3.2 Funktionelle Untersuchungen zu tRHs im Phloemexsudat
3.2.3 Expression und Aufreinigung rekombinanter T2 RNasen
Um ein Gesamtbild über die tRNA Hälften zu bekommen, ist es wichtig nicht nur die Funktion, sondern auch die Biogenese zu verstehen. Zu Beginn der Arbeit war noch keine RNase bekannt, die für das Schneiden von tRNAs im Anticodon zuständig ist. Es gab jedoch Hinweise, durch das Wissen über die Entstehung von tRHs in anderen Organismen. Die RNase Familie der T2 RNasen war ein guter Kandidat als tRNA-schneidendes Enzym. Zum einen wurde bereits 1984 gezeigt, dass die T2 RNase in der Lage ist tRNA-Phe in der Anticodonschleife zu schneiden, da in in vitro Assays zwei Fragmente entstanden (Vary & Vournakis, 1984). Dabei handelt es sich wahrscheinlich um tRNA Hälften. Zum anderen wurde in Hefe gezeigt, dass die T2 RNase Rny1 tRNAs unter oxidativem Stress in der Anticodonschleife schneidet (Thompson et al., 2008; Thompson & Parker, 2009b).
Da während dieser Arbeit auch mit Arabidopsis RNase Mutanten gearbeitet wurde, wurden jeweils drei T2 RNasen aus Arabidopsis und B. napus kloniert und exprimiert, sowie die Enzymaktivität getestet. In Arabidopsis gibt es insgesamt fünf RNase T2 Ribonukleasen, AtRNS1 bis 5, wobei AtRNS1, AtRNS2 und AtRNS3 schon gut charakterisiert sind. Zu Beginn der Arbeit wurden zudem RNS4 und RNS5 als RNS-ähnliche Enzyme aufgeführt. Sie werden zwar noch durch Sequenzähnlichkeiten der T2 RNase-Familie zugeordnet, jedoch mittlerweile nicht mehr als RNS4 und RNS5 bezeichnet (Rhee et al., 2003). Um die Kandidaten einzugrenzen, wurden daher nur die wahrscheinlichsten Kandidaten RNS1 bis 3 genauer untersucht. Aufgrund der Entstehung von B.
napus durch Allopolyploidisierung von B. rapa und B. oleracea, gab es von RNS1 sieben Homologe, von RNS2 sechs und von RNS3 acht, zu den Arabidopsis- Genen. Von B. napus wurde jeweils nur ein Homolog kloniert (siehe Tab. 14 in Kapitel 2.6). Ein Sequenzvergleich der klonierten Sequenzen ist in Abb. 20 dargestellt.
AtRNS1 und BnRNS1 besitzen eine Sequenzähnlichkeit von 87,8 %, die Aminosäuresequenzen von AtRNS2 und BnRNS2 sind sich zu 86,6 % ähnlich und AtRNS3 und BnRNS3 zu 91,9 %. Anhand des Sequenzvergleiches mittels Clustal Omega (Sievers et al., 2011) wird deutlich, dass die Aminosäuresequenzen von RNS1 und RNS3 untereinander deutlich ähnlicher sind, als die von RNS2.
BnRNS1 und BnRNS3, sowie AtRNS1 und AtRNS3 besitzen eine Ähnlichkeit von etwa 57 %, mit RNS1 jedoch höchstens 37 %. Es könnte also sein, dass sich auch die Funktionen in Bezug auf tRNAs unterscheiden. Deshalb war es wichtig, diese anhand von Enzymassays zu vergleichen. Es wurden verkürzte Produkte kloniert, da in fünf RNasen eine N-terminale Transmembrandomäne durch PredictProtein (Yachdav et al., 2014) vorhergesagt wurde und bei UniProt für alle sechs RNasen Signalpeptide angegeben sind (The Uniprot Consortium, 2019). Die N-terminalen Sequenzen der Transmembrandomänen/Signalpeptide wurden nicht kloniert. Die aktiven Zentren (CASI und CASII), befinden sich nicht im N-terminalen Bereich (Tab. 25). Die in der RNase T2-Familie konservierten aktiven Zentren CASI und CASII beinhalten zwei Histidine, die an der Katalyse von RNA beteiligt sind (Luhtala & Parker, 2010). Sie sind mit einem Pfeil markiert. Außerdem sind in UniProt je zwei Disulfidbrücken für AtRNS1 und AtRNS3, und eine für AtRNS2 angegeben. Für Raps RNasen wurden keine Disulfidbrücken vorhergesagt, es kann aber aufgrund der Sequenzähnlichkeit zu
Abb. 20: Sequenzvergleiche klonierter T2 RNasen. Mittels Clustal O wurden die Aminosäuresequenzen der klonierten T2 RNasen verglichen. Die N-terminalen, von PredictProtein vorhergesagten Transmembrandomänen sind fett und die von UniProt verhergesagten Signalpeptide unterstrichen. Die aktiven Zentren (engl., conserved active site) CASI und CASII sind gelb unterlegt. Mit einem Pfeil sind außerdem die katalytisch aktiven Histidine markiert.
Arabidopsis eine Bildung von Disulfidbrücken angenommen werden. Die rekombinanten Proteine enthielten einen N-terminalen His6-Tag, mit dessen Hilfe die Aufreinigung mittels Metall-Affinitätschromatographie stattfand. Einige Eigenschaften der Proteine sind in Tab. 25 angegeben.
Tab. 25: Eigenschaften klonierter verkürzter T2 RNase Konstrukte mit His6-Tag.
Konstrukt MW [kDa]1 ɛ1 pI1 Disulfidbrücken2 Aminosäuren2
BnRNS1 25,301 45545 5,35 - 228
BnRNS2 30,182 56225 6,25 - 268
BnRNS3 25,546 45545 6,22 - 224
AtRNS1 25,089 47035 5,79 2 226
AtRNS2 29,144 54735 6,52 1 257
AtRNS3 25,630 45545 6,17 2 224
1ExPASy Compute pI/MW Tools bestimmt (https://web.expasy.org/compute_pi/), 2 UniProt (The Uniprot Consortium, 2019)
3.2.3.1 Ermitteln der Expressionsbedingungen zur optimalen Expression der rekombinanten Proteine
Alle sechs verkürzten Konstrukte wurden erfolgreich in den pET28a(+)-Vektor kloniert und enthielten am N-Terminus einen 6x-Histag. Die Aminosäuresequenzen befinden sich im Anhang, in Abschnitt 8.2.1. Für die Herstellung der Proteine mussten zunächst geeignete Expressionsbedingungen gefunden werden. Dafür wurden drei verschiedene Expressionsstämme, die Dauer der Expression, sowie die Temperatur getestet.
Abb. 21A zeigt exemplarisch für BnRNS1 die Expression in drei verschiedenen E. coli-Stämmen. Für die Expression wurden die Stämme BL21-Gold (DE3), und CodonPlus (DE3) RIPL, sowie Rosetta-gami 2 (DE3) getestet. BL21-Gold ist geeignet für ein hohes Expressionslevel. BL21-CodonPlus (DE3) RIPL besitzt den gleichen Ursprung, durch extra Kopien seltener tRNAs, wird die Expression in diesem Stamm optimiert und er ermöglicht die Expression von GC- und AT-reichen Genen.
Rosetta-gami 2 erlaubt die Expression von Proteinen mit Disulfidbrücken und in E. coli selten vorkommenden Codons. Zum Testen der optimalen Expressionsdauer wurden stündlich Proben genommen bis zu sechs Stunden und erneut nach 24 Stunden. Die Proteine konnten in allen Stämmen erfolgreich und gleichstark exprimiert werden. Für den Vergleich der Expression bei 26 °C und 37 °C wurde die jeweils stärkste Expression verglichen (Abb. 21B). Bei 26 °C war die Expression nach 24 h etwa so hoch wie bei 37 °C nach 3 h. Durch eine langsamere Expression sollte eine Bildung von unlöslichen Aggregaten verhindert werden. Die Löslichkeit der Proteine hat sich jedoch nicht verändert und deshalb wurde aufgrund der Zeitersparnis die Expression standardmäßig bei 37 °C für 3 h durchgeführt.
Zudem konnten in keinem der Stämme die Proteine löslich exprimiert werden, obwohl Rosetta-gami 2 auch besonders für Proteine, die Disulfidbrückenbindungen ausbilden, geeignet ist (Ergebnisse nicht gezeigt). Da es also keine Unterschiede bei Löslichkeit und Expression gab, wurden alle Proteine in dem E. coli-Stamm BL21-Gold (DE3) exprimiert.
Aufgrund dieser ersten Ergebnisse sollte die Solubilisierung der Proteine verbessert werden. Es kommt häufig vor, dass Proteine bei einer Überexpression in einem heterologen Expressionssystem unlöslich sind (Lindwall et al., 2000). Dennoch könnte die Löslichkeit durch die Wahl des richtigen Puffers verbessert werden. Deshalb wurden sechs unterschiedliche Puffer mit verschiedenen Additiven getestet (Abb. 22). Beispielsweise wurde LiCl an Stelle von NaCl als Salz verwendet. Außerdem wurde zu einem der Puffer eine geringe Konzentration CHAPS gegeben. Das zwitterionische Detergens ist gut geeignet, um Proteine in ihrem nativen Zustand zu erhalten. Eine geringe Konzentration an Harnstoff sollte als chaotrophes Agens ebenfalls eine Verbesserung der Löslichkeit hervorrufen, da es auch hydrophobe Interaktionen zwischen Proteinen lösen kann. Die Zugabe von Glycerol sollte zur Stabilisierung der Proteine dienen. Eine geringe Konzentration des reduzierenden Agens DTT sollte oxidative Schäden reduzieren. Doch auch diese sechs Puffer verbesserten die Löslichkeit der Proteine nicht.
Abb. 21: Optimierung der Expression von rekombinanten T2 RNasen in E. coli. (A) Es wurden drei verschiedene E.
coli-Expressionsstämme, hier gezeigt am Beispiel von BnRNS1, getestet. Die Expression wurde über eine Dauer von 24 h bei 37 °C getestet, wobei zwischen 0 und 6 Stunden stündlich eine Probe entnommen wurde. Der Pfeil markiert die zu erwartende Höhe des Proteins. (B) Testen der Expressionstemperatur bei 26 °C und 37 °C, exemplarisch für AtRNS2 und BnRNS2.
Die Proteine schienen also in E. coli zu aggregieren und sich somit in Einschlusskörperchen zu befinden. Die hohe Expression der Ribonukleasen war also wahrscheinlich für die Bakterien toxisch, und somit diente die Bildung der Einschlusskörperchen den Bakterien als Schutz vor RNA Abbau.
Ähnliches wurde auch bei der rekombinanten Expression dieser RNasen in Hefezellen festgestellt (Megel et al., 2018). Dennoch wurde zu guter Letzt noch ein weiterer Bakterienstamm getestet, der besonders für toxische Proteine geeignet sein soll. Die spätere Aufreinigung wäre mit löslichen Proteinen sehr viel einfacher und würde weniger Verlust von Protein bedeuten. Daher wurde der E.
coli-Stamm OverExpress™ C43 (DE3) für die heterologe Expression von AtRNS3 bei zwei Temperaturen und bis zu 24 Stunden Expression getestet. In Abb. 23A sieht man eine hohe Expression von AtRNS3 bei 37 °C und eine geringe Expression bei 26 °C. Auch in diesem, für toxische Proteine optimierten, Stamm wurde das Protein nicht löslich hergestellt (Abb. 23B), da das Protein im Pellet (P) verblieb und keine Proteinbande im Überstand (Ü) erkennbar war.
Abb. 23: Testen der Expression in einem Expressionssystem für toxische Proteine. (A) Die Überexpression von rekombinantem AtRNS3 wurde in OverExpress™ C43 (DE3)-Zellen bei 37 °C und 26 °C nach der Induktion zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet. (B) Anschließend wurde die Löslichkeit mit den Puffern P1 und P7 getestet. Ü steht für die lösliche Proteinfraktion im Überstand, P für die unlösliche Fraktion im Pellet. Die Zusammensetzung der Puffer ist in der Tabelle angegeben.
Abb. 22:
Löslichkeitstest von rekombinanten T2
RNasen in
verschiedenen
Puffern. (A) Um die Löslichkeit der RNase zu verbessern, wurden verschiedene Puffer (P1-P6) getestet. Für die Puffer P1 bis P3 ist exemplarisch BnRNS1 dargestellt, für die Puffer P4 bis P5 BnRNS3. Die Proteine waren in den Puffer nicht löslich. (B) Tabellarische Übersicht der Puffer.
Für die Aufreinigung der rekombinanten RNasen wurde daher mit den unlöslichen Proteinen in Einschlusskörperchen weitergearbeitet. Die Expression der RNasen ist in Abb. 24 zu sehen und erfolgte in BL21-Gold (DE3) bei 37 °C für 3 Stunden. Bei der IPTG-induzierten Expression wurde eine große Menge an rekombinantem Protein hergestellt.
Um sicherzugehen, dass es sich bei den Proteinbanden um die Zielproteine handelte, wurden die Proteine anhand der Peptide Mass Fingerprint Methode analysiert. Dazu wurden Proteinbanden aus dem SDS-Gel ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und die Peptide mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie gemessen. Anschließend erfolgte die Auswertung des Spektrums mittels mMass.
Eine Übersicht der Ergebnisse gibt die Tab. 26 an. Es konnten alle rekombinant exprimierten Proteine eindeutig identifiziert werden, daher konnte mit der Aufreinigung der Proteine begonnen werden.
Tab. 26: Bestätigung der rekombinanten Proteine mittels MS. Zur Analyse der exprimierten Proteine wurden Banden aus der SDS-PAGE geschnitten, Trypsin-verdaut, mittels MALDI-TOF-MS analysiert und mit Hilfe der Peptide Mass Fingerprint Methode identifiziert.
Protein MASCOT-Score Seq. (%) Organismus Accession No.
AtRNS1 302 67 A. thaliana AAM63798
AtRNS2 152 44 A. thaliana NP_030524
AtRNS3 344 81 A. thaliana NP_564264
BnRNS1 96 34 B. napus XP_013705517
BnRNS2 119 40 B. napus XP_013698062
BnRNS3 126 47 B. napus XP_013651571
3.2.3.2 Renaturierung und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen
Die heterolog exprimierten RNasen konnten nicht löslich hergestellt werden. Es ist gut vorstellbar, dass eine große Menge an RNasen für das Bakterium toxisch war und daher die Bildung von Einschlusskörperchen erfolgte. Hier liegen rekombinante Proteine in sehr hohen Konzentrationen vor und bestehen oft fast ausschließlich aus dem überexprimierten Protein. In den Einschlusskörperchen ist das Protein außerdem vor proteolytischem Abbau geschützt. Einschlusskörperchen enthalten dennoch nicht nur das rekombinante Protein, sondern auch Komponenten der bakteriellen Membran, Wirtsproteine und RNA (Wang, 2009). Außerdem liegen die Proteine nicht vollständig nativ vor.
Da jedoch enzymatische Tests mit den RNasen durchgeführt werden sollten, war es wichtig, dass sie richtig gefaltet und aktiv vorlagen. Daher mussten zunächst die Einschlusskörperchen isoliert und die rekombinanten Proteine gelöst werden. Dies erfolgte durch Denaturierung mit einer hohen Konzentration des stark chaotrophen Agens Guanidiniumchlorid (GuCl). Eine übliche Vorgehensweise zur Rückfaltung, ist eine schrittweise Verdünnung des denaturierenden Agens während einer Dialyse, mit Hilfe eines geeigneten Puffers (Oganesyan et al., 2005). Diese Methode ist jedoch zeitintensiv und mit hohem Verlust von Protein verbunden. Deshalb wurde ein Protokoll
verwendet, bei dem eine gleichzeitige Aufreinigung und Rückfaltung während einer Affinitätschromatographie möglich war (Oganesyan et al., 2005).
In Abb. 25 ist die Aufreinigung der RNasen am Beispiel von BnRNS1 (A) und BnRNS2 (B) zu sehen.
Dafür wurden die gelösten Einschlusskörperchen auf einer Metallaffinitätschromatographie-Säule immobilisiert und mit Detergens gewaschen, um falsch gefaltete Proteine zu verhindern. Durch einen Waschschritt mit β-Cyclodextrin im Puffer wurde das Detergens entfernt und die Proteine bei der Rückfaltung unterstützt. Durch mehrere Waschschritte wird GuCl schrittweise entfernt und die Proteine falteten sich langsam zurück. Die Elution fand mit hohen Imidazolkonzentrationen statt. Die Elution von RNS1 war noch vergleichsweise einfach. Hier sieht man auch im Gel, dass es Elutionsfraktionen gibt, in denen besonders viel Protein eluiert wird. Für die weitere Aufreinigung wurden die Fraktionen E2 bis E10 genutzt. Die anderen Proteine waren sehr schwer von der Säule zu lösen und schienen aggregiert zu sein. Für eine humane RNase T2 konnte eine Bindung der zweiwertigen Kation Zn2+ und Cu2+ gezeigt werden, die zur Inaktivierung des Enzyms führt, von Ni2+
jedoch nicht (Thorn et al., 2012). Auch wenn die Bindung von Nickel nicht zu einer reduzierten Aktivität führt, ist dennoch eine Bindung von Ni2+ möglich. Eine Bindung von zweiwertigen Kationen stabilisiert Proteine häufig und könnte zu einer schlechteren Elution führen. Daher wurde in einem Versuch auch die Zugabe von 50 mM EDTA getestet, da dies zweiwertige Nickelionen chelatieren sollte und somit die Proteine von der Säule gelöst werden sollten.
Abb. 24: Expression von rekombinanten T2 RNasen in E. coli. Die Expression der T2 RNasen fand mittels des bakteriellen Expressionssystems in BL21 Gold (DE3)-Zellen bei 37 °C statt. Sie wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Es wurden sechs His6-getagte Konstrukte aus A. thaliana und B.napus hergestellt.
Doch auch so konnte kein besseres Ergebnis erzielt werden. Es gab somit bei RNS2 und RNS3 deutlich mehr Elutionsfraktionen als bei RNS1, wodurch das Protein verdünnter war. Nach der Elution fand eine Dialyse mit einem geeigneten Puffer und zur Entfernung des Imidazols statt. Nach der Dialyse war ein weißes Präzipitat zu beobachten, was bedeutete, dass ein großer Teil des Proteins ausgefallen war. Dabei handelte es sich wahrscheinlich um falsch gefaltetes, inaktives Protein. Bevor die rekombinanten Proteine in einer Gelfiltration weiter aufgereinigt wurden, wurden die Proteine aufgrund des hohen Volumens aufkonzentriert. Die Chromatogramme der Proteinaufreinigungen zeigen einen Peak vor dem eigentlichen Proteinpeak, bei dem es sich um aggregiertes Protein handelte. Die Proteine wurden also bei der Gelfiltration von nicht-aktivem aggregierten Protein getrennt. Die Aufreinigungen der RNS1 Ribonukleasen unterschieden sich leicht zu denen von RNS2 und RNS3 (siehe Abschnitt 2.12.2), doch grundsätzlich wurde die gleiche Methode verwendet.
Abb. 25: Renaturierung und Aufreinigung rekombinanter T2 RNasen aus E. coli. Da sich die überexprimierten RNasen in Einschlusskörperchen befanden, wurden sie mit Hilfe von 8 M GuCl gelöst und somit denaturiert. Die Aufreinigung erfolgte mit gleichzeitiger Renaturierung der Proteine mittels Nickelaffinitätschromatographie und verschiedenen Puffern. (A) In der Aufreinigung von BnRNS1 sind starke Proteinbanden in den Elutionsfraktionen des SDS-Gels zu sehen und ein hoher Peak bei der Gelfiltration. (B) Die Aufreinigung von BnRNS2 war deutlich ineffizienter, was anhand der Proteinbanden in der Elution deutlich erkennbar ist. W: Waschfraktionen, E: Elutionsfraktionen, F:
Fraktionen der Gelfiltration
Tab. 27: Konzentrationen und Mengen der aufgereinigten rekombinanten T2 RNasen.
rekombinantes Protein
Konzentration [mg/ml]
Menge Gesamtprotein
AtRNS1 0,913 785,1 µg
BnRNS1 0,932 336,6 µg
AtRNS2 0,294 41,1 µg
BnRNS2 0,766 459,6 µg
AtRNS3 0,955 114,6 µg
BnRNS3 0,45 108 µg
Die vielen notwendigen Schritte führten zum Verlust einer großen Menge an Protein. Die ursprüngliche Expression der Proteine war sehr gut, dennoch sind die Konzentrationen und Mengen der Proteine am Ende sehr gering ausgefallen (siehe Tab. 27). Für die geplanten Experimente waren sie trotzdem ausreichend.
Abb. 26 zeigt die rekombinanten Ribonukleasen nach der Renaturierung und Aufreinigung und einer Lagerung bei -70 °C. Nach der Auftrennung im SDS Gel sind saubere, monomere Proteinbanden, ohne Proteindegradation zu erkennen. Die Expression, Rückfaltung und Aufreinigung der sechs RNase T2 Enzyme war daher erfolgreich.
3.2.3.3 Nachweis enzymatischer Aktivität von T2 RNasen
Nach einer erfolgreichen Aufreinigung der RNasen musste nun überprüft werden, ob die Proteine nach der Rückfaltung funktional und aktiv vorlagen. Daher wurden zunächst ein paar relativ einfache gelbasierte Enzymassays durchgeführt, um die Aktivität einschätzen zu können. Zuerst wurden Inkubationszeiten von bis zu 20 Minuten getestet. Ein Vergleich des Abbaus von Hefe tRNA zwischen BnRNS1 und BnRNS2 zeigte eine sehr hohe Aktivität von BnRNS1, BnRNS2 schien dagegen jedoch
Abb. 26: Rekombinante T2 RNasen nach der Rückfaltung und Größenausschlusschromatografie. Nach der Größenausschlusschromatographie und einer Lagerung bei -70 °C wurden die Enzyme in einer 15 %-igen SDS-PAGE überprüft.
keine tRNA abgebaut zu haben (Abb. 27). Die RNA Banden sehen nach fünf Minuten, wie auch nach 20 Minuten genauso aus wie die der Kontrolle. Anders als bei RNS2, ist ein Abbau des tRNA Gemisches durch BnRNS1 selbst bei 4 °C zu beobachten. Die Kontrolle bestätigte, dass keine Kontamination mit Ribonukleasen vorlag. Die Reaktion lief bei BnRNS1 also sehr schnell ab. Da die Aminosäuresequenzen von RNS1 und RNS3 deutlich ähnlicher sind verglichen mit RNS2 (siehe Abb.
20), könnte es sein, dass sie auch funktionell ähnlicher sind. Eventuell besitzt RNS2 in der Pflanze eine andere Funktion als die beiden anderen T2 RNasen. BnRNS1 ist also in vitro in der Lage tRNA komplett abzubauen.
Um zu sehen, ob RNS3 aktiv ist und ob eine ähnliche Aktivität aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit besteht, wurden RNS1 und RNS3 von Arabidopsis und Raps verglichen. Da bereits in den vorherigen Versuchen eine sehr schnelle Reaktion zu beobachten war, wurden die Inkubationszeiten deutlich reduziert. Es wurden daher Inkubationszeiten zwischen 15 und 120 Sekunden getestet und auf dem Gel analysiert. Die Reaktionsansätze wurden nach der Inkubationszeit direkt auf 95 °C erhitzt, um die Reaktion zu stoppen. Für AtRNS1 und BnRNS3 wurden außerdem Proben direkt nach dem Zusammensetzen der Reaktion bei 95 C inkubiert (0 s). Dies sollte als eine weitere Kontrolle dienen. Bei diesem Versuch wurde darauf verzichtet die RNA aufzureinigen, da in
Abb. 27: Test der Enzymaktivität. Für den Aktivitätstest wurde tRNA Gemisch aus Hefe zusammen mit 10 pmol der jeweiligen RNase im Thorn-Puffer (pH 4,6) bei 37 °C inkubiert und zwei Zeitpunkte getestet. Eine Probe wurde auf Eis (4 °C) inkubiert und zu einer weiteren keine RNase hinzugegeben (K). Die RNA wurde aus den Reaktionsansätzen isoliert und auf einer 15 %-igen dPAGE (7 M Urea) aufgetrennt. Die RNA wurde mittels GelRed™ angefärbt und unter UV-Licht visualisiert.
Abb. 28: Nachweis der RNase Aktivität von RNS1 und RNS3. Die Aktivität von RNS1 und RNS3 wurde unter Verwendung des Thorn-Puffers bei 37 °C und Inkubationszeiten zwischen 0 und 120 s getestet. Die Reaktionsansätze wurden bei 95 °C inkubiert und ohne Aufreinigung auf eine 15 %-ige dPAGE (7 M Urea) aufgetragen. K ist die Kontrolle ohne Enzym. Die RNA wurde mittels GelRed™ angefärbt und mit UV-Licht visualisiert.
weiteren Versuchen gezeigt wurde, dass es keinen Vorteil hatte, die RNA vor der Gelelektrophorese aus dem Ansatz zu isolieren. Somit sollten Kosten und Zeit gespart werden. Das Ergebnis des Versuches ist in Abb. 28 zu sehen. Auch RNS3 schien zum einen sehr aktiv zu sein und zum anderen tRNA schnell und vollständig in vitro abzubauen und das schon nach 60 Sekunden. Vergleicht man den Abbau der RNA untereinander, sah man beim Verdau mit AtRNS1 nur noch schwache Banden nach 15 Sekunden, bei BnRNS3 waren diese geringfügig stärker zu sehen. Die Abbaubanden bei BnRNS1 schienen außerdem etwas schwächer zu sein als von AtRNS3. Ob man daraus Schlüsse auf die Aktivität oder Spezifität ziehen kann, ist fraglich. Dafür müssten genauere Analysen mit einer quantitativen Messmethode erfolgen. Da auch nach 0 Sekunden Inkubationszeit der RNasen mit tRNA ein Abbau der tRNA stattfand, konnte man davon ausgehen, dass RNS1 und RNS3 nicht hitzeinaktivierbar waren. Da jedoch noch Abbaubanden zu sehen waren, schien Hitze zumindest einen negativen Einfluss auf die Aktivität der RNasen zu haben. Es konnte also hiermit gezeigt werden, dass RNS1 und RNS3 eine hohe Aktivität besaßen tRNA zu degradieren.
Da die meisten T2 RNasen die höchste Aktivität bei einem pH zwischen 4 und 5 besitzen, wurde zunächst ein Puffer mit einem pH von 4,6 gewählt (Luhtala & Parker, 2010). Für Arabidopsis RNasen wurde gezeigt, dass RNS1 und RNS3 einen sauren pH-Wert bevorzugen, RNS2 dagegen einen neutralen um die pH 7,5 (Hillwig et al., 2011). In einer sehr aktuellen Studie wurde dennoch auch bei RNS2 eine höhere Aktivität im sauren pH-Bereich feststellt, was zur Lokalisation in der Vakuole passen würde (Megel et al., 2018). Es sollte überprüft werden, ob ein neutraler pH-Wert zu einer Aktivität von RNS2 und somit zum Abbau von tRNA führt. Deshalb wurde die Aktivität in einem Assay mit einem Tris-HCl Puffer, pH 7,5 erneut getestet. Außerdem wurde die Menge an RNS2 um das Dreifache auf 30 pmol erhöht. Da die Reaktion bei RNS1 immer sehr schnell ablief, wurden von
Abb. 29: Vergleich der pH-Wert abhängigen RNase Aktivität. Für den Assay wurde tRNA aus der Bäckerhefe bei einer Temperatur von 37 C° mit der zu testenden RNase inkubiert. Es wurden drei verschiedene Inkubationszeiten untersucht (1, 5 und 10 min) und zwei verschiedene Puffer getestet. Nach der Inkubation wurde die tRNA mit Hilfe eines Kits aus dem Reaktionsansatz aufgereinigt und durch eine 15 % -ige dPAGE (7 M Urea) aufgetrennt. Die RNA wurde mittels GelRed™ sichtbar gemacht. (A) Das Gelbild zeigt das Ergebnis der Reaktion im sauren Thorn-Puffer (pH 4,6). (B) Das Gelbild zeigt die Reaktion mit Tris-Puffer (pH 7,5). Da die Reaktion von RNS1 sehr schnell ablief, wurde weniger Protein eingesetzt, von RNS2 mehr als im vorherigen Versuch.
BnRNS1 nur 2 pmol eingesetzt. Wie in Abb. 29 zu sehen ist, wurde auch für AtRNS2 keine Aktivität nachgewiesen, da die detektierte RNA gleich der Kontrolle war, sowohl bei saurem als auch bei neutralem pH-Wert. Für BnRNS1 war ein deutlicher Unterschied erkennbar. Hefe tRNA war bei einem pH-Wert von 4,6 wieder fast vollständig abgebaut. Nur nach einer Minute waren noch Spuren von tRNA detektierbar. Bei einem neutralen pH-Wert könnte eventuell ein leichter Abbau nach 10 Minuten stattgefunden haben. Die pH-Präferenz von RNS1 hin zu saurem pH war jedoch eindeutig.
AtRNS2 zeigte jedoch bei neutralem pH genauso wenig tRNA Abbau, wie bei saurem pH.
Möglichweise war die Rückfaltung der Enzyme also nicht erfolgreich. Es könnte auch eine Kontamination von Proteasen vorliegen, die zu einer Inaktivität führte. Oder aber RNS2 war nicht in der Lage tRNAs zu schneiden, sondern nur RNS1 und RNS3. In der auch in dieser Arbeit verwendeten Arabidopsis Mutante, die keine RNS2-Akitivität besitzt, konnte gezeigt werden, dass der Abbau von rRNA verzögert ist und intrazellulär akkumuliert (Hillwig et al., 2011). Daher sollte auch der Abbau anderer RNA Typen getestet werden.
Insgesamt kann man jedoch sagen, dass RNS1 und RNS3 sowohl aus Raps als auch aus Arabidopsis erfolgreich zurückgefaltet wurden und in der Lage sind tRNA abzubauen. Da die Vermutung jedoch war, dass T2 RNasen tRNA spezifisch in Hälften schneiden können, wurde erwartet, dass im Gel Banden auf der Höhe von Hälften zu sehen sind. Dies ist jedoch bei beiden Enzymen nicht der Fall.
Möglicherweise spielen also noch weitere Faktoren beim Herstellen von tRHs eine Rolle, die in vitro nicht gegeben sind.
3.2.3.4 Test auf Proteasekontamination
Für beide RNS2 Enzyme konnte mit Hilfe des gelbasierten Assays keine Aktivität hinsichtlich des Abbaus von tRNA gezeigt werden. Um eine Proteasekontamination als Grund dafür auszuschließen, wurden die RNasen daraufhin überprüft. Abb. 30 zeigt am Beispiel von BnRNS2 das Ergebnis des Tests. Dabei wurde frisch aufgetautes Enzym auf Eis für bis zu 30 Minuten inkubiert, entweder mit Zugabe von Proteaseinhibitorgemisch direkt nach dem Auftauen oder erst nach der Inkubation.
Sowohl mit als auch ohne Proteaseinhibitor, konnte kein Abbau der RNasen festgestellt werden. Bei den Proteinbanden im Hintergrund handelte es sich um den Proteaseinhibitor. Eine Proteasekontamination konnte somit ausgeschlossen werden. Auch RNase-Aliquots, die bereits länger (mindestens zwei Wochen) bei 4 °C gelagert wurden, zeigten keine Abbaubanden (Ergebnisse hier nicht gezeigt). Daher könnte also eine Spezifität der RNasen für bestimmte RNAs vorliegen.