Anzahl der Tumor und Lymphknoten infiltrierenden NK- Zellen (CD56, CD57) und dendritischen Zellen (CD21, CD23) bei kleinen, primären oralen
Plattenepithelkarzinomen (OSCC) und deren Assoziation mit unterschiedlichen klinischen Verläufen
Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgische Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen- Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. M. Kesting
Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.
vorgelegt von Talisa Denise Bader
aus Augsburg
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F. Neurath
Gutachter: PD Dr. Dr. Falk Wehrhan
Gutachter: PD Dr. Markus Hecht
Tag der mündlichen Prüfung: 22.September 2020
Meiner Familie gewidmet
INHALT
1 Zusammenfassung ... 1
Hintergrund und Ziele ... 1
Methoden ... 1
Ergebnisse ... 2
Schlussfolgerung ... 2
2 Abstract ... 3
Background and aims ... 3
Methods ... 3
Results ... 4
Conclusion ... 4
3 Einleitung ... 5
Klinischer Hintergrund ... 5
NK-Zellen (Natural Killer Cells) ... 7
3.2.1 NK-Zellfunktion ... 7
3.2.2 Marker: CD56 ... 9
3.2.3 Marker: CD57 ... 9
Dendritische Zellen ...10
3.3.1 Funktion dendritischer Zellen ...10
3.3.2 Marker: CD21 ...13
3.3.3 Marker: CD23 ...13
Tumormicroenvironment ...14
Einfluss des Tumormikroenvironments auf NK-Zellen, Dendritische Zellen und Lymphknoten ...14
Lymphknoten...16
3.6.1 Lymphknotenmetastasen ...17
4 Ziel der Arbeit ...19
5 Material und Methode ...20
Auswahl des Patientenkollektivs und Gruppendefinition ...20
soziodemographische Daten und Lokalisation der Plattenepithelkarzinome ...21
Gewebeauswahl ...22
TMA-Technik ...22
Regionauswahl und Erstellen von TMAs für die immunhistochmische Färbung ...22
Marker ...23
Immunhistochemische Färbung...24
5.7.1 Probenauswahl und Vorbereitung ...24
5.7.2 Entparaffinierung ...24
5.7.3 Färbevorgang ...24
5.7.4 Manuelle Bearbeitung der Proben ...26
Statistische Analyse ...27
6 Ergebnisse ...28
Absolute NK-Zellinfiltration in Biopsien in Fällen von günstigem und ungünstigem Verlauf ...28
Absolute NK-Zellinfiltration in Tumorresektatproben in Fällen von Günstigem und ungünstigem Verlauf ...30
Absolute NK-Zellinfiltration in Lymphknotenresektatproben in Fällen von günstigem und ungünstigem Verlauf ...34
Absolute Infiltration dendritischer Zellen in Biopsien in Fällen von günstigem und ungünstigem Verlauf ...36
Absolute Infiltration dendritischer Zellen in Tumorresektatproben in Fällen von günstigem und ungünstigem Verlauf ...38
Absolute Infiltration dendritischer Zellen in Lymphknotenresektatproben in Fällen von günstigem und ungünstigem Verlauf ...42
7 Diskussion ...45
8 Schlussfolgerung ...49
9 Literaturverzeichnis ...50
10 Abkürzungsverzeichnis ...57
11 Tabellenverzeichnis ...58
14 Abbildungsverzeichnis ...62
15 Danksagung ...63
1
1 ZUSAMMENFASSUNG
HINTERGRUND UND ZIELE
Die immunologische Reaktionslage ist für das Tumorgeschehen von zentraler Bedeutung. In der klinischen Praxis basieren die Therapieplanung und die prognostische Einschätzung beim oralen Plattenepithelkarzinom (OSCC) derzeit hauptsächlich auf der TNM-Klassifikation.
Jedoch scheint dies nicht ausreichend für eine zuverlässige Prognose für Patienten mit OSCC zu sein. So zeigen Patienten trotz der gleichen TNM-Klassifikation Unterschiede im klinischen Verlauf, im Behandlungserfolg und ihrer Prognose. Da es bis jetzt keine schlüssigen Erklärungen für dieses biologische Verhalten der Tumore gibt, kann die Hypothese formuliert werden, dass die immunologische Reaktionslage des Patienten von zentraler Bedeutung ist.
Es konnte bereits festgestellt werden, dass die Makrophagenpolarisation bei OSCC (oral squamous cell carcinoma) mit dem Lymphknotenstatus und der Prognose korreliert.(Weber et al., 2015) Ob andere Immunzellen im OSCC ebenfalls mit Lymphknotenstatus und Prognose korrelieren gilt es zu untersuchen.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Infiltration des OSCC durch NK-Zellen und dendritische Zellen (DCs) und prüft, ob deren Zelldichte einen Hinweis auf den unterschiedlichen klinischen Verlauf primärer OSCC T1/T2, G1/G2, N0, R0 liefern kann. Gibt es signifikante Unterschiede bei der Immunzellanzahl von Patienten, die trotz der primär guten Prognose nach TNM einen ungünstigen (Rezidiv innerhalb von 3 Jahren) klinischen Verlauf zeigen im Vergleich zu Patienten, die bei gleicher Ausgangslage einen günstigen Verlauf (kein Rezidiv innerhalb von 3 Jahren) zeigen?
METHODEN
Das Patientenkollektiv wurde anhand des klinischen Verlaufs in zwei Untersuchungsgruppen unterteilt:
Gruppe 1= Patienten mit klinisch günstigem Verlauf, kein Rezidiv innerhalb von drei Jahren Gruppe 2 = Patienten mit ungünstigem Verlauf, mit Rezidiv innerhalb von drei Jahren
Aus ursprünglich 80 Patienten, kamen insgesamt 17 Patienten zur Auswertung in Frage. Die Biopsie- und Tumorresektatproben der Patienten wurden nach folgenden Kriterien ausgewählt: OSCC T1/T2/G1/G2/N0/R0 > 5mm, keine adjuvante Therapie, mindestens drei Jahre Nachbeobachtungszeit nach Tumorresektion.
2 Mittels TMA-Technik wurden die Proben immunhistochemisch hinsichtlich CD56 und CD57 für NK-Zellen und CD21 und CD23 für dendritische Zellen angefärbt, anschließend digitalisiert und quantitativ ausgewertet. Die statistischen Analysen erfolgten mit SPSS 22 für Mac OS (IBM Inc. New York, USA) verwendet, wobei ein p-Wert ≤ 0,05 als signifikant betrachtet wird.
ERGEBNISSE
Im Rahmen dieser Arbeit ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl dendritischer Zellen und NK-Zellen beim Vergleich von Patienten mit günstigem und ungünstigem Verlauf. Bei Patienten mit ungünstigem Verlauf zeigte sich eine tendenziell erhöhte Anzahl an NK-Zellen (CD56, CD57) in so gut wie allen untersuchten Gewebekompartimenten (Epithel, Stroma, Gesamtgewebe) von Biopsien und Tumorresektatproben, jedoch ohne statistische Signifikanz. Auch bei Betrachtung der NK- Zellen in Lymphknoten konnte anhand der Zellinfiltration kein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit günstigem oder ungünstigem Verlauf festgestellt werden.
Hinsichtlich der dendritischen Zellen ergab sich nur ein signifikanter Unterschied für CD23 positive DCs im Tumorstroma der Tumorresektatproben beim Vergleich von Patienten mit günstigem vs. ungünstigem Verlauf. Dabei zeigte sich die DC-Zellzahl bei Patienten mit ungünstigem Verlauf signifikant erhöht. Für andere Gewebekompartimente der Tumorresektatproben sowie für Biopsien konnte kein signifikanter Unterscheid beim Vergleich der Patientengruppen (günstig/ungünstig) festgestellt werden. Bezüglich der Anzahl an DCs in Lymphknoten ergab sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied bei Patienten mit günstigem vs. ungünstigem Verlauf.
SCHLUSSFOLGERUNG
Die alleinige Betrachtung der Infiltration des Tumors durch NK-Zellen und dendritischen Zellen reicht nicht aus, um eine Aussage bezüglich des klinischen Verlaufs von Patienten mit OSCC zu treffen. Man muss davon ausgehen, dass die Immunlage des Patienten nicht nur lokal im Tumormikroenvironment beeinflusst wird, sondern auch systemisch. Es ist daher entscheidend an welchem Ort die Immunzellen untersucht werden, sowie deren genauer Aktivierungszustand. Um den genauen Aktivierungszustand der NK-Zellen und DCs festzulegen ist ein noch besseres Verständnis der Zellbiologie dieser Immunzellen notwendig und dementsprechend müssten neue, spezifische Marker zum Einsatz kommen. Nur die intensive Betrachtung der systemischen und lokalen immunologischen Reaktionslage des Patienten können zu neuen Erkenntnissen führen und spezifische Immuntherapien ermöglichen. Diese haben den entscheidenden Vorteil einer geringeren Toxizität gegenüber den üblichen Radio- und Chemotherapien mit entsprechendem Patientennutzen.
3 2 ABSTRACT
BACKGROUND AND AIMS
The Patients immunological response seems to be vital for the Tumors developement. The current procedure in clinical practice concerning treatment, planning and assessment of prognosis of OSCC (oral squamous cell carcinoma) Patients, is based on the TNM classification. However, this doesn’t seem sufficent to determine the OSCC Patients’
prognosis. Patients of the same TNM classification show differences in clinical outcome, success of treatment and prognosis. As there is no conclusive explanation for the tumors biological behavior the hypothesis can be formulated that the patient’s immunological response is of fundamental importance. It has already been stated that the macrophage polarisation in OSCC correlates with lymphnode status and prognosis. Whether other immune cells in OSCC also correlate with lymphnode status and prognosis needs to be examined.
The present work examines the infiltration of NK-cells and dendritic cells (DCs) in OSCC and determines whether their cell densities can explain the varied clinical outcomes of Patients with primary OSCC T1/T2, G1/G2, N0, R0. Are there significant differences regarding Immune cell quantities in OSCC Patients who despite their primary good prognosis, have an unfavourable outcome (with recurrence within 3 years) compared to Patients with same initial TNM staging who have a favourable (no recurrence within 3 years) outcome?
METHODS
The patient cohort was divided into two groups determined by the patients’ clinical outcome:
Group 1 = Patients with favourable outcome and no recurrence within 3 years Group 2 = Patients with unfavourable outcome with recurrence within 3 years
From originally 80 patients, 17 came into question for evaluation in this study. Biopsies and tumor resection specimens of patients with following criteria were selected: OSCC T1/T2/N0/R0 > 5mm, with no adjuvant therapy and at least three years follow-up, after tumor resection.
The samples are immunhistochemically stained: Using TMA technique for CD56 and CD57, thereby identifying NK-cells and using CD21 and CD23 to identify dendritic cells. The samples are then digitalised and quantitatively analysed. Analysis is performed using SPSS 22 for Mac OS (IBM Inc. New York, USA) with p-values ≤ 0,05 being considered significant.
4 RESULTS
The results of this study show no significant difference between the number of dendritic cells and NK cells when comparing Patients with fovourable and unfavourable outcome. Patients with unfavourable outcome showed a tendency of higher NK cell numbers (CD56, CD57) in almost all examined tissue components (epithelium, stroma, entire tissue) of biopsies and tumor resection specimens, however without statistical significance. Furthermore, when reviewing lymphnode infiltrating NK cells, no significant difference between Patients with favourable or unfavourable outcome could be determined.
Concerning DCs, a significant difference was only seen when reviewing CD23 positive DCs within the stroma of tumor resection specimens, with the infiltrating DCs being significantly higher in Patients with unfavourable outcome. For the other tissue components of the tumor resection specimens (epithelium, entire tissue) and for the Biopsies there was no significant difference between the two patient groups (favourable/unfavourable). When examining the DC density in lymphnodes, no correlation between unfavourable and favourable outcome of OSCC Patients could be determined.
CONCLUSION
Soley examining the density of tumor infiltrating DCs and NK cells, isn’t sufficient in order to predict the outcome of OSCC Patients. One must assume that the Patients’ immune status is not only influenced locally by the tumormicroenvironment but also systemically. Therefore, it is critical where the examined immune cells are located and also their precise state of activation.
In order to determine the precise activation state of NK cells and DCs a deeper knowledge of their cell biology is necessary and consequently new specific markers need to be employed.
Only the thorough examination of the patients local and systemic immune response situation can lead to a deeper understanding and can help create specific immune therapies. All aiming to take advantage of the lower toxicity of immunetherapies compared to radio- and chemotherapy and therefore benefiting Patients.
5 3 EINLEITUNG
KLINISCHER HINTERGRUND
Das orale Plattenepithelkarzinom (OSCC = oral squamous cell carcinoma) ist mit rund 300000 Neuerkrankungen jährlich der sechsthäufigste Tumor weltweit. (Blatt et al., 2017) Es ist die häufigste maligne Neoplasie der Mundhöhle und macht 80-90% aller oralen Malignome aus.
(Santos et al., 2016)
Das OSCC tritt häufig an Zunge, Mundboden, Gingiva und Gaumen auf (Allen and Farah, 2015) und ist gekennzeichnet von invasivem Wachstum und häufigen Metastasen.(de Morais et al., 2017)
Als Risikofaktoren werden in der Literatur Tabakkonsum, ionisierende Strahlung, das humane Papilloma Virus (HPV), Alkohol, sowie das in manchen Regionen übliche Kauen von Betelnüssen genannt. (Scully and Bagan, 2009, Vallecillo Capilla et al., 2007, Hirota et al., 2008) Auch scheint die allgemeine Mundgesundheit ein Risikofaktor zu sein, wobei Patienten in zahnärztlicher Behandlung ein geringeres Erkrankungsrisiko aufweisen. (Holmes et al., 2009)
Trotz verbesserter chirurgischer Möglichkeiten und adjuvanter Therapien hat sich die Prognose für Patienten mit OSCC in den letzten Jahrzehnten nicht verbessert, mit 5-Jahres Überlebensraten von nur 40-50%. (Brinkman and Wong, 2006) Ein Grund dafür ist, dass das OSCC meist erst in späten Stadien erkannt wird. Dabei weisen bis zu 50% der Patienten bereits eine Lymphknotenmetastase bei Erstdiagnose auf, was mit einer schlechteren Prognose und klinischem Verlauf einhergeht. (Lingen et al., 2008, Blatt et al., 2017, Hamada et al., 2012, Son et al., 2017, Kunzel et al., 2014) Zudem erschweren die meist lange symptomfreie Zeit und die anspruchsvolle klinische Differenzierung eine Diagnosestellung im Frühstadium der Erkrankung. (Yong-Deok et al., 2015)
In der klinischen Praxis basieren die Therapieplanung und Prognose derzeit hauptsächlich auf der TNM-Klassifikation. Dabei werden neben der Tumorgröße, vorhandene Lymphknotenmetastasen als wichtigste Indikatoren für den Krankheitsverlauf gewertet.
(Brinkman and Wong, 2006, Blatt et al., 2017) Jedoch scheint dies nicht ausreichend für eine zuverlässige prognostische Beurteilung für Patienten mit OSCC zu sein.(Fu et al., 2016, Brinkman and Wong, 2006) So zeigen Patienten trotz der gleichen TNM-Klassifikation Unterschiede im klinischen Verlauf, im Behandlungserfolg und ihrer Prognose. (Blatt et al., 2017, Brinkman and Wong, 2006) Daher ist es nötig zusätzlich neue prognostische Indikatoren für orale Plattenepithelkarzinome zu finden, um dementsprechend eine individuell angepasste Therapie zu ermöglichen.(Russo et al., 2017)
6 Das Immunsystem spielt bei der Elimination von Tumorzellen eine wichtige Rolle.(Grimm et al., 2015) Die Makrophagenpolarisation konnte bereits als immunologischer Parameter für die Prognose OSCCs identifiziert werden. (Weber et al., 2015) Im Rahmen dieser Arbeit wird der mögliche prognostische Wert der NK-Zellinfiltration sowie der Infiltration dendritischen Zellen betrachtet. NK-Zellen und dendritische Zellen sind durch ihre Funktionen ein wichtiger Bestandteil der immunologischen Überwachung und Bekämpfung des Tumors.(Dunn et al., 2004, Pellicioli et al., 2017)
Das Immunsystem beeinflusst jedoch nicht nur die Quantität (Masse) des Tumors, sondern auch dessen Qualität (Immunogenität).(Schreiber et al., 2011) So konnte beobachtet werden, dass Tumoren, die sich in Mäusen mit intaktem Immunsystem bildeten, weniger Immunogen waren als solche, die sich in Mäusen mit angeschlagenem Immunsystem gebildet hatten. Das Immunsystem kann somit auch die Tumorprogression fördern indem Tumore selektiert werden die im Immunkompetenten Wirt besser überleben können.(Schreiber et al., 2011) Die Beeinflussung des Tumors durch das Immunsystem erfolgt in 3 Phasen: Eliminierung (Elimination), Gleichgewicht (Equilibrium) und Entkommen (Escape).(Schreiber et al., 2011, Canning et al., 2019)
Der Fokus heutiger onkologischer Immuntherapien und deren Wirksamkeit liegt meist auf dem lokalen immunologischen Microenvironment des Tumors und dessen Beeinflussung.(Nishida and Kudo, 2017, Yu and Di, 2017, Burugu et al., 2017, Martin et al., 2016) Dabei wird das Zusammenspiel von Tumor und Tumormicroenvironment als bestimmender Faktor von Tumorprogression und Tumorausbreitung gesehen.(Barros et al., 2018) Jedoch scheint die alleinige Betrachtung des Tumors und seinem Microenvironment nicht ausreichend um Aussagen zur Prognose der betroffenen Patienten zu treffen. Studien zum prognostischen Wert der NK-Zellinfiltration und der Infiltration dendritischer Zellen sind in ihren Ergebnissen widersprüchlich.(Takanami et al., 2001, Villegas et al., 2002, Karthaus et al., 2012, Dieu- Nosjean et al., 2008, Kornstein et al., 1987, von Andrian and Mempel, 2003, El Shikh and Pitzalis, 2012, Adema, 2009) Nicht nur die lokale Immunsuppression, sondern auch eine generelle, systemische Immunsuppression bei Tumorpatienten scheint eine entscheidende Rolle zu spielen.(Torroella-Kouri et al., 2013, Zuckerman et al., 2013)
7 NK-ZELLEN (NATURAL KILLER CELLS)
NK-Zellen wurden zunächst als spezifische Subpopulation von Lymphozyten identifiziert, mit der Fähigkeit in vitro Tumorzellen zur Apoptose zu bringen.(Herberman et al., 1975, Kiessling et al., 1975) Über 40 Jahre später ist die Relevanz der NK-Zellen als wichtiger Teil der Immunantwort bei Infektionen und Tumoren erkannt.(Morvan and Lanier, 2016)
Hämatopoetische Stammzellen differenzieren durch Wachstumsfaktoren in die CD34+
CD122+ CD56- NK-Vorläuferzellen. Es wird angenommen, dass sich NK Zellen nicht nur aus dem Knochenmark, sondern auch aus sekundären lymphatischen Geweben entwickeln können, wie den Lymphknoten oder Tonsillen. (Fu et al., 2014)
Die NK-Vorläuferzellen werden bei Entzündungen und anderen pathologischen Prozessen zur Differenzierung und Proliferation angeregt. Dabei entstehen verschiedene Subgruppen, die sich anhand ihrer Zellrezeptoren und Funktionen unterscheiden lassen: regulatorische NK Zellen, zytotoxische NK-Zellen und tolerante NK- Zellen. Die genauen Vorgänge der Differenzierung und Proliferation sind insbesondere bei den regulatorischen NK Zellen weitgehend unbekannt.(Fu et al., 2014)
3.2.1 NK-ZELLFUNKTION
Die NK-Zellfunktion wird durch aktivierende und inhibierende Signale reguliert, die über verschiedene Zellrezeptoren an der Zelloberfläche empfangen werden. Diese Immunrezeptoren sind in der Lage abnormale Zellen, wie infizierte Zellen oder Tumorzellen zu erkennen und diese abzutöten. Es bestehen unterschiedliche Wege wie abnormale Zellen die NK-Zelleffektorfunktionen, wie z.B. Zytotoxische Aktivität oder Cytokinausschüttung und Proliferation auslösen:(Morvan and Lanier, 2016)
1. Der Verlust des MHC-I Moleküls (Major histocompatibility complex class I) bei einer abnormalen Zelle. MHC-I ist ein Oberflächenmolekül körpereigener gesunder Zellen, das als Signal wirkt, um eine NK-Zellaktivität zu verhindern. (Missing self Hypothese) (Abbildung 1b)
2. Eine erhöhte Expression exzitatorischer Liganden an der abnormalen Zelle führt zu einer erhöhten Reizung der aktivierenden Zellrezeptoren an den NK-Zellen und damit zur Überstimmung inhibierender Signale (Abbildung 1c)
3. NK-Zellen besitzen zusätzliche Zellrezeptoren, die in der Lage sind an Tumorantigene zu binden. Die aktivierenden Zellrezeptoren CD16 und NKG2D sind am meisten untersucht. Diese binden Liganden, die auf schnell proliferierenden Zellen, infizierten Zellen oder Tumorzellen zu finden sind.(Morvan and Lanier, 2016, Raulet et al., 2013) Der
8 CD16 Rezeptor erkennt IgG Antikörper und bindet über diese Tumorantigene. Antibody- dependent cell-mediated cytotoxity (ADCC) (Abbildung1d)
Abbildung 1: Schematische Darstellung physiologischer NK-Zell Funktionen nach dem Vorbild von Morvan 2016 (Morvan and Lanier, 2016)
Im Vergleich zu anderen Lymphozyten benötigen NK-Zellen keine vorausgehende Immunisierung, um ihre zytolytische Funktion zu aktivieren. Neben ihrer lytischen Funktion sezernieren NK-Zellen verschiedene Cytokine, wie IFN-γ und TNF-α, die Tumorzellproliferation, Tumorangiogenese und Karzinogenese verhindern.(Barrow and Colonna, 2017) Bei regulatorischen NK-Zellen dominieren aktivierende Signale. Sie haben Zellen mit hoher Expression inflammatorischer Signalmoleküle als Angriffsziel. Bei NK-
a) Die Balance der Signale der aktivierenden und inhibierenden Rezeptoren reguliert die Erkennung gesunder Zellen durch NK Zellen, wodurch keineLyse der gesunden Zellen eingeleitet wird
b) Der Verlust des MHC-I Moleküls (Major histocompatibility complex class I) bei einer abnormalen Zelle. MHC-I ist ein Oberflächenmolekül körpereigener gesunder Zellen, das als Signal wirkt, um eine NK-Zellaktivität zu verhindern. (Missing self Hypothese)
c) Eine erhöhte Expression exzitatorischer Liganden an der abnormalen Zelle führt zu einer erhöhten Reizung der aktivierenden Zellrezeptoren an den NK-Zellen und damit zur Überstimmung inhibierender Signale d) NK-Zellen besitzen zusätzliche Zellrezeptoren, die in der Lage sind an Tumorantigene zu binden. Die
aktivierenden Zellrezeptoren CD16 und NKG2D sind am meisten untersucht. Diese binden Liganden, die auf schnell proliferierenden Zellen, infizierten Zellen oder Tumorzellen zu finden sind.(Morvan and Lanier, 2016, Raulet et al., 2013) Der CD16 Rezeptor erkennt IgG Antikörper und bindet über diese Tumorantigene.
Antibody-dependent cell-mediated cytotoxity (ADCC)
9 toleranten Zellen überwiegen dagegen inhibierende Signale. Bei zytotoxischen NK-Zellen dominieren auch aktivierende Signale. Sie haben Zellen zum Ziel, die eine hohe Expression an bestimmten drucksensiblen Liganden aufweisen. (Fu et al., 2014)
3.2.2 MARKER: CD56
Bei CD56 handelt es ich um ein integrales Membranprotein und eine Isoform des neutralen Zelladhäsionsmoleküls (NCAM), welches einen etablierten Marker für NK-Zellen darstellt.(Rathore et al., 2014) Das NCAM ist bei der Interaktion von Zellen untereinander von entscheidender Bedeutung und auch eine Rolle bei Zellmigration und Differenzierung im Zuge der Organogenese wird vermutet. Durch RNA-spleißen resultieren die verschiedenen Isoformen des Moleküls. Die Isoform des NCAM mit einem Molekulargewicht von 149kDa entspricht dem Cluster of Differentiation 56 (CD56) das auf NK-Zellen exprimiert wird. CD56 wird ebenfalls an diversen Geweben des Nervensystems exprimiert, wie z.B. Nervenfasern oder Ganglienzellen. Auch bei Malignomen des Nervensystems kann CD56 an der Oberfläche zu finden sein. (Agaimy and Wunsch, 2008) Die Funktion des CD56 auf humanen NK-Zellen ist bislang noch unbekannt. Frühe Studien vermuten eine Rolle bei der Interaktion zwischen NK-Zelle und ihrer Zielzelle.(Cooper et al., 2001, Nitta et al., 1989)
3.2.3 MARKER: CD57
Bei CD57 (auch HNK-1, Leu-7 oder L2 genannt) handelt es sich um ein Antigen mit einem Molekulargewicht von 110-115kDa, das aus einer sulfatierten Kohlenwasserstoffkette besteht und das spezifische Epitop für den Antikörper HNK-1 enthält.(Wangerin et al., 2014, Nielsen et al., 2013, Kared et al., 2016) CD57 wird an NK-Zellen nur an einer bestimmten Subgruppe exprimiert, welcher nahezu die gesamte NK- und Killerzellfunktion zugeschrieben wird.(Nielsen et al., 2013, Abo and Balch, 1982) Ansonsten kann CD57 auch an anderem normalem oder neoplastischem Gewebe, insbesondere an Gewebe des Zentralen Nervensystems, gefunden werden.(Wangerin et al., 2014) CD57 fungiert als Ligand für Laminin, L-Selectin, P-Selectin sowie des Adhäsionsproteins des Cerebellum Amphoterin.
Dies lässt eine Rolle des CD57 bei Zell-Zell oder Zell-Matrix Interaktionen vermuten.(Kared et al., 2016) Die exakte Funktion dieses Oberflächenmoleküls ist noch nicht geklärt. Antikörper gegen CD57 werden in pathologischen Laboren routinemäßig zur Identifikation von NK-Zellen genutzt.(Wangerin et al., 2014)
10 DENDRITISCHE ZELLEN
1973 wurden dendritische Zellen erstmals von der Arbeitsgruppe um Steinman et. al.
beschrieben, wofür Steinman 2011 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet wurde.(Steinman and Cohn, 1973, Neal et al., 2017)
Trotz ihrer unentbehrlichen Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort, sind dendritische Zellen (DCs) eher selten und eine sehr heterogene Gruppe von Immunzellen.(Karthaus et al., 2012) DCs entwickeln sich aus Vorläuferzellen, die CD34 als gemeinsames Oberflächenprotein exprimieren und sich aus dem Knochenmark bilden.(Shortman and Liu, 2002) Aus diesen pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen entwickeln sich unter Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren und Zytokine die verschiedenen Subtypen dendritischer Zellen .(Shortman and Liu, 2002) In der Literatur werden vier verschiedene DC Subtypen beschrieben:
1. Plasmazytoide dendritische Zellen, pDC (Yang et al., 2005, Adema, 2009)
2. Myeloische dendritische Zellen, mDC (interstitielle dendritische Zellen)(Adema, 2009)
3. Langerhanszellen (Adema, 2009)
4. Follikuläre dendritische Zellen, FDC (Aguzzi and Krautler, 2010, El Shikh and Pitzalis, 2012)
Es war die bisherige Annahme, dass sich pDC aus lymphatischen Vorläuferzellen und mDC aus myeloischen Vorläuferzellen differenzieren.(Rickmann et al., 2011) Jedoch wird dies angezweifelt, da gezeigt werden konnte, dass sich pDC auch aus myeloischen Progenitorzellen entwickeln lassen. (Traver et al., 2000) Die DC Subtypen unterscheiden sich in ihrem Phänotyp und ihrer Funktion, welche teilweise von ihrer Lokalisation abhängig ist. So werden Langerhans Zellen hauptsächlich in der Epidermis gefunden. Das humane, periphere Blut enthält zwei große Subgruppen von DCs: CD11c-positive, mDCs und CD11c-negative, pDCs.(Karthaus et al., 2012) Follikuläre dendritische Zellen (FDCs) sind in B-Zellfollikeln sekundärer lymphatischer Organe zu finden. (El Shikh and Pitzalis, 2012)
3.3.1 FUNKTION DENDRITISCHER ZELLEN
Dendritischen Zellen sind antigenpräsentierende Zellen, die als Vermittler zwischen angeborener und adaptiver Immunität dienen. Die Aufnahme apoptotischen Zellmaterials, pathogener Erreger oder tumoraler Antigene führen zur Aktivierung und Differenzierung unreifer DCs. Diese reifen DCs wandern anschließend in die Lymphorgane und präsentieren dort, die zu Proteinen prozessierten Antigene auf MHC-Molekülen (Major Histocompatibility
11 Complex). Dies führt zu einer antigenspezifischen Selektion der zirkulierenden B- und T-Zellen und damit zur Aktivierung der adaptiven Immunabwehr.(Karthaus et al., 2012)
Die Aktivierung der T-Zellen und die resultierende Immunantwort unterliegt dabei einem komplexen Zusammenspiel dreier Signale. Erst das Zusammenkommen aller drei Signale führt zu einer vollständigen Aktivierung der T-Zellen: die Erkennung des MHC- Antigenkomplexes (Signal 1), die Stimulation durch co-stimulierende Moleküle (Signal 2) und die Aktivierung durch Zytokine (Signal 3). (Karthaus et al., 2012)
Ruhende dendritische Zellen, die immuninhibierenden Signalen unterliegen (IL-10 oder Kortikosteroide), sind, im Gegensatz zu reifen DCs, nur in der Lage Signal 1 zu induzieren.(Karthaus et al., 2012, Adema, 2009) Dies führt zum immunologischen Phänomen der Toleranz, bei der gegen Selbst- oder Fremdantigene keine Immunität erzeugt wird. T- Zellen reagieren nicht auf präsentierte Antigene (Anergie) und es kommt zusätzlich zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen. Die früher auch Suppressor T-Zellen genannten regulatorischen T-Zellen schützen mit ihrer immunsupprimierenden Wirkung einerseits den Organismus vor Autoimmunerkrankungen und Allergien, während andererseits dadurch Tumore in ihrer Progression unterstützt werden.(Adema, 2009, Togashi and Nishikawa, 2017) Der Aktivierungszustand der DCs scheint somit ein entscheidender Faktor bezüglich der Art der Immunantwort zu sein. (Adema, 2009)
Nicht nur der Aktivierungszustand, sondern auch die unterschiedlichen DC-Subtypen unterscheiden sich hinsichtlich ihres Potentials T-Zellen zu aktivieren. Die im Blut vorhandenen CD11c positiven- mDCs können, anhand ihrer unterschiedlichen Expression der Oberflächenmarker CD1c (BDCA-1), CD16 und BDCA-3, in drei Untergruppen unterteilt werden und unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit T-Zellen zu aktivieren. (Karthaus et al., 2012) Die ebenfalls im Blut vorhandenen CD11c negativen-pDCs sind ein hochspezialisierter DC- Subtyp, die durch die Sekretion von Typ I Interferonen (zB. IL-12) Einfluss auf das angeborene und adaptive Immunsystem nehmen, beispielsweise durch die Rekrutierung von T- Helferzellen.(Karthaus et al., 2012)
Die Langerhans Zellen der Epidermis sind vor allem an der Aufnahme und Präsentation mikrobieller Antigene beteiligt. Die spezifische Subgruppe ist durch die Expression des Proteins Langerin gekennzeichnet. (Karthaus et al., 2012)
Follikuläre dendritische Zellen (FDCs) sind die am wenigsten untersuchten DCs. Ihnen werden drei Funktionen zugeschrieben: die Organisation der Lymphfollikelarchitektur, die Aufnahme von Antigenen und deren B-Zellpräsentation sowie die Koordination der Beseitigung apoptotischen Materials. (Aguzzi and Krautler, 2010, van Nierop and de Groot, 2002) Die noch
12 wenig untersuchte follikuläre dendritische Zelle (FDC) ist in der Lage Antigene in Primärfollikeln und Keimzentren für eine lange Zeit zu präsentieren.(Wang et al., 2011, Aguzzi and Krautler, 2010) Wang et al. untersuchten die Konsequenzen, die eine im Versuch induzierte Abwesenheit von FDCs Zellen mit sich bringt. Dabei war ein Verlust der Lymphfollikelorganisation zu beobachten, bei der B-Zell Areale ihre Homogenität einbüßen und es zur Überlappung mit T-Zell Bereichen kommt. Auch das Absterben von B-Zellen im Keimzentrum und eine verminderte Migration naiver B-Zellen in den Lymphfollikel konnte beobachtet werden. Das Vorkommen von FDCs scheint demzufolge wichtig für das Überleben von B-Zellen des Keimzentrums zu sein. (Wang et al., 2011) Dies ist hinsichtlich der tertiären lymphoiden Strukturen (TLS), die sich am invasiven Rand eines Tumors befinden, interessant.
Diese bestehen, wie andere sekundäre lymphatische Organe, aus T-Zell reichen Regionen, die an B-Zell Follikel angrenzen.(Krautler et al., 2012, Fridman et al., 2014) Reife DCs infiltrieren die T-Zell Region während follikuläre DCs in der B-Zell Region zu finden sind.(Fridman et al., 2014)
Dieu-Nosjean MC et al. beschrieben die Präsenz dieser tertiären lymphoiden Strukturen in Lungentumoren, die in tumorfernen Regionen nicht festgestellt werden konnten und daher die Vermutung nahe legten, durch das Tumormicroenvironment induziert worden zu sein. Die B- Zell Follikel der TLS waren durch das Vorkommen von CD21 positiven follikulären DCs charakterisiert, deren Zelldichte mit der Überlebensprognose assoziiert werden konnte.(Dieu- Nosjean et al., 2008) Moalli et al. untersuchten ein Phänomen, das bereits fast 30 Jahre zuvor von Mariani-Costatini et al. beim Colonkarzinom beobachtet worden war.(Moalli et al., 2015, Mariani-Costantini et al., 1991) Moalli et al. konnten in einem Tierversuchsmodell des malignen Melanoms eine ausgedehnte Ansammlung von Tumor spezifischen Antigenen (TDA, tumor- derived antigen) an follikulären DCs in tumor-drainierenden Lymphknoten feststellen. Der Transport der TDAs in den Lymphknoten wurde Makrophagen im subkapsulären Sinus des LKs zugeschrieben und nicht, wie sonst häufig in der Literatur, durch migrierende DCs. Ein Entfernen der follikulären DCs und Makrophagen hatte ein drastisch geringeres Vorkommen von TDA im LK zur Folge. (Moalli et al., 2015) Somit könnte die follikuläre dendritische Zelle eine entscheidende Rolle bei der viel diskutierten Präsentation von Tumorantigenen im Lymphknoten und der damit eingeleiteten Immunreaktion einnehmen. Zudem ist wie bei den tertiären lymphatischen Strukturen des Tumormicroenvironement auch der Lymphknoten in T- Zell reichen Regionen, die an B-Zell Follikel angrenzen, gegliedert.(Krautler et al., 2012, Fridman et al., 2014) Das Vorhandensein von follikulären dendritischen Zellen hält die B- Zellpopulation stabil, die bereits mehrfach mit einer besseren Prognose bei verschiedenen Tumoren assoziiert wurde.(Wang et al., 2011, Sakimura et al., 2017)
13 Im Rahmen dieser Arbeit erfolgt die Identifizierung der TIDCs durch die Marker CD21 und CD23. Diese sind für die Subpopulation der follikulären dendritischen Zellen spezifisch.(Bagdi et al., 2001)
3.3.2 MARKER: CD21
CD21 ist ein Membrangykoprotein mit einem Molekulargewicht von 150kDa, das primär an B- Lymphozyten und follikulären dendritischen Zellen exprimiert wird.(Carroll, 1998) Auch an aktivierten T-Zellen und epithelialen Zellen ist CD21 zu finden.(Erdei et al., 2003) Das einsträngige Glykoprotein besteht aus 15 sich wiederholenden Konsensusmodulen (SCR, short consensus repeats) die jeweils aus 60-70 Aminosäuren bestehen. CD21 (auch Complement Receptor Type 2/CR2 oder EBV Rezeptor genannt) entsteht durch Spleißen der RNA des CR2 Gens und bindet an Faktoren des Komplementsystems. (Carroll, 1998, Erdei et al., 2003) Der Rezeptor spielt eine entscheidende Rolle beim Zusammenspiel follikulärer dendritischer Zellen mit B-Zellen. Dabei wird die Aufnahme von Antigenkomplexen und deren Präsentation durch die follikuläre dendritische Zelle mitunter von CD21 reguliert.(Heesters et al., 2013)
3.3.3 MARKER: CD23
Bei CD23 handelt es sich um einen low-affinity Rezeptor für das Immunglobulin (Ig) E.(Fellmann et al., 2015) CD23 ist ein Transmembranglykoprotein Typ 2 mit einem Molekulargewicht von ca. 45kDa.(Acharya et al., 2010) Es besteht aus einem extrazellulären Anteil mit einem Lektin Typ C am C-Terminus, an welchem die Bindung von IgE erfolgt und einem kurzen Anteil im Cytoplama mit N-Terminus.(Fellmann et al., 2015) Murines CD23 existiert in zwei Isoformen: CD23a und CD23b. CD23a wird an B-Zellen und follikulären dendritischen Zellen exprimiert.(Henningsson et al., 2011) CD23 kann sowohl als verankerter Rezeptor in der Zellmembran oder aber in frei löslicher Form vorliegen. Der Rezeptor kann neben IgE auch mit Liganden wie CD21 und MHC II interagieren. Die lösliche Form kann ebenfalls IgE binden und fungiert als Signalmolekül.(Acharya et al., 2010)
14 TUMORMICROENVIRONMENT
Das Microenvironment eines Tumors ist ein komplexes System aus zellulären und extrazellulären Komponenten und nimmt eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung und Progression ein. (Noman et al., 2015) Die Tumorzellen kommen nicht isoliert vor, sondern sind in eine Stroma-Tumormikroumgebung (TME, tumor microenvironment) eingebettet. Diese nimmt auf die malignen Zellen Einfluss und steuert deren Verhalten.(Polyak et al., 2009, Gould and Courtneidge, 2014) Gleichzeitig sichern auch die malignen Zellen ihr Überleben, indem sie Einfluss auf das sie umgebende Milieu nehmen.(Karthaus et al., 2012) Die bidirektionale Kommunikation zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung ist für das Tumorwachstum essentiell.(Quail and Joyce, 2013)
Das Microenvironment eines primären Tumors enthält sämtliche Zellen des Immunsystems, wie auch NK-Zellen und dendritische Zellen. Diese sind nicht willkürlich im Tumor verteilt, sondern folgen einem bestimmten Verteilungsmuster. Ein markantes Merkmal sind dabei die tertiären lymphoiden Strukturen (TLS), die sich am invasiven Rand des Tumors befinden.
Diese bestehen aus T-Zell reichen Regionen, die an B-Zell Follikel angrenzen. Reife DCs infiltrieren die T-Zell Regionen während follikuläre DCs in den B-Zell Regionen zu finden sind.
NK-Zellen sind hauptsächlich im invasiven Rand des Tumors gehäuft und auch im Tumorstroma verteilt. (Fridman et al., 2014)
Die komplexe Entwicklung maligner Tumore beschreiben die sechs Hallmarks of Cancer (Hanahan and Weinberg, 2011): die Eigenproduktion von Wachstumshormonen, Resistenz gegenüber wachstumsinhibierender Signale, Vermeidung der Apoptose, unlimitierte Proliferation, dauerhafte Angiogenese und die Fähigkeit zu metastasieren. Seitdem wurden zwei weitere Hallmarks hinzugefügt: die Veränderung des Energiehaushalts und die Fähigkeit sich dem Zugriff des Immunsystems zu entziehen. (Karthaus et al., 2012, Fouad and Aanei, 2017) Das kreieren des Tumormicroenvironment dient der Umsetzung dieser Hallmarks of cancer. (Hanahan and Weinberg, 2011)
EINFLUSS DES TUMORMIKROENVIRONMENTS AUF NK-ZELLEN, DENDRITISCHE ZELLEN UND LYMPHKNOTEN
Die Herstellung einer hypoxischen Umgebung ist eine Möglichkeit wie maligne Tumore auf die Immunantwort Einfluss nehmen.(Noman et al., 2015) Dabei wurde bereits festgestellt, dass Tumorzellen mithilfe induzierter Hypoxie der Erkennung von NK-Zellen entkommen.(Eckert et al., 2016) Ebenso wurde der Einfluss des hypoxischen Milieus auf das Überleben, die Differenzierung und den Reifungsprozess dendritischer Zellen festgestellt. So werden diese in ihrer Tumor bekämpfenden Funktion eingeschränkt.(Noman et al., 2015)
15 Barrow et al. beschäftigten sich intensiv mit den Eigenschaften des Tumormicroenvironments, die die lytische Funktion von NK-Zellen hemmen. Die Modifikation der Oberflächenproteine (Gylcokalyx) der Tumorzelle, die Manipulation der Extrazellulären Matrix (EZM) durch Tumorzellen, ein negativer Einfluss auf das Komplement System durch den Tumor und auch das Induzieren einer hypoxischen Umgebung werden dabei als Faktoren der NK-Zellhemmung genannt. Auch andere nicht maligne Zellen, die den Tumor infiltrieren, sind in der Lage die NK- Zellfunktionen zu stören: Fibroblasten, Thrombozyten und regulatorische NK-Zellen.(Barrow and Colonna, 2017) Neben der negativen Beeinflussung der NK-Zellfunktion konnten bei Tumorpatienten mehrere Anomalien der NK-Zellen, eine geringere Anzahl sowie Toxizität und ein schlechteres Vermögen der NK-Zellen in den Tumor einzudringen beobachtet werden.(Levy et al., 2011)
In einem Review von Pinzon-Charry et al. wurden vom Tumor abgesonderte Produkte und deren negativer Einfluss auf dendritische Zellen untersucht.(Pinzon-Charry et al., 2005) Dabei konnten Zytokine (GM-CSF, IL-6, M-CSF, IL-10, VEGF), Entzündungsmediatoren (Ganglioside, PGE2) und Stoffwechselprodukte wie Tumorantigene und Polyamine als auslösende Faktoren identifiziert werden, die die Differenzierung, Reifung und das Überleben dendritischer Zellen beeinträchtigen.(Pinzon-Charry et al., 2005)
Die Migration von Tumor infiltrierenden dendritischen Zellen in die regionären drainierenden Lymphknoten und die dortige Präsentation von Tumorantigenen wird in der Literatur als Möglichkeit beschrieben, wie der Organismus auf vorhandene Tumore aufmerksam wird und eine Immunreaktion einleiten kann.(McDonnell et al., 2012, Pinzon-Charry et al., 2005) Jedoch gibt es auch Zweifel an diesem Mechanismus, insbesondere da festgestellt werden konnte, dass das Tumormicroenvironment in der Lage ist die im Tumor ansässigen dendritischen Zellen an der Migration in den Lymphknoten zu hindern.(McDonnell et al., 2012, Seyfizadeh et al., 2016, Pinzon-Charry et al., 2005)
16 LYMPHKNOTEN
Lymphknoten (LK) sind lymphatische Organe, die an strategisch günstigen Positionen im Körper stationiert sind. (Chandrasekaran and King, 2014) Im histologischen Aufbau können verschiedene Regionen unterschieden werden: der Cortex, Paracortex und das Mark. Im Cortex ist die oberflächlich gelegene B-Zell Region zu finden und zum Mark übergehend die Parakortikalzone, die der T-Zell Region entspricht.(Lüllmann-Rauch, 2009) Die B-Zell Region ist durch Lymphfollikel gekennzeichnet. Maßgebend für die Versammlung von B-Zellen in Follikeln sind die follikulären dendritischen Zellen (FDC).(Lüllmann-Rauch, 2009) Über den Paracortex treten zirkulierende Lymphozyten in den LK ein und T-zellen interagieren mit DCs.
Das Mark besteht aus einem Netzwerk lymphdrainierender Sinus und enthält Makrophagen, Plasmazellen und T-Zellen.(von Andrian and Mempel, 2003)
Abbildung 2: Lymphknoten Aufbau nach (Lüllmann-Rauch, 2009)
LK fungieren als Sammelstationen für Antigene und DCs aus dem peripheren Gewebe.(von Andrian and Mempel, 2003) Mit Antigenen beladene DCs migrieren über affarente Lymphgefäße in den Lymphknoten. (Angeli et al., 2006) Um eine Immunreaktion auszulösen,
17 reagieren die B- und T-Zellen auf die antikörperpräsentierenden DCs und follikulären dendritischen Zellen (FDCs).(von Andrian and Mempel, 2003)
3.6.1 LYMPHKNOTENMETASTASEN
Metastasen sind die häufigste Todesursache bei Krebserkrankungen und für 90% der Todesfälle verantwortlich. Tumor-drainierende Lymphknoten sind bei vielen Tumorarten der erste Zielort für Metastasen. (Chandrasekaran and King, 2014) Auch beim OSCC ist das Vorhandensein von Metastasen einer der bedeutendsten prognostischen Faktoren. OSCC Patienten mit Metastasen in regionären Lymphknoten weisen eine signifikant schlechtere Prognose auf. (Fan et al., 2011)
In Lymphknoten sind sämtliche Zellen des Immunsystems zu finden. T-Zellen, B-Zellen, NK- Zellen und antigenpräsentierende Zellen, wie dendritische Zellen und Makrophagen machen den größten Anteil aus.(Chandrasekaran and King, 2014)
Selbst wenn Tumorzellen es schaffen sekundäre Organe zu besiedeln, garantiert das ihnen noch nicht ihr Überleben. Die Immunzellen des microenvironments im sekundären Organ sind in der Lage das Überleben der eingedrungenen malignen Zellen zu erschweren oder zu verhindern. (Quail and Joyce, 2013) In der Literatur wird ein eintretender Ruhezustand der Tumorzellen (Immune-induced tumor dormancy) beschrieben, bei dem Tumorwachstum und die anti-Tumor Reaktion der Immunzellen im Gleichgewicht stehen und es zu einem Verharren als Mikrometastase kommt. (Quail and Joyce, 2013, Romero et al., 2014) NK-Zellen können durch ihre zytotoxische Aktivität das Entstehen von Metastasen verhindern.(Blake et al., 2016) Kommt es trotz Immunabwehr zur Entstehung von Lymphnotenmetastasen, alterieren diese die Lympknotenstruktur und Funktion. Es kommt zur Hyperplasie des Lymphknotens und zur Bildung neuer Lympgefäßstrukturen. Vor allem der Lymphangiogenese wird eine zentrale Rolle bei der initialen Metastasierung zugesprochen. (Ji, 2016) Durch die Expansion des Lymphgefäßnetzwerks im Rahmen der Lymphangiogenese steigt die Wahrscheinlichkeit für den Eintritt von Tumorzellen in das Lymphsystem. (Podgrabinska and Skobe, 2014)
Das von Tumorzellen sezernierte Signalmolekül VEGF-C (vascular endothelial growth factor C) induziert die Lymphangiogenese und ist ein integraler Bestandteil bei der Entstehung von Lymphknotenmetastasen. Auch Immunzellen wie B- und T-Zellen, Makrophagen und DCs stehen in direktem Zusammenhang mit der Lymphangiogenese. (Ji, 2016) B-Lymphozyten des Lymphknotens initiieren die Ausweitung des Lymphnetzwerks, die zu einer vermehrten Migration dendritischer Zellen in den Lymphknoten führt.(Angeli et al., 2006)
18 Bei Tumor-drainierenden Lymphknoten ohne Metastasen kann die Expansion des Lymphgefäßnetzwerks ein Frühzeichen für das Entstehen von Metastasen sein und als prognostischer Faktor und Angriffspunkt für Therapien bei aggressiven Tumoren fungieren.
(Liersch et al., 2012)
In dieser Arbeit wurden Patienten ohne Lymphknotenmetastasen ausgewählt, um eine günstige klinische Ausgangslage sicherzustellen.
19 4 ZIEL DER ARBEIT
Die immunologische Reaktionslage des Patienten scheint für das Tumorgeschehen von zentraler Bedeutung zu sein. Die genauen Wechselwirkungen zwischen Tumor und Immunsystem bei Invasion und Metastasierung sind jedoch noch wenig verstanden.
In dieser Arbeit soll im Rahmen einer Pilotstudie bei einem kleinen, aber klar definierten Patientenkollektiv, die Infiltration von NK-Zellen und dendritischen Zellen bei oralen Plattenepithelkarzinomen und regionären Lymphknoten untersucht werden.
Die Biopsie- und Tumorgewebeproben des definierten Patientenkollektives bestehen ausschließlich aus kleinen Tumoren, ohne Metastasen (T1/T2/N0). Orale Plattenepithelkarzinome mit dieser TNM-Klassifikation gelten als frühe Karzinome mit einer günstigen Prognose, bei denen nach Empfehlung der Leitlinie postoperativ eine regelmäßige Nachsorge ohne adjuvante Therapie (Radiotherapie, RCT) möglich ist.
Jedoch sind Patientenfälle zu beobachten, die trotz dieser guten Ausgangssituation und Prognose einen infausten klinischen Verlauf zeigen. Im Rahmen dieser Studie soll überprüft werden, ob sich Patientenfälle mit günstigem Verlauf und ungünstigem Verlauf hinsichtlich ihrer NK- und DC Zellinfiltration unterscheiden. Folgende Fragestellungen fassen das Ziel dieses Promotionsprojektes zusammen:
1. Ergibt sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl von NK Zellen in Biopsien, Tumorresektatproben oder Lymphknoten beim Vergleich von Patienten mit günstigem und ungünstigem Verlauf?
2. Ergibt sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl von dendritischen Zellen in Biopsien, Tumorresektatproben oder Lymphknoten beim Vergleich von Patienten mit günstigem und ungünstigem Verlauf?
20 5 MATERIAL UND METHODE
In der Arbeitsgruppe der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich- Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg wurden bereits mehrere Untersuchungen am selben Patientenkollektiv mit oralem Plattenepithelkarzinom vorgenommen.(Iliopoulos, 2016, Konopka, 2017, Stanuch, 2015) Es wurden etablierte Arbeitsmethoden angewandt, die bereits zuvor in einigen Studien der Arbeitsgruppe Einsatz fanden und auch weiterhin zum Einsatz kommen.(Konopka, 2017, Stanuch, 2015) Vor Beginn der Dissertation lagen bereits die Proben des Patientenkollektivs und die daraus entstandenen immunhistochemisch gefärbten Tissue Microarrays (TMAs) vor. Diese umfassen wesentlich mehr Marker als die dieses Dissertationsprojektes und werden bzw. wurden im Rahmen anderer Dissertationen untersucht. (Iliopoulos, 2016, Konopka, 2017)Die Digitalisierung der Präparate, sowie die immunhistochemische Färbung erfolgte im Pathologischen Institut der Universität Erlangen- Nürnberg (Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann) unter der Supervision von PD Dr. Maike Büttner-Herold. Im Rahmen dieser Dissertation wurde erstmalig die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten TMAs für CD21, CD23, CD56 und CD57 sowie deren statistischer Analyse vorgenommen.
AUSWAHL DES PATIENTENKOLLEKTIVS UND GRUPPENDEFINITION
Die klinische Prognose der Patienten wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst: die adjuvante postoperative Bestrahlung, Resektionsränder mit R0 > 5mm, die Tumorgröße und Lymphknotenmetastasen. Die Radiatio beeinflusst Immunzellen, wie z.B. dendritische Zellen und NK Zellen in ihrer Funktion und kann auch zur Rekrutierung verschiedener Immunzellen in den Tumor führen.(Lee et al., 2016, Friedman, 2002, Finkel et al., 2016, Shen et al., 2017) Daher wurde Im Rahmen dieser Studie ein klar definiertes homogenes Patientenkollektiv ausgewählt mit T1/T2, N0, R0 > 5mm und ohne adjuvante Therapie, damit ein möglicher Einfluss der NK-Zellinfiltration und der Infiltration dendritischer Zellen untersucht werden kann.
Für die Auswahl des Patientenkollektivs sind folgende Kriterien definiert:
➢ Primäres orales Plattenepithelkarzinom (OSCC)
➢ pT1 und pT2 Tumore (keine pT3 oder pT4 Tumore)
➢ Grading G1 und G2 (keinG3)
➢ Nur cN0 und pN0 (keine N+ Tumore)
➢ Nachbeobachtungszeitraum mindestens drei Jahre
➢ Keine Malignome des Aerodigestivtraktes oder orale Plattenepithelkarzinome in der Anamnese
➢ Mindestens 5mm Resektionsabstand am Hauptpräparat
21
➢ Keine Patienten, bei denen R0 Resektion erst im zweiten Eingriff erreicht werden konnte
➢ Keine Brachytherapie, Radiotherapie oder RCT (regionale Chemotherapie)
Die ausgewählten Patienten wurden in den Jahren 2006 bis 2011 wegen ihres OSCC in der Mund- Kiefer- Gesichtschirurgischen Klinik Erlangen behandelt. In Zusammenarbeit mit Dr.
med. Dr. med. dent. Christos Iliopoulos wurde über das Programm SOARIAN das Patientenkollektiv bezüglich der Auswahlkriterien überprüft und selektiert.(Iliopoulos, 2016) Die initiale Durchsicht kam auf 80 Patienten mit pT1/T2, pN0 und ohne andere Malignome in der Anamnese. 57 Patienten mit günstigem Verlauf und 23 Patienten mit ungünstigem Verlauf, bei welchen es innerhalb von drei Jahren zu einem Rezidiv kam. Von den 80 Patienten mussten 34 Patienten ausgeschlossen werden, da sie postoperativ aufgrund ihrer Invasionstiefe oder G3 eine Radiatio erhielten. Bei weiteren 29 Patienten war Probenmaterial nicht verfügbar. Letztendlich konnten 17 Patienten in das Patientenkollektiv aufgenommen werden. Diese Patienten wurden in zwei Gruppen aufgeteilt:
Gruppe 1 = günstiger Verlauf (kein Rezidiv innerhalb von drei Jahren) Gruppe 2 = ungünstiger Verlauf (Rezidiv innerhalb von drei Jahren) Gruppe 1 besteht aus 11 Patienten und Gruppe 2 aus 6 Patienten.
SOZIODEMOGRAPHISCHE DATEN UND LOKALISATION DER PLATTENEPITHELKARZINOME
Die 17 Patienten des Patienten des Kollektivs bestanden aus fünf Frauen und zwölf Männern.
Das Alter der Patienten mit Rezidiv lag bei Erstdiagnose 44-80 Jahre mit einem Durchschnittsalter von 59 Jahren. Bei den Patienten ohne Rezidiv lag es bei 42-79 Jahren bei Erstdiagnose mit einem Durchschnittsalter von 58 Jahren. Das Durchschnittsalter beider Gruppen lag bei 58,5 Jahren.
Bei Patienten ohne Rezidiv waren die Plattenepithelkarzinome am weichen Gaumen links (2), am Mundboden anterior (5), am Unterkiefer rechts (1) und links (1), am Zungenrand links (1) und an der Wange links (1). Bei den Patienten mit Rezidiv waren sie an der Wange Rechts (1), am Zungengrund rechts (1), am Gaumenbogen links (1), am Mundboden anterior (1) und rechts (1), am Unterkiefer rechts (1), an Wange/Mundwinkel links (1) und am weichen Gaumen links lokalisiert.
22 GEWEBEAUSWAHL
Die Gewebeproben wurden im Rahmen der routinemäßigen histopathologischen Diagnostik entnommen und an das Pathologische Institut der Universitätsklinik Erlangen weitergeleitet.
Für die Analysen am humanen Probenmaterial liegt ein Ethikvotum vor (Ref.-Nr. 45_12 Bc.).
Bei jedem Patienten müssen Primärexzision, Tumorhauptpräparat sowie Rezidiv (bei Gruppe 2) und Lymphknoten mit Status N0 zur Verfügung stehen. Die über Nummern zugeordneten Gewebeproben aus dem Archiv des Pathologischen Instituts (Gewebedatenbank des CCC- Erlangen Nürnberg, Projektnummer 100035) wurden als HE-Schnitte mikroskopiert um formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeblöcke für die TMA-Herstellung auszuwählen.
TMA-TECHNIK
Bei immunhistochemischen Färbungen ist die exakte Reproduzierbarkeit der Arbeitsschritte entscheidend um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Die TMA-Technik (TMA = tissue microarray) erlaubt durch die Fixierung vieler Gewebefragmente auf einem einzigen Paraffinblock die gleichzeitige Anfärbung einer großen Anzahl an Gewebeproben unter identischen Bedingungen.(Brown and Chandra, 2014, Fedor and De Marzo, 2005)
Je nach Größe der Gewebestanze (bei einem Durchmesser der gestanzten Gewebeprobe von 0,6 mm) können bis zu 1000 unterschiedliche Gewebeproben auf einem TMA-Block aufgenommen werden.(Bubendorf et al., 2001) In dieser Studie wurden maximal 60 Gewebeproben auf einen TMA-Block gesetzt.
Durch den Einsatz der TMA-Technik müssen nicht mehr, wie zuvor üblich, einzelne Schnitte pro Gewebeblock erstellt werden, sondern die verschiedenen Gewebeproben können auf nur einem Paraffinblock vereinigt werden. Dies erlaubt ein wirtschaftliches Arbeiten mit Zeit- und Kostenersparnis.(Brown and Chandra, 2014) Außerdem wird der Gewebeverlust bzw.
entstehende Schaden an den entnommen Gewebeproben reduziert und dadurch eine maximale Anzahl an unterschiedlichen Untersuchungen pro Gewebeblock möglich gemacht.
Bei begrenzter Verfügbarkeit von Gewebeproben ist dies ein erheblicher Vorteil.(Nocito et al., 2001)
REGIONAUSWAHL UND ERSTELLEN VON TMAS FÜR DIE IMMUNHISTOCHMISCHE FÄRBUNG
Die HE-Schnitte wurden mikroskopiert (Lichtmikroskop Axio Imager 2, 100 bis 400-fache Vergrößerung, Carl Zeiss AG, Göttingen) um repräsentative Areale für die TMA-Herstellung auszuwählen. Es erfolgte an den ausgewählten Regionen eine farbliche Markierung, um
23 anschließend mittels dermatologischer Biopsiestanze (Durchmesser 0,8mm) die manuell formalin-fixierten Gewebefragmente in den TMA-Block einzubringen. Dieser wurde erneut paraffiniert.
Der TMA-Block wurde 60 Minuten im Gefrierschrank bei -12°C aufbewahrt. Die durch die Kälte gewonnene festere Oberflächenstruktur erlaubte nun die Anfertigung feiner Mikrotomschnitte der Paraffinblöcke. In einer Schichtstärke von 2 µm wurden mithilfe eines Rotationsmikrotoms (Schlittenmikrotom Jung Hn40, Leica Instruments GmbH, Nussloch) Schnitte mit einem D- Hartmetallmesser (Feather® Safety Razor Co.Ltd., Osaka, Japan) in einem Winkel von 0° - 4°
angefertigt. Nach dem Strecken in einem auf 47°C temperierten Wasserbad (WNB14, Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach, Germany) wurden diese mit Aqua dest. auf Objektträger (Objektträger SuperFrost Plus® Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig) aufgenommen und mit entsprechender Objektnummer/-bezeichnung beschriftet.
Über Nacht erfolgte eine Aufbewahrung im Wärmeschrank (Modell 200, Memmert GmbH &
Co. KG, Schwabach, Germany) bei ca. 60°C. Anschließend wurden die Schnitte in Vorbereitung für den Autostainerprozess in absteigender Alkoholreihe entparaffiniert, um die immunhistochemische Färbung durchzuführen. Das Entparaffinieren ist nötig, um einen hydrophilen Zustand der Gewebeproben zu schaffen und dadurch eine Antigen-Antikörper- Reaktion für die spätere Auswertung zu ermöglichen. Das Färbeverfahren im vollautomatisierten Autostainer (VENTANA BenchMark ULTRA, Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim) macht Proteine mithilfe spezifischer Antikörper sichtbar. Zwei aufeinander folgende Gewebeproben wurden zudem als Positiv- und Negativkontrolle pro Färbevorgang mitgeführt.
MARKER
Antikörper Hersteller Klon Antikörpersubtyp Tier Verdünnung Anti-CD56 Cell Marque MRQ-42 Monoklonal Kaninchen 1:100
CC1 Puffer Anti-CD57 Dako Agilent
pathology solutions
TB01 Monoklonal IgM Maus 1:200 P1-8M Verdau Anti-CD21 Dako Agilent
pathology solutions
1F8 Monoklonal IgG Maus 1:100
P1-16M Verdau Anti-CD23 ThermoFisher
Scientific
SP23 Monoklonal IgG Kaninchen 1:100 CC1 Puffer
24 IMMUNHISTOCHEMISCHE FÄRBUNG
5.7.1 PROBENAUSWAHL UND VORBEREITUNG
Nach der Aufbewahrung über Nacht im Wärmeschrank bei ca. 60°C wurden die Gewebeproben inklusive Positiv- und Negativkontrollen ausgewählt. Es erfolgte die entsprechende Kennzeichnung von Objektträgern, die Festlegung von Tropfzonen sowie die Eintragung im Probenverzeichnis.
5.7.2 ENTPARAFFINIERUNG
Zur Vorbereitung auf die immunhistochemische Färbung wurden die Gewebeproben gemäß Standardprotokoll entparaffiniert.
15 min Xylol (Xylol >89%, rein, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe)
15 min Xylol
15 min Xylol
5 min 100% Isopropanol
5 min 100% Isopropanol
5 min 96% Isopropanol
5 min 96% Isopropanol
5 min 90% Isopropanol
5 min 70% Isopropanol
5 min 70% Isopropanol
5 min Glasküvette mit Aqua dest. (Rehydrierung)
30 min kochen in Citratpuffer pH-Wert 6,0, 1000ml Becherglas
(Citratpuffer PT Module Buffer, 100x, pH=6 LabVision Corp., Fremont, CA)
30 min RT (Raumtemperatur), nach Abkühlung in Citratpuffer fünfminütige Verweildauer in DAKO Waschpuffer pH-wert 7,6 (Waschpuffer DAKO Wash Buffer 10x Denmark A/S, Glostrup)
5.7.3 FÄRBEVORGANG
Die Färbung erfolgte mit dem vollautomatisierten Autostainer (VENTANA BenchMark ULTRA, Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim). Die dazugehörigen Reagenzien (siehe Tabelle 7) wurden nach Herstellerangaben verwendet. Das Färbeprotokoll besteht aus zahlreichen Schritten, in denen die Reagenzien für vorgegebene Zeitspannen bei bestimmten Temperaturen inkubiert werden. Nach jeder Inkubation führt das BenchMark ULTRA Gerät
25 einen Waschschritt durch, um ungebundenes Material von den Schnitten zu entfernen und trägt eine Coverslip-Lösung auf, die die Verdunstung von wässrigen Reagenzien vom Objektträger minimiert.(Ventana, 2017)
Die Visualisierung der Färbung erfolgte mittels UltraView Universal DAB Detection Kit (VENTANA Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim).
Mit dem ultraView Universal DAB Detection Kit werden spezifische Primärantikörper in Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten nachgewiesen. (Ventana, 2017) Die Färbung der Immunreaktion zwischen Antikörper und Antigen erfolgt mittels einer Enzym-Substrat- Reaktion, bei der farblose Chromogene in ihre farbigen Endprodukte umgewandelt werden.
Zur Detektion wurde die sog. Zwei-Schritt indirekte Methode verwendet: Zuerst bindet ein unmarkierter (unkonjugierter) Primärantikörper gegen das gesuchte Epitop im Gewebe und anschließend bindet ein Sekundärantiköper gegen den primären. Dieser zweite Antikörper ist mit der Meerrettichperoxidase gekoppelt, die später das Chromogen oxidiert. Das aktive Zentrum der Meerrettichperoxidase (Horseradish peroxidase= HRP) wird von einer Hämgruppe (Hämatin) gebildet. Das Substrat der Meerrettichperoxidase ist Wasserstoffperoxid (H2O2), das in Sauerstoff (O2) und Wasser (H2O) zerfällt. Die freiwerdenden Protonen oxidieren dabei das farblose Chromogen, welches dann ein Farbsignal abgibt. Hier wurde das Chromogen 3,3‘-Diaminobenzidin (DAB) verwendet, welches ein braunes Endprodukt bildet. Die entstandene Färbung am Ort der Antikörperbindung kann anschließend ausgewertet werden.(Parr, 2015)
Abbildung 3: Schematische
Darstellung der
Immunhistochemischen Färbereaktion Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit (Ventana, 2017)
Schematischer Ablauf einer immun- histochemischen Färbung mit der zwei- Schritt indirekten Methode: Der primäre Antikörper bindet an das Zielantigen auf dem untersuchten Gewebe. An diesen Primärantikörper kann nun ein sekundärer Antikörper binden, der mit der Meerrettichperoxidase gekoppelt ist (HRP-Multimer) Dieses Enzym vermittelt die Reaktion, die letztlich zur Oxidation des farblosen Chromogens
26 (DAB) führt, was mit einer braunen Farbreaktion verbunden ist. Die Copperlösung enthält Kupfersulfat und verstärkt die Färbung.
5.7.4 MANUELLE BEARBEITUNG DER PROBEN
3min RT, Filtration, anschließend Hämatoxylin (Histological Staining Reagent DAKO N.A., Inc., Carpinteria, CA
10min fließendes Leitungswasser (zur Entfernung überschüssiger Farbstoffe)
5 min Lagerung in Aqua dest.
Eindecken mit Aquatex (Eindeckmittel Aquatex®Merck KGaA, Darmstadt
Um eine stärkere Kontrastbildung der auszuwertenden, positiven Areale zu erreichen erfolgt eine Gegenfärbung mittels Hämatoxylin. Nach der erfolgten Gegenfärbung von Hand und der Eindeckung mit Aquatex (Deckgläser 18x18/24x24mm, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig Eindeckmittel Aquatex® Merck KGaA, Darmstadt, Faltenfilter Rotilabo® Typ 113P, Carl Roth GmbH & Co. Karlsruhe, Objektträger SuperFrost Plus®, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Pipettenspitzen, 10, 100, 200, 1000µl, Sarstedt AG& Co., Nümbrecht) wurden die Schnitte in Zusammenarbeit mit dem pathologischen Institut Erlangen gescannt (Zeiss Mirax MIDI Scanner, Zeiss, Jena, Germany) und vollständig digitalisiert (Axio Vision 4.6/4.8 Carl Zeiss AG, Göttingen; ImageJ 1,43u National institutes of Health, USA; Panoramic viewer 1.15 3DHistech, Budapest, Ungarn; ZEN 2011 lite Carl Zeiss AG, Göttingen).
Im Zuge des virtuellen Mikroskopiervorgangs werden pro Präparat je zwei Gesichtsfelder (je 0,6 mm²) ausgewählt, da die gestanzten Gewebefragmente einen zu großen Durchmesser für die Auswertung aufwiesen. Mithilfe der Software Biomas (MSAB, Erlangen, Deutschland) wurden die immunhistochemisch identifizierten NK-Zellen und dendritischen Zellen in den Gewebearten (Tumor, Probeexzision, Lymphknoten) manuell quantitativ erhoben und die positiven Zellen pro Flächeneinheit in jedem Gesichtsfeld bestimmt. Im Vorfeld erfolgte eine graphische Unterteilung innerhalb der Gesichtsfelder wobei Tumor und Probeexzision in Stroma- und Tumorregion und bei den Lymphknoten bei DCs in follikuläre und interfollikuläre Zone unterteilt wurden. Die Software Biomas konnte eine absolute Zellverteilung in Bezug auf Quadratmillimeter aus den gezählten positiven Zellen errechnen.
27 Abbildung 4: CD57 Tumorresektatprobe, Unterteilung Tumor/Stroma
Gesichtsfeld aus einer Tumorresektatprobe, dass die verschiedenen Anteile Tumor und Stroma aufzeigt. Es sind positiv angefärbte CD57 NK-Zellen in Braun zu erkennen. Immun- histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
STATISTISCHE ANALYSE
Die Auswahl von je zwei repräsentativen Gesichtsfeldern je Schnitt erfolgte in Regionen mit hoher Markerexpression. In jedem Gesichtsfeld wurden die positiven Zellen pro Flächeneinheit bestimmt. Zur Erhebung der immunhistochemischen Färberesultate und relativen Expressionsrate pro Auswertungsfläche wurde die Anzahl der ermittelten Zellen als positive Zellen pro Quadratmillimeter definiert. Vor der Auswertung wurden Mehrfachzählungen pro Gewebe zusammengefasst.
Ein p-Wert von ≤0,05 wird als signifikant betrachtet. Als Auswertungssoftware wurde SPSS 22 für Mac OS (IBM Inc. New York, USA) verwendet.
Zur Darstellung der quantitativen Daten kamen der Median, der Interquartilbereich (IQR) sowie ANOVA (Varianzanalyse) zum Einsatz.
28 6 ERGEBNISSE
Bei Analyse der Primärexzision, Tumorexzision und Lymphknotenbiopsie hinsichtlich der Infiltration von NK-Zellen und dendritischen Zellen wurden die entsprechenden Proben in einen günstigen (ohne Rezidiv innerhalb von drei Jahren) und einen ungünstigen (mit Rezidiv innerhalb von drei Jahren) Verlauf unterteilt.
ABSOLUTE NK-ZELLINFILTRATION IN BIOPSIEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die NK-Zellanzahl der CD56 positiven Zellen liegt bei Biopsien in Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf im epithelialen Anteil, im Stroma sowie im Gesamtgewebe höher (Median Epithel: 93 Zellen/mm², Median Stroma: 724 Zellen/mm2, Median Gesamtgewebe: 300 Zellen/mm² siehe Tabelle 2) als in entsprechenden Kompartimenten der Biopsien mit klinisch günstigem Verlauf (Median Epithel: 24 Zellen/mm², Median Stroma: 385 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 128 Zellen/mm² siehe Tabelle 1).
Dabei zeigt sich der Unterschied mit einem p-Wert > 0,05 als nicht signifikant siehe Tabelle 1.
p-Wert: 0,298
Abbildung 5: CD56 Gesamtgewebe in Biopsien mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD56); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die NK-Zellanzahl der CD56 positiven Zellen liegt bei Biopsien in Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf im Gesamtgewebe (Median: 300
29 Zellen/mm²) höher als im Gesamtgewebe (Median: 128 Zellen/mm²) von Fällen mit
günstigem Verlauf. p-Wert: 0,298
Die Analyse der CD57 positiven Zellzahl zeigt wie bei CD56 im epithelialen Anteil und im Gesamtgewebe der Biopsieproben höhere Werte bei ungünstigem klinischen Verlauf (Median Epithel: 95 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 253 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als bei Biopsien mit günstigem klinischen Verlauf (Median Epithel: 83 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 139 Zellen/mm² siehe Tabelle 1).
Nur im Gewebestroma der Biopsien mit ungünstigem Verlauf ist die CD57 positive Zellzahl niedriger (Median Stroma: 408 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als im Gewebestroma der Biopsien mit günstigem Verlauf (Median Stroma: 457 Zellen/mm², siehe Tabelle 1).
Auch hier liegt der p-Wert in allen Kompartimenten über 0,05, siehe Tabelle 1.
p-Wert: 0,518
Abbildung 6: CD57 Gesamtgewebe in Biopsien mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD57); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die Analyse der CD57 positiven Zellzahl zeigt im
Gesamtgewebe der Biopsieproben höhere Werte bei ungünstigem klinischen Verlauf (Median: 253 Zellen/mm²) als bei Biopsien mit günstigem klinischen Verlauf (Median: 139 Zellen/mm²). p-Wert: 0,518
30 ABSOLUTE NK-ZELLINFILTRATION IN TUMORRESEKTATPROBEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die NK-Zellzahl der CD56 positiven Zellen liegt im Anteil des Tumorstromas sowie im Gesamtgewebe bei Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf höher (Median Stroma: 324 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 183 Zellen/mm² siehe Tabelle 4) als in den entsprechenden Kompartimenten der Fälle mit günstigem klinischen Verlauf (Median Stroma:
118 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 161 Zellen/mm² siehe Tabelle 3).
Nur im jeweiligen epithelialen Anteil des Tumors liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf die Zahl der CD56 positiven Zellen niedriger (Median Epithel: 54 Zellen/mm² siehe Tabelle 4) als in Fällen mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 68 Zelllen/mm², siehe Tabelle 3).
Mit einem p-Wert von > 0,05 bei allen Kompartimenten sind die Unterschiede nicht signifikant.
(siehe Tabelle 3)
Bei der NK-Zellzahl der CD57 positiven Zellen liegen die Werte bei Fällen mit ungünstigem Verlauf sowohl im Epithel, im Stroma als auch im Gesamtgewebe höher (Median Epithel: 144 Zellen/mm², Median Stroma: 349 Zellen/mm², Gesamtgewebe: 211 Zellen/ mm², siehe Tabelle 4) als in den entsprechenden Kompartimenten bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 60 Zellen/mm², Median Stroma: 147 Zellen/mm², Gesamtgewebe: 90 Zellen/mm², siehe Tabelle 3).
Der p-Wert liegt in allen Kompartimenten über 0,05, siehe Tabelle 3.
31 p-Wert: 0,304
Abbildung 7: CD56 Stroma bei Tumorresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD56); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die NK-Zellzahl der CD56 positiven Zellen liegt im Anteil des Tumorstromas bei Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf höher (Median Stroma: 324 Zellen/mm²) als im Tumorstroma (Median Stroma: 118 Zellen/mm²) bei Fällen mit günstigem Verlauf. p-Wert: 0,304
32 Abbildung 8: CD56 Marker für NK Zellen, Tumorresektatprobe
Auswertung eines Gesichtsfeldes mit Biomas; grüne Linie unterteilt: Roi Innen (Roi= region of interest) mit Tumorgewebe von Roi außen mit Stroma; Rote Kreise: positiv markierte NK- Zellen im Roi innen (Tumor) Immun-histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
p-Wert: 0,106
33 Abbildung 9: CD57 Stroma bei Tumorresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD57); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Bei der NK-Zellzahl der CD57 positiven Zellen liegen die Werte bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im Tumorstroma (Median Stroma: 349 Zellen/mm²) höher als im Stroma (Median Stroma: 147 Zellen/mm²) bei Fällen mit günstigem Verlauf. p- Wert: 0,106
