Arbeitsvorschrift für die HPLC-Bestimmung Vitamins A and E in serum/plasma. Best.-Nr

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Arbeitsvorschrift für die HPLC-Bestimmung

Vitamins A and E in serum/plasma

Best.-Nr. 34000

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Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH ist zertifiziert nach ISO 9001 und ISO 13485 (einschließlich MDSAP). Unsere Produkte werden gemäß Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika hergestellt und in Verkehr gebracht.

Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH Am Haag 12

82166 Gräfelfing Deutschland

Tel.: +49 89 18930-0 Fax: +49 89 18930-299 www.chromsystems.de

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Inhalt ... Seite

1 Bestellinformationen ... 3

2 Einleitung ... 4

2.1 .... Hintergrundinformationen ... 4

2.2 .... Verwendungszweck ... 4

2.3 .... Prinzip des Reagenzienkits ... 4

3 HPLC-System ... 5

3.1 .... Ausstattung und Geräteparameter ... 5

3.2 .... HPLC-Säule ... 5

3.3 .... Betriebspausen ... 6

4 Chromatographische Trennung ... 6

5 Probenvorbereitung ... 6

5.1 .... Gewinnung und Aufbewahrung von Patientenproben ... 6

5.2 .... Rekonstitution des Kalibrators ... 7

5.3 .... Rekonstitution der Kontrollen ... 7

5.4 .... Probenvorbereitung ... 8

5.5 .... Haltbarkeit der vorbereiteten Proben ... 8

6 Zusätzlich benötigte Ausstattung ... 9

7 Datenerfassung und Auswertung ... 9

7.1 .... Kalibrierung des Auswertesystems ... 9

7.2 .... Quantitative Auswertung mit internem Standard ... 9

8 Qualitätskontrolle ... 9

9 Referenzbereiche ... 10

10 Umrechnungsfaktoren ... 12

11 Lagerung und Haltbarkeit der Reagenzien ... 12

12 Entsorgung ... 13

13 Beispielchromatogramme ... 13

14 Prüfung auf Interferenzen ... 14

14.1 .. Nachgewiesene Interferenzen ... 14

14.2 .. Keine Störung der Analytik ... 14

15 Maßnahmen bei Störungen ... 15

16 Literatur ... 16

Anhang I: ....Gefahren- und Sicherheitshinweise ... 17

Anhang II: ...Manuelle Berechnung ... 18

Anhang III: ..Leistungsdaten ... 19

Anhang IV: .Konformitätserklärung ... 21

Anhang V: ..Symbole... 23

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1 Bestellinformationen

Best.-Nr. Produkt

34000 HPLC-Reagenzienkit

Vitamins A and E in serum/plasma Inhalt für 100 Analysen:

Mobile Phase 1000 ml

Precipitation Reagent I 2,5 ml

Precipitation Reagent II 40 ml

Serum Calibration Standard 5 x 1,0 ml (lyoph.)

Internal Standard 2 ml

Reaction Vials 1.5 ml, amber colour 100 Stück

Einzeln lieferbare Komponenten

34001 Mobile Phase 1000 ml

34002 Mobile Phase 10 x 1000 ml

34006 Precipitation Reagent I 2,5 ml

34003 Precipitation Reagent II 40 ml

34004 Serum Calibration Standard 5 x 1,0 ml (lyoph.)

34008 Internal Standard 2 ml

33005 Reaction Vials 1.5 ml, amber colour 100 St.

Zubehör

34100 HPLC Column (equilibrated, with test chromatogram) 1 St.

15009 PEEK-encased Prefilter, 5 µm 5 St.

15010 PEEK Prefilter Housing 1 St.

18001 Precolumn Cartridge Holder 4/10 1 St.

18034 Precolumn Cartridge 4/10 1 St.

Chromsystems Kalibrator und Kontrollen für Vitamine A und E im Serum/Plasma

34004 Serum Calibration Standard 5 x 1,0 ml (lyoph.)

0032 Serum Control Bi-Level (I + II) 2 x 5 x 2,0 ml (lyoph.)

0036 Serum Control Level I 5 x 2,0 ml (lyoph.)

0037 Serum Control Level II 5 x 2,0 ml (lyoph.)

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2 Einleitung

2.1 Hintergrundinformationen

Vitamin A (auch Retinol oder Axerophtol) erfüllt eine Reihe wichtiger Funktionen im menschlichen und tierischen Organismus. Es ist an der Bildung von Rhodopsin beim Sehvorgang beteiligt, wirkt als Wachstumsfaktor beim Knochenwachstum, und ist Kofaktor bei der Bildung von Steroidhormonen. Aus Lebensmitteln tierischer Herkunft wird Vitamin A als Retinol, aus pflanzlichen Lebensmitteln als Carotinoid (Provitamin A) aufgenommen. Die Spaltung der Carotinoide in der Darmwand führt zur Bildung von Vitamin A. Mangel an Vitamin A äußert sich u. a. in Nachtblindheit, Hautaustrocknung und Haarausfall.

Bei gravierender Hypovitaminose kommt es zu Trübungen oder Einschmelzungen der Hornhaut. Vitamin-A- Mangel entsteht neben unzureichender Vitaminaufnahme auch durch eine gestörte Fettresorption,

Lebererkrankungen, Darmparasiten und Alkoholismus. Bei langfristiger Gabe hoher Dosen kann eine Hypervitaminose entstehen, die sich anfangs in Müdigkeit äußert, später treten Wachstumsstörungen und Knochenfrakturen auf.

Vitamin E umfasst eine Gruppe chemischer Verbindungen mit antioxidativen Eigenschaften. Die für den Menschen bedeutendste Form ist das α-Tocopherol, dessen wichtigste Wirkung der Schutz mehrfach ungesättigter Fettsäuren, einiger Vitamine (darunter auch Vitamin A), Hormone und Enzyme vor Zerstörung durch Oxidation ist. Tocopherol wirkt dabei als Radikalfänger. Vitamin E ist fettlöslich, reichert sich aber anders als das Vitamin A nicht im Fettgewebe an. Vitamin-E-Mangel tritt in der Regel zusammen mit

Fettstoffwechselstörungen auf und resultiert aus unzureichender Lipidaufnahme. Eine Hypovitaminose äußert sich in Ödembildung und hämolytischer Anämie (bes. bei Früh- und Neugeborenen) bzw. Schädigungen an der quergestreiften Muskulatur (bei Erwachsenen). Vitamin E wird bei oraler Aufnahme normalerweise gut vertragen, ein Überschuss an Vitamin E kann jedoch zur verminderten Aufnahme anderer fettlöslicher Vitamine führen.

2.2 Verwendungszweck

Der Chromsystems-Reagenzienkit Vitamine A und E im Serum/Plasma ist ein in-vitro-diagnostisches Produkt zur Verwendung in klinischen Laboratorien und dient der quantitativen Bestimmung von Vitamin A und Vitamin E in humanen Serum- und Plasmaproben mittels HPLC (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie).

Der Kit wird als Test bei Patienten verwendet, bei denen ein Verdacht auf einen Vitamin-A- bzw. Vitamin-E- Mangel besteht.

2.3 Prinzip des Reagenzienkits

Der vorliegende Reagenzienkit erlaubt die gleichzeitige, spezifische Bestimmung der Vitamine A und E aus Serum bzw. Plasma in einem einzigen isokratischen HPLC-Lauf. Die einfache und schnell durchführbare Probenvorbereitung besteht aus nur einem Fällungsschritt mit anschließender UV-Detektion.

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3 HPLC-System

Achtung:

Beachten Sie beim Umgang mit den Reagenzien die Gefahrenhinweise in Anhang I.

3.1 Ausstattung und Geräteparameter

Für die Bestimmung von Vitamin A und E ist ein isokratisches System mit HPLC-Pumpe, Injektor und UV- Detektor erforderlich. Die Vitamine A und E besitzen unterschiedliche Absorptionsmaxima (λ^max), deshalb muss die Messwellenlänge des Detektors nach der Elution von Vitamin A geändert werden, um das später eluierende Vitamin E zu detektieren. Es empfiehlt sich die Verwendung eines programmierbaren UV- Detektors, der die Wellenlänge zum gewünschten Zeitpunkt umschaltet (Alternative: Wenn nur bei λmax = 295 nm gemessen wird, kann auf das Umschalten der Messwellenlänge verzichtet werden). Der Einsatz eines Lösungsmittelentgasers beugt Störungen durch Luftbläschen vor und gewährleistet eine stabile Basislinie.

Geräteeinstellungen:

Probengeber: Injektionsvolumen: 50 µl, Laufzeit: ca. 9 min, Magazin abgedunkelt

HPLC-Pumpe: Flussrate 1,5 ml/min

Säulentemperatur: +20 bis +25 °C

UV-Detektor: λ (Start) = 325 nm, nach 3,5 min: λ = 295 nm Nadel-Spülflüssigkeit für den Injektor: Methanol

3.2 HPLC-Säule

Die HPLC-Säule für die Bestimmung der Vitamine A und E ist gebrauchsfertig äquilibriert und getestet. Sie kann direkt verwendet werden. Der Gegendruck einer neuen Säule beträgt bei einer Flussrate von 1,5 ml/min ca. 75 (± 10) bar. Der Druck kann sich mit zunehmendem Säulenalter erhöhen. Solange die Trennungen zufriedenstellend sind, spielt ein erhöhter Druck keine Rolle.

Hinweis:

Zur Verlängerung der Lebensdauer sind eine Vorsäule (Best.-Nr. 18034 und 18001) und ein Vorfilter (Best.-Nr. 15009 und 15010) zwingend erforderlich.

Bevor Sie eine Analysenreihe starten, bereiten Sie das HPLC-System wie folgt vor:

1. Vor dem Einbau der HPLC-Säule die Anlage mit ca. 50 ml Reinstwasser (HPLC-Qualität) spülen 2. Mit ca. 30 ml mobiler Phase bei einer Flussrate von 1,5 ml/min spülen

3. Mehrfach Reinstwasser (HPLC-Qualität) und mobile Phase injizieren, um den Injektor zu reinigen 4. Säule einbauen

5. Das System 15 bis 20 min bei einer Flussrate von 1,5 ml/min äquilibrieren bis sich die Basislinie stabilisiert hat

6. Den aufgearbeiteten Kalibrator mehrfach injizieren bis zwei Chromatogramme bezüglich Retentionszeiten und Peakflächen/-höhen identisch sind

Anschließend kann die mobile Phase im Umlauf gefördert werden.

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3.3 Betriebspausen

Bei Betriebspausen bis zu 3 Tagen fördern Sie die mobile Phase bei niedriger Flussrate (0,2 ml/min). Die HPLC-Säule bleibt im System angeschlossen. Zur Schonung der Lampe schalten Sie den Detektor ab. Wenn Sie das System länger als drei Tage außer Betrieb setzen, bauen Sie die HPLC-Säule aus. Ein Spül- oder Konservierungsschritt ist für die Säule nicht erforderlich. Bewahren Sie die Säule in der mobilen Phase bei +18 bis +30 °C auf. Anstelle der Säule montieren Sie ein Verbindungsstück. Spülen Sie das HPLC-System anschließend mit ca. 50 ml Reinstwasser (HPLC-Qualität)/Methanol (80/20).

4 Chromatographische Trennung

Die folgende Tabelle zeigt die ungefähren Retentionszeiten der Vitamine A und E sowie des internen Standards bei einer Flussrate von 1,5 ml/min.

Tabelle 1: Retentionszeiten

Substanz Retentionszeit (ca.)

Vitamin A 2,3 min

Interner Standard 4,7 min

Vitamin E 7,7 min

Die Dauer der chromatographischen Trennung beträgt bei einer Flussrate von 1,5 ml/min ca. 9 min. Die Retentionszeiten können geringfügig variieren, z. B. wenn sich die Umgebungstemperatur ändert, wenn Sie eine neue Charge der mobilen Phase verwenden oder wenn Sie die HPLC-Säule tauschen. Legen Sie daher die aktuellen Werte anhand eines Kalibrierchromatogramms fest.

5 Probenvorbereitung

Achtung:

Beachten Sie beim Umgang mit den Reagenzien die Gefahrenhinweise in Anhang I.

5.1 Gewinnung und Aufbewahrung von Patientenproben

Als Untersuchungsgut verwenden Sie Serum oder Plasma. Blutproben sollten morgens vor dem Frühstück und vor einer eventuellen Medikamenteneinnahme aus der leicht gestauten Vene genommen werden.

Nach den Erfahrungen verschiedener Arbeitsgruppen wird folgendes Vorgehen zur korrekten Gewinnung und Konservierung von Blutproben empfohlen [5]:

‒ Abnahme von ca. 1–2 ml Blut für die Bestimmung von Vitamin B12, Folsäure und Vitamin A/E.

‒ Nach der Zentrifugation (2000 x g für 5 min) sollte Plasma/Serum gewonnen und bis zur Analyse unter –18 °C im Dunkeln gelagert werden.

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Hinweis:

Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, alle verfügbaren Referenzen zu verwenden und/oder eigene Studien durchzuführen, um spezifische Stabilitätskriterien für sein Labor festzulegen.

Hämolytische und lipämische Proben können die Werte von Vitamin A und Vitamin E verfälschen und sind daher zur Analytik nicht zu verwenden. Es besteht keine Einschränkung für die Verwendung von ikterischen Proben (siehe Kapitel 14).

5.2 Rekonstitution des Kalibrators

Vor der Probenvorbereitung rekonstituieren Sie den Serumkalibrator (Best.-Nr. 34004) wie folgt:

1. 1,0 ml destilliertes Wasser in das Originalfläschchen pipettieren

2. 10 bis 15 min bei +20 bis +25 °C rekonstituieren, dabei wiederholt schwenken

Prüfen Sie, ob der Flascheninhalt homogen ist. Wenn noch ungelöste Substanzen sichtbar sind, verlängern Sie die Rekonstitutionszeit.

Die Kalibratorwerte sind auf zertifiziertes Referenzmaterial des National Institute of Standards and

Technology (NIST, Gaithersburg, MD, USA) rückführbar. Die Konzentrationen der Analyten im Kalibrator sind chargenabhängig. Die individuellen Werte finden Sie auf dem Beipackzettel des Kalibrators.

Achtung:

Dieses Produkt wurde aus gepooltem Humanserum hergestellt, das vom Hersteller auf Infektionen durch das Humane Immundefizienz-Virus (HIV), das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV) und das Bakterium Treponema pallidum getestet und für negativ befunden wurde. Dennoch kann ein Infektionsrisiko durch dieses Produkt nicht völlig ausgeschlossen werden. Betrachten Sie alle Produkte, die Humanmaterialien enthalten, als ansteckungsgefährlich und treffen Sie beim Umgang mit diesen Produkten dieselben Vorsichtsmaßnahmen wie beim Umgang mit potentiell infektiösen Patientenproben.

Haltbarkeit des Kalibrators nach Rekonstitution:

Der in Wasser gelöste Kalibrator ist wie folgt haltbar:

Tabelle 2: Haltbarkeit des Kalibrators nach Rekonstitution

Lagertemperatur Haltbarkeit Sonstige Lagerbedingungen

+2 bis +8 °C 2 Wochen Lichtschutz, dicht verschlossen

unter –18 °C 2 Monate Lichtschutz, dicht verschlossen

5.3 Rekonstitution der Kontrollen

Vor der Probenvorbereitung rekonstituieren Sie die Serumkontrollen (Best.-Nr.: 0032, 0036, 0037) wie folgt:

1. 2,0 ml destilliertes Wasser in das Originalfläschchen pipettieren

2. 10 bis 15 min bei +20 bis +25 °C rekonstituieren, dabei wiederholt schwenken

Prüfen Sie, ob der Flascheninhalt homogen ist. Wenn noch ungelöste Substanzen sichtbar sind, verlängern Sie die Rekonstitutionszeit.

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Die Konzentrationen der Analyten in den Kontrollen sind chargenabhängig. Die individuellen Werte finden Sie auf dem Beipackzettel der jeweiligen Kontrolle.

Achtung:

Dieses Produkt wurde aus gepooltem Humanserum hergestellt, das vom Hersteller auf Infektionen durch das Humane Immundefizienz-Virus (HIV), das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV) und das Bakterium Treponema pallidum getestet und für negativ befunden wurde. Dennoch kann ein Infektionsrisiko durch dieses Produkt nicht völlig ausgeschlossen werden. Betrachten Sie alle Produkte, die Humanmaterialien enthalten, als ansteckungsgefährlich und treffen Sie beim Umgang mit diesen Produkten dieselben Vorsichtsmaßnahmen wie beim Umgang mit potentiell infektiösen Patientenproben.

Haltbarkeit der Kontrollen nach Rekonstitution:

Die in Wasser gelösten Kontrollen sind wie folgt haltbar:

Tabelle 3: Haltbarkeit der Kontrollen nach Rekonstitution

+2 bis +8 °C 2 Wochen Lichtschutz, dicht verschlossen

unter –18 °C 2 Monate Lichtschutz, dicht verschlossen

5.4 Probenvorbereitung

Um Patientenproben, Kontrollen und Kalibratoren für die Bestimmung vorzubereiten, führen Sie folgende Schritte in der angegebenen Reihenfolge durch:

1. 200 µl Plasma/Serum (bzw. rekonstituierte Kontrolle/Kalibrator) + 20 µl Internal Standard

+ 25 µl Precipitation Reagent I

im bernsteinfarbenen Reaktionsgefäß (Lichtschutz) zusammengeben 2. 30 s schütteln (Vortex)

3. 400 µl Precipitation Reagent II zugeben, erneut 30 s mischen (Vortex) 4. 10 min bei 9000 x g zentrifugieren

5. 50 µl des Überstands in das HPLC-System injizieren

5.5 Haltbarkeit der vorbereiteten Proben

Proben, die gemäß Kapitel 5.4 für die Bestimmung vorbereitet wurden, sind wie folgt haltbar:

Tabelle 4: Haltbarkeit der vorbereiteten Proben

+20 bis +25 °C 12 Stunden Lichtschutz, dicht verschlossen, Glasgefäße +2 bis +8 °C 12 Stunden Lichtschutz, dicht verschlossen, Glasgefäße

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6 Zusätzlich benötigte Ausstattung

Für die HPLC-Bestimmung der Vitamine A und E im Serum/Plasma benötigen Sie zusätzlich folgende Ausstattung, die nicht Bestandteil des Reagenzienkits ist:

− Isokratisches HPLC-System

− Probengeber

− UV-Detektor

− Wirbelmischer (z.B. Vortex^TM)

− Zentrifuge

7 Datenerfassung und Auswertung

7.1 Kalibrierung des Auswertesystems

Um Ihr Auswertesystem zu kalibrieren und die Trennleistung des HPLC-Systems zu überprüfen, führen Sie vor der Bestimmung der Patientenproben Testläufe durch. Hierfür verwenden Sie den Serumkalibrator (Best.-Nr. 34004). Die Konzentration der Analyten im Kalibrator sind chargenabhängig. Die genauen Werte finden Sie im Beipackzettel.

Injizieren Sie wiederholt ein Aliquot des aufgearbeiteten Kalibrators bis zwei aufeinanderfolgende

Chromatogramme bezüglich Retentionszeiten, Peakauflösung und Peakflächen/-höhen annähernd identisch sind. Verwenden Sie das Chromatogramm der letzten Testinjektion für die Kalibrierung Ihres

Auswertesystems (PC-Software, Integrator).

Um zu prüfen, ob die HPLC-Bedingungen (Retentionszeiten, Parameter aus der Kalibrierung) über die gesamte Bestimmung konstant geblieben sind, injizieren Sie den aufgearbeiteten Kalibrator innerhalb und am Ende einer Probenserie erneut. Wählen Sie in Ihrem Auswertesystem zur Kalibrierung die “Interne- Standard-Methode“.

7.2 Quantitative Auswertung mit internem Standard

Mit Hilfe des internen Standards werden Verluste, die bei der Probenvorbereitung auftreten können, kompensiert. Dazu werden alle Proben sowie der Kalibrator und die Kontrollen mit der gleichen Menge an internem Standard versetzt. In der Software wird der Peak des internen Standards aus dem

Kalibrierungslauf (siehe Chromatogramme in Kapitel 13) entsprechend zugeordnet. Da sowohl dem Kalibrator als auch den Proben die gleiche Menge an internem Standard zugesetzt werden, kann als Konzentration des internen Standards der Wert "1" eingegeben werden.

8 Qualitätskontrolle

Überprüfen Sie die Präzision und Richtigkeit der Bestimmungen, indem Sie in jeder Probenserie zusätzliche Kontrollen (Best.-Nr. 0036, 0037) mitführen. Liegen die Werte außerhalb der auf dem Beipackzettel der

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Kontrollen angegebenen Bereiche, müssen Sie das System überprüfen. Bleibt die Abweichung bestehen, kalibrieren Sie das System neu.

9 Referenzbereiche

Die angegebenen Referenzbereiche sind Richtwerte, die der Literatur entnommen sind [5, 8, 10]. Sie können von anderen publizierten Daten abweichen. Da die Werte in Abhängigkeit vom Patientenkollektiv und der Messmethode variieren, legen Sie für Ihr Labor spezifische Referenzbereiche fest. Beachten Sie bei der Wertefestlegung auch länderspezifische Regelungen.

Tabelle 5: Referenzbereiche Vitamin A, Erwachsene

Angabe Referenzbereich Quelle

Retinol im Serum 1,05–2,45 µmol/l

0,3–0,7 mg/l [5]

toxischer Bereich ab 1,4 mg/l [8]

Mangel beginnend: 0,1–0,19 mg/l

ausgeprägt: < 0,1 mg/l [8]

Tabelle 6: Referenzbereiche Vitamin A, Neugeborene, Kinder und Jugendliche

Angabe Altersbereich Referenzbereich Quelle

Retinol im Serum/Plasma Jugendliche 1,0–2,1 µmol/l

0,3–0,6 mg/l [8]

Retinol im Serum/Plasma Kinder (bis 10 Jahre)

0,66–1,7 µmol/l

0,2–0,5 mg/l [8]

Retinol im Serum/Plasma Kleinkinder (bis 1 Jahr)

0,53–1,4 µmol/l

0,15–0,4 mg/l [8]

Retinol im Serum/Plasma Neugeborene 0,35–1,0 µmol/l

0,1–0,3 mg/l [8]

Retinol im Serum Bei der Geburt 0,49–1,81 µmol/l

0,14–0,52 mg/l [10]

Retinol im Serum 1–6 Jahre 0,7–1,5 µmol/l

0,20–0,43 mg/l [10]

0,26–0,49 mg/l [10]

0,26–0,72 mg/l [10]

Retinol im Serum/Plasma Reifgeborene (> 37 Wochen)

0,63–1,75 µmol/l

0,18–0,50 mg/l [10]

Retinol im Serum/Plasma Frühgeborene (< 36,6 Wochen)

0,46–1,61 µmol/l

0,13–0,46 mg/l [10]

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Tabelle 7: Referenzbereiche Vitamin E, Erwachsene

Angabe Referenzbereich Quelle

D-α-Tocopherol im Serum 11,6–46,4 µmol/l

5,0–20,0 mg/l [9]

Vitamin E im Serum/Plasma 12–42 µmol/l

5–18 mg/l [8]

D-α-Tocopherol im Serum 22 µmol/l [6]

Mangel < 11,6 µmol/l

< 5 mg/l [8]

untere Normgrenze 11,6 µmol/l [6]

Tabelle 8: Referenzbereiche Vitamin E, Neugeborene, Kinder und Jugendliche

Angabe Altersbereich Referenzbereich Quelle

Vitamin E im Serum/Plasma Jugendliche (13–19 Jahre) 14–23 µmol/l

6–10 mg/l [8]

Vitamin E im Serum/Plasma Kinder (1–12 Jahre) 7–21 µmol/l

3–9 mg/l [8]

Vitamin E im Serum/Plasma Frühgeborene 2,3–11,6 µmol/l

1–5 mg/l [8]

Vitamin E im Serum 1–6 Jahre 7–21 µmol/l

3,0–9,0 mg/l [10]

4,0–9,0 mg/l [10]

6,0–10,1 mg/l [10]

Vitamin E im Serum/Plasma Frühgeborene 1–8 µmol/l

0,5–3,5 mg/l [10]

Vitamin E im Serum/Plasma Reifgeborene 2–8 µmol/l

1,0–3,5 mg/l [10]

Vitamin E im Serum/Plasma 2–5 Monate 5–14 µmol/l

2,0–6,0 mg/l [10]

Vitamin E im Serum/Plasma 6–24 Monate 8–19 µmol/l

3,5–8,0 mg/l [10]

Vitamin E im Serum/Plasma 2–12 Jahre 13–21 µmol/l

5,5–9,0 mg/l [10]

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10 Umrechnungsfaktoren

Die folgende Tabelle enthält die Faktoren zur Umrechnung der Konzentrationsangabe von Massen- in Stoffmengenkonzentration und umgekehrt.

Tabelle 9: Umrechnungsfaktoren

Substanz mg/l in µmol/l µmol/l in mg/l

Vitamin A x 3,49 x 0,286

Vitamin E x 2,32 x 0,431

11 Lagerung und Haltbarkeit der Reagenzien

Ungeöffnet und unter Einhaltung der Transport- und Lagerbedingungen sind die Reagenzien bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Transportieren und lagern Sie die Reagenzien unter folgenden Bedingungen:

Tabelle 10: Transportbedingungen des Reagenzienkits

Produkt Transporttemperatur

Reagenzienkit (Best.-Nr. 34000) +18 bis +30 °C

Packen Sie die Reagenzien unmittelbar nach dem Transport aus und lagern Sie jedes Reagenz individuell unter den in der folgenden Tabelle angegebenen Bedingungen:

Tabelle 11: Lagerbedingungen der Reagenzien

Produkt Lagertemperatur

Mobile Phase (Best.-Nr. 34001) +18 bis +30 °C

Internal Standard (Best.-Nr. 34008) +2 bis +8 °C Precipitation Reagent I (Best.-Nr. 34006) +18 bis +30 °C Precipitation Reagent II (Best.-Nr. 34003) +18 bis +30 °C Serumkalibrator (Best.-Nr. 34004) unter –18 °C Serumkontrollen (Best.-Nr. 0032, 0036, 0037) unter –18 °C

HPLC-Säule (Best.-Nr. 34100) +18 bis +30 °C

Vorsäule (Best.-Nr. 18034) +18 bis +30 °C

Direkt nach Gebrauch verschließen Sie die Reagenzien und lagern Sie sie bei der angegebenen Temperatur. Die Haltbarkeit beträgt nach Anbruch ein Jahr, jedoch nicht über das angegebene

Verfallsdatum hinaus. Angaben zur Stabilität der rekonstituierten Kalibratoren und Kontrollen finden Sie in Kapitel 5.2 und 5.3.

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12 Entsorgung

Mobile Phase, Precipitation Reagent II und Internal Standard enthalten organische Lösemittel. Produktreste in einen Sammelbehälter für halogenfreie organische Lösemittel geben.

Precipitation Reagent I enthält einen umweltgefährdenden Stoff. Produktreste in einen Sammelbehälter für Salzlösungen geben.

Reste der Patientenproben und vorbereitete Proben sowie Kontrollen und Kalibratoren sind als potentiell infektiöser Abfall gesondert zu sammeln und zu entsorgen.

Die genannten Lösungen dürfen nicht mit Hausmüll entsorgt werden. Nicht in die Kanalisation gelangen lassen. Unter Beachtung der Abfallrahmenrichtlinie 2008/98/EG sowie nationalen und regionalen Vorschriften entsorgen. Sammelgefäße und -behältnisse vor dem Zugriff durch Unbefugte sichern.

13 Beispielchromatogramme

Folgende Abbildungen zeigen beispielhaft Chromatogramme, die mit der vorliegenden Methode erzeugt wurden (UV-Detektor: λ (Start) = 325 nm, nach 3,5 min: λ = 295 nm).

Abbildung 1: Chromatogramm eines Kalibrators

Minuten

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Abbildung 2: Chromatogramm einer Patientenprobe

Analytkonzentration: Vitamin A: 0,40 mg/l, Vitamin E: 21,4 mg/l

14 Prüfung auf Interferenzen

14.1 Nachgewiesene Interferenzen

Bei folgenden Probenzuständen konnten Interferenzen nachgewiesen werden:

Hämolyse

Serum- und Plasmaproben wurden mit Hämoglobin versetzt und die gemessenen Analytkonzentrationen mit denen der Originalprobe verglichen:

Für Vitamin E können unabhängig von der zugesetzten Hämoglobin Konzentration Abweichungen des Analysenwertes > 15 % festgestellt werden. Hämolytische Proben sind somit von der Analytik

auszuschließen.

Vitamin A hingegen kann bis zu einer Hämoglobin-Konzentration von 500 mg/dl uneingeschränkt quantifiziert werden (Abweichung ≤ 15 %).

14.2 Keine Störung der Analytik

Folgende Probenzustände erlauben eine störungsfreie Analytik:

Lipämie

Serum- und Plasmaproben wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen einer fetthaltigen Emulsion versetzt und die gemessenen Analytkonzentrationen mit denen der Originalprobe verglichen:

Es traten keine nennenswerten Interferenzen auf (Abweichung ≤ 15 %).

Minuten

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Ikterus

Serum- und Plasmaproben wurden mit unkonjugiertem und konjugiertem Bilirubin versetzt und die gemessenen Analytkonzentrationen mit denen der Originalprobe verglichen:

Es traten keine nennenswerten Interferenzen auf (Abweichung ≤ 15 %).

Wenn Sie Fragen zu Interferenzen haben, wenden Sie sich an unseren Außendienst oder direkt an unseren Chromsystems-Support, den Sie über unsere Hotline +49 89 18930-111 oder per E-Mail unter

support@chromsystems.com erreichen.

15 Maßnahmen bei Störungen

Tabelle 12: Maßnahmen bei Störungen

Störung Mögliche Ursache Behebung

Basislinie driftet Detektorlampe noch kalt Warten

Gealterte Detektorlampe Lampe wechseln

System noch nicht im Gleichgewicht Kalibrator wiederholt injizieren, bis zwei aufeinander folgende Chromatogramme identisch sind

Temperaturdrift Säulenofen verwenden

Flussrate nicht konstant Pumpe überprüfen

Unruhige Basislinie HPLC-Pumpe Pumpe überprüfen (Luft, Dichtigkeit)

Luft im System Mobile Phase entgasen

Detektorzelle verschmutzt Detektorzelle reinigen

Störpeaks Luft im System Mobile Phase entgasen

Verunreinigungen im Injektor Injektor reinigen Autosamplerprobengefäße

verunreinigt

Neue oder gereinigte Gefäße verwenden

Injektionsspritze verunreinigt Spritze mit Methanol reinigen Kontaminierte HPLC-Säule Säule erneuern

Proben unsachgemäß gelagert Frische Proben verwenden Breite Peaks, Tailing Gealterte HPLC-Säule Säule erneuern

Doppelpeaks Totvolumina an den Fittings Fittings erneuern Totvolumen in der HPLC-Säule Säule erneuern

Keine Peaks Injektor undicht Injektor überprüfen

Empfindlichkeit lässt nach Gealterte Detektorlampe Lampe wechseln Detektorzelle verunreinigt Zelle reinigen Injektionsventil defekt Injektor überprüfen

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Störung Mögliche Ursache Behebung Retentionszeiten

verändert

Temperaturdrift Säulenofen verwenden

Ungleichmäßige Flussrate HPLC-Pumpe überprüfen und Flussrate anpassen

System noch nicht im Gleichgewicht Ca. 15 min Mobile Phase durch das System pumpen; Kalibrator wiederholt injizieren

Kein Signal Keine oder defekte Verbindung zum Integrator/Schreiber

Signalkabel und Anschluss überprüfen

Detektorlampe Spannungsversorgung prüfen; ggf.

Lampe erneuern

Wenn Sie Fragen zur Behebung von Störungen haben, wenden Sie sich an unseren Außendienst oder direkt an unseren Chromsystems-Support, den Sie über unsere Hotline +49 89 18930-111 oder per E-Mail unter support@chromsystems.com erreichen.

16 Literatur

1. Vuilleumier JP, Keller HE, Gysel D, Hunziker F. (1983) Clinical chemical methods for the routine assessment of the vitamin status in human populations. Part I: The fat-soluble vitamins A and E, and ß- carotene. Int J Vitam Nutr Res 53(3): 265–72.

2. Reinards R. Vitaminstoffwechsel, in: Greiling H, Gressner AM (Hrsg) Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie; 3. Aufl, Verlag Schattauer Stuttgart/New York (1987) 344–6.

3. Milne DB, Botnen J. (1986) Retinol, α-tocopherol, lycopene, and α- and β-carotene simultaneously determined in plasma by isocratic liquid chromatography. Clin Chem 32(5): 874–6.

4. Lehmann J, Martin HL. (1982) Improved direct determination of alpha- and gamma-tocopherols in plasma and platelets by liquid chromatography, with fluorescence detection. Clin Chem 28(8):

1784–7.

5. Bertelsmann Stiftung (Hrsg). Mineralstoffe, Spurenelemente und Vitamine – Klinische Aspekte und chemische Analyse. Verlag Bertelsmann Stiftung Gütersloh (1997).

6. Biesalski HK, Schrezenmeir J, Weber P, Weiß H. Vitamine – Physiologie, Pathophysiologie, Therapie. Georg Thieme Verlag Stuttgart/New York (1997).

7. Baltes W. Lebensmittelchemie. 2. Aufl, Springer Verlag Berlin (1989).

8. Gressner AM, Arndt T. Lexikon der Laboratoriumsdiagnostik. 2. Aufl, 1389-90 und 1404-5, Springer Medizin Verlag, Heidelberg (2013).

9. Greiling H, Gressner AM (Hrsg) Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie; 3. Aufl, Verlag Schattauer Stuttgart/New York (1987).

10. Soldin SJ, Wong EC, Brugnara C, Soldin OP (Hrsg) Pediatric Reference Intervals; 7. Aufl, AACC Press Washington (2011) 238, 242.

(18)

Anhang I: Gefahren- und Sicherheitshinweise

Beim Umgang mit den Reagenzien beachten Sie folgende Gefahrenhinweise und treffen entsprechende Sicherheitsmaßnahmen. Weitere Informationen finden Sie in unseren Sicherheitsdatenblättern. Diese können Sie von unserer Website www.chromsystems.de herunterladen oder bei uns anfordern.

Tabelle 13: Gefahren- und Sicherheitshinweise

Piktogramme Gefahren- und Sicherheitshinweise Mobile Phase (Best.-Nr. 34001, 34002)

Gefahr

H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.

H301+H311+H331 Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen.

H370 Schädigt die Organe.

P210 Von Hitze, heißen Oberflächen, Funken, offenen Flammen und anderen Zündquellen fernhalten. Nicht rauchen.

P280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen.

P301+P310 BEI VERSCHLUCKEN: Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM/Arzt anrufen.

P302+P352 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser und Seife waschen.

P403+P233 An einem gut belüfteten Ort aufbewahren. Behälter dicht verschlossen halten.

Precipitation Reagent I (Best.-Nr. 34006) Gefahr

H318 Verursacht schwere Augenschäden.

H411 Giftig für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.

P273 Freisetzung in die Umwelt vermeiden.

P280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen.

P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.

Precipitation Reagent II (Best.-Nr. 34003) Gefahr

H319 Verursacht schwere Augenreizung.

H336 Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen.

P233 Behälter dicht verschlossen halten.

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Piktogramme Gefahren- und Sicherheitshinweise Internal Standard (Best.-Nr. 34008)

Gefahr

H319 Verursacht schwere Augenreizung.

H336 Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen.

P233 Behälter dicht verschlossen halten.

Diese Bestandteile sind gemäß Gesetzgebung der Europäischen Union nicht als gefährlich eingestuft:

Serum Calibration Standard (Best.-Nr. 34004) Serum Controls (Best.-Nr. 0032, 0036, 0037)

Anhang II: Manuelle Berechnung

Für die Berechnung benötigen Sie folgende Angaben:

− Peakfläche/-höhe des Analyten A im Chromatogramm der Probe = AProbe

− Peakfläche/-höhe des Analyten A im Chromatogramm des Kalibrators = A^Kalibrator

− Peakfläche/-höhe des internen Standards im Chromatogramm der Probe = ISProbe

− Peakfläche/-höhe des internen Standards im Chromatogramm des Kalibrators = IS^Kalibrator

− Konzentration C des Analyten A im Kalibrator = CKalibrator

Berechnen Sie die Konzentration des Analyten A in der Probe (CProbe) mit folgender Formel:

CProbe = A^Probe x IS^Kalibrator

x CKalibrator

AKalibrator x ISProbe

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Anhang III: Leistungsdaten

Die Leistungsdaten wurden an folgenden Geräten ermittelt und verifiziert:

− Shimadzu Nexera UHPLC-System mit Shimadzu LC-30AD Pumpe, SIL-30AC Autosampler und SPD- 20AV UV-Vis Detektor

Wiederfindungsrate:

Die analytische Wiederfindung wurde aus den Steigungen der Kalibrationsgeraden nach mehrfachem Aufstocken von Serum- und Plasmaproben und Verdünnungen von Standardlösungen ermittelt. Folgende Tabelle gibt die Wiederfindungsraten von Vitamin A, Vitamin E und dem internen Standard wieder:

Tabelle 14: Wiederfindungsraten

Substanz Wiederfindungsrate im Serum Wiederfindungsrate im Plasma

Vitamin A 106 % 111 %

Vitamin E 101 % 104 %

Interner Standard 114 % 109 %

Linearität und Bestimmungsgrenze (LLOQ):

Die Methode ist linear von der unteren Bestimmungsgrenze (LLOQ) bis zur angegebenen oberen Bestimmungsgrenze (linearer Bereich).

Tabelle 15: Bestimmungsgrenze und Linearität

Substanz Bestimmungsgrenze (LLOQ)* Linearer Bereich bis mind.

Vitamin A 0,02 mg/l 5,0 mg/l

Vitamin E 0,25 mg/l 45 mg/l

*Die Bestimmungsgrenze ist abhängig vom verwendeten Detektor.

Intra-Assay-Reproduzierbarkeit:

Die Bestimmung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit erfolgte durch mehrfache Aufarbeitung (n = 10) derselben Probe und Messung von Vitamin A und E bei 3 verschiedenen Konzentrationen:

Tabelle 16: Intra-Assay-Reproduzierbarkeit, n = 10

Substanz Variationskoeffizient (Substanzkonzentration)

Vitamin A 2,5 % (0,466 mg/l) 0,8 % (0,666 mg/l) 0,9 % (1,27 mg/l) Vitamin E 2,4 % (8,86 mg/l) 1,6 % (12,9 mg/l) 2,2 % (24,9 mg/l)

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Inter-Assay-Reproduzierbarkeit:

Die Bestimmung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit erfolgte durch 4-fache Aufarbeitung und Messung von Vitamin A und E in zwei Serumpools in 20 verschiedenen Serien:

Tabelle 17: Inter-Assay-Reproduzierbarkeit, n = 80

Substanz Variationskoeffizient (Substanzkonzentration)

Vitamin A 3,8 % (0,400 mg/l) 5,0 % (0,982 mg/l)

Vitamin E 2,7 % (6,93 mg/l) 4,9 % (16,9 mg/l)

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Anhang IV: Konformitätserklärung

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(24)

Anhang V: Symbole

Auf unseren Etiketten, Arbeitsvorschriften und Verpackungen verwenden wir Symbole nach EN ISO 15223-1, deren Bedeutungen in folgender Tabelle beschrieben sind:

Tabelle 18: Symbole

Symbol Bedeutung

Hersteller

Herstelldatum

Verwendbar bis

Artikelnummer

Chargencode

Gebrauchsanweisung beachten

Oberer Temperaturgrenzwert:

Lagerung unterhalb eines bestimmten Temperaturwertes Temperaturbegrenzung:

Lagerung innerhalb eines bestimmten Temperaturbereichs

In-vitro-Diagnostikum

Ausreichend für <n> Prüfungen

Seriennummer