw. TBS-T gewaschen. Zur Detektion wurden je nach erwarteter Signalstärke die Substrate Lumigen TMA-6 (GE Healthcare, Hamburg) oder SuperSignal West Pico (Pierce, Bonn) verwendet, die entstehene Lumineszenz wurde mittels einer Kamera (Luminescent Image Analyser; LAS-4000; Fujifilm) aufgenommen.

28 Tabelle 3.1: Verwendete Antikörper:

SC (Santa Cruz), Heidelberg

BD transduction Laboratories, Heidelberg

PrP (M-20) SC polyklonal Ziege 1:500

EAAT1 (H-50) SC polyklonal Kaninchen 1:250

EAAT2 (H-85) SC polyklonal Kaninchen 1:250

EAAT3 (H-79) SC polyklonal Kaninchen 1:250

Clusterin (H330) SC polyklonal Kaninchen 1:250

ApoE (H-293) SC polyklonal Kaninchen 1:250

Anti AIP1 (Alix) BD monoklonal Maus 1:1000

Tsg101 (C-2) SC monoklonal Maus 1:500

3.2.10 Entfernung der Detektionsantikörper vom Immunoblot

Zur Detektion eines zusätzlichen Antikörpers auf einer bereits benutzten Nitrozellulose-Membran wurde diese mit einer Stripping-Lösung (10 ml Eisessig, 32 ml 5 M NaCl, 278 ml ddH2O) für 5 Minuten gewaschen und anschließend mit Tris (pH 8) neutralisiert und erneut mit 4% MP-PBS-T blockiert.

3.2.11 Bindungsstudien

Für antikörperfreie Bindungsstudien wurde der Bind Reader Profile Turbo der Firma SRU Biosystems (Woburn, MA) verwendet. Die Messung der Protein-Protein oder in diesem Fall der Protein-Peptid Interaktion, beruht auf der Messung reflektierten Wellenlänge welche sich durch die Bindung von Interaktionspartnern verschiebt. Diese Verschiebung wird als Veränderung des „peak wavelength value“ (∆PWV) in pm angegeben. In diesen Versuchen wurden 364-„well“ TiO2 Platten benutzt, die mit dem zu untersuchenden Protein beschichtet wurden und der Interaktionspartner wurde dann löslich zugefügt.

Hierfür wurde die Platte zunächst mit 50 µl/well PBS gewaschen und dann wurde für jede Vertiefung der Nullwert mit 25 µl/well PBS bestimmt. Dann wurden die Vertiefungen über Nacht bei 4°C mit PrP-Fc, humanem-Fc oder einem Peptid, welches die Octarepeatregion von PrP enthält, beschichtet. Nach 3maligem Waschen mit PBS wurde dann die Effizienz der Beschichtung gemessen. Danach wurde mit 1% BSA in PBS (50 µl/well) für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurde die Effizienz des Blockens gemessen.

Die Messung wurde dann mit 25 µl PBS je Vertiefung gestartet dazu dann 25 µl des Interaktionspartners zugegeben. Die Messung der ∆PWV erfolgte jede halbe Minute und über einen Zeitraum von einer Stunde.

29

3.2.12 Immunofärbung

Auf Deckgläschen kultivierte Zellen wurden einmalig mit HBSS oder serumfreiem Medium gewaschen und mit 4% PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Dann wurde zweimal mit PBS gewaschen und 2 Stunden mit 2% BSA und 0,1% Triton X-100 in PBS blockiert. Danach wurde über Nacht bei 4°C mit dem ersten Antikörper in einer Verdünnung von 1:125 inkubiert und anschließend zweimal mit 0,1% BSA in PBS gewaschen. Die Inkubation mit dem zweiten an den Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Antikörper erfolgte für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach erneutem 2-maligem Waschen mit PBS wurden die Deckgläschen mit den Zellen nach unten mit FluorCare Dapi (Carl Roth, Karlsruhe) auf einem Objektträger befestigt und bei Raumtemperatur im Dunklen trocknen gelassen.

3.2.13 Serotonin- ELISA (Enzyme linked immunosorbent Assay)

Für den Serotonin-ELISA (Serotonin Research ELISA, LDN) wurden Hirnareale von adulten Mäusen isoliert und mit 300 µl kaltem PBS mit 0,1% Ascorbinsäure im Glashomogenisator auf Eis homogenisiert. Nach 10 minütiger Zentrifugation wurde der Überstand für den ELISA verwendet. Alle Proben wurden auf 100 µl mit dem Diluent aufgefüllt. Alle hier verwendeten Reagenzien wurden im Kit mitgeliefert.

Es wurden dann 100 µl Probe je Vertiefung in die mitgelieferte „Acylation“-Platte pipettiert. Dann wurden 25 µl „Acylation“-Puffer dazu pipettiert und die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 600 rpm (Schüttler; IKA MS3 digital) inkubiert. 100 µl des Ansatzes wurden dann in eine Vertiefung der mitgelieferten Serotonin/5-HIAA Microtiter Strips pipettiert und anschließend wurden 25 µl Serotonin Antiserum dazugegeben. Die Platte wurde dann mit eine Folie abgedichtet und bei 4°C 17 Stunden inkubiert. Danach wurde jede Vertiefung 3-mal mit Waschpuffer gewaschen und anschließend wurden je Vertiefung 100 µl Substrat pipettiert. Die Platte wurde dann mit Aluminiumfolie lichtdicht abgeschlossen und 30 Minuten bei RT bei 600 rpm inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Stopp-Solution wurde die Absorption bei 450 nm, mit einer Referenz Wellenlänge bei 620 nm, innerhalb von 10 Minuten gemessen.

3.2.14 Colorimetrischer Glutathion-Versuchsansatz

MPA-Reagenz: 5 g Metaphosphorsäure (Sigma) in 50 ml ddH2O gelöst stabil für 4 Stunden TEAM-Reagenz: 531 µl Triethanolamin (Sigma) , 469 µl ddH2O

30 Cocktail Bestandteile im Kit mitgeliefert: 11,25 ml MES-Puffer, 0,45 ml Cofaktormix, 2,1 ml Enzymmix, 2,3 ml ddH2O und 0,45 ml DTNB (5,5´-Dithio-bis-(2-nitrobenzolsäure, Ellman`s Reagenz)

Um die Konzentration an Glutathion in Geweben und Zellen zubestimmen, wurde ein colorimetrischer Ansatz der Firma Cayman verwendet (Glutathione Assay Kit). Hierfür wurden die Zellen mit kaltem MES-Puffer (50 mM Meatphosphorsäure) mit einer Spritze homogenisiert und anschließend bei 10.000×g 15 Minuten bei 4°C zentrifiugiert. Gewebe wurde mit 5 ml MES-Puffer in einem Glashomogenisator homogenisiert und ebenfalls bei 10.000×g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend durch die Zugabe des gleichen Volums MPA-Reagenz und 5-minütiger Inkubation bei RT und durch anschließende Zugabe des TEAM-Reagenz von Proteinen befreit. Um nur die Konzentration an oxidiertem Glutathion (GSSG) zu bestimmen, wurde 2-Vinylpyridin zu der Probe gegeben und 1 Stunde bei RT inkubiert. Für die Analyse wurden dann 50 µl der Probe in eine Vertiefung gegeben und dann wurden 150 µl des Assay Cocktails zugegeben. Danach wurde die Platte lichtdicht verschlossen und auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 Minuten wurde die Absorption bei 405nm gemessen was in Intervallen von 5 Minuten für 30 Minuten wiederholt wurde. Für die Auswertung wurden die Werte nach 20 Minuten genommen.

3.2.15 Glutathion-Bestimmung im Astrozytenmedium

(GSH/GSSG-Glo, Promega

)

Alle Reagenzien sind im Kit enthalten, Puffer Zusammensetzungen für eine Vertiefung einer 96-Platte

Lysispuffer: 1 µl Luciferin-NT, 10 µl passive Lysispuffer (5x), 14 µl ddH2O

für GSSG-Bestimmung: 1 µl Luciferin-NT, 10 µl passive Lysispuffer, 13,5 µl ddH2O , 0,5 µl NEM (N-ethylmaleimid)

Luciferin-Reagenz: 1,25 µl 100 mM DTT, 3 µl Glutathione-S-Transferase, 45,75 µl Glutathion-Reaktionspuffer

Luciferin-Detektions-Reagenz: Rekonstitutionspuffer mit Esterase (im Kit enthalten) mit Luciferin mischen.

Um die Glutathionkonzentration im Medium zu messen wurde ein auf Lumineszenz basierender Ansatz der Firma Promega (GSH/GSSG-Glo Assay) verwendet. Hierfür wurden Astrozyten in einer Platte mit 96 Vertiefungen kultiviert. Für die Behandlung wurden die Astrozyten in 60 µl serumfreiem Medium kultiviert. Das Medium wurde dann in einer PCR-Platte zentrifugiert um kontaminierende Zellen zu entfernen und dann wurden 25 µl Medium

31 für den Ansatz verwendet. Zunächst wurden 25 µl „totaler“ Lysispuffer oder für die Bestimmung von GSSG, GSSG-Lysispuffer zugegeben und 5 Minuten auf dem Schüttler inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Luciferin-Reagenz gestartet und nach 30minütiger Inkubation bei RT wurde das Luciferin-Detektionsreagenz zugegeben. Nach einer 15 minütigen Äquilibrierungsphase wurde die Lumineszenz (Victor 3, 1420 Multilabel counter, Perkin Elmer) gemessen.

3.2.16 Bestimmung der Glutathionreduktase-Aktivität

(Cayman)

Die Glutathionreduktase-Aktivität wurde mittels eines von Cayman erworbenen Kits bestimmt. Hierfür wurden Astrozyten in eiskaltem Kalium-Phosphat Puffer (50 mM pH 7,5, 1 mM EDTA) homogenisiert und die Zelltrümmer mittels Zentrifugation bei 10.000×g für 15 Minuten bei 4°C entfernt. Der Überstand wurde dann in dem Assay eingesetzt. Je Vertiefung einer 96er-well Platte wurden 100 µl Assay-Puffer, 20 µl GSSG und 20 µl Probe pipettiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 µl NADPH gestartet und die Abnahme der Absorption bei 340 nm bzw. die Abnahme von NADPH wurde gemessen.

3.2.17 Bestimmung der Glutathionperoxidase-Aktivität

Reaktionspuffer: Kalium/Phosphat-Puffer pH 7,5, 1 mM EDTA, Na-Azide, 1 mg reduziertes Glutathion,10µl Glutathionreduktase aus dem Glutathionreduktase Ansatz von Cayman, 0,1 mg NADPH

Wie auch bei der Glutathionreduktase-Aktivität wird die Aktivität der Peroxidase über den Abbau von NADPH bestimmt. Hierfür wurden der Überstand wie unter 3.2.16 gewonnen und 10 µl dieses Überstandes wurden mit 150 µl Reaktionpuffer in eine Vertiefung einer 96er-well Platte pipettiert. Die Abnahme an NADPH wurde wie bei der Glutathionreduktase Bestimmung ermittelt.

3.3 Methoden der Zellkultur

3.3.1 Kultivierung von CHO (chinese hamster ovary)-Zellen

Mastermix: 50 ml nicht-essentielle Aminosäuren (PAA) 50 ml Na-Pyruvat (100 mM)

50 ml Glutamat+Aspartat (100 x) 100 ml Nukleoside (50 x)

32 Nukleoside (50 x): 35 mg Adenosin 35 mg Guanosin 35 mg Cytidin 35 mg Uridin 12 mg Tymidin

gelöst in 50 ml ddH2O und gefiltert

Glutamat+Aspartat (100 x): 300 mg Na-Glutamat 300 mg Aspartat

gelöst in 50 ml ddH2O und gefiltert

Für die Kultivierung der CHO-Zellen wurde GMEM (GMEM (Biochrom, Berlin), 10% FCS (PAA), Mastermix, 2% Penicillin-Streptomycin (PAA)) verwendet. Die Kultivierung erfolgte meistens in 75 cm² Kulturflaschen. Die Passage der Zellen wurde bei ungefährer 90%iger Konfluenz der Zellen durchgeführt. Hierfür wurde das Kulturmedium abgenommen und die Zellen wurden mit HBSS (PAA) gespült. Das Ablösen der Zellen erfolgte bei 37°C mit Trypsin/EDTA (Invitrogen) für 1-2 Minuten. Die Trypsinierung wurde durch Zugabe von Medium gestoppt und die Zellen resuspendiert. Dann wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 ausgesäht.

3.3.2 Auftauen von CHO-Zellen

Die Zellen wurden bei 37°C schnell aufgetaut und in 5 ml GMEM (GMEM, 10% FCS, Mastermix, 2% Penicillin-Streptomycin) aufgenommen. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 100×g wurde das Medium abgekippt und das Pellet in frischem GMEM resuspendiert und die Zellen dann in einer Kulturflasche ausgesät.

3.3.3 Langzeitlagerung der CHO-Zellen

Für die Langzeitlagerung der CHO-Zellen wurden die Zellen einer konfluent gewachsenen Kulturflasche einmal mit 10 ml HBSS gewaschen und wie unter 3.3.1 trypsiniert und anschließend mit 5 ml HBSS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für 5 Minuten bei 1.000×g zentrifugiert und das Zellpellet in 1-2 ml Einfriermedium (70% GMEM, 20% FCS, 10% DMSO) aufgenommen. Aliquots der einzufrierenden Zellen wurden in Isopropanol in speziellen Einfrierbehältern auf -80°C gekühlt. Nach wenigen Tagen wurden die Zellen dann in flüssigen Stickstoff überführt.

33

3.3.4 Transiente Transfektion von CHO-Zellen

Die Transfektion der in Tabelle 3.2 aufgeführten pcDNA3 Vektoren, welche die PrP-Konstrukte exprimieren bzw. der pCMV5 Vektoren die die EAATs exprimieren, wurde mit TurboFect der Firma Fermentas durchgeführt. Hierfür wurden 3 x 105 Zellen/ml in 12-well Platten ausgesät und für einen Tag kultiviert bzw. kultiviert bis eine 80-90% Konfluenz erreicht wurde. Dann wurden 200 µl serumfreies Medium mit 2 µg DNA (EAAT) gemischt und dann 3 µl TurboFect zugegeben. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Ansatz tropfenweise auf die Zellen in einer Vertiefung der Kulturplatte pipettiert. Im Falle dieser Ko-Transfektion wurde in einer ersten Transfektion mit den EAAT transfiziert und die zweite Transfektion mit den PrP-Konstrukten nach 24 Stunden durchgeführt; die Zellen wurden anschließend weitere 24 Stunden vor dem Experiment kultiviert.

Tabelle 3.2 verwendete Vektoren und Herkunft

pcDNA3 Invitrogen pcDNA3-PrP Chen et al.

pcDNA3-∆octa generiert aus pcDNA3-PrP CMV5-EAAT1 erhalten von Prof. Dr. Amara CMV5-EAAT2 erhalten von Prof. Dr. Amara CMV5-EAAT3 erhalten von Prof. Dr. Amara

3.3.5 Präparation von Kleinhirnneuronen

X-1 Medium: 97 ml Neurobasal A (Invitrogen) 1 ml Pencillin-Streptomycin (PAA) 1 ml 10% BSA 100 µl Insulin (10 mg/ml) 100 µl L-Tyroxin (4 µM)

200 µl Transferrin, holo (Merck; 50 mg/ml) 100 µl Na-Selenite (30 µM)

Für die Präparation von Kleinhirnneuronen wurden 6-8 Tage alte Mäuse vom C57Bl/6 Stamm verwendet. PrP-defiziente Mäuse kamen aus der gleichen Zucht und wurden Homozygot weitergezüchtet. Die Mäuse wurden mittels einer Schere enthauptet und der Kopf von Fell und Haut befreit. Danach wurde mit einer Schere der Schädel von der Wirbelsäulenöffung her eröffnet und das Kleinhirn in eine Zellkulturschale mit HBSS (PAA) überführt.

34 Unter dem Binokular wurden auf einem Kühlblock Blutgefäße und Hirnhaut entfernt. Das gesäuberte Kleinhirn wurde in ein neues Gefäß mit HBSS überführt und in 3 Teile geteilt. In einem 15 ml Zentrifugenröhrchen wurden die Kleinhirne mit HBSS gewaschen und dann mit Trypsin/DNAse (10 mg Trypsin, 1 mg DNaseI) 15 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit HBSS wurden die Kleinhirnneurone mittels zweier Pasteurpipetten mit unterschiedlichen Öffnungen, in DNAse (0,5 mg) vereinzelt. Danach wurden 5 ml HBSS zu den Zellen gegeben und das Gemisch 15 Minuten bei 100×g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in X-1 Medium aufgenommen und die Zellzahl mit einer Neugebauer Zählkammer ermittelt. Die Kleinhirnneuronen wurden dann in einer Menge von 1,5x106 Zellen/ml ausgesät.

3.3.6 Präparation von Astrozyten

Für die Präparation von Astrozyten wurden Mäuse im Alter von P0-P2 verwendet. Die Mäuse wurden mittels Dekapitation getötet, das Gehirn entfernt und in eine Petrischale mit kaltem HBSS überführt. Dann wurde das Gehirn von den Blutgefäßen und der Hirnhaut gesäubert und das Kleinhirn entfernt. Hiernach wurde das Gehirn in Stücke geschnitten und nach 3maligem Waschen mit kaltem HBSS wurden die Stücke in 5 ml Medium aufgenommen. Mittels zwei unterschiedlichen Nylon-Netzen (Merck) mit der Porengröße 150 µm und 30 µM wurden die Zellen separiert. Die Zellen wurden dann in Medium aufgenommen und auf PLL beschichteten Platten ausgesät. Nach etwa 7 Tagen in Kultur bildete sich eine konfluente Astrozytenschicht aus.

3.3.7 Ko-Kultur von Astrozyten und Kleinneuronen

Für eine Ko-Kultur von Astrozyten und Neuronen wurden die Astrozyten wie beschrieben kultiviert. Nach 6-7 Tagen in Kultur wurden dann frisch präparierte Kleinhirnneurone auf den Astrozyten in X-1 Medium kultiviert. Die Versuche erfolgten einen Tag nach Beginn der Ko-Kultur.

3.3.8 Neutralrotfärbung

Färbelösung: 0,4% Neutralrot (Sigma) in ddH2O

Fixierungslösung: 0,1% CaCl2, 0,5% Formaldehyde in HBSS Lysislösung: 1% Eisessig, 50% Ethanol, 49% ddH2O

35 Die Neutralrotfärbung färbt lebende Zellen und da diese den Farbstoff in ihre Lysosomen aufnehmen, kann so einfach über die aufgenommene Menge des Neutralrots das Überleben bestimmt werden. Hierfür wurden die Zellen zunächst 30 Minuten mit Färbelösung bei 37°C gefärbt und anschließend mit der Fixierlösung gewaschen. Danach wurden die Zellen mit Lysispuffer lysiert wobei der Farbstoff freigesetzt wird. Nach einstündiger Lyse wurde 200 µl in je eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt und die Absorption bei 540 nm gemessen.

3.3.9 Beschichtung von Deckgläschen mit Poly-L-Lysin

Deckgläser aus Glas wurden in Aceton 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler entfettet und anschließend dreimal mit sterilem ddH2O gewaschen. Es folgte eine Inkubation mit Eisessig für 2 Stunden zum Aufrauen der Deckgläschen. Nach dreimaligem Waschen für 10 min mit Ethanol wurden die Deckgläser bei 200°C 2 h sterilisiert. Die Beschichtung mit Poly-L-Lysin (0.01% in ddH2O) erfolgte nach Auskühlen der Deckgläschen bei 4°C über Nacht. Getrocknet wurden die Deckgläser einzeln ausgelegt unter der Sterilbank mittels Bestrahlung mit UV-Licht.

3.3.10 Isolation von Exosomen

Für die Isolation von Exosomen aus konditioniertem Astrozytenmedium wurde das Medium für 30 Minuten bei 17.000×g zentrifugiert und anschließend durch einen 0,2 µm Spitzenvorsatzfilter gefiltert. Die Exosomen wurden dann durch eine einstündige Zentrifigation bei 100.000×g sedimentiert und in Medium aufgenommen. Für die Analyse wurden die Exosomen mit 5 x Probenpuffer gelöst.

3.3.11 Kultivierung von Kleinhirnneuronen in konditioniertem Medium

Astrozyten wurden hierfür mit dem serumfreien X-1 gewaschen und für 6 Stunden oder 12 Stunden in diesem unter normelan Kulturbedingungen kultiviert oder mit Hypoxie (6 Stunden) oder mit 50 µM H2O2 (12 Stunden) behandelt. Dann wurde das Medium bei 17.000×g zentrifugiert und durch einen 0,45 µM Filter gefiltert. Das so erhaltene Medium wurde dann auf die Kleinhirnneurone gegeben und die Behandlung der Kleinhirnneurone erfolgte 2 Stunden danach. Um die Exosomen aus dem Medium zu entfernen wurde das Medium 1 Stunde bei 100.000×g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf kultivierte Kleinhirnneurone gegeben.