Identifizierung und Biogenese von tRNA Hälften in
Brassicaceen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
an der Fakultät Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
Fachbereich Biologie
der Universität Hamburg
vorgelegt von Lena Krüßel
1. Gutachterin: Prof. Julia Kehr
2. Gutachter: Prof. Stefan Hoth
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ... 1
1.1 Das Leitgewebe in höheren Pflanzen ... 1
1.2 Phloemtransportierte RNAs... 4
1.3 Kleine nicht-kodierende RNAs in Pflanzen ... 5
1.4 Transfer RNAs und ihre Fragmente ... 9
1.4.1 tRNAs und ihre Funktion in der Proteinbiosynthese ... 10
1.4.2 tRNA Hälften ... 14
1.5 T2 RNasen in Pflanzen ... 17
1.6 Zielsetzung ... 20
2
Material und Methoden ... 21
2.1 Chemikalien, Oligonukleotide, Enzyme, Puffer und Lösungen ... 21
2.2 Verwendete Versuchspflanzen und Bakterienstämme ... 22
2.3 Arbeiten mit Versuchspflanzen ... 23
2.3.1 Kultivierung von A. thaliana auf Erde ... 23
2.3.2 Kultivierung von B. napus auf Erde ... 23
2.3.3 Gewinnung von Phloemsaft aus B. napus ... 23
2.3.4 Trockenstressversuche mit B. napus ... 23
2.3.5 Oberflächensterilisation von A. thaliana-Samen ... 24
2.3.6 Kultivierung von A. thaliana auf Festmedium ... 24
2.3.7 Kreuzen von Mutanten zur Erstellung von Doppelmutanten ... 24
2.3.8 Genotypisierung der T-DNA Insertionslinien ... 25
2.3.9 Lokalisation von T-DNA Insertionen ... 25
2.3.10 Phänotypische Analysen ... 26
2.4 Molekularbiologische Methoden ... 27
2.4.1 Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis ... 27
2.4.2 Isolation von gesamt RNA aus Pflanzenmaterial ... 27
2.4.3 Isolation und Anreicherung kleiner RNA aus Pflanzenmaterial ... 27
2.4.4 Isolation nativer RNA aus Phloemsaft ... 28
2.4.5 Bestimmung der RNA und DNA-Konzentration ... 28
2.4.6 Analyse der RNA Qualität ... 28
2.4.7 Reverse Transkription ... 29
2.4.8 Polymerase-Kettenreaktion ... 29
2.4.9 In-vitro-Transkription ... 30
2.4.10 Auftrennung von DNA mittels Agarosegelelektrophorese ... 32
2.5.1 Konzentrieren von Phloemsaft ... 33
2.5.2 Blau-native Gelelektrophorese ... 33
2.5.3 Nachweis von tRNA-Proteinkomplexen ... 33
2.6 Klonierung von T2 RNasen ... 33
2.6.1 PCR für die Klonierung von T2 RNasen ... 34
2.6.2 Restriktionsverdau, Dephosphorylierung und Ligation ... 34
2.6.3 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen ... 35
2.6.4 Transformation von E. coli Zellen mittels Hitzeschock ... 35
2.6.5 Kolonie-PCR ... 36
2.6.6 Plasmidisolation und –sequenzierung ... 36
2.6.7 Herstellung von E. coli-Dauerkulturen ... 37
2.7 Nachweis von tRNA Hälften in Arabidopsis und Raps mittels Northern Blot ... 37
2.7.1 Auftrennung von kleiner RNA mittels denaturierender Gelelektrophorese ... 37
2.7.2 Transfer der RNA auf eine Nylon-Membran ... 38
2.7.3 Immobilisieren von RNA auf eine Membran ... 38
2.7.4 Herstellung biotinylierter DNA-Sonden ... 39
2.7.5 Prähybridisierung und Hybridisierung der Sonden ... 39
2.7.6 Chemilumineszenz-basierter Nachweis von RNA ... 40
2.7.7 Strippen von Membranen ... 40
2.8 Nachweis von tRHs mittels sRNA Sequenzierung... 40
2.9 Funktionelle Untersuchungen von tRNA Hälften ... 42
2.10 Proteinanalytische Methoden ... 44
2.10.1 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-PAGE ... 44
2.10.2 Kolloidale Coomassie-Färbung ... 44
2.10.3 Identifizierung von Proteinen mittels Peptidmassenfingerprint ... 44
2.10.4 Nachweis biotinylierter Proteine mittels Western Blot ... 45
2.10.5 Blau native PAGE zum Nachweis von tRNA Komplexen ... 46
2.11 Herstellung von rekombinanten T2 RNasen ... 47
2.11.1 Expressionssystem ... 47
2.11.2 Expressionstest ... 47
2.11.3 Löslichkeitstest ... 47
2.12 Aufreinigung rekombinanter Proteine aus Einschlusskörperchen ... 48
2.12.1 Heterologe Expression... 48
2.12.2 Rückfaltung und Aufreinigung der T2 RNasen ... 49
2.12.3 Aktivitätstest von rekombinanten T2 RNasen ... 51
2.12.4 Test auf Proteindegradation ... 52
3.1 Analyse der tRNA Hälften im Phloem von Brassica napus ... 54
3.1.1 Das B. napus Phloem enthält spezifische tRHs ... 54
3.1.2 Analyse der tRH Zusammensetzung mittels sRNA Seq ... 55
3.1.3 tRH-Komposition im Phloemexsudat von Raps ... 60
3.1.4 Trockenstress-regulierte tRHs im Phloemsaft von Raps ... 66
3.2 Funktionelle Untersuchungen zu tRHs im Phloemexsudat ... 68
3.2.1 Die RNA Fraktion des Phloemsafts inhibiert die Translation in vitro ... 69
3.2.2 Nachweis von tRNA Komplexen im Phloemexsudat von Raps ... 71
3.2.3 Expression und Aufreinigung rekombinanter T2 RNasen ... 72
3.2.4 In-vitro-Synthese von tRNA ... 84
3.2.5 Nachweis der RNase Aktivität mittels Bioanalyzer ... 86
3.3 Genotypisierung von Arabidopsis T-DNA-Insertionslinien ... 93
3.4 Phänotypisierung der Arabidopsis-Mutanten ... 95
3.4.1 Bestimmung des Expansionswachstum und der Hyponastie von Arabidopsis T2 RNase Mutanten 97 3.4.2 Analyse der Vaskulatur von Arabidopsis-Kotyledonen ... 100
3.4.3 Nachweis von tRHs im Blattgewebe von T2 RNase Mutanten ... 103
4
Fazit und Ausblick ... 109
5
Zusammenfassung ... 115
6
Abstract ... 117
7
Literaturverzeichnis ... 119
8
Anhang ... 130
8.1 Verwendete Oligonukleotidsequenzen ... 130 8.2 Verwendete Plasmide ... 1318.2.1 Plasmid pET28a(+) zur Klonierung ... 131
8.2.2 Plasmide für die in vitro Transkription... 133
8.2.3 Plasmid für den Transkriptions/Translations-Inhibitionsassay ... 135
8.3 sRNA-Sequenzierung ... 136
8.3.1 Längenverteilung untersuchter sRNAs ... 136
8.3.2 Normalisierte sRNA Sequenzierungsdaten ... 137
8.4 Vaskuläre Komplexität ... 139
8.4.1 Rohdaten ... 139
8.4.2 Boxplots der statistischen Auswertung mit SPSS ... 141
9
Publikationen und Konferenzbeiträge ... 145
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematische Darstellung des vaskulären Systems in Dikotylen... 1
Abb. 2: Differenzierung von Xylem- und Phloemzelltypen aus dem Kambium.. ... 2
Abb. 3: Transportwege vom Source-Gewebe über das Phloem ins Sink-Gewebe.. ... 3
Abb. 4: Hauptwege zur Biogenese von siRNAs und miRNAs in Pflanzen, die in verschiedenen.. ... 6
Abb. 5: Konservierte tRNA Struktur und mögliche tRNA-Modifikationen in Eukaryoten. ... 11
Abb. 6: Identifizierte tRNA Fragmente und Hälften verschiedener Organismen. ... 15
Abb. 7: Struktur und katalytische Aktivität der T2 Familie RNasen. ... 18
Abb. 8: Aufbau eines Semi-Dry-Blots. ... 38
Abb. 9: Nachweis von tRNAs und deren Fragmenten in B. napus mittels Northern Blot Assays. ... 55
Abb. 10: Workflow zur Generierung und Analyse einer tRH-Datenbank von Raps. ... 56
Abb. 11: Trockengestresste und ungestresste B. napus Pflanzen für die sRNA-Seq.. ... 57
Abb. 12: Genkopien von kernkodierten tDNA Sequenzen in Brassica napus. ... 58
Abb. 13: Alignment von sehr ähnlichen tRNA Sequenzen.. ... 59
Abb. 14: Verteilung der mittels sRNA-Seq ermittelten Häufigkeiten von 5´tRHs und 3´tRHs im Phloemsaft von Raps.. ... 60
Abb. 15: Identifizierte tRHs im Phloemsaft von Raps unter Trockenstress- und Standardbedingungen. ... 62
Abb. 16: Anteile identifizierter tRHs im Raps Phloemsaft unter Standardbedingungen und Trockenstress, unterteilt in 5´ und 3´Hälften.. ... 63
Abb. 17: Differentielle tRHs im Phloemsaft von Brassica napus bei Trockenstress.. ... 67
Abb. 18: Nachweis der inhibierenden Wirkung von RNAs aus dem Raps Phloem, durch einen in vitro Transkriptions/Translations-Inhibitionsassay. ... 70
Abb. 19: Nachweis von tRNA Proteinkomplexen im Phloem von Raps.. ... 71
Abb. 20: Sequenzvergleiche klonierter T2 RNasen.. ... 73
Abb. 21: Optimierung der Expression von rekombinanten T2 RNasen in E. coli.. ... 75
Abb. 22: Löslichkeitstest von rekombinanten T2 RNasen in verschiedenen Puffern.. ... 76
Abb. 23: Testen der Expression in einem Expressionssystem für toxische Proteine.. ... 76
Abb. 24: Expression von rekombinanten T2 RNasen in E. coli.. ... 78
Abb. 25: Renaturierung und Aufreinigung rekombinanter T2 RNasen aus E. coli. ... 79
Abb. 26: Rekombinante T2 RNasen nach der Rückfaltung und Größenausschlusschromatografie. .... 80
Abb. 27: Test der Enzymaktivität. ... 81
Abb. 28: Nachweis der RNase Aktivität von RNS1 und RNS3. ... 81
Abb. 29: Vergleich der pH-Wert abhängigen RNase Aktivität.. ... 82
Abb. 30: Überprüfen der Stabilität von rekombinantem BnRNS2. ... 84
Abb. 32: Vergleich des RNA Abbaus von tRNA-Asp(GUC) durch RNase T2 Enzymen aus Raps
und Arabidopsis.. ... 87
Abb. 33: Vergleich des RNA Abbaus von Blatt RNA durch RNase T2 Enzymen aus Raps und Arabidopsis.. ... 88
Abb. 34: Vergleich des RNA Abbaus von 18S rRNA durch RNase T2 Enzymen aus Raps und Arabidopsis. ... 90
Abb. 35: Vergleich des Abbau von 18S rRNA bei dem Verdau mit RNS2 aus Raps und Arabidopsis und RNase T1. ... 92
Abb. 36: Lokalisation der T-DNA Insertionsstelle der Arabidopsis Mutanten. ... 94
Abb. 37: Genotypisierung von T2 RNase Einzel- und Doppelmutanten.. ... 95
Abb. 38: Vergleich des Rosettenwachstums von RNase T2 T-DNA Insertionsmutanten und Wildtypen.. ... 96
Abb. 39: Vergleich des Sprosswachstums der T2 RNase T-DNA Insertionsmutanten und Wildtypen. ... 97
Abb. 40: Ergebnisse des Phänotyps hinsichtlich Expansionswachstums und Hyponastie.. ... 99
Abb. 41: Vergleichs der vaskulären Komplexität in Kotyledonen der T2 RNase Mutanten und Wildtypen. ... 102
Abb. 42: Optimierung der Northern Blot Methode. ... 104
Abb. 43: Northern Blot mit Blatt RNA aus A. thaliana.. ... 106
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Übersicht der fünf T2 RNasen aus Arabidopsis. ... 19
Tab. 2: Zusammensetzung verwendeter Medien, Puffer und Lösungen. ... 21
Tab. 3: Verwendete Pflanzenlinien ... 22
Tab. 4: Verwendete Escherichia coli Bakterienstämme zur Klonierung und Expression... 23
Tab. 5: Übersicht der verwendeten Primerpaare für die Genotypisierung. ... 25
Tab. 6: Verwendete Primer und dazugehörige Arabidopsis-Pflanzen... 25
Tab. 7: Übersicht der hinsichtlich der vaskulären Komplexität untersuchten Keimblätter. ... 26
Tab. 8: Reaktionsansatz für die cDNA-Synthese. ... 29
Tab. 9: Standardmäßig genutzte PCR-Programme für die Phusion High-Fidelity und Taq DNA-Polymerase. ... 30
Tab. 10: Verwendete Reaktionsansätze zur Herstellung der DNA-Templates der 18S rRNA und tRNA-Asp(GUC) für die RNA-Synthese. ... 31
Tab. 11: Verwendete PCR-Programme zur Amplifikation der DNA-Templates für die RNA-Synthese. ... 31
Tab. 12: Ansatz für die in-vitro-Transkription der 18S rRNA aus Mus musculus. ... 32
Tab. 13: 100 µl Reaktionsansatz für die RNA-Synthese von tRNA-Asp(GUC) unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase. ... 32
Tab. 14: Übersicht der klonierten RNase T2 Konstrukte. ... 34
Tab. 15: Primerpaare und deren Annealing-Temperaturen. ... 34
Tab. 16: Für die Transformation verwendete E. coli Stämme und ihr Verwendungszweck. ... 36
Tab. 17: PCR-Programm für die Kolonie-PCR. ... 36
Tab. 18: Zusammensetzung eines 15 %-igen denaturierenden Polyacrylamidgels mit einer Geldicke von 0,75 mm. ... 37
Tab. 19: Ansatz für den gelbasierten Transkriptions-/Translations-Inhibierungsassay mit Luciferase-Template... 43
Tab. 20: Zusammensetzung eines 15-%igen diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgels. ... 44
Tab. 21: Verwendete Puffer für den Löslichkeitstest der exprimierten T2 RNasen... 48
Tab. 22: Faktoren zur Normalisierung der RNA-Seq Daten, ermittelt durch RPM und DESeq2. ... 60
Tab. 23: Abundanteste 5´und 3´tRHs im Phloemsaft von Raps und deren putativen Ziel RNAs und Codon Usage Frequenzen. ... 64
Tab. 24: Putative Ziel-RNAs regulierter tRHs im Phloemsaft und Funktion der Proteine. ... 68
Tab. 25: Eigenschaften klonierter verkürzter T2 RNase Konstrukte mit His6-Tag. ... 74
Tab. 26: Bestätigung der rekombinanten Proteine mittels MS.. ... 77
Abkürzungsverzeichnis
aaRS Aminoacyl-tRNA-Synthetasen OD optische Dichte
aa-tRNA Aminoacyl-tRNA ORF offener Leserahmen
ABA Abszisinsäure PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
AGO Argonauten-Protein PCR Polymerase-Kettenreaktion
ANG Angiogenin pha-siRNA phased siRNA
ATP Adenosintriphosphat Pi anorganisches Phosphat
bp Basenpaare piRNA PIWI-interacting RNA
CC Geleitzelle (companion cell) PPU pore plasmodesmal unit
cDNA komplementäre DNA pre-miRNA precurser-miRNA
Da Dalton pri-miRNA primary-miRNA
DAS days after sowing, Tage nach Aussaat PS Phloemsaft
DCL Dicer-like PTGS posttranskriptionelles Gen Silencing
DEPC Diethyldicarbonat RAM Wurzelapikalmeristem (root apical meristem)
DNA Desoxyribonukleinsäure RdDM RNA-abhängige DNA-Methylierung
Dnmt DNA-Methyltransferase RDR RNA-abhängige RNA-Polymerase
dPAGE denaturierende PAGE RER relative Expansionsrate
dsRNA doppelsträngige RNA RFU relative Fluoreszenzeinheit
easiRNA epigenetisch aktivierte siRNA RISC RNA-induced silencing complex EDC 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)
Carbodiimid
RNA Ribonukleinsäure
eEF eukaryotischer Elongationsfaktor RPM reads per million eIF eukaryotischer Initiationsfakter rRNA ribosomale RNA
ER Endoplasmatisches Retikulum RT-qPCR quantitative Real-Time PCR
eRF eukaryotic release factor SAM Sprossapikalmeristem
FU Fluoreszenzeinheiten SDS Natriumdodecylsulfat
gDNA genomische DNA SE Siebelement
GTP Guanosintriphosphat SEL size exclusion limit HD-ZIP homeodomain-leucine zipper protein SER Siebelement Retikulum
HEN Hua enhancer siRNA small interfering oder silencing RNA
hp-siRNA hairpin-siRNA snoRNA small nucleolar RNA
HRP Meerrettich Peroxidase snRNA small nuclear RNA
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid sRNA small RNA RNA
kb Kilobasen tasi trans-acting siRNA
miRNA microRNA tDNA tRNA-Gene
mRNA messenger RNA T-DNA Transfer-DNA
MS Massenspektrometrie TGS transkriptionelles Gen Silencing
natsiRNA natural antisense siRNA tRF tRNA Fragment
ncRNA non-coding RNA tRH tRNA Hälfte
Ni-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure tRNA Transfer-RNA
Nt Nukleotide UE Untereinheit
aaRS Aminoacyl-tRNA-Synthetasen UTR untranslatierter Bereich
1 Einleitung
Die Ribonukleinsäure (RNA) ist wichtiger Bestandteil aller lebender Zellen, von der ursprünglich angenommen wurde, hauptsächlich bei der Umsetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) in Proteine eine Rolle zu spielen. Doch es gibt auch funktionelle RNA Moleküle, die nicht für Proteine kodieren. Sie werden als nicht-kodierende RNAs (engl., non-coding RNA, ncRNA) bezeichnet. Die häufigste ncRNA ist die ribosomale RNA (rRNA), die struktureller Bestandteil von Ribosomen ist. Auch die Transfer RNA, die an der Translation von mRNAs beteiligt ist, gehört zu den ncRNAs. Im Jahr 1993 wurde erstmals eine kleine nicht-kodierende RNA in einem Fadenwurm entdeckt, die in der Lage war, die Translation einer messenger RNA (mRNA) zu inhibieren (Wightman et al., 1993). Dabei handelte es sich um eine microRNA (miRNA). Seitdem wurden zahlreiche weitere kleine regulatorische RNAs in fast allen eukaryotischen Organismen gefunden, so auch in Pflanzen. Sie besitzen unterschiedliche Mechanismen, um die Genexpression zu beeinflussen. Die durch kleine RNAs regulierten Mechanismen sind für sessile Pflanzen von großer Bedeutung, da sie biotischem und abiotischem Stress ausgesetzt sind und daher flexibel auf verschiedene Umweltbedingungen reagieren müssen. Eine Funktion der small interfering RNAs (siRNAs) ist beispielsweise die Abwehr gegen Viren. Wichtig ist auch, dass solche Signalmoleküle schnell in der gesamten Pflanze verbreitet werden können, um schnell auf den Stress reagieren zu können. Daher ist das Leitgewebe der Pflanzen der effektivste Weg zur systemischen Signalweiterleitung. Vor allem das Phloem ist bekannt für die Verbreitung nicht nur von Fotoassimilaten, sondern auch von Signalmolekülen und Proteinen.
1.1 Das Leitgewebe in höheren Pflanzen
Das vaskuläre System von höheren Pflanzen besitzt sehr wichtige Funktionen in der Pflanze. Es verbindet entfernte Pflanzenorgane und ist zuständig für den Langstreckentransport von Wasser, Nährstoffen und Signalmolekülen. Zudem sorgt es für Stabilität innerhalb der Pflanze (Lucas et al., 2013). Das Leitgewebe von zweikeimblättrigen Pflanzen besteht häufig aus offen kollateralen Leitbündeln, bestehend aus Phloem, Xylem und dem in der Mitte davon liegenden Kambium. Die Anordnung der primären Leitbündel im Blatt und im Stängel sind in Abb. 1 zu sehen. Im Spross sind die Leitbündel konzentrisch angeordnet, mit innen liegendem Xylem. Im Blatt ist das Xylem
Abb. 1: Schematische Darstellung des vaskulären Systems in Dikotylen. Das Leitgewebe von Pflanzen besteht aus Xylem (blau) und Phloem (rot). Die Anordnung und der Aufbau der primären Leitbündel ist schematisch durch eine Vergrößerung eines Spross- bzw. Blattquerschnitts dargestellt.
adaxial und das Phloem abaxial ausgerichtet (Lucas et al., 2013). In der Abbildung sieht man außerdem, wie der Transport von Wasser und Mineralstoffen von den Wurzeln bis in die Blätter erfolgt. Die treibende Kraft dafür sind der Transpirationssog, aufgrund der Verdunstung von Wasser aus den Stomata der Blätter, sowie der Wurzeldruck. Der Transport über das Phloem erfolgt dagegen vom Bildungsort (Source-Gewebe) zum Verbrauchs- oder Speicherort (Sink-Gewebe), aufgrund der Konzentrationsunterschiede des in Source-Geweben gebildeten Zuckers zum Sink-Gewebe (siehe auch Abb. 3). Es wird angenommen, dass der Phloemstrom durch osmotischen Druck angetrieben wird und durch Einströmen von Wasser ins Phloem ein hydrostatischer Druck entsteht (Münch, 1927; Turgeon, 2010).
Die Bildung von Xylem und Phloem erfolgt durch die Differenzierung von Kambiumzellen, die auch als vaskuläre Stammzellen bezeichnet werden (Miyashima et al., 2013). Das vaskuläre System besteht aus hochspezialisierten Zellen, deren Zellwände spezifischen Modifikationen unterzogen werden, um als Transportweg für Wasser und Nährstoffe genutzt werden zu können (Notaguchi & Okamoto, 2015). Die Differenzierung von Xylem- und Phloemzellen ist in Abb. 2 dargestellt (verändert nach Schuetz et al., 2012). Aus Parenchymzellen entstehen zunächst Prokambiumzellen, die sich dann weiter zu kambialen Stammzellen entwickeln. Daraus können dann wiederum spezialisierte Xylem- oder Phloemzellen gebildet werden. Einige Zellen bleiben jedoch auch undifferenziert zwischen Xylem- und Phloemzellen und können dann als vaskuläre Stammzellen agieren. Dies ermöglicht schnelles Längenwachstum sich entwickelnder Organe wie junge Stängel oder Blätter (Schuetz et al., 2012). Für das sogenannte Primärwachstum der Pflanze sind das Wurzelapikalmeristem (RAM = engl. root apical meristem) der Wurzelspitze und das Sprossapikalmeristem (SAM = engl. shoot apical meristem) in der Sprossspitze wichtig.
Vor der Spezialisierung zu Xylemzelltypen werden zunächst Xylem-Vorläuferzellen gebildet. Gereiftes Xylemgewebe besteht aus Tracheengliedern (Gefäßelemente), Parenchymzellen und Holzfasern. Das Protoxylem wird während des Primärwachstums gebildet, nach Reifung des
Abb. 2: Differenzierung von Xylem- und Phloemzelltypen aus dem Kambium. Das Prokambium
entsteht aus Parenchymzellen und entwickelt sich dann zu Xylem- bzw. Phloem-Vorläufer. Dazwischen bleiben undifferenzierte Kambiumzellen bestehen. Dieser können dann zu Xylem- bzw. Phloem-Zelltypen differenzieren. Verändert nach Schuetz et al. (2012).
vaskulären Gewebes wird dann das größere Metaxylem gebildet. Zur Bildung dieser Xylemgefäße werden zunächst die sekundären Zellwände verdickt und die Zellen anschließend einem programmierten Zelltod unterzogen (Schuetz et al., 2012). Durch Aussparungen in der sekundären Zellwand, der sogenannten Tüpfel, sind die Gefäßelemente miteinander verbunden, um so den schnellen Transport von Wasser und Mineralstoffen zu gewährleisten. Die Holzfasern dienen hauptsächlich der Stabilität, daher sind die Sekundärwände gleichmäßig stark verdickt und lignifiziert (Sadava et al., 2019).
Zur Bildung eines gereiften Phloems erfolgt ebenfalls zunächst die Bildung von Phloem-Vorläuferzellen. In Angiospermen entwickelt sich aus den Phloem-Vorläuferzellen das Phloemgewebe, bestehend aus einem Komplex von je einem Siebelement (engl., sieve-element, SE) mit mindestens einer Geleitzelle (engl., companion cell, CC) (Oparka & Turgeon, 1999). Beide Zellen entstehen durch ungleiche Teilung einer gemeinsamen Vorläuferzelle und interagieren stark miteinander (Esau, 1969). Dieser Komplex ist von Phloemparenchym umgeben. Bastfasern des Phloemgewebes dienen durch eine verdickte sekundäre Zellwand und Lignin, wie Holzfasern des Xylems, der Stabilität. Im Gegensatz zum Xylem handelt es sich beim Phloem um lebendes Gewebe. Während der Differenzierung durchlaufen SEs eine partielle Autolyse, dabei werden unter anderem Zellkern, Golgi-Apparat und Vakuole abgebaut (Lucas et al., 2013). Das Endoplasmatische Retikulum (ER) verändert sich strukturell und bildet Stapel, verliert Ribosomen und wandert Richtung Zellwand. Es wird auch Siebelement Retikulum genannt (SER) (Turgeon & Wolf, 2009; Heo et al., 2017). SEs besitzen noch eine Plasmamembran und Organellen wie Plastiden, die Anzahl von Mitochondrien ist reduziert und sie sind geweitet (Van Bel & Knoblauch, 2000). Aufgrund dieser Beobachtungen wird angenommen, dass im Phloem keine Translation stattfinden kann, obwohl einige Untereinheiten des Ribosoms und rRNA gefunden wurden (Pahlow et al., 2018). Elongierte Siebelemente sind über modifizierte Plasmodesmen verbunden, den sogenannten Siebplatten. Physiologische Funktionen der zellkernlosen SEs werden durch eine eng verbundene Geleitzelle, die einen Zellkern besitzt, erhalten. Die Verbindung von SE und CC wird durch viele spezielle Plasmodesmen
Abb. 3: Transportwege vom Source-Gewebe über das Phloem ins Sink-Gewebe. Siebelemente (SE) sind über
Siebplatten verbunden, die Verbindung zu Geleitzellen (CC) besteht über PPUs (pore plasmodesmal units). Die Beladung des Phloems kann symplastisch über Plasmodesmen und PPUs oder apoplastisch über Transporter erfolgen. Siebelemente besitzen modifiziertes Siebelement ER (SER). Schematische Darstellung in Anlehnung an Turgeon & Wolf (2009).
gewährleistet (Abb. 3). Diese modifizierten Plasmodesmen-Komplexe werden als PPUs (engl., pore plasmodesmal unit) bezeichnet und können sogar von Proteinen mit einer Größe von 67 kDa passiert werden (Stadler et al., 2005). Die maximale Größe, bis zu der Moleküle PPUs passieren können, wird auch size exclusion limit, (SEL) genannt. PPUs sind zur CC-Seite hin verzweigt (Oparka & Turgeon, 1999). Der Transport in SE-CC Komplexe kann, neben der symplastischen Beladung über die Plasmodesmen, auch apoplastisch erfolgen. Bei einer apoplastischen Beladung wird Saccharose in den Apoplasten abgegeben, um dann entweder aktiv durch Saccharose-Transporter in die Geleitzelle oder das Siebelement aufgenommen zu werden (Gottwald et al., 2000).
1.2 Phloemtransportierte RNAs
Durch das Phloem werden nicht nur Mikromoleküle wie Fotoassimilate und Aminosäuren transportiert. Sekundärmetabolite wie Glucosinolate und das Phytohormon Auxin nutzen ebenfalls das Phloem für ihre Verbreitung (Friml & Palme, 2002; Halkier & Gershenzon, 2006). Außerdem wurden auch Makromoleküle wie Proteine und RNAs identifiziert. Zum Beispiel wurden im Phloemsaft von Raps sehr viele lösliche Proteine mit Hilfe elektrophoretischer und massenspektrometrischer Analysen identifiziert, darunter RNA-Bindeproteine und solche, die an der Signalweiterleitung beteiligt sind (Giavalisco et al., 2006). Der Transport von RNAs durch das Phloem ist noch nicht vollständig geklärt, eine Rolle dabei könnten aber die identifizierten RNA-Bindeproteine spielen (Pallas & Gómez, 2013). Das Phloem dient somit nicht nur als Langstreckentransportweg für Nährstoffe, sondern auch zur Signalweiterleitung.
Die Entdeckung von endogenen Phloem-mobilen RNAs ist noch relativ neu in der Phloem-Forschung. Bereits in den 1970ern gab es Veröffentlichungen, die über RNAs im Phloem von Cucurbita maxima (Riesenkürbis) berichteten. Es wurde jedoch angenommen, dass es sich hierbei um Kontaminationen aus benachbarten Zellen durch die Phloemsaft-Sammelmethode handelt (Kollmann et al., 1970; Ziegler, 1975). Doch immer häufiger wurden mRNAs in SEs und CCs nachgewiesen, obwohl die Transkription nur in CCs stattfindet, was für einen Transport von RNAs in die Siebelemente sprach (Lucas et al., 1995; Kühn et al., 1997; Ruiz-Medrano et al., 1999). Daraufhin wurde vermehrt der Fokus auf RNAs im Phloem gelegt. Lucas et al. (1995) zeigten beispielsweise in Mais, dass der Transkriptionsfaktor KNOTTED1 (KN1) den Transport seiner eigenen RNA ins Phloem vermitteln kann. Mit Hilfe von Pfropfungs-Experimenten wurde erstmals der Langstreckentransport von mRNAs gezeigt (Ruiz-Medrano et al., 1999; Xoconostle-Cázares et al., 1999). In Tomatenpflanzen fand man heraus, dass mRNAs eine Signalfunktion in der Pflanze ausüben, da die translozierte mRNA eine Änderung in der Blattmorphologie bewirkte (Kim et al., 2001). Auch für weitere Phloem-transportierte mRNAs wurde eine Signalfunktion gezeigt (Haywood et al., 2005; Banerjee et al., 2006; Li et al., 2009). Durch umfangreichere Analysen von Ricinus communis Phloemsaft konnten fast 160
einzigartige Transkripte identifiziert werden. Analysen von Cucurbitaceen waren noch deutlich umfangreicher (Doering-Saad et al., 2006; Guo et al., 2012).
Doch mRNAs sind nicht die einzigen RNAs, die im Phloem transportiert werden. Neben mRNAs sind auch einige nicht-kodierende RNAs identifiziert worden, beispielsweise rRNAs und tRNAs (Buhtz et al., 2008; Zhang et al., 2009). Aber auch kleine nicht-kodierende RNAs, deren regulatorische Funktion bereits nachgewiesen wurde, wie siRNAs und miRNAs (Yoo et al., 2004; Buhtz et al., 2008; Ham et al., 2014). Phloem-mobile siRNAs vermitteln bei einem Virusbefall den Abbau von Virus-RNA und sind wichtig beim Gen Silencing (Mourrain et al., 2000; Mello & Conte, 2004). Für Phloem-mobile miRNAs wurden verschiedene Funktionen bei der Entwicklung und Anpassung an Umweltbedingungen gezeigt. miR399 und miR395 aus Brassica napus sind beispielsweise bei Nährstoffmangel reguliert, miR399 wird bei Phosphatmangel induziert, miR395 bei Schwefelmangel (Buhtz et al., 2010). In Arabidopsis wurde gezeigt, dass miR399 an der Aufnahme von Phosphat beteiligt ist (Pant et al., 2008). Dort konnte für miR156 und miR172 außerdem eine Beteiligung an der Regulation der Entwicklung von einer „jugendlichen“ zu einer „erwachsenen“ (juvenile-to-adult transition) Pflanze beobachtet werden (Wu et al., 2009). Eine der neuesten Klassen kleiner nicht-kodierender RNA leitet sich von tRNAs ab. Im Phloem wurden sie erstmals 2009 im Riesenkürbis nachgewiesen (Zhang et al., 2009). Dort fand man Fragmente von tRNAs, die entweder drei Viertel der tRNA oder der Hälfte entsprachen. Die häufigste tRNA Hälfte (tRHs) war die 3´Hälfte der tRNA-Asp(GAC). Da im Blattgewebe keine Hälften nachweisbar waren, deutete dies auf eine gezielte Häufung im Phloem hin. Zudem wurden nicht die Hälften aller tRNAs identifiziert, weshalb man auf einen spezifischen Transport ins Phloem schließen kann. In dieser Studie konnte zudem eine Translations-inhibierende Wirkung von tRNA Hälften gezeigt werden (Zhang et al., 2009). Dies passt zu der Annahme, dass im Phloem keine Translation stattfinden kann. Eine umfassende Studie zu tRHs im Phloem gab es bisher nicht.
1.3 Kleine nicht-kodierende RNAs in Pflanzen
Unter nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) versteht man RNAs, bei der keine Umsetzung zu einem Protein erfolgt. Dennoch besitzen diese RNA-Moleküle wichtige Informationen oder eine Funktion in der Pflanze. Die bekanntesten ncRNAs sind rRNAs und tRNAs. rRNAs sind struktureller Bestandteil von Ribosomen, tRNAs transportieren die Aminosäuren zum Ort der Proteinsynthese. Es wurde jedoch eine Vielzahl weiterer ncRNAs gefunden, die eine regulatorische Funktion besitzen. Darunter small nuclear RNAs (snRNAs) und small nucleolar RNAs (snoRNAs). Seit der Entdeckung der RNA-Interferenz im Jahr 1998 wurde sehr viel zu regulatorischen RNAs in Eukaryoten geforscht (Fire et al., 1998). Man kann sie in kleine ncRNAs (small RNAs, sRNAs) und lange ncRNAs (long non-conding RNAs, lncRNAs) einteilen, wobei lncRNAs größer als 200 Nt und sRNAs kleiner sind. rRNAs, tRNAs, snRNAs und snoRNAs sind davon ausgenommen (Sobala & Hutvagner, 2011). Zu den
sRNAs gehören siRNAs und miRNA in Pflanzen, in tierischen Zellen gehören auch PIWI-interacting RNAs (piRNAs) dazu.
Kleine endogene RNAs mit einer Größe von meist etwa 21 – 24 Nt besitzen wichtige Funktionen bei der Regulation der Genexpression in eukaryotischen Organismen. Sie regulieren endogene Gene aber dienen auch zur Abwehr von Fremd-RNA, die durch Viren eingebracht wird (Carthew & Sontheimer, 2009). Kleine regulatorische RNAs sind gut untersucht und können, aufgrund der Vorläufer-Strukturen und Biogenese, in zwei Hauptklassen eingeteilt werden, nämlich siRNAs und miRNAs. Die erste identifizierte regulatorische sRNA war eine miRNA und wurde im Fadenwurm Caenorhabditis elegans entdeckt (Wightman et al., 1993). Seitdem wurden in fast allen eukaryotischen Organismen miRNAs nachgewiesen. Untersuchung zur RNA-Interferenz führten zu einer weiteren Kategorie kleiner regulatorische RNAs, den siRNAs (Hamilton & Baulcombe, 1999). Beide werden aus einer längeren doppelsträngigen RNA (dsRNA) in kleinere dsRNA-Moleküle geschnitten. Die dafür zuständige RNase III ist das Dicer-ähnliche Protein (engl., Dicer-like protein, DCL). Außerdem bilden beide zusammen mit Argonauten-Proteinen (AGO) den RNA-induced silencing complex (RISC). Es gibt jedoch einige Unterschiede hinsichtlich der Biogenese und Funktion. Die Entstehung pflanzlicher siRNAs und miRNAs ist in Abb. 4 übersichtlich dargestellt (Borges & Martienssen, 2015).
Abb. 4: Hauptwege zur Biogenese von siRNAs und miRNAs in Pflanzen. Es sind die Wege und beteiligten Enzyme zur
Herstellung von miRNA und verschiedener siRNAs, sowie deren Funktion gezeigt. (A) Entstehung von sRNAs, die am PTGS beteiligt sind, wie die miRNA, hp-siRNA und natsiRNA. Sie beeinflussen die Transkription durch Schneiden von mRNA oder Inhibieren der Translation. (B) Entstehung sekundärer siRNAs, die am PTGS und TGS beteiligt sind, sie können also zusätzlich DNA methylieren. (C) Biogenese von siRNA, die nur am TGS durch DNA Methylierungen beteiligt ist. Abkürzungen: PTGS, post-transcriptional gene silencing; TGS, transcriptional gene silencing; DCL, Dicer-like protein; RDR, RNA-dependent RNA polymerase. Abbildung aus Borges & Martienssen (2015).
miRNAs sind RNA-Duplexe, die nicht perfekt komplementär sind und typischerweise zwischen 20 und 22 Nt lang (Lee et al., 2015). Für die Herstellung von miRNAs gibt es endogene Gene, die durch die RNA-Polymerase II (Pol II) in lange primary miRNAs (pri-miRNAs) transkribiert werden (Borges & Martienssen, 2015). Die einzelsträngigen pri-miRNAs sind polyadenyliert, besitzen ein 5´-Cap und bilden hairpin-ähnliche, unperfekt komplementäre Strukturen aus (Kim, 2005). Es sind zwei katalytische Schritte der RNase III Endonuklease DCL1 notwendig, um eine gereifte miRNA herzustellen (Bologna & Voinnet, 2014). Die pri-miRNA wird zunächst von DCL1 zu kleineren stem-loop Strukturen geschnitten, die als precursor-miRNA (pre-miRNA) bezeichnet werden. Durch ein weiteres Schneiden von DCL1 entsteht daraus eine gereifte miRNA mit einem 2 Nt langen Überhang am 3´-Ende (Borges & Martienssen, 2015). Die meisten sRNA-Duplexe werden anschließend durch die Methyltransferase HUA ENHANCER 1 (HEN1) am 3´-Ende methyliert, was vor einem Abbau schützen soll (Li et al., 2005). Die Reifung der miRNAs findet im Zellkern statt, anschließend werden sie ins Zytoplasma exportiert (Carthew & Sontheimer, 2009).
Die Biogenese von endogenen siRNAs ist etwas vielfältiger als die von miRNAs. siRNAs besitzen eine Länge von 21, 22 oder 24 Nt (Parent et al., 2012). Ursprünglich wurden siRNAs bei Transgen- und Virus-induziertem Silencing in Pflanzen entdeckt, um doppelsträngige Fremd-RNAs abzubauen (Baulcombe, 2004). Es gibt jedoch viele weitere Funktionen von endogenen siRNAs, die aus verschiedenen Vorläufern entstehen können. siRNA-Vorläufer können durch Hybridisierung von sense- und antisense-Transkripten oder unabhängig voneinander komplementären Sequenzen und durch Faltung von langen Transkripten mit einem Inverted-Repeat entstehen (Borges & Martienssen, 2015). Die Herstellung der meisten Vorläufer von siRNAs erfolgte jedoch durch eine RNA-abhängige RNA Polymerase (RDR), die aus zunächst einzelsträngiger eine doppelsträngige RNA generiert. Die langen RNA-Doppelstränge werden meist durch DCL2, DCL3 und DCL4 zu kleinen perfekt doppelsträngigen RNA-Duplexen prozessiert, die dann auf unterschiedlichem Wege Transkripte oder Gene regulieren (siehe Abb. 4.). Aufgrund ihrer Biogenese gehören sie zu verschiedenen Kategorien. Hairpin-derived-siRNAs (hp-siRNAs) besitzen eine Vorläufer-RNA, die durch Pol II synthetisiert wurde und einen hairpin ausbildet (Abb. 4B). Dieser Vorläufer kann von allen vier pflanzlichen DCLs zu kleinen siRNAs geschnitten werden. Zu den sekundären siRNAs gehören trans-acting siRNA (tasiRNAs), phased siRNAs (pha-siRNAs), epigenetisch aktivierte siRNAs (easiRNAs) und natural antisense siRNAs (natsiRNAs). Die Vorläufer von tasiRNAs, pha-siRNAs und easi-RNAs werden ebenfalls durch die Pol II und der RDR6 synthetisiert und anschließend von DCL2 und DCL4 prozessiert. natsiRNA-Vorläufer entstehen entweder durch Pol II oder Pol IV und RDR2 oder RDR4 und werden durch DCL1, DCL2 oder DCL3 geschnitten. trans-natsiRNAs stammen im Unterschied zu cis-natsiRNAs von komplementären Transkripten unterschiedlicher Loci. Die häufigsten sRNAs sind jedoch die heterochromatischen siRNAs (hetsiRNAs oder hc-siRNAs), die abhängig von Transposons oder perizentromerischen Repeats entstehen. Die lange dsRNA wird durch Pol IV und RDR2 generiert und anschließend von DCL3 in kleine siRNAs geschnitten (Borges & Martienssen, 2015)bo. siRNAs,
die ebenfalls einen 2 Nt Überhang besitzen, werden wie miRNAs am 3´-Ende eine 2´-O-Methylierung von HEN1 angefügt, um sie vor einer Degradation zu schützen (Li et al., 2005; Borges & Martienssen, 2015).
Nach der Prozessierung von siRNAs und miRNAs bilden sie zusammen mit den Effektor-Proteinen, den sogenannten Argonauten (AGOs), den RISC-Komplex und können so posttranskriptionelles Gen Silencing (PTGS) vermitteln, bei dem mRNA abgebaut oder die Translation gehemmt wird, oder aber transkriptionelles Gen Silencing (TGS), das DNA-Methylierungen oder Chromatin-Modifikationen beinhaltet (Parent et al., 2012). Dies ist abhängig von dem gebundenen AGO-Protein. AGOs besitzen vier Domänen. Eine variable N-terminale Domäne sowie die PAZ, MID und PIWI Domänen, die dafür sorgen, dass sRNAs in der richtigen Position sind (Bologna & Voinnet, 2014). AGOs besitzen eine 5´-terminale Nukleotidpräferenz und auch die Länge der sRNA ist entscheidend (Bologna & Voinnet, 2014; Borges & Martienssen, 2015). Diese Spezifität ist auf eine Schleifen-Struktur in der MID-Domäne des AGO-Proteins zurückzuführen (Frank et al., 2012). Außerdem tragen die Ausbuchtungen der miRNA-Duplexstruktur zur spezifischen Bindung von AGOs bei. Die PAZ-Domäne sorgt für die Bindung am 3´-Ende des Nukleotids. Ist also das passende AGO-Protein für eine sRNA gefunden, muss zunächst ein Strang des Duplexes abgebaut werden. Die PIWI-Domäne nimmt eine RNase-H-ähnliche Faltung an und kann die Endonuklease-Aktivität (Slicer) ausführen (Borges & Martienssen, 2015). Welcher der beiden Stränge abgebaut wird, wird zum Teil aufgrund der thermodynamischen Stabilität der Duplex-Enden entschieden (Tomari & Zamore, 2005). Der Strang, dessen 5´-Terminus mit dem instabileren Ende gepaart ist, wird als guide-Strang gewählt, der komplementäre passenger-Strang wird dagegen abgebaut. Für pflanzliches AGO1 konnte gezeigt werden, dass der Abbau des passenger-Strangs unter Verbrauch von Adenosintriphosphat (ATP) durch HSP90 (heat shock protein 90) geschieht (Iki et al., 2010). Beim Abbau des siRNA passenger-Strangs ist zusätzlich die RNase-Aktivität von AGO1 notwendig, beim miRNA-Strang jedoch nicht. In manchen Fällen, beispielsweise unter Stress, wird die passenger-RNA jedoch auch stabilisiert und funktional (Devers et al., 2011).
Durch den assemblierten RISC-Komplex kann zum einen PTGS im Zytoplasma vermittelt werden, zum anderen TGS im Zellkern. PTGS kann durch Abbau der mRNA bedingt sein. AGO1 bindet die meisten miRNAs und einige siRNAs. Assemblierte AGO1-RISC-Komplexe erkennen ihre Ziel-mRNAs durch komplementäre Basen und schneiden sie, wahrscheinlich zwischen Position 10 und 11 der gepaarten Region (Bologna & Voinnet, 2014). Das zytoplasmatische Exosom und die 5´-3´-Exoribonuklease XRN4 bauen die entstehenden Produkte wiederum ab. miRNAs sind dabei nahezu perfekt komplementär, im Gegensatz zu tierischen miRNAs. Daher wird angenommen, dass pflanzliche miRNAs eine limitierte Anzahl von mRNA-Zielen besitzen (Voinnet, 2009). sRNAs können auch die Translation und somit das Proteinlevel beeinflussen. Dies geschieht wahrscheinlich vorwiegend bei weniger perfekt gepaarter miRNA/mRNA-Paarung (Brodersen et al., 2008). Der
AGO1-RISC-Komplex bindet an die 5´-untranslatierte Region (UTR) oder den offenen Leserahmen (engl., open reading frame, ORF), was zu einer sterischen Hinderung der Rekrutierung bzw. Fortbewegung des Ribosoms führt und somit die Translation negativ reguliert (Lanet et al., 2009; Iwakawa & Tomari, 2013). Die Mehrheit der siRNAs ist involviert in TGS und DNA-Reparatur. Transkriptionelles Gen Silencing führt zu RNA-abhängigen DNA-Methylierungen (RdDM) und Chromatin-Modifikationen. Vorwiegend siRNAs lenken dabei repressive, epigenetische Modifikationen, wie die DNA-Methylierung von Cytosin und Histon-Methylierungen, wodurch die Transkription von Transposons und repetitiver DNA gemindert wird (Matzke & Mosher, 2014). Für die Entstehung dieser siRNAs sind jedoch zwei Polymerasen notwendig. Zuerst erfolgt die Synthese von Transkripten heterochromatischer Regionen durch die Pol IV und die Synthese des komplementären Strangs durch eine RDR. Die dsRNA wird von DCL3 geschnitten, modifiziert und aus dem Zellkern ins Zytoplasma exportiert. Dort wird sie von AGO4 gebunden und zurück in den Zellkern importiert. Die siRNA vermittelt dann die Bindung an gerade naszierende Transkripte, die durch die Pol V synthetisiert werden. Dadurch wird eine DNA-Methyltransferase aktiviert, um de novo Methylierungen von Cytosin zu vermitteln (Matzke & Mosher, 2014). Das führt zu transkriptionellem Silencing an den Loci, die von Pol V transkribiert werden, wahrscheinlich weil die Transkription von Pol II gehindert wird. Auch eine Beteiligung an der Histon-Methylierung von Lysin 9 von Histon 3 (H3K9) wird vermutet, dort führt eine Methylierung zu transkriptioneller Repression (Bologna & Voinnet, 2014).
Die bekannteste Funktion von siRNAs in Pflanzen ist die Abwehr und Resistenz gegen Viren. dsRNAs viraler Abstammung werden zu primären siRNAs zerschnitten und initiieren lokales Silencing. Durch das Schneiden von siRNA-Zielen, wird die Produktion sekundärer siRNAs gefördert und die antivirale Antwort systemisch in der Pflanze verbreitet (Parent et al., 2012). Doch auch endogene miRNAs tragen zur Abwehr von Pathogenen bei, wie beispielsweise die miR393 bei einem Befall von Bakterien. miR393 ist an der Regulation von Auxin beteiligt. Um die gesamte Energie in die Abwehr des Pathogens investieren zu können, wird so das pflanzliche Wachstum herunterreguliert (Navarro et al., 2006). Andererseits sind miRNAs an der Ausbildung der Symbiose mit arbuskulären Mykorrhizapilzen in der Wurzel beteiligt (Devers et al., 2011). Doch auch für die Entwicklung der Pflanze sind sRNAs wichtig, beispielsweise schon bei der embryonalen Teilung und der Meiose (Borges & Martienssen, 2015). miRNAs besitzen zahlreiche Funktionen, zum Beispiel bei der Regulierung von Phytohormonen, der Immunantwort und Anpassung an biotischen und abiotischen Stress werden durch miRNAs reguliert (Voinnet, 2009).
1.4 Transfer RNAs und ihre Fragmente
tRNAs besitzen etwa eine Größe von 70 – 100 Nukleotiden (Kanai, 2014). Es wird angenommen, dass alle tRNA-Gene von einer „Proto-tRNA“ abstammen (Eigen et al., 1989). Die Sekundärstruktur
erinnert an ein Kleeblatt mit einem Stamm und drei Schleifen, die Tertiärstruktur ist L-förmig und hoch konserviert (Abb. 5). Sie gehören durch ihre Struktur und aufgrund zahlreicher Modifikationen zu den stabilsten RNAs in der Zelle (Gebetsberger & Polacek, 2013) Noch bevor tRNAs überhaupt entdeckt wurden, hat Crick (1958) ein mögliches Intermediat aus RNA und Aminosäure vermutet, dass an der Proteinbiosynthese beteiligt ist. Neue Studien zeigen, dass die ursprüngliche Funktion von tRNAs, den Transport von Aminosäuren aus dem Cytoplasma zum Ribosom zu vermitteln, wo die Bildung der Polypeptidkette zur Proteinsynthese stattfindet, nicht die einzige wichtige Funktion von tRNAs ist. Sie besitzen sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten die Fähigkeit Genexpression zu regulieren (Raina & Ibba, 2014). Unbeladene tRNAs können auch zur Regulierung der Translation führen (Lee & Collins, 2005). Eine unbeladene tRNA kann zu einer Aktivierung der Kinase Gcn2p führen, wodurch wiederum die Phosphorylierung von eIF2 erfolgt. Dadurch wird die selektive Expression von Genen, die bei Aminosäuremangel wichtig sind, gefördert. Aminoacylierte tRNAs sind außerdem an der Ausbildung nicht-ribosomaler Peptidbindungen, post-translationaler Proteinmarkierung und der Modifikation von Phospholipiden in der Zellmembran beteiligt (Raina & Ibba, 2014). Die neueste Entdeckung war darüber hinaus das Vorkommen von tRNA-abgeleiteten Fragmenten, die ebenfalls regulatorische Funktionen besitzen und in einer Vielzahl von Organismen identifiziert wurden, darunter auch Pflanzen (Haiser et al., 2008; Zhang et al., 2009; Sobala & Hutvagner, 2011).
1.4.1 tRNAs und ihre Funktion in der Proteinbiosynthese
tRNAs sind wichtig für die Entschlüsselung des genetischen Codes. Sie übersetzen die mRNA-Sequenz in Polypeptidketten, indem sie Basentriplets mit Hilfe des Anticodons erkennt. Das Anticodon der passenden, mit einer Aminosäure beladenen tRNA, bindet an das sogenannte Codon, wodurch eine Polypeptidkette mit Hilfe vieler beteiligter Enzyme und Komplexe gebildet wird. Verschiedene Organismen besitzen unterschiedlich viele tRNA-Gene (tDNAs) in ihrem Genom. Eukaryoten besitzen zusätzlich zu tDNAs im Zellkern auch mitochondriale und plastidäre tDNAs. Pflanzen zum Beispiel die chloroplastidären tDNAs. Plastidäre tDNAs bilden häufig Operons, ähnlich wie in Prokaryoten. Außerdem gibt es tRNA Isodecoder, die dasselbe Anticodon besitzen, also tRNAs, deren Primärstruktur jedoch Unterschiede aufweist und Isoakzeptoren, die unterschiedliche Anticodons besitzen aber mit der gleichen Aminosäure beladen sind (Michaud et al., 2011). In Abb. 5 sieht man den Akzeptorstamm und die drei Schleifen, Dihydrouracil- (D) Schleife, Anticodonschleife und die Pseudouridin (TΨC)-Schleife und eine variable Schleife der typischen tRNA-Sekundärstruktur. Die Herstellung gereifter tRNAs ist sehr komplex und die meisten Erkenntnisse wurden durch Versuche mit Hefe generiert.
Nukleare tRNA Gene werden durch die Polymerase III (Pol III) transkribiert. Dabei scheinen in Pflanzen AT-reiche Regionen und TATA-ähnliche Sequenzen sowie CAA als Transkriptionsinitiationsstelle wichtig zu sein (Yukawa et al., 2000). Mindestens vier Ts nacheinander
signalisieren die Termination von Pol III (Dieci et al., 2007). Nach der Transkription der Vorläufer-tRNA (pre-Vorläufer-tRNA) im Zellkern folgen einige posttranskriptionelle Prozessierungsschritte. Pre-Vorläufer-tRNAs enthalten zusätzliche Sequenzen, am 5´-Ende die Leadersequenz, am 3´-Ende die Trailersequenz. Die Endonuklease RNase P entfernt zunächst die 5´-Leadersequenz, dann wird das 3´-Ende prozessiert, wobei eine Exo- und eine Endonuklease daran beteiligt sind den Trailer zu entfernen. Schließlich wird das 3´-terminale CCA angehängt, welches für die Aminoacylierung nötig ist. Dies geschieht in S. cerevisiae durch das Enzym Cca1, das sein Substrat anhand des Akzeptorstamms erkennt (Hopper, 2013). Einige tRNA-Gene besitzen außerdem Introns. In Pflanzen sind diese aber eher selten (Michaud et al., 2011). Die tRNA Exon-Ligation ist in S. cerevisiae und Pflanzen sehr ähnlich. Zum Spleißen der Introns wird die tRNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert (Hopper & Nostramo, 2019). In Hefe ist die konservierte Endonuklease SEN (engl., splicing endonuclease) dafür verantwortlich (Trotta et al., 1997). Die tRNA Exons werden durch Rlg1/Trl1 wieder zusammengefügt und ligiert. Die 2´Phosphotransferase Tpt1 entfernt das überschüssige Phosphat an der Spleißverbindung und die tRNA wird anschließend zurück in den Zellkern transportiert (Phizicky & Hopper, 2015; Hopper & Nostramo, 2019).
Abb. 5: Konservierte tRNA Struktur und mögliche tRNA-Modifikationen in Eukaryoten. (A) Die Sekundärstruktur
zeigt die drei Schleifen und den Akzeptorstamm, sowie mögliche Modifikationen. Die Kreise stehen für Nukleotide, wenn sie rosa ausgefüllt sind, sind mögliche Modifikationen vorhanden. Das Anticodon befindet sich bei den Nukleotiden 34-36. Die Linien zwischen den Nukleotiden bedeuten Basenpaarungen. Nicht alle der Modifikationen wurden auch in Pflanzen gezeigt. Exponent und Index geben die Position der Substitution bzw. die Anzahl an, m22G bedeutet daher
2-Dimethylguanosin. Cm ist 2´-O-Methylcytidin, für Um und Gm wird das entsprechende Nucleosid verwendet. m, c, n, o, t, i und s sind die Abkürzungen für Methyl-, Carbon-, Amino-, Oxy-, Threonin-, Isopentenyl- und Thiogruppen. Weitere Abkürzungen: D, Dihydrouridin; I, Inosin; Ψ, Pseudouridin; Q, Queuosin; τ, Taurin; Y, Nukleosid der Peroxybase. In Anlehnung an Chen et al. (2010). (B) In der L-förmigen tRNA-Tertiärstruktur sind die Position des Anticodonstamms (Anti) mit Anticodon (rot), sowie Akzeptorstamm, D-Stamm und TΨC-Stamm zu sehen. Tertiärstruktur entnommen aus Li et al. (2015).
Die Modifizierung von tRNAs passiert während der gesamten Reifung der tRNA und überall dort, wo tRNAs vorkommen. Im Zellkern genauso wie im Zytoplasma (Spears et al., 2012). Es gibt zahlreiche tRNA-Modifikationen. Einige eukaryotischer tRNAs sind in Abb. 5 dargestellt. Alle Modifikationen leiten sich von den vier Standard-Nukleosiden von RNAs, Adenosin, Uridin, Cytidin und Guanosin, ab. Es gibt einfache Modifikationen, wie beispielsweise eine Methylierung einer Ribose oder einem Basenrest, aber auch welche an verschiedenen Positionen von Seitenketten des Purin- bzw. Pyrimidinrings (Chen et al., 2010). Modifizierte tRNA-Nukleoside sind in allen lebenden Organismen zu finden und einige davon sind konserviert über alle Domänen. Gleiche Modifikationen können innerhalb einer tRNA auch mehr als einmal vorkommen. Sie haben verschiedene Funktionen in Organismen. Sie können die Codon-Anticodon-Interaktion und somit die Codon-Kapazität beeinflussen. Das Fehlen einer Modifikation kann daher zu reduzierter Translationseffizienz führen (Chen et al., 2010). Wie in Hefe gezeigt wurde, werden Modifikationen zudem teilweise zur Unterscheidung von tRNAs genutzt. Für Methionin gibt es die Initiator- und Elongator-tRNA, aufgrund der Ribosylierung von Adenosin in der Initiator-tRNA an der Position 64, interagiert der eukaryotische Elongationsfaktor eEF1α nicht mit dieser (Åström & Byström, 1994). In Mäusen erhöhen tRNA-Methylierungen am Cytosin-C5 durch die Enzyme Dnmt2 und NSun2 die Stabilität von tRNAs (Tuorto et al., 2012). Außerdem gibt es entwicklungsspezifische Änderungen von tRNA-Modifikationen. In Weizen zum Beispiel ist die Anzahl an Wybutosin (wY) in alten Blättern höher als in jungen (Vold & Sypherd, 1968; Shugart, 1972). In Pflanzen wurden bereits einige tRNA-modifizierenden Enzym identifiziert. Durch einen bioinformatischen Ansatz identifizierten Chen et al. (2010) fünf Gene, die in A. thaliana für tRNA-modifizierende Enzyme kodieren, nämlich AtTRM10 (m1G), AtTRM11 (m2G), AtTRM82 (m7G), AtKTI12 (ncm5U) und AtELP1 (ncm5U). Im Zellkern von
Arabidopsis gibt es außerdem zwei konservierte Methyltransferasen, TRDMT1 (AtDnmt2) und TRM4B, die dort für m5C-Methylierungen von tRNAs zuständig sind (Burgess et al., 2015). Im
Gegensatz dazu gibt es in chloroplastidären und mitochondrialen tRNAs von Arabidopsis keine m5
C-Modifikationen. Nicht-modifizierte oder nicht korrekte tRNAs werden mit A-Resten am 3´-Ende markiert und sind somit für den Abbau durch das nukleäre Exosom bestimmt. Sie können auch über den rapid tRNA turnover (RTD) – Weg im Zellkern oder Zytoplasma abgebaut werden (Hopper, 2013).
Nun muss die tRNA mit der passenden Aminosäure beladen werden. Vor dem Export aus dem Zellkern werden tRNAs aminoacyliert (Lund & Dahlberg, 1998). Dies passiert in zwei, durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (aaRS) katalysierten Schritten. aaRS erkennt sein Substrat durch das Anticodon oder Akzeptorstamm, (Lorenz et al., 2017) Für die Aminoacylierung wird die Aminosäure zunächst durch ATP aktiviert, wodurch das Intermediat Aminoacyl-Adenylat (aa-AMP) gebildet wird. Dann wird die Carboxygruppe der aktivierten Aminosäure an das 3´-terminale Adenosin der tRNA durch eine Esterbindung mit der Hydroxylgruppe der terminalen Ribose gebunden (Fujishima & Kanai, 2014).
Nach dem Beladen der tRNA mit der entsprechenden Aminosäure ist sie bereit für ihre hauptsächliche Funktion, nämlich den genetischen Code der mRNA zu entschlüsseln und in eine Polypeptidkette zu translatieren. Die Proteinbiosynthese findet an Ribosomen statt und somit entweder im Zytoplasma oder in Zellorganellen wie Mitochondrien und Chloroplasten. Die Synthese aller Proteine beginnt mit der Aminosäure Methionin. Für die Initiation der Synthese gibt es eine spezielle Methionin-tRNA, die Initiator-tRNA mit dem Anticodon CAU, welches das Startcodon AUG auf der mRNA bindet. Die drei Stoppcodons UAA, UGA und UAG stehen nicht für eine Aminosäure, sondern signalisieren die Termination der Synthese. Prinzipiell ist die pflanzliche Proteinbiosynthese gleich anderer Eukaryoten. Für den Start der Translation in Eukaryoten muss zunächst das 80S Ribosom gebildet werden. Dafür werden die 40S und 60S Untereinheiten (UE) und einige eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs) benötigt. Die aa-tRNAi bindet an die P-Stelle der 40S Untereinheit, bildet dann die Basenpaarung mit dem Startcodon der mRNA aus und dann nach Bindung der 60S Untereinheit ein funktionelles Ribosom (reviewed in Dutt et al., 2015). Die Initiation startet mit der Trennung eines bestehenden Ribosoms nach der Termination, was hauptsächlich durch eIF3 vermittelt wird. eIF3 und zwei weitere eIFs (eIF1 und eIF1A) sind an der 40S UE gebunden und verhindern die Reassoziierung mit der 60S UE. Dann bindet der Komplex eIF2-GTP-Met-tRNAi an die 40S UE und bildet den 43S Pre-Initiationskomplex (PIC). eIF2 ist dann dafür zuständig die richtige Initiator-tRNA auszuwählen und zum Ribosom zu bringen. Der 43S PIC bindet an die 5´UTR der mRNA, wobei hauptsächlich eIF4F für die Bindung der mRNA nötig ist, und bildet so den 48S PIC. Die mRNA wird abgescannt, eIF1 stößt dabei nicht-AUG-Codons ab und kann fälschlich gebundene ribosomale Komplexe entfernen. Auch eIF3 spielt beim Scannen der mRNA eine Rolle. Nachdem das Startcodon gefunden wurde, paaren sich die Basen des Startcodons mit dem Anticodon der tRNA und die gebundenen eIFs werden mit Hilfe von eIF5B entfernt. Auch bei der anschließenden Bindung von 40S und 60S UE ist eIF5B wichtig (Dutt et al., 2015).
Nach der Initiation der Translation folgt die Elongation. Das zweite Codon befindet sich in der Aminoacyl–Stelle (A-Stelle) des Ribosoms, wo die nächste passende aa-tRNA bindet. Der eukaryotische Elongationsfaktors eEF1A bindet Guanosintriphosphat- (GTP) abhängig die passende Aminoacyl-tRNA und befördert sie zur Stelle A des Ribosoms (reviewed in Dever & Green, 2012). Die A-Stelle des Ribosoms ist die Eintrittsstelle für geladene tRNAs in das Ribosom. Durch die Erkennung des Codons durch die tRNA wird GTP hydrolysiert und eEF1A entlassen, sodass die aa-tRNA binden kann. Nun wird die Aminosäure der aa-tRNA an der Peptidyl-Stelle (P-Stelle) des Ribosoms durch eine Peptidbindung mit der Aminosäure der tRNA in der A-Stelle verbunden. Die entladene tRNA der A-Stelle wird nun auf die Exit-Stelle (E-Stelle) verschoben, die tRNA mit der wachsenden Peptidkette wird auf die A-Stelle geschoben. Dies wird durch die Bindung des eEF2 GTP-abhängig vermittelt. Dann beginnt ein neuer Zyklus, wobei die entladene tRNA an der E-Stelle aus dem Ribosom entlassen wird (Dever & Green, 2012).
Wenn das Ende der kodierenden Sequenz der mRNA erreicht ist, folgt die Termination der Translation, wenn das eines der Stoppcodons die A-Stelle im Ribosom erreicht. Dabei erfüllen die beiden Proteinfaktoren eRF1 und eRF3 (engl., eukaryotic release factor) wichtige Funktionen. eRF1 ist für die hochgradige Erkennung des Stoppcodons zuständig, eRF3 beschleunigt GTP-abhängig die Entlassung des Peptids und erhöht die Terminationseffizienz (Dever & Green, 2012).
1.4.2 tRNA Hälften
tRNA Hälften sind eine relativ neu entdeckte Klasse regulatorischer RNAs, die sich von Transfer-RNAs ableiten. Das Schneiden von tTransfer-RNAs in der Anticodon-Schleife wurde erstmals von Levitz et al. (1990) in E. coli gezeigt. Dort schneidet die PrrC Endonuklease tRNA als Antwort auf eine T4-Phagen-Infektion, um die Translation zu reduzieren und somit die Verbreitung des Virus zu einzudämmen. Dennoch wurden die tRNA-Fragmente zunächst lange nicht beachtet und als Degradationsprodukte angesehen. Erst etwa 15 Jahre später sind einige Forscher wieder auf sie aufmerksam geworden, nachdem auch die Relevanz zahlreicher anderer sRNAs erkannt wurde. Seitdem sind sie intensiv erforscht worden. Dabei wurden verschiedene tRNA-Fragmente sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten identifiziert (Lee & Collins, 2005; Thompson & Parker, 2009b; Yamasaki et al., 2009; Zhang et al., 2009). Kleinere tRNA-Fragmente, die durch Schneiden in der D- oder TΨC-Schleife entstehen, besitzen eine Größe von etwa 18-22 Nt (Dhahbi, 2015). tRNA-Hälften entstehen durch spezifisches Schneiden in der Anticodon-Schleife, wobei 5´Hälften mit einer Länge von etwa 30-35 Nt und 3´Hälften mit einer Länge von etwa 40-50 Nt entstehen (Anderson & Ivanov, 2014). Da die Entdeckung von tRNA Fragmenten und Hälften noch sehr neu ist, gibt es noch keine einheitliche Bezeichnung. So werden beispielsweise stressinduzierte tRNA-Hälften häufig tiRNAs genannt, in dieser Arbeit werden jedoch alle tRNA-Hälften als tRHs abgekürzt, kürzere Fragmente werden als tRFs abgekürzt und 5´bzw 3´ der Hälfte entsprechend als Präfix angefügt.
tRHs kommen in sehr vielen verschiedenen Organismen vor, wie beispielsweise Hefe, Bakterien, dem Einzeller T. thermophila, in humanen Zelllinien und in Pflanzen (Thompson et al., 2008; Thompson & Parker, 2009a; Zhang et al., 2009; Andersen & Collins, 2012). Sie können von der 5´- und 3´-Seite einer tRNA stammen und entstehen durch spezifisches Schneiden in der Anticodon-Schleife durch eine Endoribonuklease. Typischerweise werden gereifte tRNAs zu funktionalen Hälften geschnitten, sie besitzen also zahlreiche Modifikationen, kein Intron, prozessierte 5´- und 3´- Enden und am 3´- Ende einen CCA-Anhang (Gebetsberger & Polacek, 2013). Die Entstehung von tRHs erfolgt oft unter verschiedenen Stressbedingungen, sie kommen aber auch unter Normalbedingungen vor. In dem Bakterium Streptomyces coelicolor wird die Produktion von tRHs bei Änderungen der Entwicklung oder Ernährung induziert (Haiser et al., 2008). Eine entwicklungsspezifische Akkumulation von tRHs wurde ebenfalls in dem Pilz Aspergillus fumigatus durch eine Transkriptomanalyse beobachtet (Joechl et al., 2008). Aminosäuremangel führte in Tetrahymena thermophila zur Akkumulation von tRHs, dies passiert schon als frühe Reaktion auf den Stress (Lee & Collins, 2005). Das Schneiden von tRNA
scheint bei oxidativem Stress in Eukaryoten konserviert zu sein. In S. cerevisiae wurden gehäuft tRHs unter Oxidationsstress gefunden, genauso wie in humanen Zelllinien und in Arabidopsis (Thompson et al., 2008). In humanen U2OS Zellen wurde zusätzlich zum Oxidationsstress außerdem gezeigt, dass Hitzeschock und UV-Behandlung die Bildung von tRHs induziert (Yamasaki et al., 2009). Darüber hinaus wurden sie in Nierenkarzinomzellen (engl., renal cell carcinoma, RCC) identifiziert. Die 5´Hälfte von tRNA-Val(AAC) ist in diesen Zellen im Vergleich zu normalen Nierenzellen herunterreguliert (log2-FC von -6,7), was mit einem fortgeschrittenen Stadium und Grad des Karzinoms korrelierte (Nientiedt et al., 2016). In Arabidopsis wurden unter Phosphatstress ebenfalls tRHs vorwiegend in Wurzeln gefunden (Hsieh et al., 2009). Stressunabhängig kommen sie dagegen im Phloem von Riesenkürbis vor, aber auch schwach in Blüten und Keimlingen (Thompson et al., 2008; Zhang et al., 2009).
tRHs konnten also unter verschiedenen Bedingungen und in vielen unterschiedlichen Organismen gefunden werden und auch einige Hinweise auf biologische Auswirkungen und Funktionen wurden bereits gezeigt, sowie einige putativ verantwortlichen Endoribonukleasen. Eine Übersicht von Gebetsberger & Polacek (2013), einiger bereits analysierter tRNA Fragmente und Hälften, ist in Abb. 6 zu sehen. Hier ist außerdem zu erkennen, dass auch aus pre-tRNAs kleinere regulatorische RNAs generiert werden können. Dass tRHs in der Lage sind die Translation zu regulieren, wurde schon an
Abb. 6: Identifizierte tRNA Fragmente und Hälften verschiedener Organismen. Sowohl aus Schneiden von Vorläufer-
als auch gereifter tRNAs können Fragmente resultieren. Nuklease bei denen eine Beteiligung am Schneiden gezeigt oder vermutet wird, sind in blau geschrieben. Kleine tRNA Fragmente sind in rot geschrieben. Außerdem sind mögliche Ziele und Funktionen der tRHs und tRFs angegeben. Abbildung entnommen aus Gebetsberger & Polacek (2013).
einigen Beispielen gezeigt. Unter oxidativem Stress wird Angiogenin (ANG), die zur Familie der RNase A gehört, in U2OS-Zellen vom Zellkern in das Zytoplasma sekretiert (Yamasaki et al., 2009). Im Zytoplasma kommt sie normalerweise nur gebunden an den Inhibitor RNH1 vor, unter Stress wird dieser aber dissoziiert und ANG ist somit in der Lage tRNAs zu schneiden (Yamasaki et al., 2009). 5´tRHs von tRNA-Ala und tRNA-Cys, jedoch keine 3´tRHs, können die Translation in humanen Zellkulturen inhibieren. Dies wurde gezeigt, indem isolierte endogene tRHs zu U2OS-Zellkulturen gegeben wurden (Emara et al., 2010). 5´tRHs arbeiten mit dem translationalen Repressor YB-1 (engl., Y-Box binding protein 1) zusammen, um den an das 5´-Cap gebundenen eIF4F-Komplex von der mRNA zu entfernen. Dabei bilden tRHs G-Quadruplex (G4)-Strukturen aus, die für die Inhibierung wichtig sind. Zudem können sie die Bildung von Stresspartikeln (engl., stress granule, SG) initiieren (Ivanov et al., 2014). Dabei handelt es sich um Aggregationen aus RNA-Bindeproteinen, Translations-Initiationsfaktoren, Teilen ribosomaler UEs und mRNAs (Wolozin, 2012). Dass tRHs die Translation inhibieren können, wurde auch für pflanzliche tRHs im Kürbis gezeigt (Zhang et al., 2009). Weiterhin wurde für tRHs in Drosophila melanogaster gezeigt, dass sie indirekt RNA Interferenz beeinflussen Sie können bei Hitzestress als Substrat für Dicer-2 (Dcr-2) dienen, das normalerweise durch Schneiden von langen dsRNAs siRNAs generiert. Bei Hitzestress wurden vermehrt tRNA Hälften detektiert. Der Grund für das vermehrte Schneiden von tRNAs und tRHs könnte sein, dass sie bei Hitze (oder auch anderen Stressarten) weniger stabil sind, wobei die Modifikationen durch Dnmt2 eine Rolle spielen (Durdevic et al., 2013). tRHs können sogar generationsübergreifend Informationen weiterleiten, wie in Mausspermien gezeigt wurde. In Mausspermien konnten tRNA Fragmente/Hälften zwischen 28 und 34 Nt identifiziert werden, die bei einer Proteinmangelernährung auf das zwei bis dreifach hochreguliert waren. Darunter 5´Hälften/Fragmente von Gly(CCC), Gly(UCC) und Gly(GCC), sowie Lys(CUU) und His(GUG). Sie übertragen dabei Informationen der Mangelernährung des Vaters auf die nachkommende Generation, indem spezifische tRNA Fragmente in den Spermienkopf transportiert werden. Es wurde gezeigt, dass die unter Mangelernährung regulierte tRF-Gly(GCC) aus Sperma die Expression des Retroelements MERVL im Embryo behindern oder unterdrücken kann. Die Regulation von MERVL wiederum führt zu metabolischen Veränderungen in den Nachkommen. tRNA Fragmente/Hälften können somit über die Regulierung des Sperma-Epigenoms Informationen über die Ernährung vom Vater auf den Nachkommen übertragen (Sharma et al., 2015).
Für tRFs konnte sogar eine miRNA-ähnliche Funktion beobachtet werden. Wie auch in Abb. 6 zu sehen ist, werden tRFs häufig Dicer-abhängig generiert und zu 18-22 Nt großen Fragmenten geschnitten (Cole et al., 2009; Hasler et al., 2016). In Arabidopsis wurde gezeigt, dass DCL1 tRFs generieren kann, die dann anschließend mit AGO1 assemblieren und so endogene Transposon mRNA ansteuern, um sie abzubauen (Martinez et al., 2017). Auch bei der Biogenese von Ribosomen sind kleine tRFs beteiligt (Kim et al., 2017). Eine Inhibierung einer Leu(CAG) 3´tRF führte, aufgrund reduzierter Ausbildung der 40S ribosomalen, UE zu Apoptose, da diese tRFs zwei ribosomale mRNAs
binden kann, wodurch deren Translation erhöht wird (Kim et al., 2017). tRHs und tRFs scheinen also als regulatorische RNAs wichtige Aufgaben in verschiedenen Organismen zu übernehmen. Einheitliche Funktionen und Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt.
Die für die Biogenese verantwortlichen RNasen wurden dagegen in vielen Organismen bereits identifiziert. Für Bakterien wurden drei Endoribonukleasen identifiziert, die tRNAs im Anticodon schneiden, darunter PrrC und Colicin D und E5 (Levitz et al., 1990; Masaki & Ogawa, 2002). Des Weiteren ist in Hefe die T2 RNase Rny1p und ANG in höheren Eukaryoten für das Schneiden von tRNAs in der Anticodon-Schleife zuständig (Fu et al., 2009; Thompson & Parker, 2009b). Die RNase in Pflanzen war jedoch zu Beginn dieser Arbeit unbekannt. Ein Homolog zu Angiogenin gibt es jedoch in Pflanzen nicht, zur T2 RNase Rny1p sind jedoch Homologe in Pflanzen zu finden. Im Laufe der Arbeit wurden einige Hinweise zur Beteiligung der T2 RNasen in der pflanzlichen Biogenese von tRHs veröffentlicht (Megel et al., 2018). Diese Arbeitsgruppe zeigte, dass die T2 RNasen RNS1, RNS2 und RNS3 essenziell für die Produktion von tRHs und tRFs sind, pflanzliche DCLs jedoch nicht.
1.5 T2 RNasen in Pflanzen
RNasen der T2 Familie kommen neben Pflanzen in fast allen Organismen vor, wie beispielsweise Bakterien, Tieren, Viren und Protozoen (Luhtala & Parker, 2010). Ribonukleasen der T2 Familie gehören zu den sauren Endonukleasen und besitzen keine Basenspezifität (Irie, 1999). Der optimale pH-Wert für ihre RNase-Aktivität liegt meist zwischen 4 und 5 (Deshpande & Shankar, 2002). Anhand verschiedener Kristallstrukturen von Mitgliedern der T2 Familie aus Bakterien, Pflanzen, Menschen und Pilzen lässt sich eine konservierte α/β-Struktur erkennen (Tanaka et al., 2000; Padmanabhan et al., 2001; Luhtala & Parker, 2010; Thorn et al., 2012). Abb. 5A zeigt die Tertiärstruktur einer T2 RNase aus Rhizopus niveus. Die Abbildung wurde aus dem Review von Luhtala & Parker (2010) entnommen. Die Struktur zeigt die typische Faltung der Familie mit sieben α-Helices und acht β-Strängen, die vier antiparallele Faltblätter bilden. Pflanzliche T2 RNasen besitzen vier Cysteinreste, die Disulfidbrücken bilden (Deshpande & Shankar, 2002). B1 und B2 geben außerdem die Regionen an, die von Nukleotiden besetzt werden können (Luhtala & Parker, 2010). Neben der Struktur zeigt die Abbildung den katalysierten Reaktionsmechanismus (Abb. 5B). Für die Reaktion sind die konservierten Sequenzen von CASI und CASII mit den dort lokalisierten Histidinen entscheidend. Die Katalyse läuft in zwei Schritten ab, im ersten Schritt agiert ein Histidin (H46, nummeriert nach R. niveus) als Säure, das andere Histidin entsprechend als Base (H109, nummeriert nach R. niveus). Es wird ein 2´-3´zyklisches Phosphat als Intermediat gebildet. Im nächsten Schritt, der Hydrolyse, tauschen die Histidine ihre Rolle in der Katalyse, sodass H46 als Base agiert. Unter Verbrauch von H2O entstehen Mono- oder Oligonukleotide mit einem 3´-terminalen Phosphat
Das Arabidopsis-Genom kodiert fünf T2 RNasen. Während RNS1, RNS2 und RNS3 schon teilweise untersucht sind, gibt es kaum Informationen zu RNS4 und RNS5. Phylogenetisch werden sie in drei Klassen unterteilt. Klasse I beinhaltet sehr diverse Proteine, die meist Gewebe- und/oder Stress-spezifisch reguliert sind, dazu gehören RNS1 und RNS3, RNS4 und RNS5. Die Klasse II enthält RNasen, die in Pflanzen hochkonserviert sind, und in fast allen Geweben stark exprimiert werden, dazu gehört RNS2 (MacIntosh et al., 2010). Zur Klasse III gehören überwiegend S-RNasen, also RNasen, die in gametophytischer Selbstinkompatibilität involviert sind (Hua et al., 2008).
Ein Überblick über die fünf Arabidopsis-RNasen der T2 Familie ist in Tab. 1 zu sehen. Für einige der RNasen wurde eine Regulation bei Stress festgestellt. Die Genexpression von RNS1 wird durch Wundstress und das Phytohormon Abszisinsäure (ABA) induziert (Hillwig et al., 2008). Weiterhin konnte starke Akkumulierung von Anthocyanin festgestellt werden, wenn RNS1 und RNS2 inhibiert waren, dies lässt auf eine Beteiligung bei Phosphatmangel schließen (Bariola et al., 1999). Dies wird auch unterstützt durch die Beobachtung, dass RNS1 Transkripte bei Mangel von anorganischem Phosphat stark induziert ist, das RNS3-Level ist gleichgeblieben, wie anhand von Northern Blots gezeigt wurde. Zudem wurde die Expression von RNS1 und RNS3 leicht bei Seneszenz in Blättern induziert (Bariola et al., 1994). Mittels Antikörpern wurde gezeigt, dass RNS1 sekretiert wird, RNS2 dagegen intrazellulär ist. Aufgrund der N-terminalen sekretorischen Sequenz wird auch für RNS3 ein sekretorischer Weg angenommen. RNS2 enthält dagegen Sequenz am C-Terminus,
die ein Signal für die Vakuole darstellen könnte (Bariola et al., 1999). Außerdem wurde eine Lokalisation am endoplasmatischen Retikulum und davon abgeleiteten Kompartimenten beobachtet und dazu passend eine Beteiligung an dem Recycling von ribosomaler RNA (Hillwig et al., 2011).
Abb. 7: Struktur und katalytische Aktivität der T2 Familie RNasen. (A) Die Tertiärstruktur der Rh-RNase aus dem Pilz
Rhizonus niveus zeigt neben, sieben α-Helices und acht β-Strängen, die konservierten die Positionen von CASI (dunkelrot) und CASII (hellrot). Die Nukleotidbindestellen sind gelb (B1) bzw. blau (B2) markiert. Bei Überschneidungen sind die Stellen orange (B1) bzw. lila (B2). (B) Es sind die beiden Reaktionsschritte der RNase-Katalyse, die Transphosphorylierung und Hydrolyse, gezeigt. Die beiden beteiligten Histidine sind entsprechend orange und lila gefärbt. Abbildung entnommen aus Luhtala & Parker (2010).
