3min RT, Filtration, anschließend Hämatoxylin (Histological Staining Reagent DAKO N.A., Inc., Carpinteria, CA
10min fließendes Leitungswasser (zur Entfernung überschüssiger Farbstoffe)
5 min Lagerung in Aqua dest.
Eindecken mit Aquatex (Eindeckmittel Aquatex®Merck KGaA, Darmstadt
Um eine stärkere Kontrastbildung der auszuwertenden, positiven Areale zu erreichen erfolgt eine Gegenfärbung mittels Hämatoxylin. Nach der erfolgten Gegenfärbung von Hand und der Eindeckung mit Aquatex (Deckgläser 18x18/24x24mm, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig Eindeckmittel Aquatex® Merck KGaA, Darmstadt, Faltenfilter Rotilabo® Typ 113P, Carl Roth GmbH & Co. Karlsruhe, Objektträger SuperFrost Plus®, Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Pipettenspitzen, 10, 100, 200, 1000µl, Sarstedt AG& Co., Nümbrecht) wurden die Schnitte in Zusammenarbeit mit dem pathologischen Institut Erlangen gescannt (Zeiss Mirax MIDI Scanner, Zeiss, Jena, Germany) und vollständig digitalisiert (Axio Vision 4.6/4.8 Carl Zeiss AG, Göttingen; ImageJ 1,43u National institutes of Health, USA; Panoramic viewer 1.15 3DHistech, Budapest, Ungarn; ZEN 2011 lite Carl Zeiss AG, Göttingen).
Im Zuge des virtuellen Mikroskopiervorgangs werden pro Präparat je zwei Gesichtsfelder (je 0,6 mm²) ausgewählt, da die gestanzten Gewebefragmente einen zu großen Durchmesser für die Auswertung aufwiesen. Mithilfe der Software Biomas (MSAB, Erlangen, Deutschland) wurden die immunhistochemisch identifizierten NK-Zellen und dendritischen Zellen in den Gewebearten (Tumor, Probeexzision, Lymphknoten) manuell quantitativ erhoben und die positiven Zellen pro Flächeneinheit in jedem Gesichtsfeld bestimmt. Im Vorfeld erfolgte eine graphische Unterteilung innerhalb der Gesichtsfelder wobei Tumor und Probeexzision in Stroma- und Tumorregion und bei den Lymphknoten bei DCs in follikuläre und interfollikuläre Zone unterteilt wurden. Die Software Biomas konnte eine absolute Zellverteilung in Bezug auf Quadratmillimeter aus den gezählten positiven Zellen errechnen.
27 Abbildung 4: CD57 Tumorresektatprobe, Unterteilung Tumor/Stroma
Gesichtsfeld aus einer Tumorresektatprobe, dass die verschiedenen Anteile Tumor und Stroma aufzeigt. Es sind positiv angefärbte CD57 NK-Zellen in Braun zu erkennen. Immun-histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
STATISTISCHE ANALYSE
Die Auswahl von je zwei repräsentativen Gesichtsfeldern je Schnitt erfolgte in Regionen mit hoher Markerexpression. In jedem Gesichtsfeld wurden die positiven Zellen pro Flächeneinheit bestimmt. Zur Erhebung der immunhistochemischen Färberesultate und relativen Expressionsrate pro Auswertungsfläche wurde die Anzahl der ermittelten Zellen als positive Zellen pro Quadratmillimeter definiert. Vor der Auswertung wurden Mehrfachzählungen pro Gewebe zusammengefasst.
Ein p-Wert von ≤0,05 wird als signifikant betrachtet. Als Auswertungssoftware wurde SPSS 22 für Mac OS (IBM Inc. New York, USA) verwendet.
Zur Darstellung der quantitativen Daten kamen der Median, der Interquartilbereich (IQR) sowie ANOVA (Varianzanalyse) zum Einsatz.
28 6 ERGEBNISSE
Bei Analyse der Primärexzision, Tumorexzision und Lymphknotenbiopsie hinsichtlich der Infiltration von NK-Zellen und dendritischen Zellen wurden die entsprechenden Proben in einen günstigen (ohne Rezidiv innerhalb von drei Jahren) und einen ungünstigen (mit Rezidiv innerhalb von drei Jahren) Verlauf unterteilt.
ABSOLUTE NK-ZELLINFILTRATION IN BIOPSIEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die NK-Zellanzahl der CD56 positiven Zellen liegt bei Biopsien in Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf im epithelialen Anteil, im Stroma sowie im Gesamtgewebe höher (Median Epithel: 93 Zellen/mm², Median Stroma: 724 Zellen/mm2, Median Gesamtgewebe: 300 Zellen/mm² siehe Tabelle 2) als in entsprechenden Kompartimenten der Biopsien mit klinisch günstigem Verlauf (Median Epithel: 24 Zellen/mm², Median Stroma: 385 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 128 Zellen/mm² siehe Tabelle 1).
Dabei zeigt sich der Unterschied mit einem p-Wert > 0,05 als nicht signifikant siehe Tabelle 1.
p-Wert: 0,298
Abbildung 5: CD56 Gesamtgewebe in Biopsien mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD56); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die NK-Zellanzahl der CD56 positiven Zellen liegt bei Biopsien in Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf im Gesamtgewebe (Median: 300
29 Zellen/mm²) höher als im Gesamtgewebe (Median: 128 Zellen/mm²) von Fällen mit
günstigem Verlauf. p-Wert: 0,298
Die Analyse der CD57 positiven Zellzahl zeigt wie bei CD56 im epithelialen Anteil und im Gesamtgewebe der Biopsieproben höhere Werte bei ungünstigem klinischen Verlauf (Median Epithel: 95 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 253 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als bei Biopsien mit günstigem klinischen Verlauf (Median Epithel: 83 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 139 Zellen/mm² siehe Tabelle 1).
Nur im Gewebestroma der Biopsien mit ungünstigem Verlauf ist die CD57 positive Zellzahl niedriger (Median Stroma: 408 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als im Gewebestroma der Biopsien mit günstigem Verlauf (Median Stroma: 457 Zellen/mm², siehe Tabelle 1).
Auch hier liegt der p-Wert in allen Kompartimenten über 0,05, siehe Tabelle 1.
p-Wert: 0,518
Abbildung 6: CD57 Gesamtgewebe in Biopsien mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD57); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die Analyse der CD57 positiven Zellzahl zeigt im
Gesamtgewebe der Biopsieproben höhere Werte bei ungünstigem klinischen Verlauf (Median: 253 Zellen/mm²) als bei Biopsien mit günstigem klinischen Verlauf (Median: 139 Zellen/mm²). p-Wert: 0,518
30 ABSOLUTE NK-ZELLINFILTRATION IN TUMORRESEKTATPROBEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die NK-Zellzahl der CD56 positiven Zellen liegt im Anteil des Tumorstromas sowie im Gesamtgewebe bei Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf höher (Median Stroma: 324 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 183 Zellen/mm² siehe Tabelle 4) als in den entsprechenden Kompartimenten der Fälle mit günstigem klinischen Verlauf (Median Stroma:
118 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 161 Zellen/mm² siehe Tabelle 3).
Nur im jeweiligen epithelialen Anteil des Tumors liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf die Zahl der CD56 positiven Zellen niedriger (Median Epithel: 54 Zellen/mm² siehe Tabelle 4) als in Fällen mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 68 Zelllen/mm², siehe Tabelle 3).
Mit einem p-Wert von > 0,05 bei allen Kompartimenten sind die Unterschiede nicht signifikant.
(siehe Tabelle 3)
Bei der NK-Zellzahl der CD57 positiven Zellen liegen die Werte bei Fällen mit ungünstigem Verlauf sowohl im Epithel, im Stroma als auch im Gesamtgewebe höher (Median Epithel: 144 Zellen/mm², Median Stroma: 349 Zellen/mm², Gesamtgewebe: 211 Zellen/ mm², siehe Tabelle 4) als in den entsprechenden Kompartimenten bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 60 Zellen/mm², Median Stroma: 147 Zellen/mm², Gesamtgewebe: 90 Zellen/mm², siehe Tabelle 3).
Der p-Wert liegt in allen Kompartimenten über 0,05, siehe Tabelle 3.
31 p-Wert: 0,304
Abbildung 7: CD56 Stroma bei Tumorresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD56); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die NK-Zellzahl der CD56 positiven Zellen liegt im Anteil des Tumorstromas bei Fällen mit ungünstigem klinischen Verlauf höher (Median Stroma: 324 Zellen/mm²) als im Tumorstroma (Median Stroma: 118 Zellen/mm²) bei Fällen mit günstigem Verlauf. p-Wert: 0,304
32 Abbildung 8: CD56 Marker für NK Zellen, Tumorresektatprobe
Auswertung eines Gesichtsfeldes mit Biomas; grüne Linie unterteilt: Roi Innen (Roi= region of interest) mit Tumorgewebe von Roi außen mit Stroma; Rote Kreise: positiv markierte NK-Zellen im Roi innen (Tumor) Immun-histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
p-Wert: 0,106
33 Abbildung 9: CD57 Stroma bei Tumorresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD57); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Bei der NK-Zellzahl der CD57 positiven Zellen liegen die Werte bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im Tumorstroma (Median Stroma: 349 Zellen/mm²) höher als im Stroma (Median Stroma: 147 Zellen/mm²) bei Fällen mit günstigem Verlauf. p-Wert: 0,106
34 Abbildung 10: CD57 Marker für NK Zellen, Tumorresektatprobe
Auswertung eines Gesichtsfeldes mit Biomas; grüne Linie unterteilt: Roi Innen (Roi= region of interest) mit Tumorgewebe von Roi außen mit Stroma; Rote Kreise: positiv markierte NK-Zellen im Roi außen (Stroma) Immun-histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt
indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
ABSOLUTE NK-ZELLINFILTRATION IN LYMPHKNOTENRESEKTATPROBEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die Zellzahl CD56 positiver NK-Zellen liegt im Lymphgewebe bei Fällen mit günstigem Verlauf höher (Median: 626 Zellen/mm², siehe Tabelle 5) als bei Fällen mit ungünstigem Verlauf (Median: 330 Zellen/mm², siehe Tabelle 6).
Der p-Wert liegt über 0,05, siehe Tabelle 5.
Die Zellzahl CD57 positiver Zellen liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf höher (Median:
373 Zellen/mm², siehe Tabelle 6), als bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median:246 Zellen/mm², siehe Tabelle 5)
Der p-Wert liegt auch hier über 0,05, siehe Tabelle 5.
35 p-Wert:0,462
Abbildung 11: CD56 Lymphknotenresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD56); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die Zellzahl CD56 positiver NK-Zellen liegt im
Lymphgewebe bei Fällen mit günstigem Verlauf höher (Median: 626 Zellen/mm², siehe Tabelle 5) als bei Fällen mit ungünstigem Verlauf (Median: 330 Zellen/mm², siehe Tabelle 6).
p-Wert:0,462
36 p-Wert: 0,216
Abbildung 12: CD57 Lymphknotenresektatproben bei günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: NK-Zellanzahl (CD57); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die Zellzahl CD57 positiver Zellen liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf höher (Median: 373 Zellen/mm², siehe Tabelle 6), als bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median:246 Zellen/mm², siehe Tabelle 5) p-Wert: 0,216
ABSOLUTE INFILTRATION DENDRITISCHER ZELLEN IN BIOPSIEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die Zellzahl CD21 positiver dendritischer Zellen liegt bei Biopsien in Fällen mit ungünstigem Verlauf im Stroma als auch im epithelialen Gewebe niedriger (Median Epithel: 20 Zellen/mm², Median Stroma: 160 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als in als in den entsprechenden Kompartimenten bei Biopsien mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 22 Zellen/mm², Median Stroma: 272 Zellen/mm² siehe Tabelle 1).
Im gesamten Gewebe ist jedoch die CD21 positive Zellzahl bei Biopsien mit ungünstigem Verlauf höher (Median Gesamtgwebe: 55 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als bei Biopsien mit günstigem Verlauf (Median Gesamtgewebe: 42 Zellen/mm², siehe Tabelle 1)
Der Unterschied zwischen den beiden Gruppen (günstig/ungünstig) ist mit einem p-Wert über 0,05 in allen Kompartimenten nicht signifikant, siehe Tabelle 1.
37 Für CD23 positive dendritische Zellen liegt die Zellzahl der Biopsien mit günstigem Verlauf beim epithelialen Anteil sowie beim Gesamtgewebe niedriger (Median Epithel: 39 Zellen/mm², Median Gesamtgwebe: 115 Zellen/mm², siehe Tabelle 1) als bei den einsprechenden Kompartimenten mit ungünstigem Verlauf (Median Epithel 44 Zellen/mm², Gesamtgewebe:
175 Zellen/mm², siehe Tabelle 2).
Im Gewebestroma der Biopsien mit günstigem Verlauf ist die CD23 positive Zellzahl höher (Median Stroma: 255 Zellen/mm², siehe Tabelle 1) als im Stroma der Biopsien mit ungünstigem Verlauf (Median Stroma: 229 Zellen/mm², siehe Tabelle 2).
Auch bei CD23 ist der Unterschied zwischen beiden Gruppen mit einem p-Wert über 0,05 nicht signifikant, siehe Tabelle 1.
p-Wert: 0,171
Abbildung 13: CD21 Gesamtgewebe bei Biopsien mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: DC-Zellanzahl (CD21); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Im gesamten Gewebe ist die CD21 positive Zellzahl bei Biopsien mit ungünstigem Verlauf höher (Gesamtgwebe: 55 Zellen/mm², siehe Tabelle 2) als bei Biopsien mit günstigem Verlauf (Gesamtgewebe: 42 Zellen/mm², siehe Tabelle 1). p-Wert: 0,171
38 p-Wert: 0,622
Abbildung 14: CD23 Gesamtgewebe bei Biopsien mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: DC-Zellanzahl (CD23); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Für CD23 positive dendritische Zellen liegt die Zellzahl der Biopsien mit günstigem Verlauf beim Gesamtgewebe (Median: 115 Zellen/mm²) niedriger als beim Gesamtgewebe (Median: 175 Zellen/mm²) der Biopsien mit ungünstigem Verlauf. p-Wert: 0,622
ABSOLUTE INFILTRATION DENDRITISCHER ZELLEN IN
TUMORRESEKTATPROBEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die Zellzahl der CD21 positiven dendritischen Zellen liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im epithelialen Anteil sowie im Gesamtgewebe niedriger (Median Epithel: 23 Zellen/mm², Gesamtgewebe: 119 Zellen/mm², siehe Tabelle 4) als in den entsprechenden Kompartimenten bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 32 Zellen/mm², Gesamtgewebe: 128 Zellen/mm², siehe Tabelle 3)
Im Tumorstroma hingegen liegt die Zellzahl der CD21 positiven dendritischen Zellen bei Fällen mit ungünstigem Verlauf höher (Median Stroma 326 Zellen/mm², siehe Tabelle 4) als im Tumorstroma der Fälle mit günstigem Verlauf (Median Stroma: 177 Zellen/mm², siehe Tabelle 3).
39 Der p-Wert ist bei allen Kompartimenten > 0,05, siehe Tabelle 3.
p-Wert: 0,260
Abbildung 15: CD21 Stroma in Tumorresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: DC-Zellanzahl (CD21); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (lebend) und ungünstigem (tot) Verlauf; Im Tumorstroma hingegen liegt die Zellzahl der CD21 positiven dendritischen Zellen bei Fällen mit ungünstigem Verlauf höher (Median Stroma 326 Zellen/mm², siehe Tabelle 4) als im Tumorstroma der Fälle mit günstigem Verlauf (Median Stroma: 177 Zellen/mm², siehe Tabelle 3). p-Wert: 0,260
40 Abbildung 16: CD21 Marker für DCs, Tumorresektatprobe
Auswertung eines Gesichtsfeldes mit Biomas; grüne Linie unterteilt: Roi Innen (Roi= region of interest) mit Tumorgewebe von Roi außen mit Stroma; Rote Kreise: positiv markierte NK-Zellen im Roi außen (Stroma) Immun-histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt
indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
Die Zellzahl der CD23 positiven dendritischen Zellen liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im Stromagewebe sowie im Gesamtgewebe höher (Median Stroma: 249 Zellen/mm², Gesamtgwebe: 133 Zellen/mm², siehe Tabelle 4) als in den entsprechenden Kompartimenten bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median Stroma: 52 Zellen/mm², Gesamtgwebe: 90 Zellen/mm², siehe Tabelle 3).
Im epithelialen Anteil der Fälle mit ungünstigem Verlauf ist die Zellzahl der CD23 positiven dendritischen Zellen niedriger (Median Epithel: 13 Zellen/mm², siehe Tabelle 4) als im epithelialen Anteil der Fälle mit günstigem Verlauf (Median Epithel: 39 Zellen/mm², siehe Tabelle 3).
Der Unterschied zwischen günstigen und ungünstigen Fällen ist im Tumorstroma mit einem p-Wert von 0,02 signifikant, siehe Tabelle 3.
41 p-Wert: 0,020
Abbildung 17: CD23 Stroma in Tumorresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: DC-Zellanzahl (CD23); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die Zellzahl der CD23 positiven dendritischen Zellen liegt bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im Stroma höher (Median Stroma: 249 Zellen/mm²) als bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median Stroma: 52 Zellen/mm²) p-Wert: 0,020
42 Abbildung 18: CD23 Marker für DCs, Tumorresektatprobe
Auswertung eines Gesichtsfeldes mit Biomas; grüne Linie unterteilt: Roi Innen (Roi= region of interest) mit Tumorgewebe von Roi außen mit Stroma; Rote Kreise: positiv markierte NK-Zellen im Roi innen (Tumor) Immun-histochemischen Färbung mit der zwei-Schritt indirekten Methode: Ventanta UltraView Universal DAB Detection Kit
ABSOLUTE INFILTRATION DENDRITISCHER ZELLEN IN
LYMPHKNOTENRESEKTATPROBEN IN FÄLLEN VON GÜNSTIGEM UND UNGÜNSTIGEM VERLAUF
Die Zellzahlen für CD21 positive dendritische Zellen sind bei Fällen mit ungünstigem Verlauf sowohl in der follikulären Zone, der interfollikulären Zone als auch im Gesamtgewebe höher (Median follikulär: 6392 Zellen/mm², Median interfollikulär: 287 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 954 Zellen/mm², siehe Tabelle 6) als in den entsprechenden Kompartimenten bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median follikulär: 4372 Zellen/mm², Median interfollikulär:
249 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe:728 Zellen/mm², siehe Tabelle 5)
Der Unterschied zwischen beiden Gruppen (günstig/ungünstig) ist mit einem p-Wert > 0,05 nicht signifikant.
Bei den CD23 positiven dendritischen Zellen sind die Werte bei Fällen mit ungünstigem Verlauf in der follikulären Zone, der interfollikulären Zone als auch in Gesamtgewebe niedriger (Median follikulär: 8474 Zellen/mm², Median interfollikulär: 1429 Zellen/mm², Median
43 Gesamtgewebe: 2041 Zellen/mm², siehe Tabelle 6) als in den entsprechenden Kompartimenten bei Fällen mit günstigem Verlauf (Median follikulär: 8731 Zellen/mm², Median interfollikulär: 1537 Zellen/mm², Median Gesamtgewebe: 2317 Zellen/mm², siehe Tabelle 5).
Auch hier ist der Unterschied zwischen beiden Gruppen (günstig/ungünstig) ist mit einem p-Wert > 0,05 nicht signifikant. (siehe Tabelle 5)
p-Wert: 0,733
Abbildung 19: CD21 Gesamtgwebe bei Lymphknotenresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: DC-Zellanzahl (CD23); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Die Zellzahlen für CD21 positive dendritische Zellen sind bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im Gesamtgewebe (Median: 954 Zellen/mm²) höher als im Gesamtgewebe bei Fällen mit günstigem Verlauf. p-Wert: 0,733
44 p-Wert: 1,000
Abbildung 20: CD23 Gesamtgwebe bei Lyphknotenresektatproben mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf
Y-Achse: DC-Zellanzahl (CD23); X-Achse: 2 Patientengruppen mit günstigem (kein Rezidiv) und ungünstigem (Rezidiv) Verlauf; Bei den CD23 positiven dendritischen Zellen sind die Werte bei Fällen mit ungünstigem Verlauf im Gesamtgewebe (Median Gesamtgewebe: 2041 Zellen/mm²) als im Gesamtgewebe (Median: 2317 Zellen/mm²) bei Fällen mit günstigem Verlauf. p-Wert: 1,000
45 7 DISKUSSION
Beim Colon Karzinom wird bereits der Immunoscore zusätzlich zur TNM- Klassifikation als wichtiger Prognosefaktor mit einbezogen. Dabei beschreibt der Immunoscore die quantitative Infiltration von Immunzellen im Tumor.(Galon et al., 2014) Für das orale Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle (OSCC) wird in der klinischen Praxis die TNM-Klassifikation für Therapieplanung und Prognose herangezogen.(Blatt et al., 2017, Brinkman and Wong, 2006) Da Patienten mit OSCC trotz gleicher TNM Klassifikation Unterschiede im klinischen Verlauf, dem Behandlungserfolg und ihrer Prognose zeigten, führte es zu Überlegungen beim OSCC auch einen Immunoscore zusätzlich zur TNM- Klassifikation hinzuzuziehen, wie es bereits beim Colon Karzinom der Fall ist.
Eine mögliche Korrelation zwischen NK-Zellinfiltration, dendritischer Zellinfiltration und Prognose, wie es diese Arbeit untersucht, wurde bereits bei verschiedenen Tumoren geprüft.(Fregni et al., 2012, Takanami et al., 2001, Villegas et al., 2002, Ishigami et al., 2000, Coca et al., 1997, Karthaus et al., 2012, Tran Janco et al., 2015, Mayordomo et al., 1995, Adema, 2009) Dabei wurde eine hohe NK-Zellinfiltration meist mit besserer Prognose und geringerer Progression des Tumors assoziiert.(Gannon et al., 2009, Nielsen et al., 2013) Die Infiltration dendritischer Zellen (DCs) ergab ein gespaltenes Bild bezüglich ihrer prognostischen Wertigkeit. So wird einerseits eine erhöhte Anzahl an DCs mit besserer Prognose in Verbindung gebracht andererseits aber auch deren prognostischer Wert angezweifelt.(Karthaus et al., 2012, Adema, 2009, Tran Janco et al., 2015) Die unterschiedliche Wirkung der DCs - einerseits im Rahmen der vollständigen T-Zellaktivierung das Immunsystem zu stärken - und andererseits es im Zuge des Toleranzphänomens zu schwächen (siehe Kapitel 3.3.1), könnte diese unterschiedlichen Resultate begründen.
(Karthaus et al., 2012, Adema, 2009)
Die quantitative Untersuchung der NK-Zellen und der dendritischen Zellen des Tumormicroenvironments (TME) im OSCC konnte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Patientengruppen mit günstigem und ungünstigem Verlauf aufzeigen. So zeigten Patienten mit oralem Plattenepithelkarzinom, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, trotz höherer Anzahl an infiltrierenden NK-Zellen einen infausten Verlauf. Zwar waren die höheren Werte weder für die Biopsien noch die Tumorresektatproben signifikant, jedoch zeigte sich bei so gut wie allen untersuchten Gewebeanteilen (Epithel, Stroma, Gesamtgewebe), sowohl für CD56 als auch CD57 positive NK-Zellen, die gleiche Tendenz. Bei den Ergebnissen dieser Arbeit ergibt sich auch keine klare Tendenz bezüglich des prognostischen Werts der follikulären dendritischen Zellen. So sind bei Patienten mit günstigem Verlauf teilweise sowohl eine höhere Anzahl an dendritischen Zellen in den einzelnen Gewebekompartimenten (Epithel,
46 Stroma) von Tumorresektatproben und Biopsien zu finden und teilweise auch eine niedrigere Anzahl an dendritischen Zellen. Bei Betrachtung der Werte für das Gesamtgewebe von Biopsie und Tumorresektat ist eine Tendenz für eine erhöhte Anzahl an CD23 und CD21 positiven DCs bei ungünstigen Verläufen zu erkennen. Dabei zeigte sich jedoch nur ein signifikanter Unterschied bezüglich der CD23 positiven DCs im Tumorstroma der Tumorresektatproben, wobei die Anzahl der dendritischen Zellen bei ungünstigem Verlauf erhöht war.
Nicht nur die vielfältige Einflussnahme des Tumormikroenvironments (TME) auf die in ihm befindlichen Immunzellen (siehe Kapitel 3.5) erschwert einen direkten Zusammenhang zwischen Immunzellinfiltration und Prognose herzustellen. Es ist auch zu berücksichtigen, dass das immunologische Tumormicroenvironment nicht homogen ist und sowohl für unterschiedliche Tumorarten als auch bei Patienten mit derselben Tumorart variiert. So zeigen manche Tumore eine hohe Infiltration immunologischer Zellen auf, andere eine geringe Infiltration. Auch die genaue Lokalisation dieser Zellen spielt für ihren prognostischen Wert eine Rolle. (Becht et al., 2016) Damit ist es möglich, dass die Miteinbeziehung eines Immunoscores zusätzlich zur TNM-Klassifikation für das Colonkarzinom erfolgreich ist, für andere Tumorarten jedoch nicht von Nutzen. Es scheint als lasse die Betrachtung des TME beim OSCC zwar Rückschlüsse auf die Tumorprogression zu, jedoch zeigt sie keine Relevanz bezüglich der Prognose. Als mögliche Gründe dafür rücken systemische Faktoren, die auf die immunologische Abwehrlage Einfluss nehmen, in den Fokus.
Dass Wechselwirkungen zwischen Tumor und TME einen entscheidenden Einfluss auf Tumorwachstum und Progression nehmen hat sich in den letzten 2 Jahrzehnten der Forschung manifestiert, jedoch konnte nun beobachtet werden, dass auch durch Malignität ausgelöste systemische Reaktionen des Körpers auf den Tumor Einfluss nehmen und dabei auch tumorferne Organsysteme involviert sind. Fern vom Tumor lokalisiertes Gewebe kann strukturell und auf histopathologischer und molekularer Ebene Veränderungen aufzeigen.
(McAllister and Weinberg, 2014) Somit geht die Interaktion zwischen Wirt und Tumor weit über das lokale TME hinaus.(McAllister and Weinberg, 2010)
Überlegungen, ob Tumore nicht nur lokal, sondern auch in der Peripherie eine Immundefizienz induzieren, wurden bereits angestellt. So konnte bei Versuchen mit Mäusen beim Mammakarzinom festgestellt werden, dass Makrophagen, die nicht Tumor-assoziiert waren, sondern sich fernab des Tumors in der Peritonealhöhle befanden und auch Vorläuferzellen der Makrophagen, die Monozyten des peripheren Blutes, signifikante Veränderungen im Vergleich zu ihren normalen Vergleichsmakrophagen aufzeigten. Sie zeigten Beeinträchtigungen ihrer Immunfunktion und eine verminderte
Zelldifferenzierung.(Torroella-47 Kouri et al., 2013) Tumorassoziierte Faktoren und deren indirekte Angriffspunkte wie Transkriptionsfaktoren, Cytokine und Chemokine, bewirken die Veränderungen der Makrophagen sowohl im lokalen TME als auch systemisch in der Peripherie.(Torroella-Kouri et al., 2013) Die vom Tumor abgesonderten Faktoren sind sowohl im Tumor lokal (TME) als auch über das Blut an entfernten Lokalisationen (Knochenmark, Lymphknoten, Milz) tätig und leiten so eine systemische Immunsuppression ein.(Santegoets et al., 2016) Auch die Gefäßfunktionen werden bei Tumorpatienten nicht nur lokal verändert sondern auch an tumorfernen Organen.(Cedervall et al., 2015) Die Vermutung, dass die immunologische Abwehrlage nicht nur lokal sondern auch systemisch bestimmt wird, wird auch dadurch bestärkt, dass bereits Therapieerfolge mit Checkpoint-Inhibitoren bei checkpoint-negativen Tumoren festgestellt wurden.(Troiano et al., 2019, Aguiar et al., 2016) Spitzer et al. kritisierten den Fokus heutiger Immuntherapien auf das lokale TME und konnten in ihrer Arbeit aufzeigen, dass selbst bei intratumoral injiziierter Immuntherapie eine systemische Immunreaktion nötig war um eine Tumorabwehr zu erreichen.(Spitzer et al., 2017) Die Tatsache, dass die
Zelldifferenzierung.(Torroella-47 Kouri et al., 2013) Tumorassoziierte Faktoren und deren indirekte Angriffspunkte wie Transkriptionsfaktoren, Cytokine und Chemokine, bewirken die Veränderungen der Makrophagen sowohl im lokalen TME als auch systemisch in der Peripherie.(Torroella-Kouri et al., 2013) Die vom Tumor abgesonderten Faktoren sind sowohl im Tumor lokal (TME) als auch über das Blut an entfernten Lokalisationen (Knochenmark, Lymphknoten, Milz) tätig und leiten so eine systemische Immunsuppression ein.(Santegoets et al., 2016) Auch die Gefäßfunktionen werden bei Tumorpatienten nicht nur lokal verändert sondern auch an tumorfernen Organen.(Cedervall et al., 2015) Die Vermutung, dass die immunologische Abwehrlage nicht nur lokal sondern auch systemisch bestimmt wird, wird auch dadurch bestärkt, dass bereits Therapieerfolge mit Checkpoint-Inhibitoren bei checkpoint-negativen Tumoren festgestellt wurden.(Troiano et al., 2019, Aguiar et al., 2016) Spitzer et al. kritisierten den Fokus heutiger Immuntherapien auf das lokale TME und konnten in ihrer Arbeit aufzeigen, dass selbst bei intratumoral injiziierter Immuntherapie eine systemische Immunreaktion nötig war um eine Tumorabwehr zu erreichen.(Spitzer et al., 2017) Die Tatsache, dass die