VCAM-1 ICAM-1
4.3 Ursachen antiinflammatorischer Effekte von Ramiprilat in dieser Studie
Die Behandlung mit Ramiprilat erfolgt mit 1 µM und 10 µM. Dies entspricht in etwa der Konzentration im Blut, wenn man eine orale Tagesdosis von 5 mg Ramipril, eine absolute Bioverfügbarkeit von Ramiprilat nach Einnahme von Ramipril von 28%163, ein Molekular-gewicht von Ramiprilat von 388,46 g/mol und ein Blutvolumen von 5 l zugrunde legt. Rech-nerisch ergibt sich damit eine effektive Konzentration im Blut von 721 nM nach einer Ein-maldosis von 5 mg Ramipril. Die Entwicklung eines Steady-State mit höheren Konzentratio-nen nach fünftägiger Einnahme ist dabei nicht berücksichtigt. Bei einer inhibitorischen Kon-stante IC50 von 0,00015 µmol/l ist davon auszugehen, dass mit Dosierungen von 1 µM und 10 µM die endogene ACE-Aktivität in unserem System komplett inhibiert ist. Damit sind die beobachteten Effekte durch Zugabe von AngII unabhängig von der ACE-Hemmung. Die Wahl der Dosis lehnt sich an andere in-vitro Studien an und wird nicht ausgetestet.
Als Ursachen für die antiinflammatorischen Effekte von Ramiprilat im Rahmen dieser Studie können verschiedene Angriffspunkte in Frage kommen. Diese Elemente müssen distal der AngII-Produktion im RAS angreifen um die hier untersuchten Effekte erklären zu können.
Zum einen könnte Ramiprilat auf transkriptioneller Ebene die Chemokin- und Adhäsionsmo-lekülexpression beeinflussen, zum anderen bieten diejenigen Elemente im RAS
Angriffs-punkte, welche den Effekt von AngII auf zelluläre Ebene übertragen. Auf transkriptioneller Ebene werden insbesondere NF-κB und AP-1 als inflammatorische Mediator nach AngII-Stimulation diskutiert. In dieser Arbeit wird in Monozyten und Endothelzellen lediglich die NF-κB-Aktivierung und -Inhibition durch Ramiprilat untersucht. In einem zweiten Schritt wird die Expression der AngII-Rezeptoren, deren Signifikanz bei der Atheroskleroseprogres-sion belegt ist, auf Monozyten und Endothelzellen untersucht.
4.3.1 Einfluss von AngII und Ramiprilat auf die NF-κB Aktivität in Monozyten und HUVEC
Die Stimulation von NF-κB durch AngII wird in verschiedenen in-vivo und in-vitro Studien sowohl für Monozyten88 als auch für Endothelzellen38, 132 gezeigt.
In dieser Arbeit wird mittels EMSA gezeigt, dass AngII die Aktivierung von NF-κB in Mo-nozyten signifikant erhöht (Abb. 3-7). Bisher wird dies in-vitro nur von Kranzhöfer88 nach-gewiesen. Monozyten werden bei Kranzhöfer mit 1 µM AngII für 1 h stimuliert, was eine signifikante Steigerung der NF-κB-Aktivität zur Folge hat. Dieser Effekt wird durch Losar-tan inhibiert. Im Vergleich dazu können wir mit 500 nM AngII über 1 h ähnliche, ebenfalls AT1R-abhängige Ergebnisse erhalten.
Sowohl MCP-1 als auch Il-8 unterliegen in ihrer Expression der Regulation durch NF-κB36,
128. So kann von Ortego et al.123 gezeigt werden, dass monozytäre Zellen und SMCs nach Stimulation mit AngII und TNFα eine verstärkte NF-κB-Aktivität aufweisen, welche zu einer MCP-1-Induktion führt. Interessanterweise kann in dieser Arbeit die Induktion durch Vorbehandlung mit Atorvastatin deutlich reduziert werden. Atorvastatin ist wie Simvastatin ein lipophiler CSE-Hemmer, der seine hemmende Wirkung auf die NF-κB-Aktivität über den Mevalonat-Weg vermittelt: Zugabe von Mevalonat reduziert die hemmende Wirkung lipophiler CSE-Hemmer55. In der vorliegenden Arbeit wird Simvastatin als Kontrolle im EMSA mitgeführt. Eine signifikante Reduktion der NF-κB-Aktivität kann allerdings weder für Simvastatin noch für Ramiprilat gefunden werden. Auch unterschiedliche Dosen, Stimu-lationszeiten oder ein Wechsel auf THP-1 Zellen können keine signifikanten Ergebnisse liefern. Die Erklärung dafür könnte in der zwar signifikanten, aber dennoch sehr moderaten Aktivierung von NF-κB nach AngII-Zugabe liegen. Eine deutliche Hemmung der NF-κB-Aktivität sowohl durch Simvastatin als auch durch Ramiprilat ist daher nur schwer möglich.
Kürzlich veröffentlichte Daten über die Aktivierung von NF-κB durch AT2R sind in unserm System ohne Bedeutung, da sowohl die NF-κB-Aktivierung als auch die Chemokinprodukti-on hier durch Losartan aufgehoben werden. Die Untersuchung, ob Simvastatin oder
Ramipri-lat signifikant hemmenden Einfluss auf die NF-κB-Aktivität nach LPS-StimuRamipri-lation haben, wird nicht vorgenommen.
Auch die hier untersuchten Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1, P-Selektin und E-Selektin besitzen in ihren Promotoren eine NF-κB-Bindungsstelle38, 104. Die signifikante In-duktion von NF-κB nach AngII-Zugabe führt in dieser Arbeit allerdings lediglich zu einer signifikanten Steigerung von P-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1, während E-Selektin in seiner Expression nicht signifikant alteriert wird.
Wie in Monozyten führt auch in HUVEC die Koinkubation mit Losartan zu einer Blockade der Aktivierung, wohingegen PD123.319 keinen signifikanten Einfluss hat. In einer Arbeit von Pueyo kann die Induktion von VCAM-1 nach AngII-Zugabe eindeutig mit der Aktivie-rung von NF-κB in Verbindung gebracht werden. Das Dosisoptimum liegt in dieser Arbeit bei 1 µM. Pueyo et al.132 untersuchen die NF-κB-Aktivierung mittels EMSA. Im Gegensatz dazu wird in dieser Doktorarbeit die Untersuchung der NF-κB-Aktivität auf indirektem Weg vorgenommen. Nicht die Bindung an die DNA, sondern die Translokation von p65 in den Nukleus wird untersucht. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit Studien in denen EMSAs angewandt werden132 zeigt aber, dass diese Methode, wenn es um den Nachweis der NF-κB-Aktivierung geht, ebenso aussagekräftig ist35.
Eine Reihe von in-vitro5, 37, 112 und in-vivo67, 68, 124 Studien können den hemmenden Effekt von ACE-Hemmern auf die NF-κB-Aktivierung nach Stimulation mit Zytokinen nachwei-sen. Dabei kann Cominacini zeigen, dass für diese Inhibition eine Sulfhydrylgruppe an ACE-Hemmern eine wichtige Rolle spielt. So ist Zofenopril, nicht aber Enalapril, in der Lage, die NF-κB-Aktivität in HUVEC nach Stimulation mit oxLDL ebenso wie die resultierende Ad-häsionsmolekülexpression zu reduzieren. Ursächlich ist eine Reduktion von ROS und Super-oxidradikalen durch Zofenopril nach der Zugabe von oxLDL. ROS seinerseits wird über eine AngII-AT1R-Bindung gebildet und führt damit zur NF-κB-Aktivierung172. Ramipril, ein ACE-Hemmer der zweiten Generation, besitzt ebenfalls eine Sulfhydrylgruppe. Damit bietet die Arbeit von Cominaci einen Erklärungsansatz für die in dieser Arbeit gefundene Hem-mung der NF-κB-Aktivität durch Ramiprilat.
4.3.2 Expressionsverhalten von AT1R und AT2R auf Monozyten und HUVEC in Abhängigkeit von Ramipril
Die Behandlung von Monozyten und HUVEC führt zu einer dosisabhängigen Reduktion der AT1R-Expression. Dies wird für beide Zelltypen via FACS und Western Blot gezeigt. Die
Expression von AT2R wird dagegen nicht signifikant verändert (Abbildungen 7, 8, 3-17B). Die reduzierte Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen kann daher - zumindest zum Teil - durch eine reduzierte AT1R-Expression erklärt werden. Da die Expres-sion von AT2R unverändert bleibt, wird relativ mehr AngII an AT2R gebunden haben. Diese Tatsache ist insbesondere von Bedeutung, da einige Studien zeigen, dass über Bindung via AT2R Funktionen, die über AT1R vermittelt werden, gehemmt werden1, 148. Diese Beobach-tung wird in dieser Arbeit dadurch belegt, dass die basale Chemokinproduktion nach Inhibti-on des AT2R weiter ansteigt, nicht so nach Blockade vInhibti-on AT1R.
Genauere Untersuchungen über den zugrunde liegenden Mechanismus für die AT1R-Reduktion werden in dieser Arbeit nicht durchgeführt. Eine Erklärung für die reduzierte Expression könnte sich aus einem erhöhten Anfall von Bradykinin unter ACE-Inhibition ergeben. Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen exprimieren den Bradykinin Rezep-tor 2 (BR2). Stimulation von zum Beispiel peritonealen Makrophagen mit Bradykinin führt BR2-vermittelt zur Sekretion von Superoxidradikalen, Arachidonsäure und PGE2. PGE2 wiederum führt zu einem cAMP-Anstieg in mononukleären Zellen16, 133. Erhöhte Superoxid-radikal- und cAMP-Spiegel führen zu einer Destabilisierung der AT1R mRNA und konseku-tiv zu einer reduzierten Expression des Proteins in Ratten-SMCs118, 175.
Denkbar ist auch, dass der gesteigerte Anfall von NO unter ACE-Inhibition zu einer AT1R-Downregulation führt. Es kann gezeigt werden, dass der NO Donor SNAP die AT1R-mRNA in SMCs um 90% reduziert und die Proteinexpression um 60%25, 73.
Eine kürzlich vorgelegte Arbeit zeigt, dass Angiotensin-(1-7), das amino-terminale Hepta-peptid von AngII, in der Lage ist AT1R zu reduzieren. Angiotensin-(1-7) ist ein Abbaupro-dukt von AngI, das durch Aminoendopeptidasen hergestellt wird. Physiologisch bewirkt es eine Vasodilatation und Wachstumshemmung. Durch Behandlung mit ACE-Hemmern und einer reduzierten AngII-Bildung kommt es zu einer Kumulation von Angiotensin-(1-7), wel-ches AT1R downreguliert33, 34. Weiterhin führen schon geringe Mengen Angiotensin-(1-7) zu einer NO-Freisetzung, welche ihrerseits zu einer AT1R Downregulation beitragen können44.
Weiterhin stellt sich die Frage, ob die reduzierte NF-κB-Aktivität in Monozyten und in HU-VEC nach Ramiprilatbehandlung Einfluss auf die AT1R-Expression haben. Vergleicht man die transkriptionelle Regulation von AT1R von Menschen und Ratten oder Mäusen, in denen die meisten Studien über AT1R-Expression gemacht werden116-118, 175, 176, muss man feststel-len, dass die Nukleotidsequenz nur zu 35% identisch ist. Dies ist bei der Übertragung von Daten aus Ratten- und Mausmodellen auf den Menschen besonders zu beachten. Bezüglich des Effekts von NF-κB lässt sich feststellen, dass der AT1R-Promotor in Ratten eine NF-κB-Bindungsstelle besitzt, nicht aber in Menschen139. Im Tiermodell wirkt sich daher eine
ver-änderte NF-κB-Aktivität gleichsinnig auf die Expression von AT1R aus. Die Reduktion der κB-Aktivität durch Ramiprilat in unseren Experimenten hat, wegen der fehlenden NF-κB-Bindungsstelle im humanen AT1R-Promotor, keinen Einfluss auf die Expression von AT1R.
Die Potenz von Ramiprilat die AT1R-Expression zu reduzieren liegt im gleichen Bereich wie die von Simvastatin. Bereits in früheren Arbeiten wird gezeigt, dass CSE-Hemmer die AT1R-Expression durch Reduktion der Halbwertszeit der AT1R mRNA in SMC reduzie-ren117, 176. Ichiki zeigt, dass die AT1R-Downregulation für Statine nur für lipophile Substan-zen zutrifft – Simvastatin ist ein lipophiler CSE-Hemmer. In der Arbeit von Ichiki führen 10 µM Cerivastatin zu einer reduzierten Expression und Aktivierbarkeit von AT1R72. Als Me-chanismus identifizieren die Autoren einen Mevalonat-GGPP-Rho A abhängigen Weg, da die Zugabe von Mevalonat oder GGPP den Effekt aufhebt. Dieser Mechanismus kommt für ACE-Hemmer allerdings nicht in Frage, da diese nicht mit Mevalonat oder GGPP interagie-ren. So dient die Mitführung von Simvastatin in diesen Experimenten lediglich als Positiv-kontrolle.