3.4 Untersuchungen an lebenden Zellen
4.1.1 Das durch Exosomen gesteigerte Überleben von Kleinhirnneuronen wird durch PrP C
Nachdem ich festgestellt hatte, dass besonders unter Hypoxie wildtypische Astrozyten das Überleben von wildtypischen Neuronen erhöhen und dass dieser Effekt durch PrP-defiziente Astrozyten ausbleibt, sollte nun genauer untersucht werden, welche Komponenten der Ko-Kultur diesen Unterschied ausmachen. Hierfür kommen neben dem direkten Zell-Zell-Kontakt von Astrozyten und Neuronen, ins Medium sezernierte Proteine und Exosomen in Frage.
Für die folgenden Versuche wurden Astrozyten unter den schon beschriebenen Bedingungen der H2O2-Behandlung, Hypoxie und unter normalen Kulturbedingungen kultiviert. Danach wurde das konditionierte Medium geerntet und über einen 0,45 µm Filter gefiltert um gegebenenfalls vorhandene abgelöste Zellen zu entfernen. Das so erhaltene Medium, wird im Folgenden als Vollmedium (VM) bezeichnet, da es noch alle Proteine und Exosomen enthält.
Um das Medium von Exosomen zu befreien, wurde es bei 100.000×g für eine Stunde zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand enthält nun keine Exosomen mehr und wird im Folgenden als exosomenfreies Medium (EFM) bezeichnet. Für die Isolation von Exosomen wurde VM zuerst bei 17.000× g zentrifugiert und danach durch einen 0,2 µm Filter gefiltert und die Exosomen wurden dann durch eine einstündige Zentrifugation bei 100.000× g sedimentiert. Die Exosomen wurden in einem Fünftel des ursprünglichen Volumens in Zellkulturmedium gelöst und so in einer fünffachen Konzentration eingesetzt. Das konditionierte Medium bzw. die Exosomen, wurden auf Wildtyp-Kleinhirnneurone gegeben, die zuvor einen Tag in Kultur waren. Zwei Stunden nach der Zugabe des konditionierten VM wurden die Kleinhirnneurone dem schon beschriebenen oxidativen Stress ausgesetzt.
Nach Hypoxie-Behandlung liegt die Überlebensrate der Kleinhirnneurone, die in VM von wildtypischen Astrozyten kultiviert wurden, im Vergleich zu unbehandelten Kleinhirnneuronen bei 51,8±7,4% und in VM von PrP-defizienten Astrozyten bei 51,6±7,1%.
Wurden die Astrozyten hingegen zuvor mit Hypoxie behandelt, erhöht sich das Überleben der Kleinhirnneurone auf 72,3±6,0% durch die Zugabe von VM von Hypoxie-behandelten Wildtyp-Astrozyten. Hingegen hat die Hypoxie-Behandlung der PrP-defizienten Astrozyten keinen Effekt auf das Überleben der Kleinhirnneurone, welches nach Hypoxie-Behandlung
42 57,9±7,0% beträgt (Abb. 4.2A). Ein Vergleich mit den Kleinhirnneuronen in Einzelkultur in frischem Medium ist hier nicht möglich, da das Medium in diesem Versuch bereits durch die Kultivierung auf Astrozyten nährstoffärmer ist, daher werden hier die VM verglichen die von unbehandelten und behandelten Astrozyten stammen. Durch Konditionierung der Astrozyten mit Hypoxie ist das Überleben der Kleinhirnneurone somit um 20,5% bei Kultivierung in VM von Hypoxie konditionierten Wildtyp-Astrozyten und nur um 6,3% bei Kultivierung in VM von Hypoxie konditionierten PrP-defizienten Astrozyten erhöht.
Wurden die Kleinhirnneurone hingegen in EFM von Wildtyp-Astrozyten oder PrP-defizienten Astrozyten kultiviert, überleben 58,7±8,4% bzw. 54,4±6,3% der Kleinhirnneurone die Hypoxie-Behandlung (Abb. 4.2A). Vorbehandlung der Astrozyten mit Hypoxie sowohl bei EFM von Wildtyp-Astrozyten als auch bei EFM von PrP-defizienten Astrozyten führt kaum zu einem neuroprotektiven Effekt: das Überleben beträgt 65,5±4,0%
bei Neuronen, die in EFM von Wildtyp-Astrozyten kultiviert wurden und 66,3±2,8% bei Neuronen, die in EFM von PrP-defizienten Astrozyten kultiviert wurden (Abb. 4.2A). Die Konditionierung der Astrozyten mit Hypoxie führt somit zu einem geringen Anstieg des Überlebens von 6,8% durch EFM von Wildtyp-Astrozyten und von 9,9% durch EFM von PrP-defizienten Astrozyten.
Um den Einfluss der Exosomen genauer zu untersuchen, wurden aus Astrozytenmedium isolierte Exosomen vor der Hypoxie-Behandlung zu den Neuronen gegeben. Die Hypoxie führt bei Kleinhirnneuronen, die mit Exosomen von wildtypischen Astrozyten kultiviert wurden zu einer Überlebensrate von 66,1±1,6% und zu einer in etwa gleichen Überlebensrate, wenn die Neurone mit Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten kultiviert wurden (67,3±0,6%). Stammen die Exosomen jedoch von Hypoxie-behandelten Astrozyten, erhöht sich das Überleben auf 78,3±3,3% bei Neuronen, welche mit Exosomen von Wildtyp-Astrozyten kultiviert wurden und auf 70,7±2,5% bei Neuronen, die mit Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten kultiviert wurden. Exosomen von unbehandelten Astrozyten erhöhen das Überleben somit um 9,1% und Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten erhöhen das Überleben um 10,3% im Bezug zum Überleben in Einzelkultur. Exosomen, die nach Konditionierung durch Hypoxie aus den Kulturüberständen von Wildtyp-Astrozyten PrP-defizienten Astrozyten gewonnenen wurden, führen zu einem Anstieg des Überlebens von 21,3% bzw. 13,7% (Abb. 4.2A).
Durch diese Versuche wird deutlich, dass Astrozyten nach Hypoxie-Behandlung lösliche Substanzen und Exosomen freisetzen, die neuroprotektive Eigenschaften haben. Die neuroprotektive Wirkung ist im Medium von PrP-defizienten Astrozyten geringer als im
43 Medium von Wildtyp-Astrozyten. Somit spielt PrPC offensichtlich eine wichtige Rolle in der von Astrozyten vermittelten Neuroprotektion und die Komponenten, die zu dieser Neuroprotektion führen werden durch Hypoxie induziert. Somit spielt PrPC offensichtlich eine wichtige Rolle in der von Astrozyten vermittelten Neuroprotektion und die Komponenten, die zu dieser Neuroprotektion führen werden durch Hypoxie induziert. In EFM ist diese offensichtlich durch PrPC vermittelte Neuroprotektion nicht vorhanden. Zudem steigern besonders Wildtyp-Exosomen von konditionierten Astrozyten das Zellüber leben, daher ist anzunehmen, dass die durch PrPC vermittelte Neuroprotektion über Exosomen vermittelt wird.
Die Behandlung mit H2O2 führt zu einem ähnlichen Ergebnis wie die Hypoxie-Behandlung.
Das Überleben der Kleinhirnneurone, die in VM von Wildtyp-Astrozyten kultiviert wurden beträgt nach H2O2-Behandlung 46,7±6,9% und bei Kleinhirnneuronen, die in VM von PrP-defizienten Astrozyten kultiviert wurden 50,9±5,8%. Stammt das VM jedoch von H2O2
behandelten Astrozyten, so liegt das Überleben bei 58,7±10,8%, wenn die Neuronen in VM von wildtypischen Astrozyten kultiviert wurden, und bei 51,9±7,0%, wenn die Neuronen in VM von PrP-defizienten Astrozyten kultiviert wurden (Abb. 4.2B). Auch hier ist ein Vergleich mit den Kleinhirnneuronen in Einzelkultur nicht möglich, da das Medium in diesem Versuch bereits durch die Kultivierung auf Astrozyten nährstoffärmer ist, daher werden auch hier die VM verglichen die von unbehandelten und behandelten Astrozyten stammen. Das Überleben der Kleinhirnneurone, die mit VM von behandelten Wildtyp-Astrozyten oder mit VM von behandelten PrP-defizienten Wildtyp-Astrozyten kultiviert wurden, ist im Vergleich zu dem der Neurone, welche mit Medium von unbehandelten Astrozyten kultiviert wurden, um 12% bzw. nur um 1% erhöht (Abb. 4.2B).
Bei der Kultivierung der Kleinhirnneurone in EFM von wildtypischen Astrozyten erniedrigt sich die Anzahl an lebenden Zellen durch H2O2-Behandlung auf 44,2±5,3% und in EFM von PrP-defizienten Astrozyten auf 47,0±7,1%, während die H2O2-Behandlung der Neurone in EFM von H2O2 behandelten Astrozyten zu einer Reduktion des Überlebens auf 52,0±5,6%
und in EFM von H2O2 behandelten PrP-defizienten Astrozyten zu einer Reduktion des Überlebens auf 49,5±4,8% führt. Im Vergleich zu den Kleinhirnneuronen, welche mit dem EFM von unbehandelten Astrozyten kultiviert wurden, zeigen die Neurone, die mit Medium von behandelten Astrozyten kultiviert wurden eine 7,8% höhere Überlebensrate durch Zugabe von EFM von Wildtyp-Astrozyten, wohingegen nur eine 2,5% höhere Überlebensrate durch Zugabe von EFM von PrP-defizienten Astrozyten ermittelt wurde (Abb. 4.2B).
44 Nach Behandlung mit H2O2 in Anwesenheit von Exosomen wildtypischer Astrozyten ist das Überleben auf 65,5±2,8% reduziert und in Anwesenheit von Exosomen PrP-defizienter Astrozyten ist das Überleben auf 61,6±1,9% gesenkt. Eine Vorbehandlung der Astrozyten mit H2O2 erhöht das Überleben der Neurone, wodurch die Überlebensrate auf 81,4±3,5%
durch Exosomen von Wildtyp-Astrozyten und auf 72,3±5,9% durch Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten steigt (Abb. 4.2B). Verglichen mit den Wildtyp-Neuronen in Einzelkultur erhöht sich die Überlebensrate der Kleinhirnneurone durch Exosomen bei H2O2 -Behandlung von Astrozyten somit um 21,7% durch Exosomen von unbehandelten Wildtyp-Astrozyten und um 17,8% durch Exosomen von unbehandelten PrP-defizienten Wildtyp-Astrozyten.
Exosomen von konditionierten Astrozyten führen sogar zu einem Anstieg der Überlebensrate um 37,6% im Falle der Wildtyp-Exosomen und um 28,8% im Falle der Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten.
Diese Versuche machen ebenfalls deutlich, dass die Exosomen von Wildtyp-Astrozyten einen neuroprotektiven Effekt auf die Kleinhirnneuronen ausüben. Konditionierung führt zwar sowohl bei Wildtyp-Astrozyten als auch bei PrP-defizienten Astrozyten zur Ausschüttung neuroprotektiver Substanzen, aber besonders die neuroprotektive Wirkung der Exosomen scheint stark von PrPC abzuhängen, da Exosomen PrP-defizienter Astrozyten auch nach Konditionierung weniger neuroprotektiv wirken.
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Abb. 4.2: Durch Hypoxie- oder H2O2-Behandlung konditioniertes Medium von Wildtypastrozyten erhöht das Überleben von wildtypischen Kleinhirnneuronen. (A) Wildtyp-Neurone wurden mit VM, EFM oder mit Exosomen von unbehandelten wildtypischen Astrozyten (Wt), von PrP-defizienten Astrozyten (PrP-/-) oder von Hypoxie-behandelten Astrozyten (Hypoxie) kultiviert und 6 Stunden einer Hypoxie ausgesetzt. Das Überleben ist in Relation zu unbehandelten Kleinhirnneuronen, welche in dem entsprechenden Medium kultiviert wurden, dargestellt. (B) Wildtyp-Neurone wurden mit VM, EFM oder mit Exosomen von unbehandelten wildtypischen Astrozyten (Wt), von PrP-defizienten Astrozyten (PrP-/-) oder von H2O2- behandelten Astrozyten (H2O2) stammt kultiviert und 12 Stunden mit H2O2 behandelt. Das Überleben ist in Relation zu unbehandelten Kleinhirnneuronen, welche in dem entsprechenden Medium kultiviert wurden, dargestellt. * = P-value<0,05,
**=P-value<0,01, ***=P-value<0,001.