Die Anzucht von Arabidopsis thaliana erfolgte auf einem Gemisch bestehend aus 65 % Erde, 25 % Sand und 10 % Blähton in Töpfen mit einem Durchmesser von 10 cm. Nach der Stratifikation für zwei Tage bei 4 °C im Dunkeln, wurden die Pflanzen in einer Phytokammer unter Langtagbedingungen (16 h Licht/8 h Dunkelheit) bei 22 °C, 100 µmol s-1 m-2 und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit angezogen.
2.3.2 Kultivierung von B. napus auf Erde
Die verwendeten Brassica napus Versuchspflanzen wurden in Töpfen mit einem Durchmesser von 18 cm und einem Erde-Sand-Gemisch (Einheitserde, Uetersen) im Verhältnis 3:1 angezogen. Sie wurden unter Langtagbedingungen, bei 25 °C und 70 % relativer Luftfeuchte wachsen gelassen.
2.3.3 Gewinnung von Phloemsaft aus B. napus
Das Sammeln von Phloemsaft aus Brassica napus erfolgte wie bereits von Giavalisco et al. (2006) beschrieben. Es wurden Pflanzen an der Infloreszenz mehrfach mit einer sterilen Einmalkanüle (B.
Braun, G 21 x 1"/ø 0,80 x 25 mm) angestochen, deren Blüten kurz vor der Öffnung waren. Der erste Tropfen wurde verworfen, da dieser Kontaminationen, wie z.B. Zellreste, enthält. Alle weiteren Tropfen wurden mit Hilfe einer Pipette mit nukleasefreien Filterspitzen aufgenommen und in einem nukleasefreien 2,0 ml Reaktionsgefäß auf Eis gesammelt. Bis zur Verwendung wurde der Phloemsaft bei -80 °C gelagert.
2.3.4 Trockenstressversuche mit B. napus
Um Phloemsaftproben von trockengestressten Pflanzen zu erhalten, wurden die Rapspflanzen solange wachsen gelassen, dass die Entwicklung der Knospen bereits begonnen hat. Die Pflanzen wurden ab
dem Zeitpunkt für 3 Tage nicht bewässert und anschließend der Phloemsaft gesammelt (siehe Abschnitt.2.3.3).
Die Proben wurden von zwei bis drei Pflanzen gepoolt, um genügend Material für eine RNA Isolation zu erhalten. Die Isolation der kleinen RNA erfolgte dann wie in Abschnitt 2.4.3 beschrieben.
2.3.5 Oberflächensterilisation von A. thaliana-Samen
Für die Sterilisation der Arabidopsis thaliana Samen wurden etwa 100 Samen in ein 2,0 ml Reaktionsgefäß überführt, 1 ml 70 % [v/v] Ethanol zugegeben, gemischt und für höchstens zwei Minuten darin inkubiert. Dann wurden die Samen kurz in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert und das Ethanol abgenommen. Ab diesem Schritt wurde steril gearbeitet. Es wurde eine sterile und wässrige Bleichlösung (2,6 %-iges Natriumhypochlorit, 0,1 % Triton X-100) zu den Samen gegeben. Um alle Samen mit der Bleichlösung in Kontakt zu halten, wurde zunächst das Reaktionsgefäß mehrfach invertiert und anschließend in einem Thermoschüttler für 15 Minuten inkubiert. Die Bleichlösung wurde dann verworfen und die Samen solange mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen, bis kein Schaum durch das Detergens mehr entstand, mindestens jedoch drei Mal mit ca. 2 ml Wasser. Die Samen wurden lichtgeschützt bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
2.3.6 Kultivierung von A. thaliana auf Festmedium
Die Kultivierung von Arabidopsis auf Festmedium erfolgte auf 1/2 MS-Medium mit 0,68 % Agar, basierend auf dem Protokoll von Murashige und Skoog (1962). Sterile Samen wurden auf Petrischalen mit 1/2 MS-Medium ausgelegt und unter Langtagbedingungen (16 h Licht/ 8 h Dunkelheit) mit 100 µmol s-1 m-2 Licht und bei 22 °C angezogen.
2.3.7 Kreuzen von Mutanten zur Erstellung von Doppelmutanten
Zur Generierung von Doppelmutanten wurden die T-DNA Insertionslinien FLAG_566A08 (rns1), SALK_069588 (rns2) und FLAG_164A04 (rns3) miteinander gekreuzt. Dazu wurden die Pflanzen bis zur Bildung von Blüten angezogen. Für den weiblichen Elter wurden noch vollständig geschlossene, unbefruchtete Blüten ausgewählt und die Blüte mit einer Pinzette vorsichtig geöffnet. Alle Stamina wurden mit Hilfe der Pinzette entfernt, sowie umliegende Blüten, um eine Selbstbestäubung zu verhindern. Väterliche Pollen einer geöffneten Blüte wurden dann auf den Stempel der Mutterpflanze übertragen. Durch das Schließen der Kronblätter wurde der Stempel dann geschützt, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Schotenentwicklung zu erhöhen. Es wurde jeweils in beide Richtungen gekreuzt und die Samen der Schoten nach der Reifung geerntet. Diese Samen wurden wiederum ausgesät und die Pflanzen der ersten Tochtergeneration (F1) mittels PCR auf doppelt Heterozygote gescreent (siehe 2.3.8), die entsprechenden Samen geerntet und die zweite Tochtergeneration (F2) auf doppelt Homozygote untersucht.
2.3.8 Genotypisierung der T-DNA Insertionslinien
Nach dem Kreuzen der T-DNA Insertionsmutanten mussten zunächst doppelt heterozygote Pflanzen der F1 und später doppelt Homozygote der F2 identifiziert werden. Dazu wurde zunächst gDNA aus Blattmaterial gewonnen (siehe 2.4.1) und anschließend einer PCR eingesetzt. Für den Nachweis waren pro Gen zwei Primerpaare notwendig (siehe Tab. 5).
Der Nachweis der T-DNA Insertion erfolgte unter der Verwendung eines Primers spezifisch für die linke Grenze der T-DNA Insertion (LB) und einem genspezifischen Primer (RP), welcher im flankierenden Bereich (FST = engl. Flanking Sequnece Tags) liegt. Das Wildtypgen wurde mit Hilfe zweier genspezifischer Primer (LP und RP) nachgewiesen. Die PCRs erfolgten mit der Taq DNA-Polymerase und wurden, wie in Abschnitt 2.4.8 beschrieben, durchgeführt. Die verwendete Annealing Temperatur betrug bei allen Primerpaaren 54 °C. Die Primerkombinationen sind in
Tab. 5 dargestellt und die Sequenzen befinden sich im Anhang (siehe Abschnitt 8.1).
Tab. 5: Übersicht der verwendeten Primerpaare für die Genotypisierung.
Zielsequenz Primer 1 Primer 2
AtRNS1 FLAG_566A08_LP FLAG_566A08_RP
T-DNA AtRNS1 Tag5_FLAG_LB FLAG_566A08_RP
AtRNS2 RNS2_SALK_069588_LP SALK_069588_RP
T-DNA AtRNS2 T-DNA LBb1.3 SALK_069588_RP
AtRNS3 FLAG_164A04_LP FLAG_164A04_RP
T-DNA AtRNS3 Tag5_FLAG_LB FLAG_164A04_RP
2.3.9 Lokalisation von T-DNA Insertionen
Um die exakte Insertionsstelle der inserierten T-DNA zu identifizieren, wurde zunächst genomische DNA aus Blattmaterial der Mutanten rns1, rns2 und rns3 isoliert (siehe Abschnitt 2.4.1).
Anschließend wurden die interessanten Genabschnitte mittels PCR amplifiziert, wobei jeweils 2 µl der isolierten gDNA eingesetzt wurden. Unter Verwendung der Taq DNA-Polymerase (Thermo Fisher Scientific) wurde ein 20 µl Ansatz nach Herstellerangaben angesetzt (siehe Abschnitt 2.4.8). Die Anlagerungstemperatur des PCR-Programms betrug 54 °C. Die Primer wurden so gewählt, dass ein Primer im Gen liegt und der zweite Primer in der Left Border der T-DNA, sodass der Übergang von Gen und DNA sequenziert wurde. In Tab. 6 sind die verwendeten Primer und die zugehörigen T-DNA Insertionsmutanten angegeben. Die Primersequenzen befinden sich im Anhang in Tab. A 1.
Tab. 6: Verwendete Primer und dazugehörige Arabidopsis Pflanzen.
T-DNA Insertionsmutante Forward Primer Reverse Primer
rns1 Tag5_FLAG_LB FLAG_566A08_RP
rns2 T-DNA LBb1.3 SALK_069588_RP
rns3 Tag5_FLAG_LB FLAG_164A04_RP
2.3.10 Phänotypische Analysen
2.3.10.1 Präparation und mikroskopische Untersuchung von Keimblättern
Um die Vaskulatur von Keimblättern zu untersuchen, wurden Arabidopsis-Keimlinge auf Festmedium steril angezogen (siehe Abschnitt 2.3.6) und die Keimblätter von etwa 7 Tage alten Arabidopsis-Keimlingen mit Hilfe einer Pinzette gesammelt. Die Blätter wurden für ein paar Stunden bis zu über Nacht in Ethanol:Essigsäure (50:50) eingelegt, bis sie entfärbt waren. Die Blätter wurden dann mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen und auf einen Objektträger in 50 % [w/v] Glycerol gelegt. Es wurde ein Deckgläschen daraufgelegt und mit Nagellack versiegelt, für eine längere Konservierung der Keimblätter.
Die mikroskopischen Aufnahmen erfolgten an dem Makroskop Olympus MVX10 (Olympus Life Science, Japan). Es wurden mindestens vier biologische Replikate mit mehr als 180 Keimblättern analysiert und Komplexitätsstufen nach Stanko et al. (2014) zugeordnet. Dabei wurden die Wildtypen (Col-0 und Ws-4), sowie die Einzel- und Doppelmutanten (rns1, rns2, rns3, rns1rns2, rns1rns3, rns2rns3) untersucht und verglichen.
Tab. 7: Übersicht der hinsichtlich der vaskulären Komplexität untersuchten Keimblätter.
Pflanze Gesamtheit untersuchter
Keimblätter Technische Replikate
Col-0 1150 14
Ws-4 764 9
rns1 511 9
rns2 462 7
rns3 676 8
rns1rns2 187 4
rns1rns3 581 5
rns2rns3 664 8
Für die Auswertung wurde das Statistikprogramm IBM SPSS Statistics Version 26 verwendet. Mittels des Shapiro-Wilk-Tests wurde zunächst getestet, ob die nominalskalierten Daten normalverteilt sind.
Zudem wurde durch den Levene-Test untersucht, ob eine Homogenität der Varianzen vorliegt. Da beides nicht der Fall war, konnte keine Varianzanalyse durchgeführt werden. Deshalb wurde der nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Test verwendet, um zu überprüfen, ob sich die zentralen Tendenzen mehrerer unabhängiger Stichproben signifikante unterscheiden. Mit dem Post-Hoc-Test wurde dann ermittelt, wo die Unterschiede liegen.
2.3.10.2 3D Imaging zur Analyse der Hyponastie und des Expansionswachstums
Diese Versuche und die Auswertung wurden von unseren Kooperationspartnern am Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie in Golm durchgeführt (Dr. F. Appelt, AG Kragler). Mit
Hilfe eines Hochdurchsatz-Imagingsystems wird das Expansionswachstum, also die Zunahme der Blattfläche, räumlich und zeitlich aufgelöst aufgenommen (Apelt et al., 2015). Die Pflanzen wuchsen in dem Wachstumsschrank mit einem Tag-Nacht-Rhythmus von je 12 Stunden., bei 20 °C am Tag und 18 °C bei Nacht und 160 µE. Die Arabidopsis-Mutanten rns1rns2 (n = 13) und rns1rns3 (14 Replikate) wurden zusammen mit dem Ökotyp Ws-4 (n = 11) gemessen, in dem Zeitraum von 12-19 DAS (Tage nach Aussaat; engl., days after sowing.). Die Mutante rns2rns3 (n = 18) wurde zusammen mit Col-0 (n = 16) in dem Zeitraum von 14-24 DAS gemessen. Die Messung beinhaltete die Messung der Hyponastie und der Zunahme der Blattoberfläche von Rosettenblättern (RER: engl., relative expansion rate).