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5 Diskussion
74 Wildtyp-Astrozyten. Dies kann durch mehrere Faktoren hervorgerufen werden. Zum einen können Transinteraktionen zwischen Neuronen und Astrozyten ausschlaggebend sein für das erhöhte Überleben der Wildtyp-Neuronen auf Wildtyp-Astrozyten. Diese Transinteraktionspartner für PrPC können unteranderem NCAM, Grb2, STI1, Laminin Rezeptor, LRP1 oder π-Rezeptor sein (Rieger et al., 1997; Shmerling et al., 1998;
Gauczynski et al., 2001; Spielhaupter und Schatzl, 2001; Zanata et al., 2002). Im Falle der Interaktion mit STI1 werden die neuroprotektiven Eigenschaften des PrPC durch die cAMP abhängige Proteinkinase (PKA) vermittelt (Zantat et al., 2002; Arantes et al., 2009). PrPC hat so über STI1 auch während einer Ischämie einen anti-apoptotischen Effekt auf Neuronen (Beraldo et al., 2013). Durch das Fehlen des PrPC auf den Astrozyten können Signalwege in den Neuronen nicht aktiviert werden. Ebenso lässt sich erklären, dass das Überleben von PrP-defizienten Neuronen zwar durch Wildtyp-Astrozyten erhöht wird, aber niedriger ist als das der Wildtyp-Neurone. Bei der Kultivierung von defizienten Neuronen auf PrP-defizienten Astrozyten, kann es sein, dass wie in vivo festgestellt wurde auch ohne Behandlung eine erhöhte Konzentration an Markern für oxidativen Stress vorliegt (Klamt et al, 2001; Wong B.S. et al., 2001). Es wären damit PrPC unabhängige Schutzmechanismen vermehrt aktiv.
Für die viabilitätsfördernde Wirkung des PrPC können aber auch ins Medium sekretierte Komponenten verantwortlich sein. Guillot-Sestier et al., haben 2009 gezeigt, dass das N-terminale PrPC-Fragment N1, welches durch α-Secretase Aktivität entsteht, vermehrt unter Hypoxie und Glukoseentzug (OGD) gebildet wird und neuroprotektive Eigenschaften über den Phosphatidylinositol-3-kinase/Akt Signalweg vermittelt (Vasallo et al., 2005; Guillot-Sestier et al., 2009). Um dies zu überprüfen, habe ich die Auswirkungen von konditioniertem Medium auf das Überleben der Neuronen getestet. Ich konnte zeigen, dass bei der Applikation von H2O2 oder Hypoxie kein signifikanter Unterschied im Überleben zwischen Neuronen die mit Wildtyp-Medium oder Medium von PrP-defizienten Astrozyten kultiviert wurden, entsteht. Wurden die Astrozyten von denen das konditionierte Medium stammt mit H2O2 oder Hypoxie behandelt steigt das Überleben jedoch bei den in Wildtyp-Medium kultiverten Neuronen. Medium von PrP-defizienten Astrozyten hat auch nach H2O2- oder Hypoxie-Behandlung der PrP-defizienten Astrozyten, keine viabilitätsfördernde Wirkung auf Neuronen.
Für die protektive Wirkung des Mediums kommen verschiedene Komponenten in Betracht.
Ein interessanter Kandidat wäre Erythropoetin (EPO), da in Erythrozyten von PrP-defizienten Mäusen, eine geringere Expression von EPO gezeigt wurde (Zivny et al., 2008)
75 und von Astrozyten exprimiertes EPO Neuronen und Oligodedrozyten vor Hypoxie und oxidativem Stress schützt (Bernaudin et al., 1999; Kato et al., 2011, Wu et al., 2012). Hierbei kann PrPC über Fyn auf die Hypoxie-induzierter Transkriptionsfaktor (HIF-2α) wirken (Li et al., 2011,) wobei HIF-2α wiederum die EPO Expression erhöht (Wu et al., 2012). Es wäre interessant die EPO-Expression von Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten vor und nach oxidativem Stress zuvergleichen und zu untersuchen. Außerdem wäre interessant zu analysieren, ob die EPO-Expression abhängig von der Octarepeatregion ist, da die Octarepeatregion wie in weiteren Versuchen gezeigt wird, wichtig für die Erkennung von Reaktiven Sauerstoff Spezies ist. Da neben löslichen Komponenten auch Exosomen von den Astrozyten in das Medium abgegeben werden, kann die neuroprotektive Wirkung des Mediums auch von den Exosomen ausgehen. Die Tatsache, dass nach Entfernen der Exosomen die neuroprotektive Wirkung des Wildtyp-Mediums nachlässt, rückt besonders die Exosomen von Wildtyp-Astrozyten als potentielle Kandidaten für die Vermittlung von Abwehrmechanismen in den Vordergrund.
Mittels Ultrazentrifugation habe ich Exosomen aus konditioniertem Medium isoliert und zu kultivierten Neuronen gegeben, welche dann mit H2O2 oder Hypoxie behandelt wurden. Wie auch beim Medium mit Exosomen, wird das Überleben von Neuronen durch isolierte Exosomen von behandelten Astrozyten im Vergleich zu Exosomen von unbehandelten Astrozyten erhöht. Besonders bei Hypoxie-Behandlung ist der Unterschied in der neuroprotektiven Wirkung zwischen Exosomen von Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten (Abb. 4.2A) deutlich zu sehen. Im Fall der H2O2-Behandlung steigt das Überleben der Neurone auch durch Zugabe von Exosomen von behandelten PrP-defizienten Astrozyten (Abb. 4.2B). Die Erhöhung des Überlebens ist statistisch signifikant und erhöht sich durch Vorinkubation mit Wildtyp-Exosomen um 10-20%.
In Immunoblots habe ich festgestellt, dass durch Hypoxie und auch durch Reoxigenierung aber auch durch Glukoseentzug die Expression von PrPC in Exosomen erhöht ist. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass PrPC eine wichtige Rolle in der Abwehr von oxidativem Stress spielt. Dies deckt sich mit Untersuchungen, die eine erhöhte Expression von PrPC in Zellen nach Hypoxie und in Tumoren bestätigen (Mc Lennan et al., 2004; Liang et al., 2007). In der Promotorregion des PRNP befinden sich zwei Hitzeschockelemente (HSE), welche für die vermehrte Expression von PrPC in Neuronen nach Hypoxie verantwortlich sind (Hung et al., 2001; Shyu et al., 2002). Zudem zeigt PrPC die gleiche Regulation bei Hypoxie wie HSP70, daher kommt der gleiche Signalweg für die Aktivierung der Transkription über MRK, Erk 1/2 und JNK in Frage (Hung et al., 2001; Shyu et al., 2002; Mishra et al., 2004). Auch
76 scheint HIF-1α für eine erhöhte Bildung und Sekretion von Exosomen unter hypoxischen Bedingungen wichtig zu sein (King et al., 2012). Da HIF-1α auch die Expression von PrPC reguliert (Jeong et al., 2011) kann die Funktion von PrPC auch als Bindungspartner für neuroprotektive Proteine für die Verpackung in Exosomen verstanden werden. Es ist bekannt, das PrPC Proteine in „lipid rafts“ lokalisiert wie z.B. NCAM und das „lipid rafts“
beim Proteinsorting in Exosomen eine Rolle spielen (de Gassart et al., 2003). Somit werden über vermehrte Expression von PrPC auch mehr dieser PrPC interagierenden Proteine in „lipid rafts“ lokalisiert und gelangen auf diesem Weg in die Exosomen.
Um einen genaueren Einblick in die Komposition der Exosomen von Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten nach Hypoxie zu bekommen, wurden die Exosomen massenspektrometrisch analysiert (Tabelle 1, S.48). Anhand der Exosomenmarker HSP90, GAPDH, α-Enolase und Elongationfaktor 1 ist davon auszugehen, dass es in der Exosomenkonzentration nicht allzu große Schwankungen gibt. Diese Exosomenmarker scheinen bei Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten gleich reguliert zu sein. Da aber keine Proteinkonzentration in den Exosomenpäperationen gemessen werden konnte, sind die Daten, die hier durch die quantitative Massenspektrometrie erhalten wurden noch durch Quantifikationen im Immunoblot nachzuweisen. Viele der gefundenen Proteine sind in Wildtyp-Exosomen nach OGD vermehrt exrimiert und zeigen bei PrP-defizienten entweder eine niedrigere oder eine unveränderte Menge, namentlich sind dies: GLAST, die α1 und α2-Untereinheit der K+-ATPase, die α1-Untereinheit der Na+/K+-ATPase, transitionelle Endoplasmatische-Reticulum-ATPase, Guaninnukleotid bindendes Protein, Transkriptions-aktivator-Protein, ApolipoproteinE, Alpha-2-Macroglobulin, Desmin, Vimentin, α-Internexin, und die Annexine 2 und 3. Zu einer geringeren Expression nach OGD sowohl in Wildtyp-Exosomen und PrP-defizienten Exosomen kommt es bei den Proteinen HSP 90, Glukose reguliertes Protein, GAPDH, Clusterin, Peroxredoxin 6 und Creatin Kinase B
Um genauere Aussagen über die Regulation durch PrPC treffen zu können, habe ich zunächst Clusterin und ApolopoproteinE (ApoE) mittels Immunoblots quantifiziert und konnte nach Hypoxie weniger Clusterin in Wildtyp-Astrozyten nachweisen als unter normalen Kulturbedingungen. In PrP-defizienten Astrozyten ist die Clusterinmenge sehr gering und deutlich unter der Menge die ich in Wildtyp-Exosomen detektiert habe. Die massenspektometrische Analyse ergab, dass die Clusterinmenge in Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten nach Hypoxie erniedrigt ist. In Immunoblots konnte ich jedoch kaum Clusterin in den Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten nachweisen.
77 Die Menge an ApoE ist nach Hypoxie in Exosomen von Wildtyp-Astrozyten deutlich erhöht und in Exosomen von PrP-defizienten Astrozyten unverändert, im Vergleich zur Menge in den Exosomen von unbehandelten Astrozyten, dies wird auch durch die Daten der semiquantitativen Massenspektrometrie gestützt. Eine direkte Interaktion von Clusterin und PrPC wurde bereits gezeigt (Xu et al., 2008). ApoE wird von Astrozyten sekretiert und wirkt über LRP1 bei oxidativem Stress und Hypoxie anti-apoptotisch auf Neurone (Hayashi et al., 2009) und Astrozyten (Zhou et al., 2002). Für die anti-apoptotische Wirkung auf Neuronen über LRP1 ist keine Internalisierung des ApoE nötig, sie erfolgt über LRP1 vermittelte Inhibition von Calcineurin und Aktivierung von PLCγ1 (Hayashi et al., 2009). Daher wäre auch eine extrazelluläre Bindung zwischen ApoE an LRP1 über Exosomen möglich; dabei könnte ApoE über PrPC an die äußere Membran der Exosomen gebunden sein (Abb. 5.1). Da ApoE in PrPSC Plaques detektiert wurde (Nakamura et al., 2000) und in PrPSc infizierten Mausgehirnen eine erhöhte ApoE-Expression vorliegt (Wagner et al., 2012), ist eine direkte Interaktion von ApoE und PrPC nicht unwahrscheinlich. Interessanterweise wird auch dass von uns in Exosomen gefundene Peroxiredoxin 6, in Scrapie infizierten Mausgehirnen vermehrt exprimiert (Wagner et al., 2012). In Exosomen war die Peroxiredoxin 6-Menge nach OGD sowohl in Wildtyp-Exosomen, als auch in PrP-defizienten Exosomen im Vergleich mit Exosomen von unter Normoxie kultivierten Astrozyten, erniedrigt. Die genaue Analyse der Peroxiredoxin 6-Menge mittels Immunoblot ist steht jedoch noch aus.
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Abb. 5.1: Theoretische Darstellung einer über ApoE und LRP1 vermittelten anti-apoptotischen Wirkung der Exosomen. Es ist bekannt, dass ApoE über LRP1 neuroprotektiv wirkt. ApoE könnte daher über Exosomen an LRP1 binden. Da die ApoE Menge in PrP-defizienten Exosomen nach Hypoxie nicht erhöht ist und es durch PrP-defiziente Neurone nicht zum neuroprotektiven Effekt kommt, ist eine Rolle von PrPC in diesem Szenario denkbar.