Western Blot Analyse

ECL-Plus Western Blot Detection Kit, Hybond-P PVDF Membran, Meerrettich-gekoppelter donkey anti-rabbit IgG (Amersham, Little Chalfont, UK), Aprotinin, Leupeptin, PMSF, Tetramethylendiamin (TEMED), Tween 20, Bromphenolblau, Ponceau S, Triton X-100 (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), Trishydroxymethylaminomethan (Tris), Glycin¸ NaCl, Ammoniumperoxodisulfat (APS), Natriumdodecylsulfat (SDS) (Merck, Darmstadt, Deutsch-land), Röntgenfilm X-Omat, Kodak GBX Developer and Fixer Twin Pack (Kodak, UK), 30% Acrylamid/Bisacrylamid, Proteinstandard Broad Range, Bio-Rad Protein Assay, Non-Fat Dry Milk (Biorad, München, Deutschland), Methanol (Schuchard, Höhenbrunn, Deutschland), Na-Deoxycholat (Roth, Karlsruhe, Deutschland), Glycerol, Essigsäure (Fluka, Taufkirchen, Deutschland), Faltenfilter (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland).

2.1.6 EMSA

Whatmann D-81 Papier (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland), Nuclear binding buf-fer (Promega, Mannheim, Deutschland), poly dl/dC (Pharmacia), p65(A), anti-p50(MLS), anti-c-rel(N466)X, anti-Rel-B (C-19)X, anti-p52(447)X (Santa Cruz, Heidel-berg, Deutschland), Hepes-KOH, MgCl₂, DTT, Benzamidin, NP-40 (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), Sephadex G25 (Amersham, Little Chalfont, UK).

2.1.7 Immunhistochemie

Färbetröge (Roth, Karlsruhe, Deutschland), Aquatex, Deckgläschen, SuperFrost Plus (Schu-bert und Weiss, Deutschland), DAKO LSAB + System AP, Hämatoxylin, DAKO-Pen, mou-se IgG1 (Sigma, München, Deutschland), rabbit mou-serum (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland), anti-cathepsin G Ab-1 clone 19C3, anti-chymase Ab-1 clone CC1, anti-VCAM-1 Ab-3 clone 1.4C3 (Lab Vision, Westinghouse, USA), Xylol, Ethanol, Zitronensäure (Merck, Darmstadt, Deutschland).

2.1.8 Geräte

Durchflusszytometer: FACS Calibur inkl. Cellquest Software (Becton Dickinson, Hei- delberg, Deutschland)

Photometer: Spectra Max Plus (Molecular Devices, München, Deutschland) Soft Max Pro Software: (Molecular Devices, München)

Brutschränke: (Heraeus, Hanau, Deutschland) Mikroskope: Olympus IX70

Phosphorimager: Fuji BAS2000Phosphorimager (Fuji, Kanagawa, Japan) Blotdokumentation: MultiImage™ Light Cabinet (Alpha Innotech Corp, USA) Digitalkammera: Nikon DXM1200 inkl. LUCIA Measurement 4.71 Spritzenpumpe: Harvard Apparatus (Harvard, South Natick, USA)

Analogkamera: Olympus OM4

Pipetten: Eppendorf Reference (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Zentrifugen: 3K15 und 4K15 (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) Eppendorf 5417 R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Wasserbad: (Memmert, Schwabach, Deutschland)

Gefrierschrank (-80ºC): (Heraeus, Hanau, Deutschland)

Elektrophoresekammer: Mini-PROTEAN 3 Cell, Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer

Cell (BioRad, München, Deutschland)

Western Blot-Gerät: Trans-Blot SD (BioRad, München, Deutschland) Röntgenkassette: (Dr. Goos GmbH, Heidelberg, Deutschland)

Flusskammer: Glycotech Parallel Wall Flow Chamber (Glycotech, Maryland, USA)

Thermoshaker: CLF Schutron Thermoshaker (Wolf Laboratories Ltd., York, UK)

Mikrowelle: Privileg 9021

PCR Gelkammer: Wide Mini-Sub Cell GT (Biorad, München, Deutschland) PCR-Maschine: Touch Down (Hybaid, Milford, USA)

Orbitalshaker: Shake ‘n’ Stack (Hybaid, Milford, USA)

Immulitelesegerät: Immulite Turbo (DPC Biermann GmbH, Bad Nauheim, Germany)

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

2.2.1.1 Isolation und Kultur der humanen Monozyten 2.2.1.1.1 Prinzip

Bei der Isolation mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMNC) mittels Dichtegra-dientenzentrifugation mit einer Mischung aus Ficoll und Na-Metrizoat macht man sich die Dichteunterschiede der verschiedenen Leukozytenpopulationen, der Erythrozyten sowie der Thrombozyten zu Nutze. Während sich bei der Zentrifugation die PBMNCs und die Throm-bozyten auf der Oberfläche des Gradienten als Interphase zwischen Plasma und zellulären Bestandteilen sammeln, sedimentieren die Granulozyten wegen ihrer höheren Dichte auf dem Boden des Röhrchens. Das Ficoll-Sucrosepolymer aggregiert die Erythrozyten, so dass diese bei Zentrifugation ebenfalls durch den Gradienten wandern. Thrombozyten werden durch anschließende Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit von den PBMNCs ge-trennt. Das Pellet der PBMNCs besteht zu 5% aus B-Lymphozyten, zu 60-70% aus T-Lymphozyten, zu 5-15% aus NK-Zellen sowie zu 5-15% aus Monozyten. Zur weiteren Auf-trennung via Adhärenz macht man sich dabei die Eigenschaft der Monozyten zu Nutze, dass diese innerhalb einer sehr kurzen Zeit am Plastik von Zellkulturflaschen adhärieren, während Lymphozyten im Überstand bleiben und herausgewaschen werden können18, 40, 140.

2.2.1.1.2 Vorgehen

Zunächst wird peripheres Blut durch Venenpunktion von gesunden und freiwilligen Spen-dern gewonnen. Um eine Gerinnung zu verhinSpen-dern werden 2 IE Heparin/ml in einer 50ml

FSC FSC

SSC SSC

Abbildung 2-1: Reinheitsanalyse der nativen Monozyten nach Isolation mit Ficoll und Adhä-renz. Das entsprechende Gate ist auf die Monozytenfraktion gesetzt. Abgebildet sind zwei repräsenta-tive Dot Plots.

Spritze vorgelegt. Das hepariniserte Vollblut wird 1:1 mit PBS gemischt um die Zellkonzent-ration zu reduzieren und damit die Reinheit und Effektivität der Prozedur zu erhöhen. Da-nach werden in einem 50 ml Zellkulturröhrchen 14 ml Ficoll-Paque vorgelegt und vorsichtig mit dem Gemisch aus Vollblut und PBS überschichtet. Es folgt eine Zentrifugation bei 400g für 40 min. Anschließend wird die Interphase in ein steriles Röhrchen überführt und mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Der nächste Zentrifugationsschritt bei 300 g für 20 min dient dem Auswaschen des Ficoll. Das resultierende Zellpellet wird in 50 ml PBS resuspendiert und bei 100 g für 10 min zentrifugiert um die PBMNCs von den Thrombozyten zu trennen. Dieser Schritt wird nochmals wiederholt, bevor die PBMNCs in Medium (M199 mit 10% hitzeinak-tiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin) in einer Konzentration von 1×10⁷/ml ausgesät werden. Nach 45-minütiger Inkubation im Brut-schrank wird der Überstand, der die lymphozytären Zellen enthält, abpipettiert, die adhären-ten Zellen werden viermal mit PBS gewaschen. Medium wird wieder hinzugegeben, und die Monozyten werden im Brutschrank kultiviert.

Üblicherweise kann mit dieser Methode eine Monozytenreinheit von über 80% erzielt wer-den (s. Abb. 2-1). Bei geringeren Reinheiten werwer-den die Zellen nicht für Versuche verwen-det.

2.2.1.2 Kultur der monozytären Zelllinie THP-1

THP-1 Zellen werden in RPMI 1640 mit 10% FCS kultiviert. Die Zellen werden in einer Konzentration von 1×10⁵/ml ausgesät und nach zwei Tagen gesplittet. Die Zellkonzentration von 1×10⁶/ml sollte nicht überschritten werden. Überflüssige Zellen werden entweder ver-worfen oder aber in Medium in 10% DMSO in FCS in flüssigem Stickstoff konserviert. Vor dem jeweiligen Versuch werden THP-1 Zellen in einer Konzentration von 1×10⁶/ml mit RPMI 1640 ohne FCS in einer 6-well Platte ausgesät. Anschließend erfolgt die Stimulation entsprechend des Protokolls.

2.2.1.3 Isolation und Kultur von humanen Nabelschnurzellen 2.2.1.3.1 Prinzip

Die Nabelschnurvene wird zunächst mit 0,9% NaCl gewaschen. Anschließend wird ein En-zym in das Lumen der Nabelschnur injiziert, wodurch die Endothelzellen von der Basal-membran sowie auch die Endothelzellkontakte untereinander gelöst werden. Es folgt das Auswaschen abgelöster Endothelzellen und deren Kultur⁷⁶.

2.2.1.3.2 Vorgehen

Die Nabelschnüre werden von der gynäkologischen Abteilung des Klinikums Nürnberg Süd gesammelt und bis zur Abholung bei 4°C in NaCl mit 1% Penicillin/Streptomycin gelagert.

Bei der Isolation der Endothelzellen wird grundsätzlich autoklaviertes chirurgisches Besteck, bestehend aus Gefäßklemmen, Gefäßsonden, Pinzetten und Scheren, verwendet. Darüber hinaus kommt steriles Einmalmaterial wie Dreiwegehähne, Spritzen und Mediumfilter (Po-rengröße 0,2 µm) zur Verwendung.

Dispase wird mit einer Aktivität von 2,4 U/ml präpariert (z.B. 60 mg Dispase in 30 ml PBS bei 37°C gelöst). In die Nabelschnurvene wird eine Sonde eingeführt und mit Hilfe einer Klemme so fixiert, dass die Vene nach oben hin dicht abgeschlossen ist. Anschließend wird die Vene mit isotoner NaCl-Lösung gespült. Das distale Ende der Nabelschnur wird danach ebenfalls abgeklemmt. Daraufhin wird der Dreiwegehahn auf die Sonde aufgesteckt, auf den Dreiwegehahn wird schließlich noch der Mediumfilter montiert. Über den Filter und den Dreiwegehahn wird dann die Dispase-Lösung in die Vene injiziert, bis diese prall gefüllt ist.

Es folgt eine 30-minütige Inkubation der Nabelschnüre bei 37°C. Nach Ablauf der Inkubati-onszeit wird die Schnur desinfiziert und kräftig mit zwei Fingern massiert. Nun wird die untere Klemme entfernt und die Zellsuspension in einem sterilen Zellkulturröhrchen gesam-melt. Zur Neutralisierung des Enzyms wird dem Zellkulturröhrchen Endothelzellmedium mit 10% FCS zugefügt. Das Röhrchen wird nun bei 100 g für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wird dann in 10 ml Endothelzellmedium resuspendiert, in einer Zellkulturflasche ausgesät und im Brutschrank kultiviert.

Am Tag nach der Isolation werden die HUVEC mit PBS gewaschen, um Erythrozyten im Überstand zu entfernen. Die weitere Behandlung der Zellen erfolgt nach Protokoll.

2.2.2 RNA-Isolation