Il-8 und MCP-1 Freisetzung und Produktion werden durch Angiotensin II dosisabhängig stimuliert

Erste Versuche sind darauf ausgerichtet, die Basis der Arbeit, nämlich die Stimulation der Chemokinproduktion durch AngII, zu etablieren. Dazu werden, wie in Material und Metho-den beschrieben, Monozyten aus peripherem Blut isoliert. Die Reinheit der im Experiment eingesetzten Monozytenfraktion ist immer >80%. Zur Bestimmung von MCP-1 bzw. Il-8 Konzentrationen im Überstand werden die Monozyten (10⁶/ml) in 24 well Platten ausgesät und 24 h vor Stimulation auf Medium mit 2% FCS umgesetzt. Anschließend erfolgt die Sti-mulation mit AngII in Dosen von 10 nM bis 10 µM für 24 h. Losartan und PD123.319 wer-den jeweils 30 min vor AngII-Stimulation zugegeben. In ähnlicher Weise wird mit THP-1 verfahren, allerdings werden diese 24 h vor Stimulation komplett serumdepriviert. Aus der Literatur ist bekannt, dass AngII in Dosen von 100 nM bis 1 µM Il-8 und MCP-1 in SMC ^28,

75 und Endothelzellen⁴⁷ hochreguliert, von isolierten humanen Monozyten ist dies bisher nicht bekannt.

Die Analyse von MCP-1 und Il-8 mRNA erfolgt nur in THP-1 Zellen. 4 h vor Lyse werden THP-1 Zellen mit AngII verschiedener Dosen stimuliert. Losartan und PD123.319 werden 30 min vor Stimulation zugegeben.

Die Abbildungen 3-1A/B zeigen eine dosisabhängige Steigerung der MCP-1- und Il-8-Freisetzung aus humanen Monozyten nach Stimulation mit AngII. Monozyten werden wie oben beschrieben mit AngII in verschiedenen Konzentrationen über 24 h stimuliert, die Kon-zentration der Chemokine wird nachfolgend in den Zellkulturüberständen bestimmt. Die MCP-1-Freisetzung erreicht ihren Höhepunkt nach Stimulation mit 500 nM AngII, während bei der Il-8-Freisetzung das Dosisoptimum zwischen 500 nM AngII und 1 µM AngII liegt.

Die MCP-1 Konzentration im Überstand steigt von 11,39±4,62 pg/ml auf 82,22±4,63 pg/ml mit 500 nM AngII (p<0,001), die Il-8 Konzentration steigt von 28,37±2,26 pg/ml auf 69,33±8,04 pg/ml mit 1 µM AngII (p=0,001). Ähnlich verhalten sich die RNA-Levels nach Stimulation von THP-1 Zellen (Abb. 3-1C/D). Wiederum führt die Stimulation mit 500 nM AngII zur maximalen Antwort der MCP-1 Synthese, während das Maximum für Il-8 zwi-schen 500 nM und 1 µM AngII liegt.

Angiotensin II [nM] Dosis-Wirkbe-ziehungen zwischen AngII und der MCP-1- bzw. Il-8-Freisetzung aus humanen Monozyten (A/B) und RNA-Synthese in THP-1 Zellen (C/D).

A/B: Die Behandlung von humanen Monozyten mit AngII verschiedener Dosen führt zu einer dosisabhängigen Steigerung der MCP-1 (A) und Il-8 (B) Freisetzung. Ordinate zeigt jeweils die Chemokinkonzentration im Über-stand, Abszisse spiegelt die AngII-Konzentration wieder. Werte sind angegeben als MW±SD, n = 3, * p<0,05, **p<0,01 zum Basalwert.

C/D: Serumdeprivierte THP-1 Zellen werden mit AngII verschiedener Kon-zentrationen für 4h stimuliert. An-schließend erfolgt die Analyse der MCP-1 (C) und Il-8 (D) RNA mittels one-step RT-PCR. Gezeigt ist je ein repräsentatives Gel für drei unabhän-gige Experimente. In weiteren Experimenten muss herausgefunden werden, ob die AngII-induzierte

Chemo-kinproduktion über AT1R oder AT2R vermittelt wird. Dazu werden die Zellen entweder mit dem kompetitiven AT1R-Antagonisten Losartan oder mit dem kompetitiven AT2R-Antagonisten PD123.319 inkubiert. Die Untersuchung der Chemokinfreisetzung erfolgt wie bereits beschrieben. Darüber hinaus werden auf Proteinebene THP-1 Zellen humanen

Mono-zyten vergleichend gegenübergestellt, um bei ähnlichen Resultaten die Fortführung der Ar-beiten an den THP-1 zu legitimieren.

basal AngIILosartan PD123.319

basal AngIILosartan PD123.319

basal AngIILosartan PD123.319

Abbildung 3-2A-D: Vergleichende Gegenüberstellung der Wirkung von AngII und den Angio-tensinrezeptorantagonisten Losartan und PD123.319 auf die Chemokinfreisetzung in humanen Monozyten (A/B) und in THP-1 Zellen (C/D). A/B: Einfluss von Losartan (1 µM) und PD123.319 (1 µM) auf die Freisetzung von Il-8 (A) und MCP-1 (B) in humanen Monozyten nach Stimulation mit AngII (500 nM) für 24 h. C/D: Stimulation wie A/B, hier anhand von THP-1 Zellen. C gibt die Il-8-, D die MCP-1-Freisetzung wieder. MW±SD, n = 3, *p<0,05, ns = nicht signifikant.

In humanen Monozyten kann die AngII-vermittelte Il-8- und MCP-1- Freisetzung komplett durch die Vorbehandlung mit dem AT1R-Antagonisten Losartan geblockt werden (Abb. 3-2A/B). PD123.319 hat auf die Il-8-Produktion keinen signifikanten Einfluss. Jedoch wird die MCP-1-Freisetzung nach Vorbehandlung mit dem AT2R-Antagonisten signifikant gegen-über AngII behandelten Zellen gesteigert.

Nach identischer Behandlung serumdeprivierter THP-1 Zellen resultieren vergleichbare Er-gebnisse. Wiederum wird durch AngII die Il-8- und MCP-1-Freisetzung signifikant gestei-gert. Diese wird durch Vorinkubation mit Losartan geblockt, während PD123.319 keinen signifikanten Einfluss hat. Im Einzelnen ergeben sich folgende Werte (MW±SD, n=3):

Monozyten: THP-1:

basal AngII (500nM) Losartan 1µM + AngII (500nM) PD123.319 1µM + AngII (500nM) basal AngII (500nM) Losartan 1µM + AngII (500nM) PD123.319 1µM + AngII (500nM)

Il-8 Tabelle 3-1: Stimulation von Monozyten und THP-1 mit AngII. Einfluss der Vorbehandlung mit Losartan oder PD123.319

Trotz der Vergleichbarkeit der Ergebnisse von humanen Monozyten und THP-1 Zellen erge-ben sich insbesondere hinsichtlich des Basalwerts und der Stimulierbarkeit lediglich geringe Unterschiede. So sind die Basalwerte sowohl von Il-8 als auch MCP-1 in THP-1 Zellen deut-lich höher als die von humanen Monozyten. Die Stimulierbarkeit der MCP-1-Freisetzung mit AngII fällt in THP-1 Zellen deutlich geringer aus. Während AngII die MCP-1-Freisetzung in Monozyten verachtfachte, wird diese in THP-1 Zellen nur vervierfacht. Il-8 wird in beiden Fällen um das zweieinhalbfache gesteigert. Auch die Steigerung der MCP-1-Freisetzung nach AT2R-Blockade in Monozyten findet in THP-1 Zellen nicht statt. Trotz dieser geringen Unterschiede werden viele der weiteren Versuche wegen der einfacheren Handhabung an THP-1 Zellen durchgeführt.

Nachdem in den Abbildungen 3-1C/D bereits gezeigt wurde, dass AngII nicht nur die Frei-setzung von Chemokinen aus Monozyten fördert, sondern auch dosisabhängig eine de-novo Synthese bewirkt, soll auch hier die Rezeptorzugehörigkeit gefunden werden. Dazu werden die kompetitiven Rezeptorantagonisten ebenso wie in obigen Experimenten 30 min vor der AngII Stimulation zugegeben, um ihnen eine Bindung an den jeweiligen Rezeptor vor Zuga-be von AngII zu ermöglichen.

Das Verhalten des RNA-Levels in THP-1 ist dem des Proteinlevels nach AngII-Stimulation und Hemmung mit Losartan sehr ähnlich. Wieder wird die Induktion der Chemokinexpressi-on nach Zugabe vChemokinexpressi-on Losartan komplett gehemmt, während der AT2R-RezeptorantagChemokinexpressi-onist keine signifikante Wirkung zeigt (Abb. 3-3A-D).

Folglich setzt AngII nach Bindung an den AT1R eine Signalkaskade in nativen Monozyten und THP-1 in Gang, welche zu einer verstärkten Synthese und zeitlich verzögert zu einer verstärkten Freisetzung der Chemokine Il-8 und MCP-1 führt.

A B

Standard basal AngII Losartan PD123.319 Standard basal AngII Losartan PD123.319

+ AngII + AngII Il-8 MCP-1

basal

Ang IILosartan PD 123,319

Il-8 mRNA in % ctrl

0 200 400 600 1200

C

basal

Ang IILosartan PD 123,319

MCP-1 mRNA % ctrl

0 100 200 300 400 500

D

+ AngII + AngII

Abbildung 3-3A-D: AngII (500nM) stimuliert AT1R-vermittelt die RNA-Synthese von Il-8 (A/C) und MCP-1 (B/D) in THP-1 Zellen. A/B: RT-PCR zeigt den Einfluss von AngII (500 nM), Losartan (1 µM) und PD123.319 (1 µM) auf die Il-8- (A) und MCP-1- (B) RNA-Synthese in THP-1 Zellen.

Banden sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. GAPDH-PCR der gleichen Proben ist jeweils darunter abgebildet. C/D: Densitometrische Auswertung von A und B. Der Basalwert ent-spricht jeweils 100%, die anderen Werte sind in Relation dazu gesetzt.

3.1.2 Ramiprilat reduziert die AngII-vermittelte Freisetzung von