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Abb. 5.1: Theoretische Darstellung einer über ApoE und LRP1 vermittelten anti-apoptotischen Wirkung der Exosomen. Es ist bekannt, dass ApoE über LRP1 neuroprotektiv wirkt. ApoE könnte daher über Exosomen an LRP1 binden. Da die ApoE Menge in PrP-defizienten Exosomen nach Hypoxie nicht erhöht ist und es durch PrP-defiziente Neurone nicht zum neuroprotektiven Effekt kommt, ist eine Rolle von PrPC in diesem Szenario denkbar.
5.2 PrP
Chat einen regulatorischen Einfluss auf das interzelluläre
79 In transfizierten CHO Zellen konnte ich jedoch auch eine vermehrte Cysteinaufnahme in Abwesenheit von PrPC feststellen, wohingegen sich unter oxidativem Stress die Cysteinaufnahme in diesem Falle nicht veränderte (Abb. 4.14). Hingegen erhöhte sich die Cysteinaufnahme in PrPC exprimierenden Zellen unter oxidativem Stress auf das Niveau der PrP-defizienten CHO-Zellen. Dieser Befund lässt den Schluss zu, dass PrPC für die Bereitstellung von Cystein und für eine geregelte Cysteinaufnahme in Neuronen verantwortlich sein könnte und somit die Versorgung der Neuronen mit Cystein unter oxidativem Stress sicherstellt. Des Weiteren könnte dies mit ein Grund dafür sein, warum die PrP-defizienten Neuronen keinen Unterschied im Überleben auf Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten zeigen, denn es könnte sein, dass der Mangel an Cystein durch den geringeren GSH-Abbau und durch die erhöhte Transportrate in den PrP-defizienten Neuronen kompensiert wird (Abb. 4.1).
Neben dem Cysteintransport über den EAAC1, habe ich auch den Glutamattransport über die drei Glutamattransporter GLAST, GLT-1 und EAAC1 untersucht. Während GLAST und GLT-1 nicht über PrPC reguliert zu sein schein, konnte ich aber zeigen, dass der Glutamattransport über EAAC1 von PrPC abhängig ist: im Gegensatz zum Cysteintransport war der Glutamattransport über den EAAC1 in Anwesenheit von PrPC höher als in Abwesenheit von PrPC (Abb. 4.13). Bei oxidativem Stress änderte sich die Glutamataufnahme über EAAC1 in An- und Abwesenheit von PrPC nicht. Es ist somit vorstellbar, dass bei oxidativem Stress die Affinität des EAAC1 durch PrPC zu Gunsten des Cysteins verschoben wird. Ein denkbarer Ablauf wäre, dass PrPC durch Bindung an EAAC1 die für den Cysteintransport wichtigen Aminosäuren verdeckt und dass es durch Binden von ROS an PrPC es zur „Dissoziation“ des PrPC von EAAC1 zur Exposition dieser Aminosäuren und folglich zum Cysteintransport kommt. Diese Exposition kann zum Beispiel durch eine von ROS herbeigeführte Konformationsänderung des PrPC stattfinden, wodurch die Interaktion zwischen PrPC und EAAC1 verändert bzw. aufgehoben wird. Auch ist es möglich, dass es zum β-Schnitt des PrPC kommt, der durch ROS initiiert wird (Watt und Hooper, 2005; Haigh et al., 2009) und somit der an EAAC1 bindende N-terminus entfernt wird. Es wird zwar beschrieben, dass hierfür Cu2+ an PrPC gebunden sein muss, da ich dem Versuch kein extra Cu2+ zugefügt habe, muss daher angenommen werden, dass Cu2+ oder auch Fe2+ über das Kulturmedium zur Verfügung stehen. In der Tat befindet sich Eisen(III)nitrat im Medium; dass mögliche Spuren von Cu2+ durchs Serum in die Zellkultur gelangen und diese für die Einleitung des proteolytischen β-Schnitts ausreichen würden, ist eher unwahrscheinlich. Ist PrPC an EAAC1 gebunden würde dies dann zu einer Exposition
80 der für den Glutamattransport wichtigen Aminosäuren führen. Dass es durch ROS zu einer Veränderung der Bindung zwischen EAAC1 und PrPC kommt wird dadurch gestützt, dass durch das Fehlen der für die Erkennung von ROS wichtigen Octarepeatregion in PrPC der Cysteintransport in Anwesenheit von ROS unverändert niedrig bleibt. Es ist also davon auszugehen, dass die Bindung von PrPC an EAAC1 nicht über die Octarepeatregion geschieht, aber dass die Bindung durch das Wirken von ROS an der Octarepeatregion beeinflusst wird. Das für den Transport von Glutamat und Cystein unterschiedliche Aminosäuren des EAAC1 verantwortlich sind, wurde durch die Mutation des Arginins R447 gezeigt, die zwar den Glutamattransport verhinderte nicht aber den Cysteintransport (Sheldon et al., 2006). Ich konnte mit einer Kompetition des Cysteintransportes mit Glutamat jedoch zeigen, dass der Transport in Anwesenheit und Abwesenheit von PrPC um 50% durch die Zugabe von Glutamat verringert wird, also die Affinität mit oder ohne PrPC zwischen Glutamat und Cystein gleich ist. Um hier jedoch genauere Aussagen treffen zu können, müsste die Interaktion in An-und Abwesenheit von ROS noch weiter untersucht werden.
Abb. 5.2: Darstellung einer möglichen Interaktion zwischen EAAC1 und PrPC und einer hypothetischen Affinitätsverschiebung des EAAC1 durch ROS, welche entweder zu einer Konformationsänderung oder zur Einleitung des proteolytischen β-Schnitts und somit zu Generierung der PrP-Fragmente C2 und N2führt.
Neben der reduzierten Aktivität der GGT und dem reduziertem Glutamattransport und dem erhöhten Cysteintransport über den EAAC1 konnte ich außerdem nach H2O2-Behandlung im Medium von PrP-defizienten Astrozyten eine deutlich höhere rGSH-Konzentration feststellen als im Medium von Wildtyp-Astrozyten. Dies lässt sich zum einen durch eine extrazelluläre Akkumulation von rGSH durch die verringerte GGT-Aktivität beschreiben, es kann aber auch sein, dass die Exportrate von rGSH aus den Astrozyten bei PrP-defizienten Astrozyten unter oxidativem Stress erhöht ist. Ein erhöhter Export von rGSH aus Astrozyten und somit eine höhere Substratkonzentration für die GGT, wie auch die erhöhte Cysteinaufnahme könnten die verringerte GGT-Aktivität in PrP-defizienten Astrozyten kompensieren. Durch
81 diese Kompensation, würde meine Beobachtung, dass bei einer Ko-Kultur von PrP-defizienten Neuronen auf Wildtyp-Astrozyten bzw. PrP-PrP-defizienten Astrozyten kein Unterschied in der Überlebensrate der Neuronen zu sehen ist, bestätigen. In wieweit die Aktivität der γ-Glutamyltranspeptidase von der Konzentration an rGSH abhängig ist, muss noch untersucht werden. Die intrazelluläre Konzentration an GSH ist in PrP-defizienten Astrozyten höher als in Wildtyp-Astrozyten und erniedrigt sich bei oxidativem Stress jedoch stark. Dieses Resultat ist in Übereinstimmung mit dem Befund, dass die Menge an rGSH im Medium PrP-defizienter Astrozyten nach oxidativem Stress erhöht ist (Abb. 4.7). Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass der Export über „multi drug resistant-associated protein 1“
(MRP1) durch oxidativen Stress erhöht wird, aber in Anwesenheit von PrPC eine Regulation erfolgt um die intra- und extrazelluläre GSH-Konzentrationen aufrechtzuerhalten.
Interessanterweise wurde eine Interaktion zwischen PrP und einem ebenfalls mit der Arzneimittelresistenz in Verbindung stehendem Transporter, dem MDR1 bzw. die P-Glykoprotein Pumpe, wie MDR1 auch bezeichnet wird, nachgewiesen (Li et al., 2009).
Bestimmte Chemotherapeutika führen zur erhöhten Expression von PrPC, welches dann wahrscheinlich MDR1 an der Zellmembran stabilisiert (Li et al., 2009) und somit zur Resistenz gegenüber Chemotherpautika beiträgt. Da MRP1 und MDR1 strukturel ähnlich sind und beide ähnliche Funktionen ausüben könnte auch eine Interaktion zwischen MRP1 und PrP zur Regulation des Glutathionexport führen.
Abb. 5.3: Vielfältige Regulation des GSH-Systems durch PrPC. PrPC reguliert die Aktivitäten von EAAC1, der γ-Glutamyltranspeptidase und wahrscheinlich auch die Aktivität der MRP1. Dies führt zu einem höheren Export von GSH nach oxidativem Stress, aber zu einem verringertem extrazellulären Abbau von GSH. Die Aktivität von EAAC1 wird durch PrPC dem oxidativen Status der Zelle angepasst.
Bei PrP-defizienten Astrozyten sinkt intrazellulär besonders die Konzentration von rGSH ab, wohingegen die Menge an GSSG steigt. Bei Wildtyp-Astrozyten ist hingegen kaum ein
82 Unterschied zwischen physiologischen Bedingungen und oxidativem Stress zu beobachten.
Der höhere GSSG-Gehalt in PrP-defizienten Astrozyten nach oxidativem Stress im Vergleich zu den Wildtyp-Astrozyten könnte Ausdruck einer reduzierten Aktivität der Glutathionreduktase sein. Ich konnte jedoch keine Unterschiede der am Redoxsystem beteiligten Enzyme GSH-Reduktase und GSH-Peroxidase feststellen (Abb. 4.8), es wurden aber schon Dysregulationen der Aktivität beschrieben (White et al., 1999). Diese Dysregulationen wurden allerdings in Neuronen gemesssen, während ich die Aktivitäten in Astrozytenlysat bestimmt habe.