Bestimmung des Expansionswachstum und der Hyponastie von Arabidopsis T2 RNase

Für eine genauere Analyse sollte das Wachstum mittels 3D Imaging untersucht werden. Dies war in Kooperation mit dem MPIMP in Golm möglich (Dr. F. Apelt, AG Kragler). Beim sogenannten Phytotyping^4D wurde die Expansion der Blattoberfläche von Rosettenblättern und die Blattbewegung, also Hyponastie, zeitlich aufgelöst aufgenommen und analysiert (Apelt et al., 2015). Hiermit ist es möglich auch lichtabhängig das Expansionswachstum und die Hyponastie zu messen. Durch Unterschiede in der Kohlenhydratverteilung am Tag und in der Nacht kann es zu Wachstumsunterschieden kommen. Am Tag werden Kohlenhydrate aus der Fotosynthese verwertet, für das nächtliche Wachstum muss auf Kohlenhydratreserven, wie beispielsweise Stärke, zurückgegriffen werden (Smith & Stitt, 2007). Eventuell können die Mutationen der RNasen auch zu einer Änderung der Verwertung von Kohlenhydraten führen, da für RNS2 bereits eine Beteiligung am rRNA Recycling gezeigt wurde.

Abb. 39: Vergleich des Sprosswachstums der T2 RNase T-DNA Insertionsmutanten und Wildtypen. Dazu wurden die A. thaliana Pflanzen unter Normalbedingungen und Langtag (16 h Licht/ 8 h Dunkelheit) angezogen. Das Sprosswachstum wurde ab der sechsten Woche nach der Stratifizierung bis zur neunten Woche beobachtet. Außen befinden sich die Wildtypen Ws-4 und Col-0 und daneben die entsprechenden Mutanten.

Die Auswertungen der Messung sind in Abb. 40 dargestellt. Auf der linken Seite sind die Ergebnisse von Ws-4 (rot), rns1rns2 (blau) und rns1rns3 (grün) dargestellt, auf der rechten Col-0 (blau) und rns2rns3 (rot). Außerdem sind die grau unterlegten Bereiche die Phasen ohne Licht. Mit Klammern und p-Wert sind die verglichenen und analysierten Pflanzen angegeben, deren Unterschiede signifikant sind. Dies wurde mittels Zweistichproben-t-Test getestet. Abb. 40A und B zeigen die Ergebnisse der Expansion der Blattoberfläche von Rosettenblättern (RER, engl., relative expansion rate). Hierbei war eine exponentielle Steigung des Expansionswachstums zu beobachten. Das Wachstum von Ws-4, rns1rns2 und rns1rns3 wurde bis zu 19 DAS (Tage nach Aussaat; engl. days after sowing) aufgenommen. Das Expansionswachstum der beiden Doppelmutanten unterschied sich, trotz Inaktivität zweier RNasen, nicht vom Wildtyp. Wenn man sich das gemittelte Expansionswachstum am Tag und in der Nacht ansieht (Abb. 40C), zeigte sich bei rns1rns2 und rns1rns3 kein signifikanter Unterschied zum Wildtypen. Beim Gesamtwachstum gab es dennoch einen signifikanten Unterschied (p = 0,014) zwischen Ws-4 und rns1rns2. Bei der Betrachtung von durchschnittlicher RER zeitlich aufgelöst nach Stunden (RER/h) waren keine Phasen zu sehen, in denen sich das Wachstum von rns1rns3 signifikant vom Wildtyp unterschied (Abb. 40E). Das veränderte Expansionswachstum von rns1rns2 lässt sich jedoch mit dem Wachstum zwischen Stunde drei und sechs, sowie zwischen Stunde 13 und 14 erklären, da in diesen Zeiträumen ein geringeres Expansionswachstum zu erkennen war. Zusätzlich zum Expansionswachstum wurde eine Blattwinkelmessung durchgeführt. Es wird der Blattwinkel des Blattes ohne Petiole in Grad angegeben, wobei 0 ° ein gerades, horizontales Blatt bedeutete (Abb. 40G). Zwischen Wildtyp und rns1rns3 gab es keinen Unterschied, zu rns1rns2 wiesen jedoch auch die Blattwinkel Unterschiede auf. Die Blattwinkel sind zwischen Stunde drei und 22 durchgehend niedriger bei der Doppelmutante.

Das Wachstum von Col-0 und rns2rns3 wurde bis 24 DAS aufgenommen. Die Doppelmutante besaß ein signifikant höheres Expansionswachstum als der Wildtyp (p = 0,00061) (Abb. 40B). In Abb. 40D ist das Expansionswachstum aufgeteilt in Tag und Nacht und zeigte ein signifikant höheres Wachstum der Doppelmutante am Tag (p = 0,0042), welches auch insgesamt zu signifikant höherem Expansionswachstum führte (p = 0,0034). Betrachtet man das Expansionswachstum pro Stunde, dann kann festgestellt werden, dass der Zeitraum zwischen drei und sechs Stunden für das höhere Expansionswachstum verantwortlich war, die Kurve ist ansonsten sehr ähnlich (Abb. 40F). Obwohl Hillwig et al. (2011) keinen morphologischen Phänotyp von rns2 beobachten konnten, stellten Floyd et al. (2015) dagegen ein kleines, aber signifikant erhöhtes Wachstum der Rosette der rns2-Mutante fest. In beiden Fällen wurde mit der gleichen T-DNA Insertionsmutante wie in dieser Arbeit gearbeitet. Außerdem wurde eine Akkumulierung von ungeschnittener rRNA in Vakuolen gezeigt, RNS2 ist somit die wichtigste RNase in Vakuolen (Hillwig et al., 2011; Floyd et al., 2015). Aufgrund einer erhöhten Bildung von Autophagosomen in der rns2 Mutante und konstitutiver Aktivierung von Autophagie, wurde angenommen, dass RNS2 wichtig ist, um die normale zelluläre Homöostase zu erhalten (Floyd et al., 2016). Dass der Abbau von rRNA in Vakuolen stattfinden kann, ist bereits

bekannt, wie der Transport zu den Vakuolen geschieht, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die Autophagosomen enthielten aber ribosomale und ER-Bestandteile, sowie RNA (Floyd et al., 2015).

Dadurch, dass in der Mutante rRNA nicht wiederverwertet werden kann, verändert sich auch der Kohlenhydratfluss (Morriss et al., 2017). rns2 Mutanten besaßen eine veränderte

Abb. 40: Ergebnisse des Phänotyps hinsichtlich Expansionswachstums und Hyponastie. Das Wachstum erfolgte bei 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit. (A) Wachstum der Blattoberfläche der Rosettenblätter in RER (engl., relative expansion rate) von Ws-4, rns1rns2 und rns1rns3 (n ≥ 11 Pflanzen) zwischen 12 und 19 DAS (engl., days after sowing) (B) Wachstum der Blattoberfläche der Rosettenblätter in RER von Col-0 und rns2rns3 (n ≥ 16 Pflanzen) zwischen 14 und 24 DAS. (C) Vergleich von durchschnittlichem RER am Tag, in der Nacht und gesamt von Ws-4, rns1rns2 und rns1rns3. (D) Vergleich von durchschnittlichem RER am Tag, in der Nacht und gesamt von Col-0 und rns2rns3. (E) Zeitlich aufgelöste RER, gemittelt über die 24 Stunden der sieben gemessenen Tage, von Ws-4, rns1rns2 und rns1rns3. (F) Zeitlich aufgelöste RER, gemittelt über die 24 Stunden der zehn gemessenen Tage, von Col-0 und rns2rns3. (G) Zeitlich aufgelöste, durchschnittliche Hyponastie (in °), gemittelt über die 24 Stunden der sieben Tage, von Ws-4, rns1rns2 und rns1rns3. (H) Zeitlich aufgelöste, durchschnittliche Hyponastie (in Grad), gemittelt über die 24 Stunden der zehn gemessenen Tage, von Col-0 und rns2rns3. Grau unterlegte Bereiche markieren die Phasen ohne Licht. Die Signifikanz ist mit * markiert: * p-Wert ≤ 0,05, ** p-Wert ≤ 0,01, *** p-Wert ≤ 0,001.

Monosaccharidzusammensetzung der Zellwand. Zwei Komponenten der Hemizellulose, Mannose und Glucuronsäure, waren reduziert, sowie auch Vorläufer dieser Monosaccharide, Fruktose und Glukose.

Das könnte zu einer instabileren Zellwand und einem reduzierten Turgor führen, wodurch mehr Wasser in die Zellen eindringt. Da außerdem ein höherer Wassergehalt in rns2 beobachtet wurde, wurde dies als eine mögliche Ursache für die größere Rosette angenommen (Morriss et al., 2017). Die Ergebnisse stimmen also mit diesen Beobachtungen überein. Die Kreuzung der zwei Ökotypen könnte zu diesem Phänotyp beigetragen haben.

Außerdem gibt es Unterschiede in der Hyponastie zwischen Col-0 und rns2rns3 (Abb. 40G).

Zwischen den Stunden vier und 20 sind die Blattwinkel bei der Doppelmutante durchgängig größer.

Wenn man die Unterschiede von rns1rns2 und rns2rns3 jeweils mit dem anderen Ökotyp vergleicht fällt auf, dass es dort Ähnlichkeiten gibt. Das geringere Expansionswachstum von rns1rns2 zwischen den Stunden drei und sechs (Abb. 40E) passte zu dem Wachstum von Col-0 zu diesem Zeitraum (Abb.

40F). Andersherum entsprach das erhöhte Expansionswachstum von rns2rns3 in diesem Zeitraum auch dem Wachstum von Ws-4. Die Wachstumskurve von rns1rns2 zwischen Stunden 13 und 14 war ebenfalls ähnlich der von Col-0. Diese Unterschiede könnten somit durch die Kreuzung der beiden Ökotypen entstanden sein. Dafür würden auch die Unterschiede der Hyponastie sprechen. Denn auch hier war der Blattwinkel von rns2rns3 höher als der von Col-0 und der von rns1rns2 niedriger als von Ws-4. Insgesamt reagierten die Pflanzen jedoch gleich auf die Licht- und Dunkelperioden. Bei allen Pflanzen konnte ein höherer Blattwinkel kurz nach dem Eintreten der Dunkelheit festgestellt werden, sowie eine Verringerung des Blattwinkels kurz nach Beginn der Lichtperiode. Studien zur Blattwinkelmessung von Col-0 und Ws-2 zeigten, dass Col-0 insgesamt niedrigere Blattwinkel aufweist im Vergleich zu Ws-2, die Kurve der Blattwinkel war jedoch auch hier sehr ähnlich und zeigte gleiche Reaktionen auf Licht- und Dunkelperiode (Apelt et al., 2017). Dass also rns2rns3 höhere Blattwinkel als Col-0 aufwies, kann also ebenfalls an der Kreuzung der Ökotypen liegen.

Unter normalen Wachstumsbedingungen war somit für rns2rns3 ein Phänotyp sichtbar, der dem Phänotyp von bereits untersuchten rns2 entsprach und erhöhtes Expansionswachstum zeigte. Dies könnte mit dem rRNA Recycling und der dadurch veränderten zellulären Homöostase zusammenhängen. Um auszuschließen, dass die Unterschiede der Hyponastie von rns2rns3 und rns1rns2 und des etwas veränderten zeitlich aufgelösten Expansionswachstums von rns1rns2 auf die Kreuzung der Ökotypen zurückzuführen ist, müssten Mutanten des gleichen Ökotyps verwendet werden.

3.4.2 Analyse der Vaskulatur von Arabidopsis-Kotyledonen

Wie bereits bekannt ist, akkumulieren tRNA Hälften sehr stark im Phloemsaft. Das könnte zum einen daran liegen, dass das Phloem für die systemische Weiterleitung dieser Signalmoleküle genutzt wird.

Zum anderen kann eine Beteiligung der tRHs bei der Entwicklung des vaskulären Gewebes vermutet werden. Angiogenin, welches für die Bildung von tRHs im Menschen zuständig ist, ist beispielsweise

am Wachstum von neuen Blutgefäßen beteiligt (Fett et al., 1985; Yamasaki et al., 2009). Analog dazu könnte die Aktivität von T2 RNasen und die dadurch entstehenden tRHs im Phloemsaft zur Bildung von vaskulärem Gewebe führen. Daher sollte diese These untersucht werden. Am einfachsten kann die Vaskulatur in Keimblättern untersucht werden, da hier die Vaskulatur weniger komplex ist als in echten Blättern. Um also zu ermitteln, ob die drei T2 RNasen einen Einfluss auf die Ausbildung von vaskulärem Gewebe besitzen, wurde die Komplexität der Vaskulatur der Einzel- und Doppelmutanten untersucht.

Für die Analyse von Keimblättern wurden diese zunächst entfärbt, mikroskopiert und Komplexitätsstufen zugeordnet. Das Ergebnis der Auswertungen ist in Abb. 41 dargestellt. Die Rohdaten (Tab. A 5), sowie die Verteilung der Daten anhand von Box-Plots (Abb. A 6) sind im Anhang zu finden. Signifikante Unterschiede wurden mittels Post-Hoc-Test unter Verwendung von SPSS ermittelt. Um Unterschiede zum Wildtypen festzustellen, wurden die Mutanten mit den entsprechenden Ökotypen verglichen, also rns2 und rns2rns3 mit Col-0, die anderen Mutanten mit Ws-4. Die Einteilung der vaskulären Komplexität in fünf Stufen und zwei Klassen erfolgte nach Stanko et al. (2014) (Abb. 41A). Je höher die Stufe ist, desto komplexer ist die Vaskulatur. Stufe 1 besitzt zwei sekundäre Schleifen, Stufe 2 hat drei sekundäre Schleifen. In Stufe 3 sind die drei Schleifen zusätzlich miteinander verbunden. In Stufe 4 gibt es zwei sekundäre Schleifen und zwei nicht komplett verbundene Schleifen. Bei der höchsten Komplexitätsstufe 5 sind vier verbundene Schleifen vorhanden. Die Stufen wurden außerdem Klassen untergeordnet, Klasse I (Stufen 1 und 2) bedeutet eine niedrige, Klasse II (Stufen 3 bis 5) eine hohe Komplexität. Als Beispiele für die Stufen dienen Mikroskopaufnahmen. Die Tabelle in Abb. 41C gibt die Anzahl aller untersuchten Keimblätter an. Die Säulen der Diagramme von Abb. 41B sind nach den Stufen in A gruppiert. Für die Ergebnisse wurden die relativen Anteile pro Stufe (in %) gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Im oberen Teil befinden sich die Ergebnisse von Col-0, rns2 und rns2rns3, im unteren Teil die von Ws-4, rns1, rns3, rns1rns2 und rns1rns3. Insgesamt konnten die meisten Keimblätter der Komplexitätsstufe 3 zugeordnet werden. Stufe 5 war die zweithäufigste Stufe, Stufe 1 die seltenste. Die Vaskulatur der Keimblätter von rns2 und rns2rns3, zeigte keine signifikante Veränderung zum Wildtyp. Auch die Einzelmutanten rns1 und rns3 und die Doppelmutante rns1rns2 besaßen eine ähnlich komplexe Vaskulatur, wie der Wildtyp 4. Für rns1rns3 wurde dagegen ein signifikanter Unterschied zu Ws-4 in den Stufen 1 und 2 festgestellt. Keimblätter dieser Stufe kamen hier signifikant häufiger vor als beim Wildtyp. Der Anteil der Kotyledonen beträgt in Stufe 1 für rns1rns3 durchschnittlich etwa 8,1 %, für Ws-4 2,8 %, in Stufe 2 für rns1rns3 etwa 22 % und für Ws-4 etwa 6,4 %. Die höchste Komplexitätsstufe schien in der Doppelmutante dagegen einen geringeren Anteil auszumachen.

Durchschnittlich ca. 17 % der Keimblätter von rns1rns3 sind dieser Stufe zugeordnet worden, der Anteil von Ws-4 betrug 36 %. Dennoch war dieser Unterschied nicht signifikant. Betrachtet man die Ergebnisse dargestellt als gestapelte Säulen (Abb. 41D), wird es noch deutlicher, dass rns1rns3 häufiger Keimblätter besaß, die der Klasse I zugeordnet werden können (Blautöne), verglichen mit

dem Wildtyp. Durchschnittlich war der Anteil von Kotyledonen der Klasse I um 21 % höher in rns1rns3.

Die vaskuläre Komplexität der Keimblätter schien somit durch die Inaktivität von RNS1 und RNS3 abgenommen zu haben. Da jedoch kein signifikanter Unterschied in den Einzelmutanten rns1 und rns3 beobachtet wurde, besitzen die beiden RNasen wahrscheinlich eine ähnliche Funktion hinsichtlich der Ausbildung der Vaskulatur. Erst durch Ausschalten beider RNasen wird dieser Phänotyp sichtbar. Die Aktivität von RNS2 besitzt keinen Einfluss auf die Vaskulatur.

Bisher wurden keine Studien von T2 RNasen hinsichtlich einer direkten Funktion zur Ausbildung von vaskulärem Gewebe veröffentlicht, anders als zu Angiogenin. Angiogenin, das im Menschen unter

Abb. 41: Vergleichs der vaskulären Komplexität in Kotyledonen der T2 RNase Mutanten und Wildtypen. (A) Die fünf Stufen der vaskulären sind gruppiert in Klasse I (Stufe 1-2) und Klasse II (Stufe 3-5) nach Stanko et al. (2014). (B) Durchschnittliche relative Verteilung von Ws-4 (n = 9), rns1 (n = 9), rns3 (n = 8), rns1rns2 (n = 4), rns1rns3 (n = 5), Col-0 (n = 14), rns2 (n = 7) und rns2rns3 (n = 8) in die Komplexitätsstufen 1 bis 5 (in %). Signifikante Unterschiede zum Wildtyp wurden durch Pot-Hoc-Tests ermittelt und sind mit * markiert. (C) Die Tabelle enthält die Anzahl aller analysierten Keimblätter der Pflanzen. (D) Gestapelte Säulen mit der mittleren Verteilung der fünf Komplexitätsstufen der untersuchten

Stress tRNA Hälften produziert, ist an der Bildung von Blutgefäßen beteiligt (Shapiro & Vallee, 1987;

Yamasaki et al., 2009). Es könnte also einen Zusammenhang zwischen der Bildung von tRHs und der Angiogenese bestehen. tRHs im Phloemsaft könnten als Signal zur Differenzierung von Phloem oder Xylem dienen. Dass kleine nicht-kodierende RNAs an der Entwicklung von vaskulärem Gewebe beteiligt sein können, wurde bereits anhand von miRNAs gezeigt (Kim et al., 2005; Williams et al., 2005; Zhou et al., 2007). In Arabidopsis wurde ein miRNA166-vermittelter Abbau des ATHB15-Transkriptes gezeigt, das erweiterte Xylemgefäßen verursacht (Kim et al., 2005). Außerdem wurde ein vergrößertes Meristem der Sprossspitze beobachtet (Williams et al., 2005). Dieses Protein gehört zur Familie der Klasse III HD-ZIP (engl., homeodomain-leucine zipper protein) Transkriptionsfaktoren, die unter anderem die vaskuläre Entwicklung regulieren und an der Bildung von Apikal- und Lateralmeristem beteiligt sind. In ähnlicher Weise könnten also tRHs die Entwicklung von vaskulärem Gewebe beeinflussen, indem die Translation bestimmter Proteine inhibiert wird. Außerdem könnten sie bei der Entwicklung von neuem vaskulärem Gewebe die teilweise Apoptose einleiten, indem sie die Translation blockieren. Um eine mögliche Funktion von tRHs beim Ausbilden von vaskulärem Gewebe zu überprüfen, könnte eine sehr abundant im Phloemsaft vorkommenden tRNA Hälfte, wie beispielsweise 5´Gly(UCC) oder 5´Glu(UUC), überexprimiert werden und der Einfluss auf die vaskuläre Komplexität der Keimblätter erneut untersucht werden.