Einfluss von AngII und Ramiprilat auf die Adhäsionsmo- Adhäsionsmo-lekülexpression und Monozytenadhäsion auf HUVEC

3.2.1 Hochregulation von VCAM-1, ICAM-1 und P-Selektin durch AngII führt zu einer erhöhten Adhäsion von Monozyten auf Endothelzellen

Wie in der Einleitung ausgeführt spielen bei der Leukozytenrekrutierung auf entzündetem Endothel vor allem P-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 eine wichtige Rolle. Aus der Literatur ist bekannt, dass AngII zwischen 100 nM und 1 µM induktiven Effekt auf die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen hat. In den folgenden Experimenten wird zu-nächst untersucht welche Adhäsionsmoleküle sich durch AngII stimulieren lassen. Anschlie-ßend werden nur diejenigen zu hemmen versucht, welche sich vorher durch AngII hatten stimulieren lassen.

Vorab wird die basale Expression von E-Selektin, P-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 auf HUVEC analysiert. Abbildung 3-11 zeigt vier repräsentative Histoplots mit der basalen Ex-pression der Adhäsionsmoleküle im Vergleich zur Isotypkontrolle. Lediglich ICAM-1 wird basal signifikant exprimiert, während die anderen Adhäsionsmoleküle keine basale Expres-sion zeigen. Diese Tatsache weist auf eine niedrige Aktivität der HUVEC zum Zeitpunkt der Stimulation hin⁷⁹.

Abbildung 3-11: Basale Expression von E-Selektin, P-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 auf HU-VEC. HUVEC werden 24 h bei 2% FCS kultiviert, anschließend erfolgt die Färbung mit direkt mar-kierten Antikörpern. Für E-Selektin (CD 62E), P-Selektin (CD 62P), VCAM-1 (CD 106) und ICAM-1 (CD54) wird jeweils die basale Expression gemessen. Aufgetragen ist die FIuoreszenzintensität gegen die Anzahl der markierten Zellen. Die Linien in den Histogrammen entsprechen der Isotypkontrolle (--) und der jeweiligen Probe (▬). Die Histogramme sind für sieben Experimente repräsentativ.

Anschließend wird der Einfluss von AngII auf die Expression der Adhäsionsmoleküle unter-sucht. Dazu werden HUVEC mit 1 µM AngII für 6 h stimuliert. Auf Untersuchungen der Dosis-Wirk-Beziehungen wird verzichtet, da in mehreren Veröffentlichungen die deutliche Stimulation von Adhäsionsmolekülen mit 1 µM AngII auf Endothelzellen beschrieben ist.

Die Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle wird im FACS bestimmt. Losartan (1 µM) und PD123.319 (1 µM) werden dem Protokoll entsprechend eine halbe Stunde vor AngII zugegeben.

P-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 werden durch AngII 1 µM signifikant hochreguliert (Tab.

3-2). Dabei handelt es sich in allen drei Fällen um einen AT1R-vermittelten Prozess, da die Induktion durch Vorinkubation mit Losartan blockiert werden kann. Die Behandlung mit PD123.319 hat dagegen keinen Effekt. Im Gegensatz dazu wird die Expression von E-Selektin nicht signifikant durch AngII beeinflusst. Aus sieben unabhängigen Experimenten ergeben sich im Einzelnen folgende Werte (relative Expression im Vergleich zum Basalwert, MW±SD, n = 7):

basal AngII + Losartan + PD123.319 t-test

(AngII vs. Basal)

E-Selektin 100 107,00±61,33 97,01±45,67 129,81±57,89 0,70 P-Selektin 100 276,49±84,52 125,18±52,31 301,22±69,74 0,02 ICAM-1 100 244,34±79,06 110,62±35,89 215,01±22,30 0,001 VCAM-1 100 303,86±130,24 97,11±55,43 332,18±65,91 0,03 Tabelle 3-2: Einfluss von AngII sowie Losartan und PD123.319 auf die Expression von

E-Selektin, P-E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1. MFI der Basalwerte entsprechen 100%. Die übrigen Werte sind in Relation zur basalen Expression angegeben.

Flusskammeruntersuchungen sollen zeigen, ob diese Induktion auch insofern physiologische Relevanz hat, als die erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen zu einer verstärkten Ad-häsion und damit Rekrutierung von Monozyten führt. Dazu werden HUVEC wie bei der Expressionsanalyse behandelt. THP-1 Zellen werden anschließend über den konfluenten HUVEC-Monolayer mit einer Scherkraft von 2 dyne/cm² perfundiert. Die Zahl adhärenter Zellen wird mittels Videomikroskopie quantifiziert. Die Rollgeschwindigkeit der einzelnen Monozyten und die Zahl rollender Zellen werden nicht untersucht. Es werden jeweils vier Felder für 30 Sekunden beobachtet. Adhärente Zellen sind als solche definiert, die sich wäh-rend dieses Beobachtungsintervalls nicht bewegen.

A B

Abbildung 3-12A-B: Adhäsion von THP-1 Zellen auf konfluenten HUVEC nach unterschiedli-cher Vorbehandlung. Die Abbildungen repräsentieren Bilder nach vierminütiger Perfusion mit THP-1 Zellen. A: unstimulierte Kontrolle. B: AngII THP-1 µM, 6 h. Im Hintergrund scheint der HUVEC-Monolayer unscharf durch, THP-1 Zellen stellen sich glatt begrenzt und rund dar. Es sind repräsentati-ve Abbildungen für sechs unabhängige Experimente. Vergrößerung 10x.

Abbildung 3-12 zeigt repräsentative Abbildungen aus sechs unabhängigen Flusskammerun-tersuchungen. Die Folgende Tabelle gibt die Werte im Einzelnen wieder (MW±SD, n = 6):

basal AngII + Losartan + PD123.319 t-test

(AngII vs. Basal)

Adhäsion

(Zellen/mm²) 3,25±2,19 19,5±5,21 4,25±1,83 21,63±5,78 0,001

Die Adhäsion von THP-1 auf HUVEC wird durch AngII signifikant gesteigert (p<0,001).

Diese ist nahezu komplett durch Losartan aufhebbar. PD123.319 führt dagegen nicht zu ei-ner Reduktion der Adhäsion.

3.2.2 Ramiprilat reduziert die AngII-vermittelte Stimulation von Adhäsionsmolekülen und damit die Adhäsion von Monozy-ten

Die weiteren Versuche sollen sich auf die Untersuchung des Einflusses von Ramiprilat auf die AngII-induzierte Stimulation von VCAM-1, ICAM-1 sowie P-Selektin konzentrieren.

Dazu werden HUVEC mit Ramiprilat (1 µM) für 20 h inkubiert, anschließend erfolgt die Zugabe von AngII (1 µM, 6 h). Die Expression der Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberflä-che wird wiederum mittels FACS analysiert. Im Einzelnen ergeben sich folgende Fluores-zenzintensitäten (MW±SD, n = 7):

AngII + Ramiprilat t-test

P-Selektin 276,49±84,52 130,08±22,37 0,01 ICAM-1 244,34±79,06 127,56±23,29 0,006 VCAM-1 303,86±130,24 150,24±110,16 0,04

Die Inkubation der HUVEC mit Ramiprilat vor der Stimulation mit AngII führt zu einer signifikanten Reduktion der Expression von P-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1. Zusammen-fassend sind die Ergebnisse aus Tabelle 3-2 und 3-4 in Abbildung 3-13 dargestellt.

Tabelle 3-3: Adhäsion von THP-1 Zellen auf HUVEC nach Stimulation mit AngII (1µM, 6h) und Vorbehandlung durch Losartan oder PD123.319. Adhärierende Zellen/mm², Werte als MW±SD.

Tabelle 3-4: Einfluss von Ramiprilat auf die AngII-vermittelte Induktion von P-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1. Werte sind angegeben als Prozent der basalen Expression, die in jedem Ex-periment 100% gleichgesetzt wird.

Eine physiologische Bedeutung dieses Befundes soll wiederum in der Flusskammer unter-sucht werden. HUVEC werden 20 h mit Ramiprilat (1 µM) behandelt, anschließend wird AngII (1 µM, 6h) zugegeben. THP-1 Zellen werden wie beschrieben für vier Minuten über den Endothelzellmonolayer perfundiert. Im Vergleich zu der Zahl adhärenter Zellen auf AngII-stimuliertem Endothel bewirkt die Vorinkubation mit Ramiprilat eine signifikante Reduktion adhärenter THP-1 Zellen (Abb. 3-14).

AngII

Abbildung 3-13: Einfluss von Ramiprilat auf die AngII-vermittelte Induktion von Adhäsionsmo-lekülen. Im Diagramm ist die Expression der Adhäsionsmoleküle nach AngII-Behandlung (links) und nach Vorinkubation mit Ramiprilat (rechts) relativ zur Basalexpression (--) dargestellt. Der Basalwert wird in jedem Experiment und für jeden Adhäsionsmarker 100% gesetzt, die MFI nach AngII und nach AngII/Ramiprilat Behandlung werden in Relation dazu berechnet. *p<0,05 AngII vs. basal,

**p<0,01 AngII vs. basal, ^µp<0,05 AngII/Ramiprilat vs. AngII, ^µµp<0,01 AngII/Ramiprilat vs. AngII, n = 7. Werte sind als MW±SD angegeben.

3.2.3 Einfluss von Ramiprilat auf die p65-Translokation in dem Nukleus von HUVEC

Im Unterschied zu Kapitel 3-1 wird in den folgenden Experimenten nicht die Bindung von NF-κB an das Zielgen bestimmt, als vielmehr p65, das in den Kern transloziert ist. Zum ei-nen ist diese Methode einfacher zu realisieren als ein EMSA, zum anderen legitimiert sich dieses Verfahren dadurch, dass nach Aktivierung und Abspaltung von IκB nur freies und damit aktives p65 in den Kern wandert und an sein Zielgen bindet.

ctrl AngII Ramiprilat LPS

Abbildung 3-14: Adhäsion von THP-1 Zellen auf HUVEC nach Behandlung des Endothels mit verschiedenen Sti-muli. Dargestellt ist die Zahl adhärenter THP-1 Zellen auf unstimuliertem Endo-thel (ctrl) sowie auf EndoEndo-thel behandelt mit AngII, AngII + Ramiprilat (Ramipri-lat) oder LPS. Werte sind angegeben als MW±SD, n = 6, *p<0,01.