Aus der Medizinischen Klinik II mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. W. G.

Aus der

Medizinischen Klinik II mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. W. G. Daniel

Antiinflammatorische Wirkung einer ACE-Inhibition in Monozyten und Endothelzellen:

Einfluss von Ramiprilat auf die Angiotensin II-vermittelte Expression von Chemokinen und Adhäsionsmolekülen in

Monozyten und Endothelzellen

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Oliver Söhnlein

aus Neumarkt i. d. Opf.

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. B. Fleckenstein

Referent: Priv.-Doz. Dr. C. D. Garlichs Korreferent: Prof. Dr. W. G. Daniel

Prof. L. Lindbom, MD, PhD Priv.-Doz. Dr. R. Braun-Dullaeus

Tag der mündlichen Prüfung: 21. Dezember 2005

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 1

1.1 Atherosklerose als entzündliche Erkrankung 1

1.1.1 Epidemiologie 1

1.1.2 Atherosklerose – ein Überblick 1

1.1.3 Leukozytenrekrutierung 4

1.1.3.1 Selektine und deren Liganden 4

1.1.3.2 Chemokine und ihre Rezeptoren 5

1.1.3.3 Integrine und Ig-ähnliche Adhäsionsmoleküle 6

1.2 Das Renin-Angiotensin-System 8

1.2.1 Distribution des Renin-Angiotensin-Systems in der Atherosklerose 9 1.2.2 Angiotensin II als Entzündungsmediator in der Atherosklerose 10 1.2.3 Funktionelle Signaltransduktion via AT1R und AT2R 11

1.2.3.1 AT1R 11

1.2.3.2 AT2R 12

1.2.4 ACE-Hemmer 13

1.3 Bedeutung von NF-κB in der Atherosklerose 13

1.4 Fragestellung 15

2 MATERIALIEN UND METHODEN 18

2.1 Materialien 18

2.1.1 Zellkultur 18

2.1.2 RT-PCR 18

2.1.3 Bestimmung von MCP-1 und Il-8 18

2.1.4 Durchflusszytometrie 19

2.1.5 Western Blot Analyse 19

2.1.6 EMSA 19

2.1.7 Immunhistochemie 19

2.1.8 Geräte 20

2.2 Methoden 21

2.2.1 Zellkultur 21

2.2.1.1 Isolation und Kultur der humanen Monozyten 21

2.2.1.1.1 Prinzip 21

2.2.1.1.2 Vorgehen 21

2.2.1.2 Kultur der monozytären Zelllinie THP-1 22 2.2.1.3 Isolation und Kultur von humanen Nabelschnurzellen 22

2.2.1.3.1 Prinzip 22

2.2.1.3.2 Vorgehen 23

2.2.2 RNA-Isolation 23

2.2.2.1 Prinzip 23

2.2.2.2 Durchführung 24

2.2.2.3 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit 24 2.2.3 One-Step Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 25

2.2.3.1 Prinzip 25

2.2.3.2 Durchführung 25

2.2.3.3 Gelelektrophorese 26

2.2.4 Bestimmung von Il-8 und MCP-1 26

2.2.4.1 Das Prinzip des Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay 26 2.2.4.2 Durchführung des ELISA zur MCP-1 Bestimmung 27 2.2.4.3 Durchführung der Bestimmung von Il-8 27

2.2.5 Durchflusszytometrie 27

2.2.5.1 Prinzip 27

2.2.5.2 Bestimmung der AngII-Rezeptoren auf THP-1 und HUVEC 28

2.2.5.3 Bestimmung von Adhäsionsmolekülen 28

2.2.5.4 Bestimmung der p65 Translokation in den Nucleus von HUVEC 28

2.2.5.4.1 Prinzip 28

2.2.5.4.2 Messung von p65 29

2.2.6 Western Blot Analyse 29

2.2.6.1 Prinzip 29

2.2.6.2 Zelllyse und Proteinbestimmung 29

2.2.6.3 Elektrophorese 30

2.2.6.4 Blotting 31

2.2.6.5 Detektion und Auswertung 31

2.2.7 EMSA 32

2.2.8 Immunhistochemie 33

2.2.8.1 Präparatesammlung, -lagerung und -vorbereitung 33

2.2.8.2 Färbeprozedur 33

2.2.9 Flusskammeruntersuchungen 34

2.2.10 Statistik 35

3 ERGEBNISSE 36

3.1 Einfluss von Angiotensin II und Ramiprilat auf die Chemokinfreisetzung und –synthese in Monozyten 36 3.1.1 Il-8 und MCP-1 Freisetzung und Produktion werden durch Angiotensin II dosisab-

hängig stimuliert 36 3.1.2 Ramiprilat reduziert die AngII-vermittelte Freisetzung von Il-8 und MCP-1 dosis-

abhängig 40 3.1.3 Ramiprilat reduziert die AngII-vermittelte NF-kB-Aktivierung nur teilweise 43 3.1.4 Ramiprilat vermindert die AT1R-Expression auf der Monozytenoberfläche dosisab-

hängig 44

3.2 Einfluss von AngII und Ramiprilat auf die Adhäsionsmolekülexpression und

Monozytenadhäsion auf HUVEC 47 3.2.1 Hochregulation von VCAM-1, ICAM-1 und P-Selektin durch AngII führt zu einer

erhöhten Adhäsion von Monozyten auf Endothelzellen 47 3.2.2 Ramiprilat reduziert die AngII-vermittelte Stimulation von Adhäsionsmolekülen und

damit die Adhäsion von Monozyten 49 3.2.3 Einfluss von Ramiprilat auf die p65-Translokation in dem Nukleus von HUVEC 50 3.2.4 Ramiprilat reduziert die AT1R-Expression auf HUVEC 52 3.2.5 Lokalisation von AT1R, Cathepsin G, Chymase und VCAM-1 im fortgeschrittenen

atherosklerotischen Plaque 53 3.2.5 Lokalisation von AT1R, Cathepsin G, Chymase und VCAM-1 im fortgeschrittenen

atherosklerotischen Plaque 53

4 DISKUSSION 55

4.1 AngII setzt AT1R-abhängig Chemokine aus Monozyten und THP-1 Zellen frei 55 4.2 AngII stimuliert AT1R-vermittelt die Expression von Adhäsionsmolekülen auf

HUVEC und erhöht damit die Adhäsion von THP-1 Zellen 57 4.3 Ursachen antiinflammatorischer Effekte von Ramiprilat in dieser Studie 59 4.3.1 Einfluss von AngII und Ramiprilat auf die NF-κB Aktivität in Monozyten und HUVEC 60 4.3.2 Expressionsverhalten von AT1R und AT2R auf Monozyten und HUVEC in Abhäng-

igkeit von Ramipril 61 4.4 Distribution des lokalen RAS im atherosklerotischen Plaque 63

4.5 Pathophysiologische Relevanz 64

5 ZUSAMMENFASSUNG 67

6 SUMMARY 69

7 LITERATURVERZEICHNIS 71 8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 83 9 VORVERÖFFENTLICHUNGEN 87 10 DANKSAGUNG 88 11 LEBENSLAUF 90

1 Einleitung

1.1 Atherosklerose als entzündliche Erkrankung 1.1.1 Epidemiologie

Die Atherosklerose und ihre Komplikationen wie Herzinfarkt und Schlaganfall stellen eine der wichtigsten gesundheitsökonomischen Herausforderungen der westlichen Welt dar. Mit einem Anteil von 29,3% an der Gesamtsterblichkeit der Weltbevölkerung repräsentieren kardiovaskuläre Erkrankungen die häufigste Todesursache weltweit, wobei ischämische Herzerkrankungen bzw. cerebrovaskuläre Erkrankungen einen Anteil von 12,7% bzw. 9,6%

an der Gesamtsterblichkeit haben¹⁸⁰. Bedenkt man, dass in Entwicklungsländern weniger kardiovaskuläre Erkrankungen als viel mehr infektiöse und parasitäre Erkrankungen sowie Erkrankungen durch Unterernährung im Vordergrund stehen, so erhöht sich der relative An- teil kardiovaskulär bedingter Erkrankungen in den Industrieländern Nordamerikas, Europas sowie des westlichen Pazifiks erheblich.

Epidemiologisch ist die kardiovaskulär bedingte Sterblichkeit unter der männlichen Bevölke- rung wesentlich höher als in der weiblichen Bevölkerung. Darüber hinaus ist die Mortalitäts- rate in den westlichen Industrieländern erheblich größer als in Ostasien. So erreicht die kar- diovaskuläre Mortalität in Japan nur ein Sechstel derjenigen in den USA. Bei Japanern, die in Amerika wohnen und entsprechende Essgewohnheiten übernommen haben, ist jedoch ein Anstieg auf amerikanisches Niveau zu beobachten. Dies weist auf den starken Einfluss von Lebens- und Ernährungsgewohnheiten bei der Progression der Erkrankung hin.

Seit 1975 konnte in den westlichen Industrieländern die kardiovaskuläre Mortalität leicht gesenkt werden. Dies ist zum einen auf die Verbesserungen bei der Behandlung kardio- vaskulärer Erkrankungen zurückzuführen, zum anderen spielt die Reduktion von Risikofak- toren, insbesondere verringerter Nikotinkonsum sowie verbesserte Blutdruckeinstellung, eine wesentliche Rolle17, 91, 109, 180.

1.1.2 Atherosklerose – ein Überblick

Ursache der meisten ischämischen kardio- und zerebrovaskulären Ereignisse ist die Athe- rosklerose, eine Erkrankung der größeren und mittleren muskulären und elastischen Arterien.

Laut WHO ist sie als „eine variable Kombination von Veränderungen der Intima, bestehend aus einer herdförmigen Ansammlung von Fettsubstanzen, komplexen Kohlenhydraten, Blut und Blutbestandteilen, Bindegewebe und Calciumablagerungen, verbunden mit Veränderun- gen der Arterienmedia“ definiert¹⁷. Zu den Risikofaktoren erster Ordnung gehören Hyperli- pidämie, Hypertonie, Nikotinabusus sowie Diabetes mellitus. Sie alle bewirken eine Endo- thelzellschädigung mit der Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion. Daneben spielen

Risikofaktoren zweiter Ordnung, wie Adipositas, Hyperurikämie, Stress und familiäre Dis- position eine Rolle. Atherosklerotische Läsionen sind nicht zufällig verteilt. Bestimmte Be- reiche der Gefäße, wie etwa Gefäßkurven (z. B. Aortenbogen) oder Bifurkationen (z. B. A.

carotis) sind prädisponiert. Schon früh im Leben beginnt die Entwicklung erster Läsionen, sog. fatty streaks, mit der Einwanderung von Monozyten in den subendothelialen Raum¹¹³.

Heute wird die Atherosklerose als chronische Entzündungskrankheit der Gefäßwand gese- hen96, 103, 145. Dabei nimmt das Endothel eine zentrale Stellung ein. Physiologisch dient es als Barriere zwischen Blut und Gewebe und ist damit an der Regulation von Gefäßtonus, Gerin- nung, Fibrinolyse und Rekrutierung von Zellen und Molekülen wesentlich beteiligt³¹. Nach der response-to-injury-Hypothese¹⁴⁵ werden diese Endothelfunktionen durch einwirkende Noxen verändert. Hier wird den verschiedenen kardiovaskulären Risikofaktoren eine ent- scheidende Bedeutung zugeschrieben. Als besonders wichtig gelten erhöhte LDL- Plasmakonzentrationen und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die sich infolge von arterieller Hypertonie oder Zigarettenrauchen bilden.

Der erste Schritt bei der Initiation der Atherosklerose ist die Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion, die an Stellen turbulenten Flusses entsteht und zu einer erhöhten Permeabilität für LDL-Lipoproteine führt. Dies hat die Akkumulation von LDL im subendothelialen Raum zur Folge, wobei die Ansammlung von LDL-Lipoproteinen ihrer Plasmakonzentration direkt proportional ist. In der Gefäßwand wird LDL durch die Einwirkung von Radikalen zu oxi- diertem LDL (oxLDL) modifiziert. Dadurch kommt es zu einer ersten Entzündungsreaktion in der Gefäßwand: Hochregulation von Adhäsionsmolekülen, Chemokinen und Wachstums- faktoren sind die Folgen. Daneben blockiert oxLDL die Produktion von Stickstoffmonoxid

(NO), einem Mediator mit verschiedenen antiathero- genen Eigenschaften, wie etwa Vasodilatation und konsekutiver Blutdrucksen- kung. Weiterhin nehmen auch andere Faktoren auf die primäre Entzündungsre- aktion wichtigen Einfluss.

Erhöhte Scherkräfte in Ge- bieten turbulenten Flusses, erhöhte Homocysteinspie- gel und Geschlechtshormo- Abbildung 1-1: Endotheliale Dysfunktion in der Atherosklero-

seentwicklung ^nach145.

ne tragen zur Inflammation bei^{96, 145}.

Die Extravasation von Monozyten und Lymphozyten, ein wichtiger Schritt bei der Progres- sion der Atherosklerose, wird von Selektinen, Integrinen und Chemokinen gesteuert. Produk- te der initialen Entzündungsreaktion, wie ROS und oxLDL, regulieren die Expression dieser Moleküle und schaffen damit die Grundlage für die Extravasation mononukleärer Zellen.

Selektine vermitteln die primäre Interaktion zwischen mononukleären Zellen und dem Endo- thel, während Integrine und deren Liganden die feste Adhäsion vermitteln. Chemokine akti- vieren Integrine und führen die mononukleären Zellen zum Ort der Entzündung, womit sie folglich sowohl bei der Adhäsion als auch bei der Migration maßgeblich beteiligt sind. Unter Einfluss von ROS und Enzymen (sekretorische Phopholipase A2 u.a.) wird LDL in oxLDL überführt, das von membranständigen Rezeptoren auf Makrophagen (Scavenger Rezeptoren) erkannt und damit aufgenommen wird⁸⁹. Makrophagen werden dabei zu Schaumzellen (foam cells) umgebildet. Die Ex- pression der Scavenger Re- zeptoren steht unter dem Einfluss von Zytokinen wie TNFα, IFNγ und M-CSF, welche von aktivierten Makrophagen in großer Menge freigesetzt wer- den¹⁶⁴. Daneben sezernieren sie nach Aufnahme von oxLDL auch Chemokine, Wachstumsfaktoren und Hydrolasen, wie z.B. Metal- loproteinasen. Aktivierte Makrophagen exprimieren Klasse II MHC und können damit T-Lymphozyten Antigene präsentieren. Dadurch werden T-Lymphozyten aktiviert und sezernieren ihrerseits ebenfalls Zytokine wie IFNγ oder TNFα und verstärken damit die entzündlichen Vorgänge im Plaque⁶³.

Abbildung 1-2: Fortgeschrittene komplizierte atheromatöse Läsion ^nach145.

Der nächste Schritt in der Atheroskleroseprogression, die Bildung eines fibrösen Plaques, ist durch die Zunahme von extrazellulären Lipiden (v. a. oxLDL), glatten Muskelzellen (SMC) und extrazellulärer Matrix charakterisiert. Die fibröse Kappe bildet einen Schutzschild des Plaques gegenüber dem Blutstrom. Seine Effektivität ist v. a. durch den Gehalt und die Sta- bilität der extrazellulären Matrix, im wesentlichen Kollagen, die von SMCs gebildet werden, abhängig. Die Degradation der fibrösen Kappe ist ein Ergebnis der Produktion von Metal- loproteinasen, wie Kollagenasen, Elastasen und Stromelysine⁴⁹. Aktivierte T-Zellen stimulie-

ren die Produktion dieser Enzyme im Makrophagen und führen damit zu einer verstärkten Plaqueinstabilität.

Das klinische Korrelat der Atheroskleroseprogression äußert sich am Herzen in einer belas- tungsabhängigen Angina Pectoris. Die weitere Zunahme führt dann eventuell zur Plaquerup- tur, die sich als akutes koronares Syndrom in Form einer instabilen Angina Pectoris, eines akuten Myokardinfarkts oder eines plötzlichen Herztodes zeigt. Die Wahrscheinlichkeit ei- ner Ruptur korreliert nur wenig mit dem Grad der Obstruktion, vielmehr entscheidet die Vulnerabilität des Plaques, wann und wo es zu einer Ruptur kommt. Zumeist rupturiert die fibröse Kappe in der Schulterregion, dem Übergang von atherosklerotisch veränderter Ge- fäßwand zu normaler Gefäßwand. Dabei wird dem Blutstrom thrombogenes Material expo- niert, wodurch die Gerinnungskaskade aktiviert wird. In der Folge kommt es zur Gefäß- okklusion mit seinen klinischen Erscheinungsformen.

Entscheidend für die Destabilisierung des Plaques sind vor allem drei Mechanismen:

1. Die Degradation extrazellulärer Matrix (v. a. Kollagen) durch Matrixmetalloprotei- nasen, die aus Makrophagen und SMC freigesetzt werden, führt zur Aufweichung der fibrösen Kappe.

2. Die Zunahme der Menge an Makrophagen und Lymphozyten im Plaque treibt den entzündlichen Teufelskreis in der Gefäßwand voran.

3. Die Neovaskularisation im Plaque, ausgehend von der Tunica media und unterhalten durch Entzündungsmediatoren, fördert den Zustrom von Entzündungszellen und er- höht die Wahrscheinlichkeit von Einblutungen in den Plaque.

1.1.3 Leukozytenrekrutierung

Grundsätzlich erfolgt die Rekrutierung von Leukozyten aus dem peripheren Blutstrom in den extravaskulären Raum gemäß einer schrittweisen Abfolge von Interaktionen zwischen Leu- kozyten und Endothelzellen (s. Abb. 1-3), wobei eine Vielzahl von Zelladhäsionsmolekülen diesen Prozess vermittelt. Diese funktionieren nach einem Rezeptor-Gegenrezeptor Prinzip:

Die Bindung passender Rezeptoren aneinander löst in beiden Zelltypen eine aktive Reaktion aus. Daraus ergeben sich zwei Konsequenzen: Erstens kann durch die Notwendigkeit des passenden Gegenspielers eine Spezifität und Selektivität für bestimmte Leukozytenpopulati- onen erreicht werden. Zweitens ergibt sich aus diesem Schritt-für-Schritt Model, dass die Blockade eines dieser Schritte zur Blockade des gesamten Prozesses führt^{7, 98}.

1.1.3.1 Selektine und deren Liganden

Die Selektin-Familie der Adhäsionsmoleküle besteht aus drei Mitgliedern¹⁰⁷: P-Selektin, E- Selektin und L-Selektin. Grundsätzlich vermitteln sie alle das Rollen von Leukozyten ent-

lang des Endothels, hinsichtlich ihres Expressionsmusters und ihrer Effektivität bestehen jedoch deutliche Unterschiede.

P-Selektin hat prinzipiell die Aufgabe den primären Zell-Zellkontakt zu schaffen. Es wird in Endothelzellen (in Weibel-Palade Körperchen) und der α-Granula von Plättchen gespeichert.

In beiden Fällen kann P-Selektin innerhalb weniger Minuten mobilisiert werden¹⁰⁸. Daneben kann die Expression auch auf transkriptioneller Ebene durch eine verstärkte de-novo Synthe- se nach Zytokinstimulation hochreguliert werden²⁶. P-Selektin ragt mit einer Größe von 50nm sehr weit in das Gefäßlumen und ist damit auch das wichtigste Selektin bei der initalen Vermittlung des Rollens⁹⁵.

E-Selektin ist bei dem Prozess des Fangens von Leukozyten aus dem Blutstrom (Capturing) von untergeordneter Bedeutung. Allerdings verstärkt es die Effizienz beim Übergang des Rollens in feste Adhäsion, indem es die Rollgeschwindigkeit reduziert^{48, 90}. Es wird durch eine de-novo Expression nach Stimulation mit Entzündungsmediatoren wie TNFα, Il-1β oder LPS an der Endotheloberfläche präsentiert¹⁴.

L-Selektin spielt beim Homing von Lymphozyten eine wichtige Rolle. Im Fall der Adhäsion auf entzündetem Endothel wird eine Kooperation zwischen L-Selektin und P-Selektin ver- mutet, die zu einem additiven Effekt führt.

Der Gegenrezeptor für P-Selektin ist P-Selektin Glycoprotein Ligand 1 (PSGL-1)¹²⁰. Dieser wird auf vielen Leukozytensubtypen an den Spitzen der Mikrovilli konstitutiv exprimiert.

Für E-Selektin ist ein Ligand nicht sicher definiert, möglicherweise interagiert PSGL-1 auch mit E-Selektin⁹⁴. Funktionelle Liganden für L-Selektin finden sich auf entzündetem Endothel sowie auf Leukozyten. Der Ligand auf Leukozyten ist ebenfalls PSGL-1.

1.1.3.2 Chemokine und ihre Rezeptoren

Chemokine aktivieren zum einen Integrine, zum anderen steuern sie die Zellmigration durch Chemo- und Haptotaxis¹³⁷. Sie können aufgrund ihrer ersten vier Cysteinreste in vier Klassen eingeteilt werden. Die zahlenmäßig größte Klasse ist die der C-C Chemokine (Prototyp:

MCP-1), bei der die Cysteinreste direkt benachbart sind, während bei der zweitgrößten Chemokinklasse, den C-X-C Chemokinen (Prototyp: Il-8), die Cysteinreste durch eine ande- re Aminosäure getrennt sind. Daneben gibt es noch C Chemokine und CX₃C Chemokine mit je einem Vertreter, die allerdings von untergeordneter Bedeutung sind.

C-C Chemokine haben insbesondere Einfluss auf Monozyten. Durch die Reduktion der Flussgeschwindigkeit aufgrund der Selektinwirkung wird die Kontaktzeit zwischen Leuko- zyten und Chemokinen, die durch Proteoglykane an die Endothelzelloberfläche gebunden sind, verlängert. Damit können Chemokine mit ihren Rezeptoren auf Monozyten in Kontakt treten und dort Integrine aktivieren. Dies geschieht durch eine Konformationsänderung des

entsprechenden Integrins, wodurch es strukturell an seinen Gegenrezeptor binden kann^{131, 155}. Weiterhin steuert ein Konzentrationsgradient der Chemokine in der Gefäßwand die Richtung der Migration. Schon in frühen Stadien der Atherosklerose wird MCP-1 vorwiegend in Makrophagen gebildet, daneben exprimieren auch SMC und Endothelzellen MCP-1¹¹⁴. Die Expression von MCP-1 wird durch oxLDL, M-CSF, TNFα, Il-1β und IFNγ stimuliert. CCR- 2, der MCP-1 Rezeptor, wird konstitutiv auf Monozyten exprimiert, auf Lymphozyten je- doch nur nach deren Aktivierung¹⁰⁰. Die Rezeptorexpression ist zudem abhängig vom Reife- stadium des Monozyten: im Blut zirkulierende Monozyten präsentieren CCR-2 in hohem Maße auf ihrer Oberfläche, während Makrophagen, welche bereits durch verschiedene Ent- zündungsmediatoren aktiviert wurden, weniger CCR-2 präsentieren. Stattdessen exprimieren diese Zellen CCR-5, den RANTES-Rezeptor, in großer Dichte. Dies spiegelt die hohe Affi- nität von zirkulierenden Monozyten für MCP-1 wider, während bereits transmigrierte Mono- zyten weniger suszeptibel für MCP-1 sind¹⁷⁷.

C-X-C Chemokine wurden lange Zeit als spezifisch für Neutrophile gehalten. Neue Untersu- chungen zeigen aber für Il-8 eine bedeutende Rolle in der Rekrutierung von Monozyten. So vermittelt Il-8 eine feste Adhäsion von Monozyten⁵⁴. Es wirkt dabei ähnlich wie bereits für MCP-1 beschrieben. Daneben hat Il-8 angiogenetische Eigenschaften⁸⁶, stimuliert die T-Zell Migration¹⁸¹ und fördert die SMC-Proliferation¹⁸⁴. Im Plaque wird Il-8 größtenteils von akti- vierten Makrophagen produziert¹⁷³. Sein Rezeptor CXCR-2 findet sich im fortgeschrittenen Plaque an Stellen hoher Makrophagendichte¹⁹.

1.1.3.3 Integrine und Ig-ähnliche Adhäsionsmoleküle

Integrine sind adhäsive Proteine, die auf Leukozyten ebenso wie auf vielen anderen Zellty- pen präsent sind. Sie sind als Dimere mit jeweils einer α und einer β Untereinheit angeord- net. Bis jetzt wurden mindestens 18 α und 8 β Einheiten identifiziert. Sie vermitteln die Ad- häsion von Zellen an Matrixproteine, zelluläre Gegenrezeptoren und andere Substrate. Bei der Leukozytenrekrutierung sind das α_Lβ₂ (LFA-1, CD11a/CD18) und das α_Mβ₂ (Mac-1, CD11b/CD18) Integrin für die feste Adhäsion von Leukozyten an das Endothel von essen- tieller Wichtigkeit. Die Blockade ihrer β₂ Untereinheit (CD18) durch den Antikörper IB4 reduziert die Zahl fest adhärierender Leukozyten deutlich⁷. α_Lβ₂ wird auf allen reifen Leuko- zyten exprimiert, während αMβ2 nur auf Neutrophilen, Monozyten und Makrophagen expri- miert wird. Das α₄β₁ (VLA-4, CD49d/CD29) Integrin ist konstitutiv auf Lymphozyten und Monozyten vorhanden²⁶. Es kann sowohl transiente als auch feste Adhäsion durch Interakti- on mit seinem Gegenrezeptor VCAM-1 auf aktiviertem Endothel vermitteln¹³. Daher stellt die VCAM-1-VLA-4 Interaktion eine Möglichkeit dar, den Übergang von freiem Fluss im

Blutstrom zu fester Adhäsion auf der Endotheloberfläche - unter bestimmten Voraussetzun- gen - ohne Selektine zu vermitteln.

Wichtige Gegenrezeptoren für Integrine sind ICAM-1 und VCAM-1. ICAM-1, der Rezeptor für β₂-Integrine, wird konstitutiv auf Endothelzellen exprimiert⁷⁹ und kann nach Zytokinsti- mulation deutlich hochreguliert werden. Die Blockade oder eine genetische Aberration von ICAM-1 führt zu einer deutlichen Reduktion der Leukozytenrekrutierung in entzündete Ge- biete⁸. VCAM-1 dagegen wird nicht konstitutiv exprimiert, kann aber rasch nach Behand- lung mit inflammatorischen Stimuli induziert werden. Es vermittelt feste Adhäsion von Leu- kozyten an Endothelzellen durch Interaktion mit seinem Gegenrezeptor ebenso wie es in einem Selektin unabhängigen Mechanismus Rollen vermittelt.

Wichtige Elemente bei der Leukozytenrekrutierung sind folglich P-Selektin, E-Selektin, β₁- und β₂-Integrine mit ihren jeweiligen Gegenrezeptoren sowie die Chemokine MCP-1 und Il- 8. Diese können im atherosklerotischen Plaque in verschiedenen Lokalisationen nachgewie- sen werden⁷¹. Dabei ist P-Selektin stark auf Endothel oberhalb einer fibrösen Kappe expri- miert, nicht aber auf gesundem Endothel⁷⁸. Hingegen kann die Expression von E-Selektin auf Endothelzellen im Plaque nicht sicher nachgewiesen werden⁷⁴. Dieselbe Studie zeigt die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 auf Endothelzellen des atherosklerotischen Plaques, auf glatten Muskelzellen und Makrophagen. Daneben werden auch Chemokine stark im atherosklerotischen Plaque exprimiert. MCP-1 wird hauptsächlich von Makrophagen gebil-

Selectins

Chemoattractants

Integrins

Margination Capture & rolling Activation Adhesion Migration

Leukocyte

Chemoattractants

Endothelium &

basement membrane

Blood

TNFα, IL-1β, etc

Abbildung 1-3: Step-by-step Model der Leukozytenrekrutierung aus dem Blutfluss ^{nach 155}.

det¹¹⁴, darüber hinaus aber auch von glatten Muskelzellen¹¹⁴ sowie Endothelzellen¹⁵⁹. Il-8 findet sich im Plaque vornehmlich mit Makrophagen kolokalisiert¹⁹.

In-vitro Studien auf Aortenendothelzellen (HAEC) zeigen, dass VCAM-1 alleine nicht für die Adhäsion von Lymphozyten verantwortlich sein kann, wohl aber von Monozyten. Da- rüber hinaus ist VCAM-1 an der Schaffung des primären Kontakts und der Transmigration von Monozyten beteiligt^{52, 53}. Die Bindung wird sogar noch erheblich durch chemokinver- mittelte Integrinaktivierung (insb. MCP-1) gesteigert^{54, 178}. In-vivo Studien mit apoE- defizienten Mäusen zeigen die Wichtigkeit von P-Selektin bei der Vermittlung des Rollens, wobei das Rollen durch Blockade von P-Selektin beinahe komplett aufgehoben wird¹³⁶. Im selben Model wird die Adhäsion von Monozyten durch Blockade der VLA-4-VCAM-1- Interaktion mit Antikörpern um 95% reduziert^{71, 136}. Neben P-Selektin und VCAM-1 wird aber auch die Bedeutung von MCP-1 und Il-8 bei der atherosklerotischen Leukozytenrekrutierung mehrfach bestätigt. In-vivo Studien zeigen weiterhin, dass in MCP- 1/CCR-2 knock-out Mäusen die Monozyteninfiltration deutlich reduziert ist²¹, während eine Überexpression von MCP-1 die Größe der atherosklerotischen Läsion deutlich steigert⁴. Um die Wichtigkeit von Il-8 und seines Rezeptors CXCR2 zu zeigen, wurde eine Studie an LDL- Rezeptor defizienten Mäusen durchgeführt. In der einen Gruppe wurden Leukozyten, die den Rezeptor exprimierten, injiziert, in der anderen rezeptordefiziente Leukozyten. Es zeigte sich eine deutlich Reduktion der Leukozytenrekrutierung von CXCR2 defizienten Zellen¹⁹.

1.2 Das Renin-Angiotensin-System

Angiotensin II (AngII) wird aus den Vorstufen Angiotensinogen und Angiotensin I über partielle Proteolyse gebildet. Dabei wird Angiotensin I aus Angiotensinogen mit Hilfe von Renin produziert, AngII aus AngI durch das Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE).

Daneben kann AngII durch die enzymatische Wirkung von tissue-Plasminogen-Activator (t- PA), Cathepsin G und Tonin direkt aus Angiotensinogen entstehen. Dieser Alternativweg wird in geringem Ausmaß lokal eingesetzt. Neben ACE sind auch Chymase, Cathepsin G, Cathepsin D und das Chymostatin-sensitive Angiotensin Generating Enzyme (CAGE) in der Lage AngII aus AngI zu bilden (s. Abb. 1-4). AngII vermittelt seine Effekte vornehmlich über seine zwei Rezeptoren AT1R und AT2R (s. Abb. 1-5, 1-6), welche auf glatten Muskel- zellen, Endothelzellen und Monozyten exprimiert werden.

Dzau zeigt, dass neben dem zirkulie- renden Renin-Angiotensin-Sytem (RAS) auch ein lokales, gewebestän- diges RAS existiert⁴³. Dem zirkulie- renden RAS ordnet man Kurzzeitef- fekte der kardiovaskulären und rena- len Homöostase zu. Hierzu zählen Blutdruckerhöhung oder Vaso- konstriktion. Das gewebeständige RAS ist dagegen für Langzeiteffekte verantwortlich und bezieht sich auf Angiotensin, welches von lokalem Gewebe wie der Gefäßwand syntheti- siert wird und dort seine Wirkung entfaltet. Das RAS liegt im Körper zu über 90% gewebeständig vor. Hohe lokale Angiotensinkonzentrationen können folglich un- abhängig vom Plasma-Angiotensinspiegel sein.

Angiotensinogen

Angiotensin I

Angiotensin II

Angiotensin III

Renin

ACE

Chymase Cathepsin G

CAGE

t-PA Tonin

Peptidase

Das ACE, als unspezifische Metallopeptidase, katalysiert nicht nur die Bildung von AngII, sondern trägt auch zur Inaktivierung der Kinine bei, wie z.B. des potenten Vasodilatators Bradykinin. ACE bildet damit eine Brücke zwischen dem RAS und dem Kallikrein-Kinin- System.

1.2.1 Distribution des Renin-Angiotensin-Systems in der Athe- rosklerose

Die Komponenten des RAS finden sich an verschiedenen Stellen des atherosklerotischen Plaque wieder. AngII, ACE und AT1R werden in der Schulterregion des Plaques in der Nähe CD68 positiver Makrophagen gefunden¹⁴⁹. In normalen Arterien findet sich AT1R vor allem in glatten Muskelzellen der Media, dagegen wird der Rezeptor in atherosklerotischen Pla- ques zusätzlich auf Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen nachgewiesen. Mit zunehmender Progression der Atherosklerose nimmt die Expression von AT1R im Plaque zu⁵⁹. Neben stationären transmigrierten Makrophagen werden AT1R und AT2R ebenso auf humanen nativen mononukleären Zellen exprimiert¹⁵¹.

Die Enzyme zur ACE-unabhängigen AngII-Bildung werden ebenfalls an wichtigen Stellen des atherosklerotischen Plaques gefunden. Chymase ist ein Enzym vor allem in Mastzellen.

Diese finden sich normalerweise nur in der Gefäßadventitia, im Plaque sind sie allerdings Angiotensin (1-7)

Amino- endo- peptidase

Abbildung 1-4: Bildung von AngII. Dicke Pfeile mar- kieren die Wege der systemischen AngII Bildung, dünne Pfeile die alternativen Wege der lokalen AngII Formati- on^{nach 66}.

auch in der Schulterregion angereichert⁸⁰. In rupturierten Plaques lässt sich eine hohe Chy- masekonzentration nachweisen⁹³. Daneben werden Cathepsin G und D auch in Monozyten und SMC synthetisiert, was in beiden Fällen eine ACE-unabhängige AngII-Synthese nach sich zieht⁷⁰. Cathepsin D findet sich im fortgeschrittenen atherosklerotischen Plaque in Schaumzellen angereichert, in frühen atherosklerotischen Läsionen kann Cathepsin D dage- gen nicht nachgewiesen werden⁸¹.

1.2.2 Angiotensin II als Entzündungsmediator in der Atheroskle- rose

Die Extravasation von mononukleären Zellen stellt einen entscheidenden Schritt bei der in- flammatorischen Progression der Atherosklerose dar. AngII hat dabei wichtigen Einfluss auf die verschiedenen Schritte der Extravasation, indem es zur Expression von Adhäsionsmole- külen und Chemokinen beiträgt und mononukleäre Zellen aktiviert.

Piqueras weist in-vivo eine Hochregulation von P-Selektin durch AngII nach, was eine er- höhte Rekrutierung von Leukozyten zur Folge hat¹²⁹. Die Expression von E- und P-Selektin sind auch in-vitro durch AngII induzierbar57, 58, 161. Weitere in-vitro Studien zeigen, dass AngII direkten Einfluss auf die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 auf Endothelzellen und glatten Muskelzellen hat^{125, 132}. In verschiedenen Tiermodellen wurde kürzlich gezeigt, dass die AngII-vermittelte Expression von ICAM-1 und VCAM-1 durch AT1R/MAP-Kinase und Redox-Signalwege gesteuert wird, vom Blutdruck aber unabhängig ist. Damit belegen Studien unterschiedlichen Designs, dass AngII in der Lage ist, Adhäsionsmoleküle, die bei der Leukozytenextravasation in der Atherosklerose eine wichtige Rolle spielen, zu induzie- ren.

Nicht nur Selektine und CAMs werden von AngII reguliert, sondern auch die Expression von Chemokinen wird von AngII beeinflusst. Bei Patienten mit kardiovaskulären Erkran- kungen kann der erhöhte MCP-1-Spiegel im Plasma durch AT1R-Antagonisten deutlich reduziert werden¹³⁴. Auch die Behandlung mit ACE-Hemmern reduziert den Plasma-MCP-1 Spiegel¹⁵⁴. Außerdem wird in verschiedenen Tiermodellen die Monozytenrekrutierung nach Behandlung mit ACE-Hemmern aufgrund einer Reduktion der MCP-1-Expression verrin- gert^{67, 68}. In Apo-E-defizienten Mäusen reduziert der AT1-Antagonist Irbesartan die Monozy- tenrekrutierung durch eine Reduktion der MCP-1- und MIP-1α Produktion⁴².

Neben der Regulation von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen beeinflusst AngII noch andere inflammatorische Ereignisse bei der Progression der Atherosklerose. AngII induziert die Bildung von ROS und verringert damit die Verfügbarkeit von NO, was das Entstehen der endothelialen Dysfunktion in frühen Stadien der Atherosklerose begünstigt¹¹⁶. Weiterhin stimulieren ROS die Oxidation von LDL und fördern damit die Akkumulation von oxLDL

und die Schaumzellbildung¹⁵⁶. Plasminogen Activator Inhibitor (PAI-1) wird durch AngII verstärkt gebildet und führt damit zu einer Hemmung der Fibrinolyse mit konsekutiver Thromboseneigung¹⁷⁰.

1.2.3 Funktionelle Signaltransduktion via AT1R und AT2R

Die AngII-Rezeptoren vermitteln die Wirkung des RAS. Heute sind vier Subtypen von AngII-Rezeptoren bekannt, von denen AT1R und AT2R bei kardiovaskulären Erkrankungen am wichtigsten sind¹⁷².

1.2.3.1 AT1R

Das humane AT1R Gen ist auf der q22 Bande des Chromosoms 3 lokalisiert und wurde zum ersten Mal 1992 geklont¹¹. Es enthält 359 Aminosäuren und gehört in die Gruppe der G- Protein-gekoppelten Rezeptoren, die durch sieben transmembranäre Domänen charakterisiert sind. Im Gegensatz zu Nagetieren werden beim Menschen keine AT1R-Subtypen gefunden.

Abbildung 1-5 gibt einen schematischen Überblick über die Signaltransduktion an AT1R wieder. Bindung von AngII an AT1R führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptors, was eine Entkopplung des Gq Proteins nach sich zieht¹¹⁹. Dies aktiviert PLC, was wiederum zur Generation von DAG und IP3 aus PIP2 führt. DAG erhöht die intrazelluläre Ca²⁺ Kon- zentration durch PKC Aktivierung, was zu Ca²⁺ Einstrom aus dem Extrazellärraum führt, IP3 steigert die intrazelluläre Ca²⁺ Konzentration durch Freisetzung von Ca²⁺ aus intrazellulären Speichern. Dieser Konzentrationsanstieg führt u. a. zu Vasokonstriktion.

Aktivierung von AT1R reguliert daneben auch Tyrosinkinasen. Diese bewirken eine Tyro- sinhyperphosphorylierung, was die Aktivierung der MAP Kinasenkaskade zur Folge hat.

MAP Kinasen und PKC führen zur Induktion von Transkriptionsfaktoren, die Zellwachstum und Proliferation bewirken¹².

In einem dritten Signalweg aktivieren JAK und STAT über PTK NF-κB^{105, 146}. NF-κB Akti- vierung führt zu inflammatorischen und proliferativen Prozessen^{68, 156}.

Schließlich führt die Bindung von AngII an AT1R auch zur Stimulation von membrange- bundenen NADH/NADPH-Oxidasen, was zur Bildung reaktiven Sauerstoffs führt¹⁸⁵. Die Reduktion von NO durch ROS resultiert in einer Vasokonstriktion. Ferner fördern ROS auch die Oxidation von LDL und führen damit zu erhöhter Atherogenität⁸³.

AT1R

NADH/NADPH

oxidases Ç JAK/STAT Ç Gq uncoupling Tyrosine kinases Ç

Tyrosine phosphorylation

MAPkinases Ç

AT1R ist bei verschiedenen pathologischen Zuständen, insbesondere nach mechanischer Manipulation, bei turbulentem Fluss und bei Dehnung, in der Gefäßwand erhöht. Patienten mit Hypercholesterinämie weisen ebenfalls eine verstärke Expression von AT1R auf¹⁵⁷. Im Vergleich zur stabilen Angina Pectoris ist AT1R bei instabiler Angina Pectoris erhöht¹¹⁵. Bei chronischer Herzinsuffizienz hingegen ist AT1R weniger im Herzen exprimiert als im ge- sunden Herzen. Dies ist vermutlich als Kompensationsmechanismus auf die erhöhte AngII- Produktion zurückzuführen⁹.

1.2.3.2 AT2R

Das Gen für AT2R ist auf der q22 Bande des X-Chromosoms lokalisiert. AT2R besteht aus 363 Aminosäuren und gehört wie AT1R in die Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezepto- ren.

Einen schematischen Überblick der Signaltransduktion an AT2R gibt Abbildung 1-5 wieder.

Nach AngII-Bindung kommt es zu einer Entkopplung von G_i¹⁸⁶. Dies aktiviert PP2A und PTP, was die Protein-Serin/Threonin und Protein-Thyrosin Phosphorylierung reduziert. Da- durch wird die AT1R-vermittelte MAP-Kinase-Aktivierung supprimiert. Konsekutiv werden Zellwachstum und Proliferation vermindert¹¹¹. Daneben führt die AT2R-Aktivierung über die intrazelluläre Bildung von Ceramid und ROS zur Stimulation von NF-κB¹⁴⁶. In verschie- denen Tiermodellen wird gezeigt, dass AT2R-Bindung zur Aktivierung eines Bradyki- nin/NO-cGMP Weges führt, was eine Vasodilatation nach sich zieht^{99, 153}.

AT2R ist im Wesentlichen als Gegenspieler zu AT1R zu verstehen. In Tiermodellen hemmt AT2R die Proliferation von SMC und Endothelzellen. Daneben vermittelt AT2R die Diffe- renzierung von SMC und wirkt proapoptotisch. Dies ist insbesondere während der fötalen Entwicklung von Bedeutung¹²¹. Daher ist AT2R in der Fötalzeit in vielen Geweben expri- miert, danach ist seine Expression stark regredient⁵⁶. Beim Erwachsenen wird er in Atrium

AT2R

ROS Ç Ceramide Ç Gi uncoupling BK Ç

Gene transcription factors Ç (c-fos, c-myc, c-jun) Growth and proliferation PLC Ç

DAG Ç IP3 Ç

PKC Ç

Intracellular calcium Ç

Vasokonstriction PTK Ç AP-1 Ç

ROS

NO È OxLDL Ç NF-κB Ç

Vasokonstriktion Inflammation Proliferation Coagulation

Increased atherogenicity

Inflammation Proliferation

NF-κB Ç

Inflammation

PP2A Ç PTP Ç

Protein-ser/thre Phosphorylation È

NO Ç

cGMP Ç Protein-tyrosin Phosphorylation È

MAP kinases È

Vasodilatation Cell growth È

Apoptosis Ç

Abbildung 1-5: Signaltransduktion an AT1R (links) und AT2R (rechts)^{nach 172}.

und Ventrikel des Herzens¹⁶⁶, der Adventitia der A. interlobularis der Niere, im Gehirn und in geringem Ausmaß in anderen Organen exprimert. In Ratten wird AT2R auch in Endothel- zellen gefunden, nicht aber in SMCs¹⁷⁴.

1.2.4 ACE-Hemmer

Ende der siebziger Jahre lag mit Captopril, dem Prototyp der ACE-Hemmer, der erste blut- drucksenkende ACE-Inhibitor vor. Heute sind eine Vielzahl an ACE-Hemmern auf dem Markt, denen allen der gleiche Effekt, die Hemmung der AngII-Synthese und die Erhöhung der Bradykinin-Bildung, zugrunde liegt. Antiatherogene Effekte dieser Substanzen konnten schon in vielen Tiermodellen nachgewiesen werden. So werden antiproliferative, antithrom- botische, plaquestabilisierende und vasoprotektive Wirkungen gefunden. Chobanian et al.

untersuchen die Auswirkungen von Captopril in hyperlipidämischen Kaninchen und finden eine Reduktion und Stabilisierung der atherosklerotischen Läsionen²⁹. Gleiche Resultate finden sich auch bei cholesterolgefütterten Affen² und beim Minischwein.

Riezebos et al. zeigt eine deutliche Reduktion von Plaques in der Aorta und eine Verbesse- rung der endothelabhängigen Relaxation unter der Behandlung mit Ramipril¹⁴³. Ebenso kann Becker et al. in-vivo eine Erhöhung der cGMP im Endothel der Aorta nachweisen¹⁰. Zurück- zuführen ist dies auf eine lokal gesteigerte Aktivität von NO. Diese wird wiederum hervor- gerufen durch die erhöhte endotheliale Bradykinin-Aktivität infolge der ACE-Hemmung durch Ramipril²⁴. Letztendlich kommt es zu einer verstärkten Vasodilatation und einer Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen. Auch in-vitro zeigt sich eine erhöhte cGMP-Bildung in Endothelzellen, die durch Ramipril und Bradykinin gesteigert werden kann.

1.3 Bedeutung von NF-κB in der Atherosklerose

NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor (TF), der eine Vielzahl von Zielgenen, die mit der Pro- gression der Atherosklerose in Verbindung stehen, aktiviert. Darunter finden sich Zytokine, Chemokine (v. a. Il-8, MCP-1), Adhäsionsmoleküle (u. a. ICAM-1, VCAM-1) und weitere Gene, die für die Zellproliferation und das Überleben der Zelle eine wichtige Rolle spielen³⁶.

Die Aktivierung von NF-κB untersteht einer Gruppe von Inhibitoren, den IκBs, die an NF- κB Dimere binden und damit den NF-κB Komplex im Zytoplasma zurückhalten. Durch Phosphorylierung und Aktivierung der IκB Kinase (IKK) werden IκBs aktiviert, die dann rasch ubiquitiniert und damit Ziel der proteolytischen Degradation in Proteasomen werden.

Nachdem NF-κB von seinem Inhibitor befreit wurde, wandert das freie NF-κB, ein Hetero- dimer mit zwei Untereinheiten (p50, p65), in den Nukleus, wo es als TF aktiv werden kann¹⁰².

AngII produziert über die NADH/NADPH-Oxidase ROS, wie z.B. H2O2. Diese wiederum aktivieren NIK und MEKK-1, die beide in der Lage sind, den IKK-Komplex zu aktivieren und damit NF-κB Dimere aus dem Komplex mit IκB freizusetzen. Insbesondere MEKK-1 führt neben der Aktivierung von IKK auch zur Aktivierung von c-fos und c-jun, welche ih- rerseits AP-1 aktivieren, was zu einer Induktion von Entzündungsmediatoren und Proteinen der extrazellulären Matrix führt¹⁰². Neben dem Signalweg über ROS und MEKK-1/NIK tragen zwei weitere Wege zur NF-κB-Aktivierung durch AngII bei. PKC, die durch DAG und IP3 aktiviert wird, führt ebenfalls zu einer Aktivierung von NF-κB⁷⁷. Auch über JAK/STAT kommt es zu einer Aktivierung von NF-κB¹⁷². Damit sind alle vier AT1R abhän- gigen Signaltransduktionswege in der Lage, direkt oder indirekt NF-κB in der Zielzelle zu aktivieren.

In Studien zum Zusammenhang zwischen NF-κB und AngII wird gezeigt, dass AngII über eine Aktivierung von NF-κB und der daraus folgenden MCP-1- und Il-8-Expression in ei- nem Tiermodel zu einer verstärkten Monozyteninfiltration in die Neointima führt⁶⁸. Im glei-

chen Tiermodel wird gezeigt, dass ACE-Hemmer über eine Reduktion der NF-κB-Aktivität und der damit verbun- denen Reduktion NF-κB-abhängiger Zytokine und Chemokine eine Verlang- samung der Monozyteninfiltration be- wirken⁶⁷. Die Stimulierung von MCP-1 durch AngII ist in diesen Studien vor allem SMC-abhängig. In anderen Stu- dien wird die Induktion von ICAM-1 und VCAM-1 nach AngII-Stimulation gezeigt. Dies ist ein Prozess, der abhän- gig von ROS und NIK ist, beides Fakto- ren, die NF-κB in der Zielzelle aktivie- Abbildung 1-6: Aktivierung von NF-kB durch ver-

schiedene Stimuli^{nach 36}.

ren^{38, 132}.

Neben AngII stimulieren und aktivieren viele weitere Atherosklerose-relevante Substanzen wie AGE, oxLDL, LPS, verschiedene Zytokine und Matrixproteine NF-κB³⁶ (s. Abb. 1-6).

1.4 Fragestellung

AngII wird durch ACE und andere Enzyme wie Chymase, Cathepsin G und CAGE gebildet, wobei lediglich ACE durch ACE-Hemmer inhibiert wird. Die anderen werden durch Protea- seinhibitoren gehemmt. Cathepsin G ist ein Enzym, das vor allem in neutrophilen Granulo- zyten exprimiert wird. Diese haben in der Atheroskleroseprogression vermutlich nur einen geringen Stellenwert, wenngleich sie in regem Kontakt mit dem atherosklerotischen Plaque stehen⁴⁶. Daneben werden Cathepsin G und D auch in Monozyten und SMC synthetisiert, was in beiden Fällen eine ACE unabhängige AngII-Synthese nach sich zieht⁷⁰. Dagegen wird Chymase vor allem in Mastzellen exprimiert, die in der normalen Gefäßwand einen Anteil von 0,1% aller kernhaltigen Zellen haben. Bei der Entwicklung der „fatty streaks“ erhöht sich der Anteil von Mastzellen allerdings um das Neunfache, im fortgeschrittenen Plaque ist der Anteil sogar um das 50fache gesteigert. In der gleichen Studie wird eine hohe Chyma- seaktivität der Mastzellen im Plaque gezeigt⁸⁰.

Die Bildung von AngII in menschlichen Arterien ist in hohem Maß von CAGE, Cathepsinen und Chymase abhängig, während ACE nur etwa 30-40% des AngII im Plaque bildet¹²². Ara- kawa et al. zeigen, dass die AngII-Bildung im atherosklerotischen Plaque im Vergleich zur normalen arteriellen Wand um ein Mehrfaches gesteigert ist. In atherosklerotisch veränder- ten Gefäßen macht die Chymase-abhängige AngII-Produktion etwa 80-90% der gesamten AngII-Formation aus, der Rest wird durch ACE und Cathepsine synthetisiert⁶.

Trotz der erheblichen ACE-unabhängigen AngII-Synthese im Plaque haben sich ACE- Hemmer in klinischen Studien als sehr wirkungsvoll bei der Vorbeugung von Herzinfarkt und Schlaganfall erwiesen. In der HOPE-Studie hatten Patienten täglich 10mg Ramipril im Vergleich zur Placebokontrolle bekommen. Die übrige medikamentöse Therapie erfolgte nach den derzeitig gültigen Richtlinien. Unter dieser Behandlung wird das Auftreten von Herzinfarkten um 20% und von Schlaganfällen um 32% im Vergleich zur Kontrolle ge- senkt⁶⁴. Daneben wird in einer Unterstudie von HOPE, der SECURE-Studie, gezeigt, dass bei Behandlung mit dem ACE-Hemmer Ramipril die Progression der Atherosklerose in den Carotiden deutlich verlangsamt wird¹⁰¹. In beiden Studien wird der Blutdruck nicht wesent- lich beeinflusst, so dass eventuell ein Effekt unabhängig von der blockierten AngII-Bildung für den positiven Effekt verantwortlich sein könnte. Studien, welche die Wirksamkeit von AT1R-Antagonisten und ACE-Inhibitoren miteinander vergleichen, zeigen keine signifikan- ten Unterschiede hinsichtlich der Mortalität¹²⁷.

Da unter ACE-Inhibition AngII in großen Mengen bereitgestellt wird, die Ergebnisse aus vergleichenden Studien zwischen AT1R-Antagonisten und ACE-Hemmern dennoch ver- gleichbare Ergebnisse liefern, stellt sich die Frage, ob ACE-Hemmer neben der Enzymblok- kade noch durch Modifikationen an anderen Stellen des RAS Einfluss auf die Progression der Atherosklerose nehmen. Weiterhin wirft die Diskrepanz zwischen den guten Effekten von ACE-Hemmern in klinischen Studien und der deutlichen ACE-unabhängigen AngII- Bildung im atherosklerotischen Plaque ebenfalls die Frage auf, ob ACE-Inhibitoren neben der Blockade von ACE noch weitere antiatherogene Effekte besitzen.

Um dies herauszufinden, untersuchen wir die AngII-abhängige Chemokinproduktion in hu- manen Monozyten aus peripherem Blut. Die Zellen werden mit dem ACE-Hemmer Ramipri- lat, dem aktiven Metaboliten von Ramipril, behandelt und zugleich mit AngII stimuliert um die AngII-Bereitstellung via Chymase, CAGE und Cathepsin G/D zu imitieren. Der Effekt

Angiotensin II AT1-R

AT2-R

Chemokinexpression (Il-8, MCP-1)

Mononukleäre Infiltration

Plaquestabilität ACE Inhibitoren

Transkription (NF-κB) AngiotensinI ACE Chymase

Cathepsin G CAGE

?

?

Monozyten Endothelzellen

Adhäsionsmolekülex- pression (Selectins, CAMs)

Abbildung 1-7: Arbeitshypothese: Trotz ACE-Inhibition wird durch alternative Wege (Chymase, Cathepsin G) lokal AngII produziert, was über Zytokinstimulation und der Expression von Adhäsi- onsmolekülen die Monozyteninfiltration unterhält. Damit wird die Plaquedestabilisierung vorange- trieben. Fraglich ist, ob ACE-Hemmer auch an anderen Stellen der Vermittlung der AngII Wirkung eingreifen, dies ist Gegenstand dieser Studie.

von Ramiprilat wird auf verschiedenen Ebenen untersucht: Expression der AngII- Rezeptoren, NF-κB Aktivität, Expression von Chemokinen.

In einem weiteren Versuchsabschnitt werden vergleichbare Experimente mit humanen Na- belschnurendothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Diese werden mit AngII und Ramiprilat behandelt. Dass der Effekt von Ramiprilat auf HUVEC unabhängig von der ACE-Inhibition ist, wird wiederum auf mehreren Ebenen untersucht: Expression der AngII-Rezeptoren, Ad- häsionsmolekülexpression, p65-Translokation. Die physiologische Relevanz wird mit Fluss- kammerexperimenten dargestellt. Daneben werden immunhistochemische Färbungen von AT1R, Adhäsionsmolekülen sowie AngII-produzierender Enzyme im atherosklerotischen Plaque zur Überprüfung einer Kolokalisation derer angefertigt.

2 Materialien und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Zellkultur

Basalmedium für Endothelzellen, Supplement zum Wachstumsmedium für Endothelzellen (Promocell, Heidelberg, Deutschland), Medium RPMI 1640, fötales Kälberserum (FCS), L- Glutamin, Penicillin, Streptomycin, EDTA-Lösung 1% in PBS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺), Try- panblau, Biocoll (Biochrom, Berlin, Deutschland), Accutase (PAA, Linz, Österreich), Falcon Gewebekulturplatte (6, 12, 24, 48 Vertiefungen), Falcon Gewebekulturflasche (60 ml, 250 ml), Falcon konisches Röhrchen (15 ml, 50 ml), Falcon Einwegpipette (2, 5, 10, 25 ml), Falcon Rundbodenröhrchen, Dreiwegehahn, Spritze (10, 20, 50 ml) (Becton Dickinson, Hei- delberg, Deutschland), Dispase (2,4 U/ml), Dulbeccos PBS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺) (Gibco, Karlsruhe, Deutschland), Zellschaber (NUNC, Wiesbaden, Deutschland), Kochsalzlösung 0,9% (Baxter, Unterschleißheim, Deutschland), Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg, Deutschland), Kryoröhrchen (Nalge Company, Rochester, USA), Bakterienfilter (Porengröße 0,2 µm) (Sartorius, Göttingen, Deutschland), Angiotensin II, PD123.319, bovines Serumal- bumin (BSA), Natriumazid (NaN₃), Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), THP-1 (American Type Culture Collection).

Ramiprilat wurde freundlicherweise von der Firma Aventis zur Verfügung gestellt. Losartan und Simvastatin wurden von der Pharmafirma Merck zur Verfügung gestellt.

2.1.2 RT-PCR

RNeasy mini kit, RNase-free DNase Set (Qiagen, Maryland USA), Il-8, MCP-1, GAPDH Primer (MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland), 5fach Probenpuffer (Biorad, München, Deutschland), Ethidiumbromid (Fluka, Taufkirchen, Deutschland), Tris-borat, EDTA, Aga- rose (Roth, Karslruhe, Deutschland), ThermoScipt One-Step RT-PCR kit, 1Kb DNA Ladder (Invitrogen/Life, Karlsruhe, Deutschland), β-Mercaptoethanol (β-ME) (Sigma, Taufkirchen, Deutschland).

2.1.3 Bestimmung von MCP-1 und Il-8

MCP-1 ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Kat. Nr. DCP00, Deutschland), Immulite Kit (DPC, Los Angeles, USA, Kat. Nr. LK8P1).

2.1.4 Durchflusszytometrie

Anti-AT1 (306) rabbit polyclonal IgG, anti-AT2 (H-143) rabbit polyclonal IgG, anti-human p65 F-6 (Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland), anti-human CD106 PE (CBL 206P), anti- human CD62E PE (CBL180P) (Cymbus, Hant, UK), anti-CD62P FITC, anti-CD54 PE, mou- se IgG1 PE Isotype, mouse IgG1 FITC Isotype (BD Biosciences, San Diego, USA), anti- rabbit IgG FITC conjugated (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), mouse IgG1, goat anti- mouse IgG-FITC (Dako, Hamburg, Deutschland).

2.1.5 Western Blot Analyse

ECL-Plus Western Blot Detection Kit, Hybond-P PVDF Membran, Meerrettich-gekoppelter donkey anti-rabbit IgG (Amersham, Little Chalfont, UK), Aprotinin, Leupeptin, PMSF, Tetramethylendiamin (TEMED), Tween 20, Bromphenolblau, Ponceau S, Triton X-100 (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), Trishydroxymethylaminomethan (Tris), Glycin¸ NaCl, Ammoniumperoxodisulfat (APS), Natriumdodecylsulfat (SDS) (Merck, Darmstadt, Deutsch- land), Röntgenfilm X-Omat, Kodak GBX Developer and Fixer Twin Pack (Kodak, UK), 30% Acrylamid/Bisacrylamid, Proteinstandard Broad Range, Bio-Rad Protein Assay, Non- Fat Dry Milk (Biorad, München, Deutschland), Methanol (Schuchard, Höhenbrunn, Deutschland), Na-Deoxycholat (Roth, Karlsruhe, Deutschland), Glycerol, Essigsäure (Fluka, Taufkirchen, Deutschland), Faltenfilter (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland).

2.1.6 EMSA

Whatmann D-81 Papier (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland), Nuclear binding buf- fer (Promega, Mannheim, Deutschland), poly dl/dC (Pharmacia), anti-p65(A), anti- p50(MLS), anti-c-rel(N466)X, anti-Rel-B (C-19)X, anti-p52(447)X (Santa Cruz, Heidel- berg, Deutschland), Hepes-KOH, MgCl₂, DTT, Benzamidin, NP-40 (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), Sephadex G25 (Amersham, Little Chalfont, UK).

2.1.7 Immunhistochemie

Färbetröge (Roth, Karlsruhe, Deutschland), Aquatex, Deckgläschen, SuperFrost Plus (Schu- bert und Weiss, Deutschland), DAKO LSAB + System AP, Hämatoxylin, DAKO-Pen, mou- se IgG1 (Sigma, München, Deutschland), rabbit serum (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland), anti-cathepsin G Ab-1 clone 19C3, anti-chymase Ab-1 clone CC1, anti-VCAM-1 Ab-3 clone 1.4C3 (Lab Vision, Westinghouse, USA), Xylol, Ethanol, Zitronensäure (Merck, Darmstadt, Deutschland).

2.1.8 Geräte

Durchflusszytometer: FACS Calibur inkl. Cellquest Software (Becton Dickinson, Hei- delberg, Deutschland)

Photometer: Spectra Max Plus (Molecular Devices, München, Deutschland) Soft Max Pro Software: (Molecular Devices, München)

Brutschränke: (Heraeus, Hanau, Deutschland) Mikroskope: Olympus IX70

Phosphorimager: Fuji BAS2000Phosphorimager (Fuji, Kanagawa, Japan) Blotdokumentation: MultiImage™ Light Cabinet (Alpha Innotech Corp, USA) Digitalkammera: Nikon DXM1200 inkl. LUCIA Measurement 4.71 Spritzenpumpe: Harvard Apparatus (Harvard, South Natick, USA)

Analogkamera: Olympus OM4

Pipetten: Eppendorf Reference (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Zentrifugen: 3K15 und 4K15 (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) Eppendorf 5417 R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Wasserbad: (Memmert, Schwabach, Deutschland)

Gefrierschrank (-80ºC): (Heraeus, Hanau, Deutschland)

Elektrophoresekammer: Mini-PROTEAN 3 Cell, Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer

Cell (BioRad, München, Deutschland)

Western Blot-Gerät: Trans-Blot SD (BioRad, München, Deutschland) Röntgenkassette: (Dr. Goos GmbH, Heidelberg, Deutschland)

Flusskammer: Glycotech Parallel Wall Flow Chamber (Glycotech, Maryland, USA)

Thermoshaker: CLF Schutron Thermoshaker (Wolf Laboratories Ltd., York, UK)

Mikrowelle: Privileg 9021

PCR Gelkammer: Wide Mini-Sub Cell GT (Biorad, München, Deutschland) PCR-Maschine: Touch Down (Hybaid, Milford, USA)

Orbitalshaker: Shake ‘n’ Stack (Hybaid, Milford, USA)

Immulitelesegerät: Immulite Turbo (DPC Biermann GmbH, Bad Nauheim, Germany)

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

2.2.1.1 Isolation und Kultur der humanen Monozyten 2.2.1.1.1 Prinzip

Bei der Isolation mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMNC) mittels Dichtegra- dientenzentrifugation mit einer Mischung aus Ficoll und Na-Metrizoat macht man sich die Dichteunterschiede der verschiedenen Leukozytenpopulationen, der Erythrozyten sowie der Thrombozyten zu Nutze. Während sich bei der Zentrifugation die PBMNCs und die Throm- bozyten auf der Oberfläche des Gradienten als Interphase zwischen Plasma und zellulären Bestandteilen sammeln, sedimentieren die Granulozyten wegen ihrer höheren Dichte auf dem Boden des Röhrchens. Das Ficoll-Sucrosepolymer aggregiert die Erythrozyten, so dass diese bei Zentrifugation ebenfalls durch den Gradienten wandern. Thrombozyten werden durch anschließende Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit von den PBMNCs ge- trennt. Das Pellet der PBMNCs besteht zu 5% aus B-Lymphozyten, zu 60-70% aus T- Lymphozyten, zu 5-15% aus NK-Zellen sowie zu 5-15% aus Monozyten. Zur weiteren Auf- trennung via Adhärenz macht man sich dabei die Eigenschaft der Monozyten zu Nutze, dass diese innerhalb einer sehr kurzen Zeit am Plastik von Zellkulturflaschen adhärieren, während Lymphozyten im Überstand bleiben und herausgewaschen werden können18, 40, 140.

2.2.1.1.2 Vorgehen

Zunächst wird peripheres Blut durch Venenpunktion von gesunden und freiwilligen Spen- dern gewonnen. Um eine Gerinnung zu verhindern werden 2 IE Heparin/ml in einer 50ml

FSC FSC

SSC SSC

Abbildung 2-1: Reinheitsanalyse der nativen Monozyten nach Isolation mit Ficoll und Adhä- renz. Das entsprechende Gate ist auf die Monozytenfraktion gesetzt. Abgebildet sind zwei repräsenta- tive Dot Plots.

Spritze vorgelegt. Das hepariniserte Vollblut wird 1:1 mit PBS gemischt um die Zellkonzent- ration zu reduzieren und damit die Reinheit und Effektivität der Prozedur zu erhöhen. Da- nach werden in einem 50 ml Zellkulturröhrchen 14 ml Ficoll-Paque vorgelegt und vorsichtig mit dem Gemisch aus Vollblut und PBS überschichtet. Es folgt eine Zentrifugation bei 400g für 40 min. Anschließend wird die Interphase in ein steriles Röhrchen überführt und mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Der nächste Zentrifugationsschritt bei 300 g für 20 min dient dem Auswaschen des Ficoll. Das resultierende Zellpellet wird in 50 ml PBS resuspendiert und bei 100 g für 10 min zentrifugiert um die PBMNCs von den Thrombozyten zu trennen. Dieser Schritt wird nochmals wiederholt, bevor die PBMNCs in Medium (M199 mit 10% hitzeinak- tiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin) in einer Konzentration von 1×10⁷/ml ausgesät werden. Nach 45-minütiger Inkubation im Brut- schrank wird der Überstand, der die lymphozytären Zellen enthält, abpipettiert, die adhären- ten Zellen werden viermal mit PBS gewaschen. Medium wird wieder hinzugegeben, und die Monozyten werden im Brutschrank kultiviert.

Üblicherweise kann mit dieser Methode eine Monozytenreinheit von über 80% erzielt wer- den (s. Abb. 2-1). Bei geringeren Reinheiten werden die Zellen nicht für Versuche verwen- det.

2.2.1.2 Kultur der monozytären Zelllinie THP-1

THP-1 Zellen werden in RPMI 1640 mit 10% FCS kultiviert. Die Zellen werden in einer Konzentration von 1×10⁵/ml ausgesät und nach zwei Tagen gesplittet. Die Zellkonzentration von 1×10⁶/ml sollte nicht überschritten werden. Überflüssige Zellen werden entweder ver- worfen oder aber in Medium in 10% DMSO in FCS in flüssigem Stickstoff konserviert. Vor dem jeweiligen Versuch werden THP-1 Zellen in einer Konzentration von 1×10⁶/ml mit RPMI 1640 ohne FCS in einer 6-well Platte ausgesät. Anschließend erfolgt die Stimulation entsprechend des Protokolls.

2.2.1.3 Isolation und Kultur von humanen Nabelschnurzellen 2.2.1.3.1 Prinzip

Die Nabelschnurvene wird zunächst mit 0,9% NaCl gewaschen. Anschließend wird ein En- zym in das Lumen der Nabelschnur injiziert, wodurch die Endothelzellen von der Basal- membran sowie auch die Endothelzellkontakte untereinander gelöst werden. Es folgt das Auswaschen abgelöster Endothelzellen und deren Kultur⁷⁶.

2.2.1.3.2 Vorgehen

Die Nabelschnüre werden von der gynäkologischen Abteilung des Klinikums Nürnberg Süd gesammelt und bis zur Abholung bei 4°C in NaCl mit 1% Penicillin/Streptomycin gelagert.

Bei der Isolation der Endothelzellen wird grundsätzlich autoklaviertes chirurgisches Besteck, bestehend aus Gefäßklemmen, Gefäßsonden, Pinzetten und Scheren, verwendet. Darüber hinaus kommt steriles Einmalmaterial wie Dreiwegehähne, Spritzen und Mediumfilter (Po- rengröße 0,2 µm) zur Verwendung.

Dispase wird mit einer Aktivität von 2,4 U/ml präpariert (z.B. 60 mg Dispase in 30 ml PBS bei 37°C gelöst). In die Nabelschnurvene wird eine Sonde eingeführt und mit Hilfe einer Klemme so fixiert, dass die Vene nach oben hin dicht abgeschlossen ist. Anschließend wird die Vene mit isotoner NaCl-Lösung gespült. Das distale Ende der Nabelschnur wird danach ebenfalls abgeklemmt. Daraufhin wird der Dreiwegehahn auf die Sonde aufgesteckt, auf den Dreiwegehahn wird schließlich noch der Mediumfilter montiert. Über den Filter und den Dreiwegehahn wird dann die Dispase-Lösung in die Vene injiziert, bis diese prall gefüllt ist.

Es folgt eine 30-minütige Inkubation der Nabelschnüre bei 37°C. Nach Ablauf der Inkubati- onszeit wird die Schnur desinfiziert und kräftig mit zwei Fingern massiert. Nun wird die untere Klemme entfernt und die Zellsuspension in einem sterilen Zellkulturröhrchen gesam- melt. Zur Neutralisierung des Enzyms wird dem Zellkulturröhrchen Endothelzellmedium mit 10% FCS zugefügt. Das Röhrchen wird nun bei 100 g für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wird dann in 10 ml Endothelzellmedium resuspendiert, in einer Zellkulturflasche ausgesät und im Brutschrank kultiviert.

Am Tag nach der Isolation werden die HUVEC mit PBS gewaschen, um Erythrozyten im Überstand zu entfernen. Die weitere Behandlung der Zellen erfolgt nach Protokoll.

2.2.2 RNA-Isolation 2.2.2.1 Prinzip

Bei der RNA-Isolation mittels RNeasy Mini Kit werden die Zellen zunächst in einem guani- dinisothiocyanathaltigen Puffer lysiert und homogenisiert. Dabei werden RNasen sofort in- aktiviert. Nach Zugabe von Ethanol wird die Probe auf eine Säule geladen, die in ihrer Mitte eine Membran enthält. Bei der anschließenden Zentrifugation bindet die RNA an die Memb- ran und kann dort mit Puffern aufgereinigt werden, bevor die RNA mit RNase-freiem Was- ser eluiert wird.

2.2.2.2 Durchführung

Nach der Stimulation der Zellen gemäß des entsprechenden Versuchsprotokolls werden die Zellen geerntet und in einem Zellkulturröhrchen bei 4°C zentrifugiert. Alle weiteren Schritte werden ausschließlich auf Eis durchgeführt. Das Zellpellet wird in „Buffer RLT“ aufge- nommen und zur Homogenisierung wird das Lysat auf ein „QIAshredder“ Röhrchen pipet- tiert und anschließend zwei Minuten bei 12000 U/min zentrifugiert. Das Homogenat wird mit 70%igem Ethanol gemischt. Das Gemisch wird auf eine „RNeasy Mini“ Säule gegeben und anschließend für 15 s bei 12000 U/min zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen, die Gesamt-RNA ist nun an die Membran im Röhrchen gebunden. Zur weiteren Aufreinigung erfolgt ein DNA-Verdau mit dem RNase-free DNase Set. Dazu werden 80 µl DNase (3 U/µl) auf die Membran pipettiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Membran mit „Buffer RW1“ gewaschen und bei 12000 U/min für 15 s zentrifugiert. Zur weiteren Aufreinigung wird die RNA zweimal mit „Buffer RPE“ gewaschen. Die RNA wird mit 30 µl RNase freiem Wasser eluiert und bei -20°C tiefgefroren.

2.2.2.3 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit

In einem Spektrophotometer wird die Absorption der RNA bei 260nm und 280nm gemessen.

Daraus lässt sich Reinheit und Menge der isolierten RNA bestimmen.

Eine Absorption von 1 bei 260nm entspricht einer RNA-Konzentration von 40µg/ml. Aus diesem Verhältnis kann nach Formel 2-1 die Konzentration der isolierten RNA errechnet werden, wenn der Wert für die Absorption bei 260nm bekannt ist:

sfaktor Verdünnung A

ion

Konzentrat _RNA =40× ₂₆₀×

Formel 2-1: Berechnung der RNA-Konzentration.

Die Reinheit der RNA lässt sich aus dem Verhältnis der Absorption bei 260nm und 280nm bestimmen. Reine RNA hat ein A260/A280 Verhältnis von 1,9-2,1. Geringere Werte spre- chen für eine Verunreinigung durch Substanzen, die ebenfalls UV-Licht absorbieren, wie etwa Proteine, oder aber für Schwankungen des pH-Werts. Die Werte in dieser Studie lagen meist zwischen 1,8 und 2,0¹⁷⁹.

2.2.3 One-Step Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 2.2.3.1 Prinzip

Herkömmlich wird die RT-PCR in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst wird die isolierte RNA mittels der reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Im zweiten Schritt werden mittels genspezifischer Oligonukleotide bestimmte Abschnitte der DNA beliebig verviel- facht. Bei der one-step RT-PCR werden beide Schritte kombiniert, was den Zeitaufwand verringert, das Kontaminationsrisiko reduziert und die Sensitivität und Spezifität der cDNA- Synthese erhöht.

Die PCR wird verwendet um ein Segment der DNA zu amplifizieren, das zwischen zwei Regionen bekannter Sequenz liegt. Dazu werden zwei Oligonukleotide als Primer für eine Reihe von Syntheseschritten verwendet, welche von der DNA-Polymerase katalysiert wer- den. Die Oligonukleotide haben unterschiedliche Sequenzen und sind komplementär zu den Sequenzen, die am gegenüberliegenden Strang liegen. Sie flankieren das Segment, das amplifiziert werden soll. Im ersten Schritt wird die Matrizen-DNA durch Erhitzen denatu- riert. Dies geschieht in Anwesenheit eines Überschusses an dNTPs sowie der Primer. Im nächsten Schritt wird die Temperatur gekühlt, die Primer können sich an ihre spezifische komplementäre Sequenz anlagern. Im letzten Schritt wird die Zielsequenz mit Hilfe der Taq- Polymerase synthetisiert. Der Zyklus, bestehend aus Denaturierung, Anlagerung und Synthe- se, wird vielfach wiederholt.

2.2.3.2 Durchführung

Bei der Durchführung der RT-PCR werden RNase-freie Röhrchen sowie Pipettenspitzen verwendet. Sämtliche Schritte werden auf Eis durchgeführt. Puffer und Enyzme sind im RT- PCR Kit bereits enthalten.

Zunächst wird ein Master-Mix nach folgendem Rezept präpariert:

25 µL 2×ThermoScript Reaction Mix, 0,5 µg RNA, 1 µL des Sense- und Antisense-Primers (10µM), 1 µL ThermoScript Plus/Platinum Taq Mix. Mit destilliertem Wasser wird auf 50 µl Gesamtvolumen aufgefüllt.

Die genspezifischen Primer wurden von MWG Biotech bezogen und anschließend Anealing- temperatur und Zyklenzahl für jedes Primerpaar etabliert. Die Sequenzen sind wie folgt:

Oligo Sequenz Produktlänge Il-8 sense 5’-GGA CAA GAG CCA GGA AGA AAC C-3’

Il-8 antisense 5’-CTT CAA AAA CTT CTC CAC AAC-3’ 325 bp MCP-1 sense 5’-GAT GCA ATC AAT GCC CCA GTC-3’

MCP-1 antisense 5’-TTG CTT GTC CAG GTG GTC CAT-3’ 205 bp

GAPDH sense 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3’

GAPDH antisense 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’ 226 bp

Zur cDNA-Synthese sowie zur Prädenaturierung wird ein Zyklus bei 60°C für 30 min und 95°C für 5 min gefahren. Zur anschließenden PCR-Amplifikation werden 29 Zyklen bei 95°C für 15 sec (Denaturierung), bei 57°C für 30 sec (Anlagerung) und bei 70°C für 30 sec (Synthese) gefahren. Am Ende der RT-PCR wird der Heizblock auf 4°C abgekühlt, die End- produkte werden daraufhin entweder bei -20°C eingefroren oder sofort mittels Gele- lektrophorese analysiert.

2.2.3.3 Gelelektrophorese

Zunächst wird ein 2%iges Agarosegel in 100 ml TBE-Puffer (0,045 M Tris-borat, 0,001 M EDTA, pH 8,0) hergestellt. Anschließend werden 2 µl Ethidiumbromid zugegeben, das Gel kurz gemischt und in den Elektrophoreseschlitten gegossen. Zur Probenvorbereitung werden aus den Röhrchen mit den PCR-Endprodukten 20 µl entnommen und im Verhältnis 1:5 mit Probenpuffer vermischt. Der Elektrophoreseschlitten wird in der Elektrophoresekammer platziert, das Gel mit TBE-Puffer überschichtet. Anschließend werden die 25 µl Probenvo- lumen in die Taschen im Gel pipettiert, wobei die erste Tasche immer mit 5 µl Standard be- legt ist. Eine Spannung von 80 V wird für 60 min angelegt. Im Stromfeld wandert die bei neutralem pH negativ geladene DNA zur Anode. Die Gele werden im MultiImage™ Light Cabinet mittels UV-Licht dokumentiert. Die Intensitäten der Banden werden mit Hilfe des

„alpha-manager 12220“ geschätzt, indem von der Gesamtintensität einer Bande die Intensität des Hintergrunds abgezogen wird.

2.2.4 Bestimmung von Il-8 und MCP-1

2.2.4.1 Das Prinzip des Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Das Prinzip des Sandwich ELISA basiert auf einer Antikörperbindung an die zu bestimmen- de Substanz mit anschließender Farbentwicklung über ein Enzymsystem. Eine 96-well Platte wird mit einem monoklonalen Antikörper gegen die fragliche Substanz beschichtet. Danach werden Standards und Proben in die Vertiefungen pipettiert, die Substanz bindet an den im- mobilisierten Antikörper. Anschließend wird ein polyklonaler enzymgekoppelter Antikörper, der ebenfalls gegen die gesuchte Substanz gerichtet ist, hinzugegeben. Ungebundener Anti- körper wird durch Waschen entfernt, und eine Substratlösung wird in die wells pipettiert. Es resultiert eine Farbentwicklung, die direkt proportional zur Menge der an den monoklonalen