Kombination chemischer, gentechnischer und enzymatischer Methoden zur Darstellung schwer synthetisierbarer Proteine

(1)

und enzymatischer Methoden zur Darstellung schwer synthetisierbarer Proteine:

Möglichkeiten und Grenzen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.) im Fach Chemie eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Chem. Sabine Abel

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Stefan Hecht

Gutachter: 1. Prof. Dr. Oliver Seitz

2. Prof. Dr. Christian P. R. Hackenberger Tag der mündlichen Prüfung: 22. April 2014

(2)

(3)

(4)

Institut für Molekulare Pharmakologie im Forschungsverbund e.V. (FMP) von Februar 2010 bis September 2013 angefertigt.

(5)

'DV ¿EULOOHQELOGHQGH EHWD0LNURJOREXOLQ E0 XQG GDV &5)0LPHWLNXP PLW YHU]ZHLJWHU 5FNJUDWVWUXNWXU N|QQHQ DOV ÄVFKZLHULJH³ 3URWHLQH EHWUDFKWHW ZHUGHQ GHUHQ 'DUVWHOOXQJ VLFK HLJQHWJHJHQZlUWLJH0|JOLFKNHLWHQXQG*UHQ]HQGHU3URWHLQV\QWKHVH]XHUPLWWHOQ'LH3URWHLQH VROOHQ ]X VSHNWURVNRSLVFKHQ 8QWHUVXFKXQJHQ YRQ 3URWHLQIDOWXQJ E]Z /LJDQG5H]HSWRU Wechselwirkungen eingesetzt werden.

9HUVXFKH ]XU &KHPRV\QWKHVH YRQ E0 EHU GUHL 6HJPHQWH IKUWHQ SHU 1&/ ]ZDU ]X OLQHDUHQ 3URGXNWHQ PLW NRUUHNWHU 3ULPlUVWUXNWXU DEHU ZLHGHUKROW ZXUGHQ]ZHL PLWWHOV +3/& WUHQQEDUH 3URWHLQH HUKDOWHQ GHUHQ HQ]\PDWLVFKH 6SDOWXQJ ]X LGHQWLVFKHQ )UDJPHQWHQ IKUWH (LQH ,VRPHULVLHUXQJZLH]%(SLPHULVLHUXQJDOV8UVDFKHIUGLH%LOGXQJGHU]ZHL3URGXNWHNRQQWH DXVJHVFKORVVHQZHUGHQ0LWWHOV&'XQG)7,56SHNWURVNRSLHZXUGHQIUEHLGH3URGXNWHEHWD )DOWEODWW6WUXNWXUHQHUPLWWHOWGLHVLFKVRZRKOXQWHUHLQDQGHUDOVDXFKYRPUHNRPELQDQWHQ3URWHLQ XQWHUVFKLHGHQ 'LH ÄIHKOJHIDOWHWHQ³ 6\QWKHVHSURGXNWH NRQQWHQ QLFKW HQWIDOWHW XQG DQVFKOLHHQG LQ GLH ÄNRUUHNWH³ 6WUXNWXU GHV UHNRPELQDQWHQ E0 EHUIKUW ZHUGHQ (V LVW GHQNEDU GDVV GLH EHREDFKWHWHÄ)HKOIDOWXQJ³GHUHQ8UVDFKHQLFKWJHNOlUWZHUGHQNRQQWHIUYRPE0DXVJHO|VWH Amyloidosen verantwortlich ist.

'DV &5)0RGHOO GDV DXV GUHL ]\NOLVFKHQ 3HSWLGHQ XQG HLQHP 3URWHLQ PLW 'LVXO¿GEUFNHQ EHVWHKW ZHOFKH DXI HLQHP OLQHDUHQ 3HSWLG7HPSODW YHUDQNHUW VLQG ZXUGH GXUFK HLQ ]\NOLVFKHV 7HPSODW]XUVWUXNWXUHOOHQ(LQVFKUlQNXQJPRGL¿]LHUW'XUFKGDV]\NOLVFKH7HPSODWHUJDEHQVLFK NHLQH6\QWKHVHSUREOHPHDEHULQWHUHVVDQWHUZHLVHIKUWHGLH=\NOLVLHUXQJGHV7HPSODWV]XHLQHU VLJQL¿NDQWK|KHUHQ$I¿QLWlWIUGHQ$JRQLVWHQ8URFRUWLQ,LPIXQNWLRQHOOHQ$VVD\'DUEHUKLQDXV ZXUGHJH]HLJWGDVVHLQ]\NOLVFKHV5H]HSWRU/RRS3HSWLGPLWWHOV(3/LPPJ0DVWDEHUKDOWHQ ZHUGHQNDQQZDVNQIWLJGLH6\QWKHVHLVRWRSHQPDUNLHUWHU$QDORJDIU6WUXNWXU8QWHUVXFKXQJHQ HUP|JOLFKW

(6)

7KH ¿EULO IRUPLQJ EHWDPLFURJOREXOLQ EP DQG WKH &5) PLPLF ZLWK EUDQFKHG SHSWLGH EDFNERQHFRXOGEHFRQVLGHUHGDV³GLI¿FXOW´SURWHLQVZKRVHV\QWKHVLVLVVXLWHGIRUGHWHUPLQLQJ SUHVHQWSRVVLELOLWLHVDQGOLPLWVRISURWHLQV\QWKHVLV7KHSURWHLQVVKDOOEHXVHGIRUVSHFWURVFRSLF DQDO\VLVRISURWHLQPLVIROGLQJRUOLJDQGUHFHSWRULQWHUDFWLRQUHVSHFWLYHO\

(IIRUWVRIWKHFKHPRV\QWKHVLVRIEPRYHUWKUHHVHJPHQWVPD\OHDGYLD1&/WROLQHDUSURGXFWV ZLWKFRUUHFWSULPDU\VWUXFWXUHEXWWZRYLD+3/&LVRODWDEOHSURWHLQVZHUHUHSHWLWLYHO\VXVEVWDLQHG whose enzymatic digest lead to identical fragments. An isomerization (such as e. g. epimerization) DVUHDVRQIRUWKHIRUPDWLRQRIWKHWZRSURGXFWVFRXOGEHH[FOXGHG%\PHDQVRI&'DQG)7,5 VSHFWURVFRS\ IRU ERWK SURGXFWV EHWDVKHHW VWUXFWXUH ZHUH GHWHUPLQHG ZKLFK GLIIHU DPRQJ WKHPVHOYHVDVZHOODVIURPWKHUHFRPELQDQWSURWHLQ7KH³PLVIROGHG´V\QWKHWLFSURGXFWFRXOGQRW EHXQIROGHGXQGVXEVHTXHQWO\FRQYHUWHGLQWRWKH³FRUUHFW´VWUXFWXUHRIWKHUHFRPELQDQWEP,WLV SRVVLEOHWKDWWKHREVHUYHG³PLVIROGLQJ´ZKRVHFDXVHFRXOGQRWEHFODUL¿HGLVUHDVRQDEOHIRUWKH amyloidosis induced by b2m.

7KH &5) PRGHO WKDW FRQVLVWV RI WKUHH F\FOLF SHSWLGHV DQG RQH SURWHLQ ZLWK GLVXO¿G EULGJHV FRXSOHGWRDOLQHDUSHSWLGHWHPSODWHZDVPRGL¿HGIRUVWUXFWXUDOFRQVWUDLQWVE\DF\FOLFWHPSODWH ,Q FRQVHTXHQFH RI WKH F\FOLF WHPSODWH QR V\QWKHWLF SUREOHPV DURXVHG DOWKRXJK WKH F\FOLVDWLRQ RI WKH WHPSODWH OHDGV LQWHUHVWLQJO\ WR D VLJQL¿FDQW KLJKHU DI¿QLW\ IRU WKH DQWDJRQLVW XURFRUWLQ, LQWKHIXQFWLRQDODVVD\)XUWKHUPRUHLWZDVVKRZQWKDWDF\FOLFUHFHSWRUORRSSHSWLGHFRXOGEH UHFHLYHGYLD(3/LQPJVFDOHZKDWLQIXWXUHHQDEOHVWKHV\QWKHVLVRILVRWRSLFDOO\ODEHOHGDQDORJV for structure investigations.

(7)

I

NHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG . . . 1

2. STANDDER FORSCHUNG. . . 3

2.1. Ligations-Methoden . . . 3

2.1.1. Segment-Verknüpfung durch chemische Methoden . . . 3

2.1.2. Ligation durch enzymatische Katalyse . . . 5

2.1.3. Semi-Synthese . . . 7

'DVȕ₂-Mikroglobulin . . . 10

2.2.1. Synthese-Strategie . . . 11

9RUDUEHLWHQ]XU'DUVWHOOXQJYRPȕ₂-M . . . 12

&5)0LPHWLND . . . 15

3. ZIELSTELLUNG . . . 19

4. ERGEBNISSE & DISKUSSION . . . 21

&KHPRV\QWKHVHGHVȕ₂-Mikroglobulins . . . 21

'LHHUVWH1&/]XU9HUNQSIXQJYRP6HJPHQW%65XQG6HJPHQW& . . . 23

'LH]ZHLWH1&/]XU'DUVWHOOXQJYRQOLQHDUHPȕ₂0$%& . . . 24

&KDUDNWHULVLHUXQJGHU]ZHL/LJDWLRQV3URGXNWH$%& . . . 25

$EVLFKHUXQJGHU3ULPlU6WUXNWXU . . . 25

4.1.3.2. Ausschluss einer cis/trans-Isomerie am Prolin . . . 30

1HEHQSURGXNW%LOGXQJZlKUHQGGHU1&/ . . . 31

(SLPHULVLHUXQJYRQ$VQ₂₄LQGHU1&/ . . . 44

8QWHUVFKLHGHLQGHU6HNXQGlU6WUXNWXU . . . 46

'HQDWXULHUXQJGHUOLQHDUHQȕ₂-M-Produkte . . . 48

4.1.4. Protein-Faltung . . . 52

6HPL6\QWKHVHXQG&KDUDNWHULVLHUXQJGHU&5)0LPHWLND . . . 56

'DV]\NOLVFKH&5).RQVWUXNW&5)_zykl) . . . 56

6\QWKHVH6WUDWHJLHXQG5HDOLVLHUXQJ . . . 56

([SUHVVLRQXQG(LQEDXHLQHU5H]HSWRUORRS'RPlQH . . . 59

4.2.2.1. Synthese-Strategie . . . 59

(3/GHVH[WUD]HOOXOlUHQ/RRSV(&/_expr2) . . . 59

9HUJOHLFKGHU/LJDQG%LQGXQJV(LJHQVFKDIWHQYRQ]\NOLVFKHPXQGOLQHDUHP &5).RQVWUXNW . . . 62

5. ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK . . . 65

6. EXPERIMENTELLER TEIL . . . 69

6.1. Materialien und Methoden . . . 69

5HDJHQ]LHQ . . . 69

6.1.2. Instrumente . . . 69

6.1.3. Methoden . . . 74

6\QWKHVHQXQG([SHULPHQWH . . . 76

(8)

6\QWKHVHGHVȕ₂-Mikroglobulins . . . 76

6\QWKHVHGHV1WHUPLQDOHQ6HJPHQWHV6HJPHQW$65 . . . 76

6\QWKHVHGHU1%RF7KLRD]ROLGLQFDUERQVlXUH%RF7K]2+ . . . 77

6\QWKHVHGHVPLWWOHUHQ6HJPHQWHV6HJPHQW%65 . . . 78

6\QWKHVHGHV&WHUPLQDOHQ6HJPHQWHV6HJPHQW& . . . 80

(UVWHQDWLYHFKHPLVFKH/LJDWLRQ]XP6HJPHQW%& . . . 80

=ZHLWHQDWLYHFKHPLVFKH/LJDWLRQ]XPOLQHDUHQȕ₂-Mikroglobulin . . . 82

)DOWXQJ]XU7HUWLlU6WUXNWXUGHVȕ₂-Mikroglobulins . . . 84

6\QWKHVHQGHU0RGHOOSHSWLGHIU([SHULPHQWHLP=XVDPPHQKDQJGHU6\QWKHVH YRPȕ₂-Mikroglobulin . . . 86

%HQ]R\O/1S$FHWDPLGRSKHQRO%]/165 . . . 86

0RGHOO3HSWLGHELVIULQWUDPROHNXODUH=\NOLVLHUXQJV8QWHUVXFKXQJHQ 065 . . . 87

6.2.2.3. L-/D6lXUHQGHU0RGHOO3HSWLGHELV02+ . . . 89

6.2.2.4. L-/D-Segmente als Standards zum Vergleich mit dem Fragment nach dem &K\PRWU\SVLQ9HUGDXYRP$%&*HPLVFK . . . 93

([SHULPHQWHLP=XVDPPHQKDQJGHU6\QWKHVHYRP ȕ₂-Mikroglobulin . . . 94

6\QWKHVHGHU&5)0LPHWLND . . . 99

%LRV\QWKHVHGHV5H]HSWRU17HUPLQXV(&' . . . 99

6\QWKHVHGHUOLQHDUHQ&5).RQVWUXNWHPLWGHPH[SULPLHUWHQ(&/_expr2 . . . 101

6\QWKHVHGHV]\NOLVFKHQ&5).RQVWUXNWHV . . . 111

6.2.4. Biologische Untersuchungen der Mimetika . . . 116

*73Ȗ6$VVD\ . . . 116

6.2.4.2. Bindungs-Assay . . . 116

7. LITERATURVERZEICHNIS . . . 118

8. BILDNACHWEIS . . . 125

9. ANHANG. . . 126

9.1. Abkürzungsverzeichnis . . . 126

9.2. Danksagung . . . 131

9HU|IIHQWOLFKXQJHQ . . . 132

6HOEVWVWlQGLJNHLWVHUNOlUXQJ . . . 133

(9)

1. E

^INLEITUNG

'LH9HUOHLKXQJGHV1REHOSUHLVHVDQ5REHUW-/HINRZLW]XQG%ULDQ..RELONDIUGHUHQ

%HLWUDJ]XP9HUVWlQGQLVGHU*3URWHLQJHNRSSHOWHQ5H]HSWRUHQ*3&5V^[1]-[3] veranschaulicht das JURH,QWHUHVVHIUGDV9HUVWHKHQSURWHLQEH]RJHQHU3UR]HVVH7URW]EDKQEUHFKHQGHU)RUWVFKULWWH LQGHU9HUJDQJHQKHLWZLHGLHUDGLRDNWLYH0DUNLHUXQJ]XU/RNDOLVLHUXQJYRQ5H]HSWRUHQ^[4][5]GLH ,VROLHUXQJYRQ5H]HSWRUJHQHQ^[6] bis hin zur kürzlich beschriebenen Kristallstruktur des ȕ₂-adrenergen 5H]HSWRUV LQ VHLQHU DNWLYHQ )RUP^[7] VLQG GLH 6LJQDO7UDQVGXNWLRQVZHJH QRFK LPPHU QLFKW YROOVWlQGLJYHUVWDQGHQ8PHLQHQ(LQEOLFNLQ3URWHLQ0HFKDQLVPHQXQG0ROHNO(UNHQQXQJ]X EHNRPPHQ LVW GLH .HQQWQLV YRQ 6WUXNWXU)XQNWLRQV%H]LHKXQJHQ VWUXNWXUHOOHU '\QDPLN XQG GHU,QWHUDNWLRQ]ZLVFKHQ3URWHLQ'RPlQHQJUXQGOHJHQG*HJHQVWDQGGHUDNWXHOOHQ)RUVFKXQJLVW YHUVWlUNW GLH &KDUDNWHULVLHUXQJ GHU %HZHJXQJ GHU ,QWHUDNWLRQ XQG GHU FKHPLVFKHQ 8PJHEXQJ YRQ0DNURPROHNOHQLQOHEHQGHQ=HOOHQXPQHEHQGHP9HUVWlQGQLVEHUGLHVH3UR]HVVHGHP

=LHOGHV'HVLJQVYRQNQVWOLFKHQ(Q]\PHQ$QWLN|USHUQ+RUPRQHQRGHU6WUXNWXU3URWHLQHQIU SKDUPD]HXWLVFKH=ZHFNHQlKHU]XNRPPHQ

'LH 8QWHUVXFKXQJ YRQ 3URWHLQHQ VHW]W YRUDXV GDVV PDQ DXVUHLFKHQGH 0HQJHQ LVROLHUHQ E]Z V\QWKHWLVLHUHQ NDQQ 'LH ,VROLHUXQJ GHU 3URWHLQH DXV QDWUOLFKHQ 5HVVRXUFHQ OLHJW HUVW HLQPDO QDKH$OOHUGLQJVZLUGVLHKlX¿JGXUFKXQJHQJHQGH0DWHULDOPHQJHQPKVDPXQSUDNWLNDEHOXQG EHGLQJWHLQHJHZLVVH9RUNHQQWQLVEHUGLH(LJHQVFKDIWHQZHOFKHQLFKWLPPHUJHJHEHQLVW$OVR QXW]WPDQGLH)lKLJNHLWHQGHU1DWXU3URWHLQH]XJHQHULHUHQXQGVWHOOWGLHJHZQVFKWHQ3URWHLQH GXUFK ([SUHVVLRQ ELRV\QWKHWLVFK GDU 'LHV KDW ]XP 9RUWHLO GDVV ]XP HLQHQ HLQH DXVUHLFKHQGH 0HQJHHUKDOWHQZHUGHQNDQQXQG]XPDQGHUHQGXUFKJH]LHOWH0DQLSXODWLRQHLQ]HOQH$PLQRVlXUHQ

$6RGHUDXFKJDQ]H)UDJPHQWHVXEVWLWXLHUWZHUGHQN|QQHQ^[8]-[10]

'DV 9HUVWlQGQLV YRQ 3URWHLQ)XQNWLRQHQ VHW]W HLQH YROOH %HVFKUHLEXQJ SRVWWUDQVODWLRQDOHU 0RGL¿NDWLRQHQ ZLH *O\NRV\OLHUXQJHQ 3KRVSKRU\OLHUXQJHQ XQG $ON\OLHUXQJHQ XQG GHUHQ (IIHNWH DXI LQWULQVLVFKH )XQNWLRQHQ 6WDELOLWlW /RNDOLVDWLRQ XQG GUHLGLPHQVLRQDOH 6WUXNWXUHQ YRUDXV*HQHUHOOVLQGGHP(LQEDXQLFKWJHQHWLVFKHU6WUXNWXUHQLQGHU%LRV\QWKHVHYRQ3URWHLQHQ

*UHQ]HQ JHVHW]W 'LH &KHPRV\QWKHVH HUZHLWHUW GDV 6SHNWUXP GHU 3URWHLQ6\QWKHVH XP GLH 0|JOLFKNHLW D$6 DUWL¿]LHOOH LVRVWHULVFKH $6 RGHU SRVWWUDQVODWLRQDOH 0RGL¿NDWLRQHQ ]XU 8QWHUVXFKXQJ FKHPLVFKHU 0HFKDQLVPHQ HLQ]XEULQJHQ ,P *HJHQVDW] ]XU %LRV\QWKHVH EHL GHU eine sequenzabdeckende Isotopenmarkierung mit ¹⁵1¹³&RGHUDXFK²+IUNHUQPDJQHWUHVRQDQ]

VSHNWURVNRSLVFKH 1058QWHUVXFKXQJHQ UHDOLVLHUEDU LVW NDQQ GXUFK FKHPLVFKH 6\QWKHVH HLQH SRVLWLRQVVSH]L¿VFKH ,VRWRSHQPDUNLHUXQJ RGHU HLQH (LQEHWWXQJ YRQ )OXRUHV]HQ]0DUNHUQ GXUFKJHIKUWZHUGHQ'HV:HLWHUHQNDQQPLW+LOIHGHU&KHPRV\QWKHVHGLH6WUXNWXUPDQLSXOLHUW ZHUGHQ XQG VR HLQHQ (LQEOLFN LQ VWUXNWXUHOOH *UXQGODJHQ HQ]\PDWLVFKH 0HFKDQLVPHQ RGHU 0ROHNO(UNHQQXQJHUP|JOLFKWZHUGHQ

(10)

1HEHQGHQ9RUWHLOHQGHU&KHPRV\QWKHVHLVWGLHVHMHGRFKVRZRKOGXUFKGLHEHJUHQ]WH(I¿]LHQ]

YRQ 6HJPHQW.XSSOXQJHQ DOV DXFK GLH /lQJH GHU PLWWHOV )HVWSKDVHQ3HSWLGV\QWKHVH 6336 darstellbaren Peptid-Segmente begrenzt (40 bis 60 AS). Die Verknüpfung der Vorzüge der

%LRV\QWKHVH ]XU 'DUVWHOOXQJ K|KHUPROHNXODUHU 3URWHLQH PLW GHQ 9RUWHLOHQ GHU FKHPLVFKHQ 9DULDELOLWlWGHU&KHPRV\QWKHVHEHLQKDOWHWGDV*HELHWGHU6HPL6\QWKHVH6HPL6\QWKHVHQN|QQHQ KHXWHVHKUHOHJDQWPLWWHOVH[SUHVVHG3URWHLQ/LJDWLRQ(3/HUIROJHQ'LH(3/OHKQWVLFKDQGDV FKHPLVFKH9HUIDKUHQGHUQDWLYHQFKHPLVFKHQ/LJDWLRQ1&/DQZREHLGHU9RUJDQJGHV3URWHLQ 6SOHLHQVDXVJHQXW]WZLUG

(11)

2. S

^TAND ^DER

F

^ORSCHUNG

'LH HUIROJUHLFKH &KHPRV\QWKHVH YRQ 3URWHLQHQ EDVLHUW LP :HVHQWOLFKHQ DXI PHWKRGLVFKHQ (QWZLFNOXQJHQLQGHU3HSWLGFKHPLH+LHUZDUVLFKHUOLFKQHEHQ)RUWVFKULWWHQDXIGHQ*HELHWHQ GHU 6FKXW]JUXSSHQ&KHPLH^[11][12] XQG $NWLYLHUXQJ YRQ $PLQRVlXUHQ^[13]-[16] GLH (LQIKUXQJ GHU )HVWSKDVHQ3HSWLGV\QWKHVHQDFK0HUUL¿HOG^[17] ein wichtiger Faktor.

2.1. Ligations-Methoden

(LQ$QVDW]]XU6\QWKHVHYRQ3URWHLQHQEHVWHKWLQGHU9HUNQSIXQJYRQEHUZLHJHQGJHVFKW]WHQ 3HSWLG6HJPHQWHQ 'LHV ELUJW MHGRFK HLQLJH 6FKZLHULJNHLWHQ .XSSOXQJVUHDNWLRQHQ YRQ VHLWHQNHWWHQJHVFKW]WHQ6HJPHQWHQVLQGDXI*UXQGGHUVFKOHFKWHQ/|VOLFKNHLWHLQHUVHLWVVFKZHU handhabbar und andererseits analytisch meist sehr kompliziert zu kontrollieren. Daher wurden 0HWKRGHQ HQWZLFNHOW XQJHVFKW]WH 3HSWLG6HJPHQWH ]X OHJLHUHQ 'LHVH 6\QWKHVH6WUDWHJLH VHW]W HLQH KRKH 6HOHNWLYLWlW GHU /LJDWLRQV0HWKRGH YRUDXV XP 1HEHQUHDNWLRQHQ PLW DQGHUHQ XQJHVFKW]WHQIXQNWLRQHOOHQ*UXSSHQGHU$66HLWHQNHWWHQRGHU5D]HPLVLHUXQJ]XYHUPHLGHQ)U diese Vorgehensweise der Kupplung ungeschützter Segmente sind mehrere Methoden entwickelt worden.

2.1.1. Segment-Verknüpfung durch chemische Methoden

=XU %LOGXQJ XQQDWUOLFKHU 3HSWLG%LQGXQJHQ ZXUGHQ X D GLH7KLRO0DOHLPLG.XSSOXQJ^[18][19]

die Pseudoprolin-Ligation^[19]-[21]XQGGLHÄ&OLFN³.XSSOXQJ[19][22]-[24] entwickelt.

%HLGHU7KLRO0DOHLPLG.XSSOXQJKDQGHOWHVVLFKXPHLQH0LFKDHO$GGLWLRQZREHLGDV0DOHLPLG den Michael-Akzeptor 1 (ĮȕXQJHVlWWLJWH &DUERQ\O9HUELQGXQJ XQG GHU 6FKZHIHO GHV 7KLROV den Michael-Donator 2 DOVR GDV 1XNOHRSKLO UHSUlVHQWLHUHQ $EELOGXQJ ^[18][19] (V ILQGHW somit eine Schwefel-Kohlenstoff-Verknüpfung 3 VWDWW$XI *UXQG GHU 7DWVDFKH GDVV HLQHU GHU 5HDNWLRQVSDUWQHUHLQ7KLROEHLVSLHOVZHLVHHLQ&\VWHLQLVWZLUNWVLFKGLH$QZHVHQKHLWPHKUHUHU

&\VWHLQHVW|UHQGDXIHLQHQVHOHNWLYHQ9HUODXIGHU5HDNWLRQDXV'DKHUPVVHQHYHQWXHOO]XVlW]OLFK YRUKDQGHQH&\VWHLQHIUGLHVHQ=ZHFNJHVFKW]WZHUGHQ8PHLQH/LJDWLRQPLWGHU$PLQRJUXSSH GHU /\V6HLWHQNHWWHQ ]X YHUKLQGHUQ GDUI GHU S+:HUW EHL GHP GLH .XSSOXQJ VWDWWILQGHW QLFKW K|KHUDOVQHXQVHLQ'LHVH0HWKRGLNZLUGJHUQIU6HLWHQNHWWHQ9HUNQSIXQJHQRGHU]XP(LQEDX von Fluorophoren verwendet.

(12)

7URW] YLHOHU 9RUWHLOH ZHOFKH /LJDWLRQV0HWKRGHQ ]XU $XVELOGXQJ XQQDWUOLFKHU3HSWLG9HUNQSIXQJHQDXV]HLFKQHWZLHGLHKRKH(I¿]LHQ]

XQG6HOHNWLYLWlWGHU7KLRO0DOHLPLG/LJDWLRQEHVLW]HQ9HUIDKUHQIUGLH Knüpfung natürlicher Peptid-Bindungen einen besonderen Stellenwert.

'LH LQ GHQ PHLVWHQ )lOOHQ YHUZHQGHWH /LJDWLRQV0HWKRGH ]XU Darstellung von Peptid-Bindungen ist die native chemische Ligation.

'LH 1&/ KDW LKUHQ 8UVSUXQJ LQ GHU 6\QWKHVH VFKZHIHOKDOWLJHU3HSWLGH nach Wieland et al. von 1953.^[25] 7KHRUHWLVFK ZXUGH GLHVHV 3ULQ]LS HUVW YRQ .HPS ZLHGHU DXIJHQRPPHQ ZREHL HV DEHU QRFK QLFKW gelang ein ausgereiftes Verfahren zu entwickeln.^[26] Der Durchbruch NDPHUVW0LWWHGHULJHU-DKUH'LH1&/EHUXKWDXIGHU5HDNWLRQHLQHV VHLWHQNHWWHQXQJHVFKW]WHQ &WHUPLQDOHQ Į7KLRHVWHU3HSWLGHV 4 mit einem seitenketten-ungeschützten Peptid 5 ZHOFKHV HLQ 1WHUPLQDOHV

&\VWHLQDXIZHLVW$EELOGXQJ ^[27][28] Diese beiden unterliegen in einer

*OHLFKJHZLFKWV5HDNWLRQ HLQHP FKHPRVHOHNWLYHQ 7KLRO$XVWDXVFK 8QPLWWHOEDU QDFK GHU 7KLRHVWHU%LOGXQJ6 DQ GHU &\VWHLQ6HLWHQNHWWH

¿QGHW EHU HLQHQ JOLHGULJHQ hEHUJDQJV]XVWDQG7 HLQH 6ĺ1$F\O 8PODJHUXQJ ]XU $XVELOGXQJ GHV QDWUOLFKHQ 3HSWLG5FNJUDWV 8 statt.^[27][28]

HN Peptid O

SH

N O

O Peptid +

N O

O Peptid S

O Peptid HN

Peptid H

N O

O Peptid S

O Peptid HN

Peptid Peptid

1 2

3

Abbildung 1:

Reaktions-Schema der Thiol-Maleimid-Ligation

Peptid O

SR H2N

HS O

Peptid +

H2N S

O Peptid O

Peptid

O Peptid H2

N S Peptid

O HN

HS O

Peptid O

Peptid

- RS^- + RS^-

4 5 6

7 8

Abbildung 2:

Reaktions-Mechanismus der nativen chemischen Ligation

(13)

:LHDXFKEHLGHQDQGHUHQ0HWKRGHQ]XU/LJDWLRQXQJHVFKW]WHU3HSWLGHKDWGLH1&/GHQ9RUWHLO GDVV VRZRKO GHU .XSSOXQJV3UR]HVV DOV DXFK GLH $XIDUEHLWXQJ GHV 3URGXNWHV SHU UHYHUVHG SKDVHKLJKSHUIRUPDQFHOLTXLGFKURPDWRJUDSK\53+3/&XQSUREOHPDWLVFKLVW^[29](LQZHLWHUHU SRVLWLYHU$VSHNW EHVWHKW LQ GHU HLQIDFKHQ 'XUFKIKUXQJ GHU /LJDWLRQ X D LP :lVVULJHQ EHL QHXWUDOHPS+XQGXQWHU$QZHVHQKHLWGHQDWXULHUHQGHU$JHQ]LHQ^[29]=XGHP]HLJWGLHVH/LJDWLRQV 0HWKRGHHLQH7ROHUDQ]JHJHQEHUZHLWHUHQ&\VWHLQHQLQGHQ3HSWLG6HJPHQWHQDXI$QGLHVHQ

&\VWHLQHQ NDQQ ]ZDU DXFK GLH *OHLFKJHZLFKWV5HDNWLRQ GHV7KLRO$XVWDXVFKHV VWDWW¿QGHQ XQG VRPLWHLQLQWHUQHU7KLRHVWHUJHELOGHWZHUGHQDEHUNHLQHGDUDXIIROJHQGH8PODJHUXQJ]XHLQHP stabilen Produkt.^[29] Daher kann hier auf Schutzgruppen verzichtet werden.

7URW] DOOHU 9RUWHLOH GHU 1&/ PXVVWHQ ]XQlFKVW 9HUIDKUHQ HQWZLFNHOW ZHUGHQ XP HI¿]LHQW XQG RKQH RSWLVFKHQ 9HUOXVW HSLPHUHQUHLQ GLH EHQ|WLJWHQĮ7KLRHVWHU KHU]XVWHOOHQ 'LH RSWLPLHUWH tert%XW\OR[\FDUERQ\O %RF&KHPLH LQ GHU 6336^[30] hat das Problem der Verwendung von NRUURVLYHQ VWDUNHQ 6lXUHQ ZHOFKH LQ PRGHUQHQ$XWRPDWHQ QLFKW HLQVHW]EDU VLQG^[31] Dagegen sind in der leichter automatisierbaren 9-Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc)-Strategie vorzeitig H[LVWLHUHQGH7KLRHVWHUJHJHQEHU3LSHULGLQODELOZHOFKHVIUGLH)PRF$EVSDOWXQJHUIRUGHUOLFK ist.^[31]6RPLWZXUGHQYHUVFKLHGHQH0|JOLFKNHLWHQ]XU7KLRHVWHU*HZLQQXQJHQWZLFNHOWZLH]XP

%HLVSLHO QHXH $EVSDOW&RFNWDLOV IU GLH )PRF6FKXW]JUXSSH^[32] GLH 9HUZHQGXQJ YRQ ÄVDIHW\

FDWFK³ /LQNHUQ^[33]-[36] HQWVSUHFKHQGH +DU]DEVSDOWXQJHQ EHL GHQHQ HUVW GLH 7KLRHVWHU JHELOGHW werden^[37][38] GLH $XVQXW]XQJ HLQHV 1ĺ6$F\O6KLIWHV ]XU %LOGXQJ GHV 7KLRHVWHUV^[39]-[41] HLQH selbstreinigende Methode^[42][43] RGHU QDFK GHU +DU]DEVSDOWXQJ GLH 7KLRHVWHU%LOGXQJ DQ HLQHU VHLWHQNHWWHQJHVFKW]WHQ3HSWLGVlXUHRKQH5D]HPLVLHUXQJGHU&WHUPLQDOHQ$6^[44][45].^[19] Letztere Methode wird in unserem Labor erfolgreich verwendet.

8P GLH 1&/ IU PHKUHUH DXIHLQDQGHUIROJHQGH /LJDWLRQHQ DQZHQGHQ ]X N|QQHQ PXVV MHGRFK EHDFKWHW ZHUGHQ GDVV GLH 6HJPHQWH ZHOFKH VRZRKO DP & DOV DXFK DP 17HUPLQXV HLQH .XSSOXQJVVWHOOH DXIZHLVHQ ZHGHU ]\NOLVLHUHQ QRFK SRO\PHULVLHUHQ .RQ]HSWH GLH IU GLHVH 3UREOHPDWLN HQWZLFNHOW ZXUGHQ EHLQKDOWHQ ]XP %HLVSLHO GLH 1XW]XQJ YRQ 6FKXW]JUXSSHQ ZLH GLH $FHWDPLGRPHWK\O $FP6FKXW]JUXSSH IU GLH 7KLRO6HLWHQNHWWH GHV &\VWHLQV^[46][47] GLH Methylsulfonylethoxycarbonyloxy- (Msc)-Schutzgruppe für die Amino-Funktion^[30][47] oder das DOV 7KLRD]ROLGLQ JHVFKW]WH &\VWHLQ^[48]-[50] (LQ DQGHUHU $QVDW] VLQG /LJDWLRQHQ DQ )HVWSKDVHQ 63&/^[46][47]RGHUGLH$XVQXW]XQJYRQNLQHWLVFKHU.RQWUROOHZlKUHQGGHU1&/^[50][51]+LHUSUR¿WLHUW PDQDXVGHQXQWHUVFKLHGOLFKHQ5HDNWLYLWlWHQYRQ$ON\OXQG$U\O7KLRHVWHUQ

2.1.2. Ligation durch enzymatische Katalyse

1HEHQ GHQ GLYHUVHQ )lKLJNHLWHQ ZHOFKH GXUFK GLH YHUVFKLHGHQHQ 9HUIDKUHQ GHU FKHPLVFKHQ /LJDWLRQHQ JHERWHQ ZHUGHQ NDQQ PDQ VLFK ]XVlW]OLFK GHU (LJHQVFKDIWHQ GHU HQ]\PDWLVFKHQ .DWDO\VHZLH]XP%HLVSLHOGHU/LJDVHQEHGLHQHQ/LJDVHQVLQG(Q]\PHGLHXQWHU(QHUJLHYHUEUDXFK GLH 9HUNQSIXQJ ]ZHLHU 0ROHNOH GXUFK HLQH NRYDOHQWH %LQGXQJ NDWDO\VLHUHQ ,Q GLH *UXSSH

(14)

GHU /LJDVHQ JHK|UHQ DXFK GLH 7UDQVSHSWLGDVHQ (Q]\PH GLHVHU .ODVVH NDWDO\VLHUHQFKHPLVFKH5HDNWLRQHQZLHGLHUHYHUVLEOHhEHUWUDJXQJHLQHV 3HSWLGHVDXIHLQDQGHUHVGXUFK3URWHDVHQLQZHOFKHU$6VRGHU3HSWLGH DXI DQGHUH$PLQR.RPSRQHQWHQ WUDQVIHULHUW ZHUGHQ (V ZLUG DOVR GLH

%LOGXQJYRQ$PLG%LQGXQJHQ]ZLVFKHQ$PLQRXQG&DUERQ\OJUXSSHQ LQQHUKDOE H[LVWLHUHQGHU 3HSWLG9HUELQGXQJHQ NDWDO\VLHUW (LQH /LJDVH ZHOFKH ]X GLHVHP =ZHFN EHUHLWV HLQJHVHW]W ZXUGH LVW GLH 6RUWDVH $ (Srt A)^[52][53].

'LH6RUWDVH$LVWHLQH7UDQVSHSWLGDVHZHOFKHin vivo an der Anknüpfung von Proteinen an bakterielle Peptidoglykane beteiligt ist^[54][55] und eine JHULQJH 3URWHRO\VH$NWLYLWlW DXIZHLVW 6RPLW VWHOOW HLQH SRWHQWLHOOH +\GURO\VH ZlKUHQG GHU /LJDWLRQ NHLQ 3UREOHP GDU^[52] $XI *UXQG GHU 7DWVDFKH GDVV GLH 6UW $ HLQH (UNHQQXQJV6HTXHQ] YRQ IQI $6 EHQ|WLJW^[56]LVWNHLQHSURWHRO\WLVFKH6SDOWXQJXQG7UDQVSHSWLGLHUXQJDQ DQGHUHU6WHOOHGHU5HDNWDQGHQ]XEHIUFKWHQ

Bei der Ligation mittels Sortase A werden die Substrate 9 an dem (UNHQQXQJV0RWLY ZDV GLH$6$EIROJH YRQ /3;7* KDW^[56] ]ZLVFKHQ GHP 7KUHRQLQ XQG GHP *O\FLQ XQWHU $XVELOGXQJ HLQHV 7KUHRQ\O 7KLRHVWHUV DP &\VWHLQ GHU 6UW$ JHVSDOWHQ XQG DXI HLQ 2OLJR*O\FLQ 1XNOHRSKLO 10 übertragen (Abbildung 3).^[54][55] In Anwesenheit HLQHV 1XNOHRSKLOV LVW GLH %LOGXQJ GHV $F\O(Q]\P.RPSOH[HV JHVFKZLQGLJNHLWVEHVWLPPHQG ZREHL XQWHU $EZHVHQKHLW HLQHV 1XNOHRSKLOVVHKUODQJVDP+\GURO\VHVWDWW¿QGHW^[52]

'LH 6RUWDVH $YHUPLWWHOWH /LJDWLRQ LVW KRFK VHOHNWLY GD VLH DP (UNHQQXQJV0RWLY QXU HLQH JHULQJH 7ROHUDQ] DXIZHLVW^[55][56] Die 7UDQVSHSWLGLHUXQJ ZLUG ]XVlW]OLFK GXUFK GLH (LJHQVFKDIWHQ GHU

a) Nomenklatur

Sortase A

S₄ S₃ S₂ S₁ S₁' S₂' S₃' S₄'

L P X T G X¹ X² X³

...

H2N ... COOH

Spaltung Substrat

b) Transpeptidierung

Peptid L P X T G Peptid n(G) Peptid

Peptid L P X T (G)n Peptid G Peptid +

+ Srt A

9 10

Abbildung 3:

Sortase A Transpeptidierung

D1RPHQNODWXUYRQ Substrat & Protease nach Schechter & Berger^[57] auf GLH6RUWDVH$DQJHZHQGHW E5HDNWLRQV6FKHPDGHU Sortase A-vermittelten 7UDQVSHSWLGLHUXQJ S_1-4/S`_1-4 = Substrat- Bindungsstellen

(15)

(GXNWH EHHLQÀXVVW^[52] =XGHP IKUHQ GLH 9HUZHQGXQJ HLQHV (GXNWHV LP hEHUVFKXVV VRZLH GDV (QWIHUQHQ HLQHV 3URGXNWHV ]XU ZHLWHUHQ 9HUVFKLHEXQJ GHV *OHLFKJHZLFKWHV LQ 5LFKWXQJ GHU 7UDQVSHSWLGLHUXQJ

1HEHQ GHU KRKHQ 6HOHNWLYLWlW VLQG GLH PLOGHQ 5HDNWLRQV%HGLQJXQJHQ EHL GLHVHU /LJDWLRQ YRQ 9RUWHLO 6LH NDQQ LQ ZlVVULJHQ QHXWUDOHQ 3XIIHUQ XQG VRJDU LQ $QZHVHQKHLW YRQ RUJDQLVFKHQ /|VXQJVPLWWHOQ XQG RKQH GLH =XJDEH YRQ7KLROHQ RGHU DQGHUHU 5HGXNWLRQVPLWWHO GXUFKJHIKUW werden.^[52][53]'DKHULVWVLHIUGLH/LJDWLRQODELOHU6XEVWUDWHGLH]XP%HLVSLHO'LVXO¿G%UFNHQ RGHU JO\NRV\OLHUWH (LQKHLWHQ EHLQKDOWHQ KHUYRUUDJHQG JHHLJQHW 1DWUOLFK NDQQ GHU 9RUWHLO GHU 6HOHNWLYLWlWIUGDV/3;7*0RWLYDXFKDOVHLQH/LPLWLHUXQJGHU6RUWDVH$YHUPLWWHOWHQ/LJDWLRQ GLVNXWLHUWZHUGHQ(LQH/|VXQJIUGLH(LQVFKUlQNXQJGHU$QZHQGXQJGHU6UW$DXIGDV/3;7*

(UNHQQXQJV0RWLY NRQQWH GXUFK HLQH 0XWDQWH GHU 6RUWDVH $ HU]LHOW ZHUGHQ 'LHVH WROHULHUW DQVWHOOHGHV/HXFLQVHLQZHLWHV6SHNWUXPDQ$6IUGLHHUVWH3RVLWLRQGHV(UNHQQXQJV0RWLYV^[58]

2.1.3. Semi-Synthese

0|FKWH PDQ HLQHQ 6FKULWW ZHLWHU JHKHQ XQG VLFK ]XVlW]OLFK GHU 9RUWHLOH GHU ELRFKHPLVFKHQ 6\QWKHVHEHGLHQHQELHWHWGDV3URWHLQ6SOHLHQHLQHZLFKWLJH*UXQGODJH%LRFKHPLVFKH9HUIDKUHQ stellen eine Verknüpfung biologischer und chemischer Verfahren dar. Die Biosynthese bedient sich UHNRPELQDQWHU'1$]XU([SUHVVLRQGHUJHZQVFKWHQ3URWHLQH^[10][31]'LHUHNRPELQDQWH([SUHVVLRQ KDW GHQ 9RUWHLO GDVV ]XP HLQHQ JU|HUH 0HQJHQ XQG ]XP DQGHUHQ OlQJHUH$66HTXHQ]HQ DOV LQ GHU &KHPRV\QWKHVH UHDOLVLHUW ZHUGHQ N|QQHQ^[59] 6ROOHQ DXHU GHQ QDWUOLFK YRUNRPPHQGHQ

$6 XQQDWUOLFKH HLQJHEDXW ZHUGHQ VR NDQQ PDQ IU 6WUXNWXUDQDORJD GHU QDWUOLFKHQ$6V GLH ÄIRUFHG ELRV\QWKHWLF LQFRUSRUDWLRQ³ QXW]HQ^[10] $QGHUH 0|JOLFKNHLWHQ SRVLWLRQVVSH]L¿VFKHU ,QNRUSRUDWLRQHQMHJOLFKHUXQQDWUOLFKHU$6VLQG7HFKQLNHQGLHDXIGHU(QWZLFNOXQJGHU6\QWKHVHQ YRQVXSSUHVVRUW51$RGHUHQJLQHHUHGW51$EDVLHUHQ^[8]*HQHUHOOZLUGGLH%LRV\QWKHVHNRUUHNW JHIDOWHWHU3URWHLQHDXI*UXQGYRQ$JJUHJDWLRQOLPLWLHUWXQGNDQQ0RGL¿NDWLRQHQQXUKRPRJHQ XQG QLFKW SRVLWLRQVVSH]L¿VFK KHUYRUUXIHQ ZLH ,VRWRSHQPDUNLHUXQJHQ RGHU SRVWWUDQVODWLRQDOH 0RGL¿NDWLRQHQ^[31][59]+LHUVHW]WGLH6HPL6\QWKHVHDQZHOFKHHLQH.RPELQDWLRQGHU&KHPRXQG Biosynthese beinhaltet.

)UGLH(QWZLFNOXQJGHU6HPL6\QWKHVHZDUGLH.OlUXQJGHV0HFKDQLVPXVGHV3URWHLQ6SOHLHQV HLQDXVVFKODJJHEHQGHU3XQNW'LHELVODQJHWDEOLHUWHVWHQ7HFKQLNHQGHU6HPL6\QWKHVHGLH(3/

XQGGDVWUDQV6SOHLHQEHUXKHQDXIGHU0DQLSXODWLRQGLHVHV0HFKDQLVPXV)UGLH$XINOlUXQJ GHV3URWHLQ6SOHLHQVZDUGDVPHFKDQLVWLVFKH9HUVWlQGQLVGHU1&/YRQJUXQGOHJHQGHU%HGHXWXQJ GDKLHUlKQOLFKH$EOlXIHVWDWW¿QGHQ

'DV 6SOHLHQ ¿QGHW DQ 3RVLWLRQHQ VWDWW DQ GHQHQ VLFK 6HULQ 7KUHRQLQ RGHU &\VWHLQ EH¿QGHQ ,P HUVWHQ 6FKULWW ZLUG GLH 1WHUPLQDOH 6SOHL3RVLWLRQ GXUFK HLQH 1ĺ26$F\O8PODJHUXQJ aktiviert 11 (Abbildung 4). Dies führt zu einer zwischenzeitlich linearen Verknüpfung des

(16)

1([WHLQV DQ GHU 6HU7KU&\V6HLWHQNHWWH GHV ,QWHLQV LQ )RUP HLQHV 7KLR(VWHUV 12 $QVFKOLHHQG ¿QGHW HLQH LQWUDPROHNXODUH WUDQV 7KLR8PHVWHUXQJ VWDWW 'DEHL ZLUG GHU $F\OUHVW GHV 1([WHLQV YRQ GHU 6HLWHQNHWWH GHU 1WHUPLQDOHQ $6 GHV ,QWHLQV DXI GLH 1WHUPLQDOH 6HU7KU&\V6HLWHQNHWWHGHV&([WHLQVEHUWUDJHQ(VHQWVWHKWGDGXUFK ein verzweigtes Protein-Intermediat 13 PLW ]ZHL 17HUPLQL JHK|UHQG ]XP 1([WHLQ XQG ,QWHLQ XQG HLQHU 7KLR(VWHU9HUEUFNXQJ ]ZLVFKHQ GHP 1([WHLQ XQG GHP &([WHLQ PLW HLQHP 6HU7KU&\V DOV 9HUNQSIXQJVVWHOOH 'LH 6SDOWXQJ GHU 3HSWLG+DXSWNHWWH ¿QGHW GXUFK die Ausbildung eines Succinimides 14 GXUFK GLH =\NOLVLHUXQJ GHV

&WHUPLQDOHQ$VSDUDJLQVGHV,QWHLQVVWDWWZDVGHQ$XIEUXFKGHU3HSWLG

%LQGXQJ ]ZLVFKHQ ,QWHLQ XQG &([WHLQ PLW VLFK IKUW $EVFKOLHHQG

¿QGHW DQDORJ GHU 1&/ HLQH VSRQWDQH 26ĺ1$F\O8PODJHUXQJ GHU VHLWHQNHWWHQYHUEUFNWHQ ([WHLQH ]X HLQHU $PLG%LQGXQJ 15 statt.

'DV 6HOEVW6SOHLHQ OlVVW YHUPXWHQ GDVV GLH 6SOHL3RVLWLRQHQ HLQH VHKU VWULNWH FKHPLVFKH HOHNWURQLVFKH XQG VWHULVFKH 6SH]L¿WlW EHGLQJHQ XQG ]XGHP $6 LP 3URWHLQ GHP 6SOHLHQ DVVLVWLHUHQ LQGHP VLH GLH Intermediate stabilisieren oder als Protonen-Donatoren oder -Akzeptoren fungieren.^[60]

,Q GHU (3/ PDQLSXOLHUW PDQ GLH ,QWHLQH GDKLQJHKHQG GDVV HQWZHGHU

&WHUPLQDOH 7KLRHVWHU RGHU 1WHUPLQDOH &\VWHLQH JHQHULHUW ZHUGHQ ZHOFKHEHLGHIUHLQHGDUDXIIROJHQGH1&/PLWHLQHPFKHPRV\QWKHWLVFKHQ 3HSWLGHLQJHVHW]WZHUGHQN|QQHQ:LOOPDQHLQHQ7KLRHVWHUHUKDOWHQVR QXW]WPDQHLQPXWLHUWHV6SOHL3URWHLQZDVDXIGHU6WXIHHLQHV7KLRHVWHU Intermediates (13 mit Y = S) stehen bleibt.^[61][62] 'XUFK =XVDW] HLQHV HQWVSUHFKHQGHQ 7KLROV 7KLRSKHQRO 0HUFDSWRHWKDQVXOIRQDW1DWULXP 0(61$ NDQQ QDFK 7KLRO$XVWDXVFK GHU 7KLRHVWHU16 IU GLH 1&/

gewonnen werden.[62][61][62] Dieses Konzept kann natürlich auch für die

Y

Extein-N Extein-N

O HN

X

Intein

O NH₂ O

NH

C-Extein N-Extein

H2N X

Intein

O NH2

O NH Y

C-Extein O

Extein-N N-Extein

H₂N X

Intein

O NH2

O NH Y

C-Extein Extein-N O

N-Extein O

NH Y

C-Extein N-Extein

H2N X

Intein NH O

O +

R R

R R R

R 11

H H

H

H H

H

12

13 14

15

Abbildung 4:

Mechanismus des Protein-Spleißens

PLW;< 26IU 6HU 7KU&\VXQG 5 +0HIU 6HU &\V7KU

(17)

6HPL6\QWKHVH]\NOLVFKHU3HSWLGHXQG3URWHLQHJHQXW]WZHUGHQLQGHP das zu zyklisierende Molekül zwischen zwei entsprechend manipulierten Inteinen 17 eingebaut wird (Abbildung 5)^[62].

'LH YHUVFKLHGHQHQ 9HUIDKUHQ LQ GHU &KHPR %LR XQG 6HPL6\QWKHVH ELHWHQ HLQ ZHLWHV 6SHNWUXP DQ 0|JOLFKNHLWHQ IU GLH 'DUVWHOOXQJ YRQ 3URWHLQHQ $XI *UXQG GHU XQWHUVFKLHGOLFKHQ (LJHQVFKDIWHQ 0RGL¿NDWLRQHQ XQG )UDJHVWHOOXQJHQ ZHOFKH VLFK KLQWHU GHU $XIJDEH GHU 6\QWKHVH HLQHV JHZQVFKWHQ 3URWHLQV YHUEHUJHQ PVVHQ IU HLQ MHGHV 3URWHLQ HQWVSUHFKHQGH 6\QWKHVH6WUDWHJLHQ HQWZLFNHOW XQG GLHVH Verfahren zielgerichtet optimiert werden.

,Q GHU 3HSWLG6\QWKHVH VLQG VRJHQDQQWH ÄVFKZLHULJH³ 3HSWLGH EHNDQQW 'DV VLQG 3HSWLGH GLH GXUFK GDV $XIWUHWHQ VWHULVFKHU +LQGHUXQJHQ RGHU VWDUNHU $VVR]LDWLRQVSKlQRPHQH XQG GDPLW YHUEXQGHQHU /|VOLFKNHLWVSUREOHPH VFKZHU V\QWKHWLVLHUEDU VLQG 0LW DQDORJHQ Problemen muss man ebenso bei Synthesen entsprechender Proteine UHFKQHQ (V VROOWHQ GHVKDOE FKHPLVFKH JHQWHFKQRORJLVFKH XQG HQ]\PDWLVFKH 0HWKRGHQ GDKLQJHKHQG JHWHVWHW ZHUGHQ PLW ZHOFKHP (UIROJ ÄVFKZLHULJH³ 3URWHLQH ZLH VROFKH GLH VHKU VWDUN ]XU )LEULOOHQ

%LOGXQJ QHLJHQ KHUJHVWHOOW ZHUGHQ N|QQHQ 'DIU ZXUGH GDV ȕ₂-Mikroglobulin (ȕ₂0 DOV 0RGHOOYHUELQGXQJ JHZlKOW ZHLO EHUHLWV (UIDKUXQJHQ KLQVLFKWOLFK GHU 6FKZLHULJNHLW VHLQHU &KHPRV\QWKHVH vorlagen^[63][64] GDV PLWWHOV ([SUHVVLRQ JHZRQQHQH =LHOSURWHLQ ]XP 9HUJOHLFKYRUKDQGHQZDUXQGOHW]WOLFKRUWVVSH]L¿VFKLVRWRSHQPDUNLHUWHV Protein zum Abschluss von Untersuchungen zur Faltungsdynamik dringend notwendig war. Als zweiten Untersuchungsgegenstand wurde GLH 6\QWKHVH HLQHV H[WUD]HOOXOlUHQ 5H]HSWRU0RGHOOV YRP &5) 5H]HSWRU JHZlKOW *HJHQEHU GHP EHNDQQWHQ .RQVWUXNW^[65][66] sollte NHLQ OLQHDUHV 3HSWLG7HPSODW ]XP $QNQSIHQ GHU H[WUD]HOOXOlUHQ /RRS6WUXNWXUHQ XQG GHV 5H]HSWRU17HUPLQXV JHQXW]W VRQGHUQ GLH )OH[LELOLWlWGHU5H]HSWRU'RPlQHQGXUFK9HUZHQGXQJHLQHV]\NOLVFKHQ 3HSWLG7HPSODWHVHLQJHVFKUlQNWZHUGHQ

-

Peptid H2N

HS

+ RSH

SR O NCL

NH OHS

Peptid Peptid C-Intein N-Intein

N-Intein

Peptid H2N

HS

C-Intein

C-Intein 17

16

Abbildung 5:

Mechanismus der EPL zur Bildung eines zyklischen Peptides

(18)

2.2. Das ȕ

₂

-Mikroglobulin

'DV/LJDWLRQV9HUIDKUHQGHU1&/VROOLP5DKPHQGHU8QWHUVXFKXQJHQ EH]JOLFK GHU 5HDOLVLHUEDUNHLW GHU &KHPRV\QWKHVH YRQ ¿EULOOlUHQ 3URWHLQHQ LP VSH]LHOOHQ YRQȕ₂0LNURJOREXOLQ'HULYDWHQ XQWHUVXFKW werden. Das Interesse an ȕ₂-Mikroglobulin begründet sich auf seiner pathologischen Auswirkung durch Protein-Fehlfaltung.

Das ȕ₂0LVWHLQN'DVFKZHUHV3URWHLQZDVDXV$6DXIJHEDXW ist.^[67] (V ELOGHW GLH OHLFKWH QLFKWNRYDOHQW JHEXQGHQH .HWWH GHV +DXSWKLVWRNRPSDWLELOLWlWV.RPSOH[HV0+&$EELOGXQJ ^[68]

Das ȕ₂0LNURJOREXOLQEHVWHKWDXVHLQHPVLHEHQVWUlQJLJHQȕ-Sandwich mit Immunglobulin-Faltung.^[67][68] Aufgebaut wird diese Struktur aus zwei antiparallelen ȕ)DOWEOlWWHUQ ZHOFKH GXUFK HLQH 'LVXOILG%UFNH

&\V₂₅&\V₈₀) stabilisiert werden (Abbildung 7).^[67][68] Dabei besteht das HLQH)DOWEODWWDXVYLHU6WUlQJHQ$_6-11%_21-30'_50-56(_62-70) und das andere DXVGUHL6WUlQJHQ&_36-41)_78-83*_91-94).^[67][68]

Abbildung 6:

MHC und ȕ₂-Mikroglobulin

%lQGHUPRGHOOHGHU Kristallstrukturen YRP0+&PLW3HSWLG (links)^[1]XQGYHUJU|HUWHP Ausschnitt vom ȕ₂-M (rechts)^[2]

ȕ₂-M Į1

Į3 Į2

Peptid

Abbildung 7:

ȕ₂-Mikroglobulin

%lQGHUPRGHOOPLW 2ULHQWLHUXQJGHU7\U Seitenketten und der Pro₃₂-Seitenkette

(links)^[3] und AS-Sequenz mit Kennzeichnung der einzelnen ȕ)DOWEOlWWHU (blau) & der Disulfid-

%UFNHJUQUHFKWV

(19)

Das medizinische Interesse am ȕ₂0LNURJOREXOLQ EHJUQGHW VLFK GDPLW GDVV HV GLH 8UVDFKH IU GLH GLDO\VHEHGLQJWH $P\ORLGRVLV '5$ EHL +lPRGLDO\VHSDWLHQWHQ LVW^[69] Bei Langzeit- Dialysepatienten wird das ȕ₂0 EHLP 0+&$EEDX ZHJHQ GHUHU 1LHUHQIHKOIXQNWLRQ QLFKW PHKU NDWDEROLVLHUW XQG ]XGHP QLFKW YROOVWlQGLJ ZlKUHQG GHU 'LDO\VH HQWIHUQW^[69][70] Dies führt ]X HLQHU HUK|KWHQ .RQ]HQWUDWLRQ DQȕ₂0 LQ GHU %OXWEDKQ ZR HV GXUFK )HKOIDOWXQJ DP\ORLGH )LEULOOHQ DXVELOGHW ZHOFKH LQ GHQ %HZHJXQJVDSSDUDW JHODQJHQ[69][71][72] Diese Ablagerungen LP *HOHQNZDVVHU N|QQHQ ]XP %HLVSLHO ]X .QRFKHQ]\VWHQ RGHU GHP .DUSDO7XQQHO6\QGURP führen.^[71]

%LVODQJ LVW OHGLJOLFK EHNDQQW GDVV GLH DP\ORLGH 6WUXNWXU DXI *UXQG DOORVWHULVFK NRQWUROOLHUWHU Konformations-Änderungen hervorgerufen wird.^[72] Weiter ist das native ȕ₂-Mikroglobulin als 0RQRPHU LQ /|VXQJ VWDELO XQG NDQQin vitro durch Initiation zur Ausbildung der amyloiden )RUPDWLRQ DQJHUHJW ZHUGHQ 1RUPDOHUZHLVH LVW GHU 3UR]HVV GHU )HKOIDOWXQJ ODQJVDP DEHU 8QWHUVXFKXQJHQKDEHQHUJHEHQGDVVGLH)LEULOOHQ%LOGXQJGXUFK,PSIHQXQGRGHUGLH=XJDEHYRQ .XSIHU,,,RQHQYRQ'HWHUJHQ]LHQRGHURUJDQLVFKHQ&R6ROYHQWLHQDXVJHO|VWZHUGHQNDQQ^[73]-[75]

Da der Bildungs-Mechanismus und die komplette Struktur der amyloiden Fibrillen noch nicht JHNOlUWLVWVROOHQDQGLHVHU6WHOOHLQIUDURW,5VSHNWURVNRSLVFKH8QWHUVXFKXQJHQHLQHQ(LQEOLFN HUODXEHQ+LHUIUVROOHQSRVLWLRQVVSH]L¿VFKLVRWRSHQPDUNLHUWHȕ₂0'HULYDWHGDUJHVWHOOWZHUGHQ ZDVGXUFK&KHPRV\QWKHVHUHDOLVLHUWZHUGHQVROO

2.2.1. Synthese-Strategie

Die Synthese des ȕ₂-Mikroglobulins wurde in zwei vorhergehenden Arbeiten (Dissertation B. Briand^[63] & Diplomarbeit S. Abel^[64]) mit folgender Synthese-Strategie bereits angegangen.

Bei den zu synthetisierenden ȕ₂0'HULYDWHQ VROO MHZHLOV HLQ 7\URVLQ GHVVHQ 6HLWHQNHWWH LQ GDV ,QQHUH GHV 3URWHLQV ]HLJW DQ GHU &3RVLWLRQ GHV 3KHQRO5LQJHV¹³&PDUNLHUW ZHUGHQ XP GXUFK 9HUlQGHUXQJHQ GHU >¹³&@7\U%DQGH ZlKUHQG ,5VSHNWURVNRSLVFKHU 8QWHUVXFKXQJHQ 5FNVFKOVVHDXIGLH8PJHEXQJGLHVHU7\URVLQH]LHKHQ]XN|QQHQ^[76]-[78]. Das ȕ₂-Mikroglobulin EHVLW]WLQVJHVDPWVHFKV7\URVLQH^[67][68]ZREHLOHGLJOLFKGLH6HLWHQNHWWHQGHU7\URVLQHDQ3RVLWLRQ 66 und 78 in die Struktur hinein weisen^[67][68]VLHKH$EELOGXQJ XQGVRPLWYRQ5HOHYDQ]IU faltungskinetische Untersuchungen sind.

'LH7DWVDFKHGDVVGDVȕ₂0DQGHQ3RVLWLRQHQXQG&\VWHLQHDXIZHLVW^[67]OHJWHLQH6\QWKHVH 6WUDWHJLH QDKH GLH DXI GHU QDWLYHQ FKHPLVFKHQ /LJDWLRQ DXIEDXW $EELOGXQJ 0LW GHP .RQ]HSWGHU1&/HUJHEHQVLFKIUGDVȕ₂0LNURJOREXOLQUHWURV\QWKHWLVFKGUHL3HSWLG6HJPHQWH ZHOFKHPLWWHOVDXWRPDWLVLHUWHU6336V\QWKHWLVLHUWZHUGHQN|QQHQ^[63][64]

(20)

'LHVH 6HJPHQW DXV GHQ VLFK GDV ȕ₂0 ]XVDPPHQVHW]W VLQG GDV 1WHUPLQDOH 3HSWLGA (Seg_1-24 GDV PLWWOHUH 6HJPHQWB (Seg_25-79) und GDV &WHUPLQDOH 6HJPHQWC (Seg_80-99 )U GLH /LJDWLRQHQ SHU 1&/

ZHOFKH EOLFKHUZHLVH LQ &ĺ15LFKWXQJ YROO]RJHQ ZHUGHQ PXVV GDV 1WHUPLQDOH&\VWHLQGHVPLWWOHUHQ6HJPHQWHVB geschützt werden (B*).

+LHUZXUGHGDV7KLRD]ROLGLQDXVJHZlKOWHLQDOV3VHXGRSUROLQJHVFKW]WHV

&\VWHLQ^[48]=XU$NWLYLHUXQJGHU&7HUPLQLGHV1WHUPLQDOHQ6HJPHQWHV A und des mittleren Segmentes B* wurde der literaturbekannte para-

$FHWDPLGRSKHQ\O7KLRHVWHU JHELOGHW A-SR B*-SR).[44][79]-[85] Da im 5DKPHQ HUVWHU$UEHLWHQ 3URPRWLRQ % %ULDQG GLH$XVEHXWHQ IU GLH EHLGHQ 1&/V QXU MHZHLOV EHWUXJHQ^[63] VROOWH GDUDXI DXIEDXHQG GLH(LQVHW]EDUNHLWGHU*HO¿OWUDWLRQIUHLQHYHUOXVWlUPHUH$XIUHLQLJXQJ DQVWDWW GHU EOLFK YHUZHQGHWHQ 53+3/& XQWHUVXFKW ZHUGHQ (Diplomarbeit S. Abel^[64]).

2.2.2. Vorarbeiten zur Darstellung vom ȕ₂-M

,P5DKPHQYRUDQJHJDQJHQHU$UEHLWHQLQXQVHUHP/DERU'LVVHUWDWLRQ B. Briand^[63]) wurde 1.2 mg gefaltetes synthetisches ȕ₂-Mikroglobulin GDUJHVWHOOW ZDV IU GLH JHSODQWHQ VSHNWURVNRSLVFKHQ 8QWHUVXFKXQJHQ nicht ausreichend war. Dies war den geringen Ausbeuten der beiden /LJDWLRQHQ JHVFKXOGHW ZHOFKH QDFK 5HLQLJXQJ MHZHLOV QXU Ausbeute hervorbrachten.^[63] Dieses synthetische ȕ₂0EHVDGLHIUGDV natürliche ȕ₂0LNURJOREXOLQ FKDUDNWHULVWLVFKHQ ,5VSHNWURVNRSLVFKHQ Banden für die antiparallele ȕ)DOWEODWW6WUXNWXUVFKZDFKH§ FP^-1 VWDUNH§ FP^-1XQGHLQH%DQGHZHOFKHYHUPXWOLFKDXIHLQHWXUQ DUWLJH6WUXNWXU]XUFN]XIKUHQLVWVFKZDFKH§ FP^-1).^[78]$XIIlOOLJ ZDU GDVV GDV V\QWKHWLVFKH ȕ₂-M Unterschiede zum rekombinanten (rek.) ȕ₂0 LQ GHU ,5VSHNWURVNRSLVFKHQ &KDUDNWHULVLHUXQJ ]HLJWH (Abbildung 9)^[63] 'DUDXV PXVV JHVFKORVVHQ ZHUGHQ GDVV GDV

+

A-SR B*-SR C

+

1. NCL Entschützung (B*C → BC), 2. NCLB*C

ABC

-SR = S H

N Disulfid-Brücken-Bildung,

Proteinfaltung β2-M

H2N Seg1-24

O SR

S HN

O Seg_26-79

O

SR Seg_81-99

O H₂N

HS

O

Abbildung 8:

Synthese-Strategie für das ȕ₂-Mikroglobulin

SPPS der Peptid-Segmente (A-SRB*-SRC Schrittweise Kupplung der einzelnen Segmente per 1&/

DQVFKOLHHQGH$XVELOGXQJ GHU'LVXO¿G%UFNHXQG Proteinfaltung

(21)

synthetische Protein nicht ausreichend sauber war. Dies zeichnete sich in den Spektren der matrix-unterstützten Laser-Desorption/Ionisation JHNRSSHOW PLW HLQHU WLPH RI ÀLJKWWLPH RI ÀLJKW06 0$/',06 DE (Abbildung 10)^[63] +LHU ZDUHQ QHEHQ GHP ]XP ȕ₂-Mikroglobulin JHK|ULJHQJHNHQQ]HLFKQHWHQ0DVVH3HDNm/zYRQ 'D>0+@⁺ GLH GD]XJHK|ULJHQ ]ZHLIDFK § 'D XQG HYHQWXHOO GUHLIDFK

§ 'D XQG YLHUIDFK § 'D JHODGHQHQ 3HDNV ]X VHKHQ 2EZRKO OHW]WHUH VWDUNH $EZHLFKXQJHQ EH]JOLFK LKUHU WKHRUHWLVFKHQ 0DVVHDXI]HLJWHQ=XVlW]OLFKZLHVGDV0DVVH6SHNWUXPGHVFKHPLVFKHQ 6\QWKHVH3URGXNWHV HLQ ZHLWHUHV 6LJQDO 0DVVH3HDN m/z) von ca.

'D DXI GDV DXI HLQH HQWVSUHFKHQGH 9HUXQUHLQLJXQJ GHU 3UREH hindeutete.

Abbildung 9:

FTIR-Spektren vom V\QWKHWLVFKHQȕ₂-M von B.

Briand (rot) & vom rek.

ȕ₂-M (schwarz)

Abbildung 10:

MALDI-Massespektrum YRPV\QWKHWLVFKHQȕ₂-M aus der Dissertation B. Briand^[3]

(22)

:HJHQ GHU JHULQJHQ 3URWHLQ$XVEHXWH XQG XQ]XUHLFKHQG DQDORJHQ ,5VSHNWURVNRSLVFKHQ (LJHQVFKDIWHQ ]XP UHNRPELQDQWHQȕ₂-M (Promotion B. Briand^[63] ZXUGH GLH DXWRPDWLVLHUWH SPPS der einzelnen Peptid-Segmente optimiert (Diplomarbeit S. Abel^[64]). Des Weiteren wurden GDEHLGLHFKHPLVFKHQ/LJDWLRQHQKLQVLFKWOLFKLKUHU$XVEHXWHQYHUEHVVHUWXQGGLH*HO¿OWUDWLRQDOV

$OWHUQDWLYH]XUEOLFKHQ53+3/&5HLQLJXQJGHU3URGXNWHXQWHUVXFKW

'LH 2SWLPLHUXQJ GHU )PRF6336 GHU 3HSWLG6HJPHQWH IKUWH GD]X GDVV GLH 6\QWKHVH GHU Segmente A-SR und B*-SR unter Verwendung von Pseudoprolin-Dipeptiden[48][86][87] durchgeführt ZXUGH RKQH GLH EHL EHLGHQ 6\QWKHVHQ HLQ KRKHU$QWHLO DQ$EEUXFKVHTXHQ]HQ DXIWUDW ZDV IU B*-SRPLWHLQHU/lQJHYRQ$PLQRVlXUHQ]XHUZDUWHQLVW)UGLH6\QWKHVHGHU$VSKDOWLJHQ Peptid-Segmente B*-SR und C wurden zur Inhibition der Aspartimid- und Piperidid-Bildung^[88][89]

GDV7HQWD*HO6&KORUWULW\OFKORULG+DU]&O7UW&O+DU]^[90]GLHtert-Butyl (tBu)-Schutzgruppe für Asp^[91] XQG HLQ =XVDW] YRQ +&22+ )$ LQ GHU LJHQ 3LSHULGLQ$EVSDOW /|VXQJ YHUZHQGHW^[92]. Im Fall des Segmentes B*-SR ZXUGH GLH ]HLW XQG VHTXHQ]DEKlQJLJH 7ULÀXRUDFHW\OLHUXQJ^[93] QDFK GHU 7ULÀXRUHVVLJVlXUH 7)$YHUPLWWHOWHQ $EVSDOWXQJ GXUFK DQVFKOLHHQGH%HKDQGOXQJLPZlVVULJHQ0LOLHXUFNJlQJLJJHPDFKW'LH6WHUW%XW\OVXOIRQLXP Bildung am Methionin des Segmentes CZlKUHQGGHUVDXUHQ6FKXW]JUXSSHQ$EVSDOWXQJZXUGH GXUFK%HKDQGOXQJEHLHUK|KWHU7HPSHUDWXULQ:DVVHUHEHQIDOOVXPJHNHKUW^[94][95].^[64]

'LHHUVWH1&/]XU%LOGXQJYRQB*CYHUOLHIRKQH3UREOHPHDEHUIUGLH]ZHLWH1&/]XU.XSSOXQJ von A-SR mit BCZXUGHGLH%LOGXQJHLQHV1HEHQSURGXNWHVEHREDFKWHWGHVVHQ,GHQWLWlWQLFKW JHNOlUWZHUGHQNRQQWH)UGLH]ZHLWH1&/ZXUGHZHLWHUKLQEHREDFKWHWGDVVHLQH+HUDEVHW]XQJ GHV S+:HUWHV DXI HLQH K|KHUH (I¿]LHQ] HUJLEW )U GLH 5HLQLJXQJ GHU 3URGXNWH QDFK GHQ 1&/VHUEUDFKWHGLH$QZHQGXQJGHU*HO¿OWUDWLRQIUGLHHUVWH1&/HLQHJXWH$XVEHXWHIUGLH ]ZHLWH1&/ZDUVLHDEHUGHXWOLFKZHQLJHUHUIROJUHLFK'LH/LPLWLHUXQJGHU*HO¿OWUDWLRQEHVWHKW KLHUGDULQGDVVGLHVDXUHQ%HGLQJXQJHQIUGDVȕ₂-M zu einer Initiierung von Aggregation und Fibrillen-Bildung führt.^[64]

,P (UJHEQLV JHODQJ HV DXFK LP 5DKPHQ GLHVHU $UEHLWHQ 'LSORPDUEHLW 6 $EHO^[64] QLFKW ausreichende Mengen von ȕ₂-Mikroglobulin (1.6 mg ungefaltetes ȕ₂-M/ABC) darzustellen.

=XGHPZDUGDV/LJDWLRQV3URGXNWABCDXFKKLHUQLFKWUHLQZLHGHVVHQ0$/',0DVVHVSHNWUXP zu entnehmen ist (Abbildung 11)^[64] 1HEHQ GHP 0DVVH3HDN m/z) für das Produkt mit 'D LVW LP 0DVVHEHUHLFK XP 'D HLQ 1HEHQSURGXNW QDFKZHLVEDU 'LHVHU 3HDN N|QQWHDXI9HUXQUHLQLJXQJGHV=LHOSURWHLQVGXUFKGDV6HJPHQWBC hinweisen.

(23)

2.3. CRF1-Mimetika

'HU &RUWLFRWURSLQ5HOHDVLQJ )DFWRU 5HFHSWRU 7\S &5) JHK|UW ]X GHQ HLQJHKHQG LQ LKUHU %HGHXWXQJ XQWHUVWULFKHQHQ *3URWHLQ JHNRSSHOWHQ 5H]HSWRUHQ *3&5V^[1][96] ZHOFKH HLQH JURH hEHUIDPLOLH DQ 5H]HSWRUHQ ELOGHQ GLH 6LJQDOH EHU GLH =HOOPHPEUDQ KLQZHJ LQ GDV=HOOLQQHUHOHLWHQ^[2][97]. Das Signal kann dabei u. a. ein Photon oder HLQ 3HSWLG/LJDQG VHLQ 'LHV IKUW ]X HLQHU LQWUD]HOOXOlUHQ ,QWHUDNWLRQ GHV 5H]HSWRUV PLW HLQHP *3URWHLQ XQG HLQHU DQVFKOLHHQGHQ

$NWLYLHUXQJ HLQHV 6HNXQGlU0HVVHQJHUV $EELOGXQJ ^[98][99] Im )DOOHGHV&5)LVWGLHVHU/LJDQGGDV+RUPRQ&RUWLFRWURSLQ5HOHDVLQJ )DFWRU &5+^[96] oder verwandte Peptide wie das Urocortin^[100] oder Sauvagin^[101]. Im zytosolischen Bereich wird nach Interaktion mit GHP *3URWHLQ XQWHU DQGHUHP GHU 0HWDEROLVPXV GHV ]\NOLVFKHQ Adenosinmonophosphates aktiviert[96][100][101] ZDV LQ HLQHU YHUPHKUWHQ

$XVVFKWWXQJ YRQ &RUWLFRWURSLQ UHVXOWLHUW^[102] 'LHV IKUW OHW]WHQ (QGHV zu einer breiten Spanne von Stress-Anpassungen.^[96][102]

Abbildung 11:

MALDI-Massespektrum von ABC aus der Diplomarbeit S. Abel^[64]

(24)

'HU &5) LVW DXV $6 DXIJHEDXW XQG EHVWHKW ZLH DOOH *3&5V DXV HLQHP HLQ]LJHQ 6WUDQJ GHU VLHEHQ 0DO GLH =HOOPHPEUDQ GXUFKOlXIW^[98] $EELOGXQJ XQG VRPLW VLHEHQ 7UDQVPHPEUDQ 'RPlQHQDXIZHLVW^[102].[96][103][104] Daraus ergibt sich ein Aufbau aus vier LQWUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ GUHL /RRSV XQG GDV &WHUPLQDOH (QGH XQG YLHU H[WUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ (&' GDV 1WHUPLQDOH (QGH (&' XQGGLHGUHLH[WUD]HOOXOlUHQ/RRSV(&/

'LH H[WUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ UHSUlVHQWLHUHQ ZDKUVFKHLQOLFK GLH +DXSWELQGXQJVVWHOOH IU GLH SHSWLGLVFKHQ /LJDQGHQ ZDV GXUFK HLQH Vielzahl von experimentellen Befunden gesichert ist.[105]-[107] Die 3UREOHPH EHL GHU *HZLQQXQJ DXVUHLFKHQGHU 3URWHLQPHQJHQ ]XU

Abbildung 12:

GPCR-Zyklus

%LQGXQJ*3URWHLQV /LJDQG5H]HSWRU Komplex Ausbildung 5H]HSWRU$NWLYLHUXQJ

*3URWHLQ$NWLYLHUXQJ

*3URWHLQ'LVVR]LDWLRQ und Signaltransduktion

*3URWHLQ,QDNWLYLHUXQJ^[5]

Abbildung 13:

Schematische Darstellung des CRF1

(&'«H[WUD]HOOXOlUH 'RPlQH

(&/«H[WUD]HOOXOlUHU Loop

,&/«LQWUD]HOOXOlUHU/RRS 70«

7UDQVPHPEUDQ'RPlQH^[4]

(25)

VSHNWURVNRSLVFKHQ6WUXNWXUDQDO\VHYRQ*3&5VLPEHVRQGHUHQ0DHLP )DOOGHU.ODVVH%IKUWH]XU(QWZLFNOXQJHLQHV3URWHLQPRGHOOVIUGLH H[WUD]HOOXOlUHQ %LQGXQJVVWHOOHQ EDVLHUHQG DXI HLQHU .RPELQDWLRQ GHU H[WUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ (&' (&/ DXI HLQHP OLQHDUHQ 3HSWLG 7HPSODW^[65][66] (Abbildung 14). Besonders interessant war dabei der

%HIXQGGDVVHLQVROFKHV.RQVWUXNWHLQHQDQRPRODUH%LQGXQJVNRQVWDQWH für den natürlichen Liganden Urocortin-1 zeigt.^[65][66]

'DQRFKNHLQHH[SHULPHQWHOOHQ'DWHQIUGLH6WUXNWXUGLHVHU5H]HSWRU .ODVVH EHNDQQW VLQG VROOWH GLHVHV 7HPSODW NHLQH VWUXNWXUHOOHQ (LQVFKUlQNXQJHQ DXIZHLVHQ^[65][66] 'DKHU ZXUGH JURHU :HUW DXI GLH )OH[LELOLWlWGHUHLQ]HOQHQ'RPlQHQJHOHJWZDVHLQH6HOEVWRUJDQLVDWLRQ GXUFK VSH]L¿VFKH :HFKVHOZLUNXQJHQ XQWHUHLQDQGHU XQG LQ *HJHQZDUW GHV /LJDQGHQ HUP|JOLFKHQ VROOWH^[65][66] *UXQGEDXVWHLQH IU GDV OLQHDUH 7HPSODW GHV &5)0LPHWLNXPV ZHOFKHV QDFK GHP .RQ]HSW WHPSODW assoziierter Konstrukte^[108][109] DXIJHEDXW ZXUGH ZDUHQ *O\ /\V XQG

*OX $EELOGXQJ ^[65][66] =XGHP ZXUGH %LRWLQ ]XU )L[LHUXQJ IU DQVFKOLHHQGH%LQGXQJV$VVD\VHLQJHEDXW^[65][66]

Abbildung 14:

Schematische Darstellung des CRF1-Konstruktes

Abbildung 15:

Gerüst des linearen Templates vom CRF1-Mimetikum

0K[«

0DOHLPLGRKH[DQVlXUH

$K[«İ$PLQRKH[DQVlXUH

=«%HQ]\OR[\FDUERQ\O Schutzgruppe

Mhx Ahx Gly Glu Gly Lys Gly Glu Gly Lys Gly Glu Gly

Lys Gly Glu Gly Lys Biotin NH₂ Z Gly Gly Gly Gln

Dde

(26)

'DV 7HPSODW ZXUGH GXUFK 6WDQGDUG6336 V\QWKHWLVLHUW 'LH H[WUD]HOOXOlUHQ /RRSV ZXUGHQ

EHU GLH 7KLRO0DOHLPLG/LJDWLRQ DQ HLQHP 0DOHLPLGRKH[DQVlXUH 0K[5HVW GHU EHU HLQHQ DNWLYLHUWHQ (VWHU DQ GHQ /\V6HLWHQNHWWHQ HLQJHEUDFKW ZDU JHNRSSHOW %HL GHQ (&/ ZXUGH GHVVHQ 7RSRORJLH EHLEHKDOWHQ G K GDVV VLH LKUHU QDWUOLFKHQ $66HTXHQ] HQWVSUHFKHQ /HGLJOLFK LQWHUQH &\VWHLQH ZXUGHQ JHJHQ$OD E]Z 6HU DXVJHWDXVFKW^[65][66] ZDV IU GHQ QDWLYHQ 5H]HSWRUNHLQHQ(IIHNWDXIGHVVHQKRFKDI¿QH%LQGXQJ]XP3HSWLG/LJDQGHQKDW^[110]. Dies war Q|WLJGDGLH/RRSVQDFK$XIEDXLKUHU$66HTXHQ]EHU)PRF6336SHU1&/EHUHLQH*&*

Ligations-Stelle zyklisiert werden sollten.^[65][66]$XFKKLHUZXUGH]XU$NWLYLHUXQJGHV&7HUPLQXV GHU$FHWDPLGRWKLRSKHQRO(VWHUJHQXW]WVLHKHREHQ^[65][66]'LH]XU7KLRO0DOHLPLG/LJDWLRQGHU (&/RUWKRJRQDOH(LQIKUXQJGHV17HUPLQXVZXUGHGXUFKHLQH6RUWDVH$YHUPLWWHOWH/LJDWLRQ UHDOLVLHUWZRIUDP17HUPLQXVGDVIUGLH6RUWDVH$]ZLQJHQGQRWZHQGLJH(UNHQQXQJV0RWLY^[56]

LQGHU$6$EIROJH/3.7*HLQJHIKUWZXUGH^[65][66]'LH6\QWKHVHGHVODQJHQ17HUPLQXVZXUGH biosynthetisch durchgeführt.[65][66][107]

%LQGXQJV8QWHUVXFKXQJHQ PLWWHOV HLQHV 6FLQWLOODWLRQ3UR[LPLW\ $VVD\V 63$ KDEHQ JH]HLJW GDVV GDV &5).RQVWUXNW VRZRKO 8URFRUWLQ DOV DXFK 6DXYDJLQ ELQGHW^[65][66] Letzteres ist EHPHUNHQVZHUWGDGHU5H]HSWRU17HUPLQXVNHLQH%LQGXQJJHJHQEHU6DXYDJLQDXIZHLVW^[107](V NRQQWH]ZDUHLQHKRKH$I¿QLWlW]XP8URFRUWLQPLWHLQHPK_d § Q0EHVWLPPWZHUGHQ^[65][66]

MHGRFK LVW GLHVH VFKOHFKWHU DOV GLH GHV &5) LP *3URWHLQXQJHNRSSHOWHQ =XVWDQG +(.

=HOOHQK_d § Q0^[111] 7URW]GHP ERW GLHVHV 0LPHWLNXP HLQH JXWH *UXQGODJH IU ZHLWHUH Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkung einer strukturellen Stabilisierung des Konstruktes GXUFKHLQ]\NOLVFKHV7HPSODW:HJHQGHUKRKHQ$I¿QLWlWGHV3URWHLQ0RGHOOVIUGLHQDWUOLFKHQ 3HSWLG/LJDQGHQ ZlUH HV YRQ EHVRQGHUHP ,QWHUHVVH PLWWHOV VSHNWURVNRSLVFKHU 0HWKRGHQ ZLH 1056SHNWURVNRSLH RGHU 5|QWJHQEHXJXQJV$QDO\VH HLQHQ (LQEOLFN LQ GLH VWUXNWXUHOOHQ 9RUDXVVHW]XQJHQ GHU /LJDQG5H]HSWRU:HFKVHOZLUNXQJ ]X HUKDOWHQ XP LQ GHU )ROJH HLQ HUVWHV

%LQGXQJVPRGHOOIUGLHVH5H]HSWRU.ODVVH]XHQWZLFNHOQ

(27)

3. Z

IELSTELLUNG

0LW GHU (LQIKUXQJ GHU YHUVFKLHGHQHQ /LJDWLRQV0HWKRGHQ LQ GLH 3URWHLQ&KHPRV\QWKHVH LQVEHVRQGHUH GHU QDWLYHQ FKHPLVFKHQ /LJDWLRQ ZXUGHQ GLH *UHQ]HQ ]XU 'DUVWHOOXQJ NOHLQHU 3URWHLQH ZHVHQWOLFK HUZHLWHUW ZDV VLFK X D LQ GHU 'DUVWHOOXQJ YRQ 5LERQXNOHDVH$^[112] YRP ÄNRYDOHQWHQ'LPHU³GHV+,93URWHDVH(Q]\PHV^[50]RGHUGHU(LQWRSI6\QWKHVHGHV&UDPELQV^[49]

ZLGHUVSLHJHOW:HQLJLVWLQGHU/LWHUDWXUGDJHJHQEHUGLHJHJHQZlUWLJHQ*UHQ]HQGHU3URWHLQ 6\QWKHVH ]X ¿QGHQ 'LHVH *UHQ]HQ N|QQHQ HLQHUVHLWV ZLH LP )DOO GHU 3HSWLG6\QWKHVH DOV VRJHQDQQWH ÄVFKZLHULJH³ 3HSWLGH EHNDQQW GXUFK VWUXNWXUEHGLQJWH (LJHQVFKDIWHQ GHV DXI]XEDXHQGHQ0ROHNOVJHJHEHQVHLQLQGHPVFKRQ3DUWLDOVHTXHQ]HQGLH]XP$XIEDXYHUNQSIW ZHUGHQ VROOHQ VFKOHFKW RGHU QLFKW O|VOLFK VLQG $QGHUHUVHLWV NDQQ VLFK GLH 6FKZLHULJNHLW GHU 3URWHLQ6\QWKHVH DEHU DXFK DXV HLQHU QLFKW OLQHDUHQ 7RSRORJLH HLQHV 0RGHOO3URWHLQV HUJHEHQ ZHOFKH GLH .RPELQDWLRQ HLQHU 5HLKH RUWKRJRQDOHU /LJDWLRQV9HUIDKUHQ XQG VHPLV\QWKHWLVFKHU 0HWKRGHQ]XU3URWHLQ+HUVWHOOXQJHUIRUGHUW

'LH ELVKHULJHQ (UIDKUXQJHQ GLH ZLU EHL GHU &KHPRV\QWKHVH GHVȕ₂-Mikroglobulin machen mussten^[63][64] KDEHQ XQV GHXWOLFK JHPDFKW GDVV GLHVHV VWDUN ]XU $JJUHJDWLRQ XQG )LEULOOHQ Bildung neigende Protein^[67] HLQ VHKU JXWHV %HLVSLHO IU HLQ ÄVFKZHU V\QWKHWLVLHUEDUHV³ 3URWHLQ LVWXQGZLUKLHUGLH0|JOLFKNHLWHQXQG*UHQ]HQGHUJHJHQZlUWLJHQ3URWHLQ6\QWKHVH0HWKRGLN GHPRQVWULHUHQN|QQHQ'LH:DKOGLHVHV3URWHLQVLVWGDUEHUKLQDXVDXFKGDGXUFKVLQQYROOZHLO wir rekombinant synthetisiertes Protein für einen direkten Strukturvergleich zur Verfügung KDWWHQ)HUQHUVROOWHXQVHLQHHUIROJUHLFKH&KHPRV\QWKHVHSRVLWLRQVVSH]L¿VFKLVRWRSHQPDUNLHUWHU ȕ₂0'HULYDWHLQGLH/DJHYHUVHW]HQ,5VSHNWURVNRSLVFKH8QWHUVXFKXQJHQ]XP)DOWXQJVDEODXI dieses für die Amyloidose verantwortlichen Proteins^[69]DEVFKOLHHQ]XN|QQHQZHOFKHEHUHLWVPLW unmarkiertem Protein durchgeführt wurden^[78].

)U HLQ ]ZHLWHV 3UREOHP GHU 6HPL6\QWKHVH GHU 6\QWKHVH HLQHV 3URWHLQV PLW QLFKWOLQHDUHU 7RSRORJLH GHV 5FNJUDWHV LVW GLH 6\QWKHVH HLQHV HUVWHQ 3URWHLQ0RGHOOV IU GLH H[WUD]HOOXOlUH

%LQGXQJV'RPlQHGHV&5)5H]HSWRUVHLQLQWHUHVVDQWHV%HLVSLHO)UGHVVHQ'DUVWHOOXQJZXUGH GLH NRPELQLHUWH UHNRPELQDQWH HQ]\PDWLVFKH XQG FKHPLVFKH 6\QWKHVH6WUDWHJLH LQ XQVHUHP Labor entwickelt^[65][66] 'LHVH 3URWHLQ6\QWKHVH6WUDWHJLH VROOWH LP 5DKPHQ GHU YRUOLHJHQGHQ

$UEHLWHUZHLWHUWZHUGHQLQGHPGLHH[WUD]HOOXOlUHQ'RPlQHQ(&/PLWWHOVH[SUHVVHG3URWHLQ /LJDWLRQDQ6WHOOHGHU6336GDUJHVWHOOWZHUGHQ+LQWHUJUXQGIUGLHVHQPHWKRGLVFKHQ$QVDW]ZDU HVHLQ9HUIDKUHQ]XHQWZLFNHOQGDVXQVLQGLH/DJHYHUVHW]WGLHH[WUD]HOOXOlUHQ'RPlQHQLQ¹³&

und ¹⁵1PDUNLHUWHU)RUP]XHUKDOWHQXPPLWWHOV105JHVWW]WHU6WUXNWXUDQDO\VHHLQHQ(LQEOLFN LQ /LJDQG5H]HSWRU:HFKVHOZLUNXQJHQ ]X HUKDOWHQ XQG GDUDXV HLQ HUVWHV %LQGXQJVPRGHOO IU GLHVH5H]HSWRU.ODVVH]XHQWZLFNHOQ'LHVVHW]WGLH(QWZLFNOXQJHLQHVHI¿]LHQWHQ(3/3URWRNROOV IU GLH ([SUHVVLRQ ]\NOLVFKHU 3HSWLGH YRUDXV 3DUDOOHO ]X GLHVHQ PHWKRGLVFKHQ$UEHLWHQ VROOWH

(28)

JHNOlUWZHUGHQREVLFKDXVHLQHU9HUULQJHUXQJGHUVWUXNWXUHOOHQ)OH[LELOLWlWGHV3HSWLG7HPSODWHV HWZDGXUFKHLQH=\NOLVLHUXQJYHUlQGHUWH%LQGXQJV(LJHQVFKDIWHQIUGDV5H]HSWRU.RQVWUXNW HUJHEHQGLHIUZHLWHUIKUHQGHVWUXNWXUDQDO\WLVFKH8QWHUVXFKXQJHQUHOHYDQWVHLQN|QQWHQ

(29)

4. E

^RGEBNISSE

& D

^ISKUSSION

'LH KLHU EHVFKULHEHQHQ$UEHLWHQ YHUIROJWHQ JUXQGVlW]OLFK ]ZHL =LHOH (LQHUVHLWV VROOWH YHUVXFKW ZHUGHQGLH]XYRUEHREDFKWHWHQ6FKZLHULJNHLWHQEHLGHU&KHPRV\QWKHVHGHV¿EULOOHQELOGHQGHQ Proteins ȕ₂-Mikroglobulin zu beseitigen (Promotion B. Briand^[63] 'LSORPDUEHLW 6 $EHO^[64]

ZREHLHVLP:HVHQWOLFKHQGDUXPJLQJGLH4XDOLWlWGHVV\QWKHWLVFKHQ3URWHLQV]XYHUEHVVHUQ$OV 4XDOLWlWVVWDQGDUGJDOWGDIUGDVUHNRPELQDQWH[SULPLHUWH3URWHLQXQGGHVVHQ6WUXNWXU9HUEXQGHQ PLWGHUhEHUZLQGXQJGHU6\QWKHVHVFKZLHULJNHLWHQZDUHLQHRUWVVSH]L¿VFKH,VRWRSHQPDUNLHUXQJ von ȕ₂0IU,5VSHNWURVNRSLVFKH8QWHUVXFKXQJHQ]XU3URWHLQIDOWXQJGDV=LHO

$QGHUHUVHLWV VROOWH IU HLQ 0RGHOO3URWHLQ GDV HLQ YHU]ZHLJWHV 3URWHLQUFNJUDW EHVLW]W XQG VRPLWQLFKWGLUHNWEHUHLQH([SUHVVLRQLQLVRWRSHQPDUNLHUWHU)RUPIU105VSHNWURVNRSLVFKH 8QWHUVXFKXQJHQ]XJlQJOLFKLVWYHUVXFKWZHUGHQGLH([SUHVVLRQHLQHU3DUWLDOVHTXHQ]]\NOLVFKHQ Peptids) als methodische Variante zur partiellen Markierung des Modell-Proteins in die Synthese- 6WUDWHJLH HLQ]XEDXHQ 'DEHL VROOWH DXFK JHNOlUW ZHUGHQ RE HLQ ]\NOLVFKHV 3HSWLG7HPSODW JHJHQEHUHLQHPOLQHDUHQ]XU$QNRSSOXQJGHUH[WUD]HOOXOlUHQ/LJDQG%LQGXQJV'RPlQHQHLQHV

*3URWHLQJHNRSSHOWHQ5H]HSWRUVGLH%LQGXQJGHUQDWUOLFKHQ3HSWLG/LJDQGHQQRFKYHUEHVVHUQ kann.

4.1. Chemosynthese des ȕ

₂

-Mikroglobulins

Auf der Basis der optimierten Bedingungen zur automatisierten Fmoc-SPPS der drei Segmente des ȕ₂-M (Diplomarbeit S. Abel^[64]ZXUGHQGXUFK5HLQLJXQJPLWWHOV53+3/&FKURPDWRJUD¿VFK einheitliche Peptide von A-SRB*-SR und C reproduzierbar erhalten (Abbildung 16). In analoger Weise wurden die isotopenmarkierten Segmente ¹³&7\U₆₆ B*-SR und ¹³&7\U₇₈ B*-SR ebenfalls LQ PHKUHUHQ &KDUJHQ LQ KRKHU 5HLQKHLW GDUJHVWHOOW XQG LKUH ,GHQWLWlW PDVVHQVSHNWURPHWULVFK QDFKJHZLHVHQVLHKH([SHULPHQWHOOHU7HLO

(30)

Für die Synthese des ȕ₂-Mikroglobulins wurde ein Konzept der VFKULWWZHLVHQ 9HUNQSIXQJ SHU 1&/ LQ /|VXQJ YHUIROJW ZHOFKHV HLQH 5HLQLJXQJ GHU LQWHUPHGLlUHQ 3URGXNWH EHLQKDOWHW (LQH DQGHUH 0|JOLFKNHLW KlWWH HLQH (LQWRSI6\QWKHVH ZLH VLH ]XP %HLVSLHO IU GLH

&UDPELQ6\QWKHVH^[49] EHVFKULHEHQ ZXUGH VHLQ N|QQHQ 6ROFKH (LQWRSI 6\QWKHVHQ KDEHQ MHGRFK GHQ 1DFKWHLO GDVV VLH PHLVW XQWHU JHULQJHUHQ Peptid-Konzentrationen (2 mg/ml^[49] DXVJHIKUW ZHUGHQ ZDV ]X OlQJHUHQ 5HDNWLRQV]HLWHQ IKUW =XGHP VLQG KLHU GLH$XVEHXWHQ PHLVW JHULQJHUDOVEHLVFKULWWZHLVHU/LJDWLRQ(LQHDQGHUH0|JOLFKNHLWKlWWHLQ GHU 63&/ EHVWDQGHQ ZHOFKH DOOHUGLQJV HLQ JU|HUHV 5HSHUWRLUH DQ ]X EHDFKWHQGHQ XQG GDPLW ]X RSWLPLHUHQGHQ 3DUDPHWHUQ EHGHXWHW KlWWH 'D]X ZlUHQ 8QWHUVXFKXQJHQ KLQVLFKWOLFK HLQHV JHHLJQHWHQ +DU]HV /LQNHUV XQG JHHLJQHWHU 6FKXW]JUXSSHQ QRWZHQGLJ JHZHVHQ ZREHL GHU Mehraufwand unter Berücksichtigung der meist geringeren Ausbeute im 9HUJOHLFK ]XU 1&/ LQ /|VXQJ QLFKW JHUHFKWIHUWLJW ZlUH =XGHP NDQQ EDVLHUHQG DXI GHP (LQVDW] HLQHV 3KHQ\O7KLRHVWHUV DXI GHQ =XVDW]

HQWVSUHFKHQGHU7KLRSKHQROHZlKUHQGGHU1&/YHU]LFKWHWZHUGHQ'LHVH ZHUGHQ KlX¿J GHU /LJDWLRQV/|VXQJ ]XJHVHW]W ZHQQ ZHQLJHU UHDNWLYH

a) d)

A-SR A-SR

b) e)

B*-SR B*-SR

c) f)

C C

Abbildung 16:

Exemplarische Analysen der reinen Segmente vom ȕ₂-M

DE FVLQGGLH53 +3/&&KURPDWRJUDPPH 89'HWHNWLRQ QP GH IVLQGGLH(6, 7R)066SHNWUHQm/z) von A-SRB*-SR & C

(31)

$ON\O3HSWLG7KLRHVWHU ]XP (LQVDW] NRPPHQ XP LQWHUPHGLlU GXUFK 7KLRO$XVWDXVFKHLQHQUHDNWLYHUHQ3HSWLG7KLRHVWHU]XJHQHULHUHQ^[113]

'LH HLQ]HOQHQ 3HSWLG6HJPHQWH ZXUGHQ DOVR VFKULWWZHLVH SHU 1&/ LQ /|VXQJ RKQH 7KLRO=XVlW]H YHUNQSIW 'LH 5HLQLJXQJ GHU /LJDWLRQV 3URGXNWH VROOWH XUVSUQJOLFK PLWWHOV *HO¿OWUDWLRQ VWDWW¿QGHQ 'LHVHV 9RUJHKHQ ZXUGH VFKOLHOLFKDXIJHJHEHQ GD VLFK GLH *HO¿OWUDWLRQ]ZDU QDFK GHU HUVWHQ 1&/ DOV$XIDUEHLWXQJ HLJQHW IU GLH ]ZHLWH /LJDWLRQ MHGRFKHLQHVHKUXQJHQJHQGH3URGXNWTXDOLWlWHUUHLFKWZXUGH^[63][64]

4.1.1. Die erste NCL zur Verknüpfung vom Segment B*-SR und Segment C

Die Bildung von B*C durch native chemische Ligation von B*-SR an CIDQGLQHLQHPZlVVULJHQ3XIIHUPLW 0*XDQLGLQ+\GURFKORULG

*Q+&ODOV'HQDWXULHUXQJVPLWWHOEHLS+XQGHLQHU*HVDPW3HSWLG Konzentration von 13 mg/ml statt.

'LHVH /LJDWLRQ YHUOLHI LQ PHKUHUHQ $QVlW]HQ ODXW 53+3/& XQG PDVVHQVSHNWURPHWULHJHNRSSHOWHU )OVVLJNHLWVFKURPDWRJUDILH /&

06 QDKH]X YROOVWlQGLJ XQG RKQH HLQH VLJQLILNDQWH %LOGXQJ YRQ 1HEHQSURGXNWHQ'LHDQVFKOLHHQGH*HOILOWUDWLRQIKUWHLP'XUFKVFKQLWW LQ LJHU PD[LPDO $XVEHXWH ]XP JHZQVFKWHQ 3URGXNW ZREHLQLFKWJHNOlUWZHUGHQNRQQWHZDUXPGLHLQHLQHPHUVWHQ9HUVXFK HU]LHOWH$XVEHXWH YRQ ^[64] nicht mehr reproduziert wurde. Da die SUlSDUDWLYH53+3/&EHVVHUH$XVEHXWHQOLHIHUWHZXUGHGLH5HLQLJXQJ PLWWHOV*HOILOWUDWLRQLQGHU6\QWKHVH6WUDWHJLHIUGDVȕ₂-Mikroglobulin HUVHW]W (V NRQQWH JHPl GHU DQDO\WLVFKHQ 9HUIDKUHQ 53+3/& XQG /&06 HLQ HLQKHLWOLFKHV /LJDWLRQV3URGXNWB*C mit Ausbeuten von ELV]X HUKDOWHQZHUGHQ$EELOGXQJ 8PHLQH'LPHULVLHUXQJ GXUFK'LVXOILG%LOGXQJDP1WHUPLQDOHQ&\VWHLQYRQB]XYHUPHLGHQ ZXUGH GDV ]XU /LJDWLRQ HLQJHVHW]WH 7KLRD]ROLGLQ DXFK ZlKUHQG GHU 5HLQLJXQJEHLEHKDOWHQ

a) b)

Abbildung 17:

Exemplarische Analyse vom reinen B*C-Segment nach der 1. NCL für die ȕ₂-M-Synthese

D53+3/&

&KURPDWRJUDPP

89'HWHNWLRQ QP E(6,7R)066SHNWUXP (m/z)

(32)

(V NRQQWH JH]HLJW ZHUGHQ GDVV GLH 6\QWKHVH YRQB*C HI¿]LHQW XQG UHSURGX]LHUEDULQH[]HOOHQWHU5HLQKHLWHUIROJWH

4.1.2. Die zweite NCL zur Darstellung von linearem ȕ₂-M (ABC)

=XU %LOGXQJ YRQ OLQHDUHPABC aus A-SR und B*C PXVVWH ]XQlFKVW GDV 1WHUPLQDOH &\VWHLQ YRQB*C entschützt werden (B*C ĺBC GDPLWHVDQVFKOLHHQGPLWA-SR die Ligation eingehen kann. Das verlief ZLHGHUKROW JODWW LQGHP PDQB*C LQ HLQHU /|VXQJ YRQ 0 *Q+&O 00H21+₂EHLHLQHPS+:HUWYRQ3HSWLG.RQ] PJPO IUYLHU6WXQGHQEHL &UKUWZREHLNHLQHDQVFKOLHHQGH5HLQLJXQJ notwendig war.

,P*HJHQVDW]]XUHUVWHQ/LJDWLRQYHUOLHIGLH]ZHLWH1&/XQWHU6WDQGDUG

%HGLQJXQJHQ PLW JUDYLHUHQGHQ 6FKZLHULJNHLWHQ GHQQ GLHVH 5HDNWLRQ IDQGXQWHUHLQHPHQRUPHQ9HUOXVWDQ7KLRHVWHUA-SR mit sehr schlechter /LJDWLRQV(I¿]LHQ] VWDWW 1DFK ]ZHL 6WXQGHQ /LJDWLRQ LVW QHEHQ GHQ (GXNWHQA-SR und BC das gewünschte Produkt ABC nachweisbar. Für GDV (UJHEQLV GHU 1HEHQSURGXNW%LOGXQJ GLHVHV /LJDWLRQV6FKULWWHV LVW HLQUHSUlVHQWDWLYHV%HLVSLHOZLHHVIUPHKUHUH/LJDWLRQV$QVlW]HXQWHU DQDORJHQ %HGLQJXQJHQ HUKDOWHQ ZXUGH LQ $EELOGXQJ GDUJHVWHOOW 'DV 53+3/&&KURPDWRJUDPP YHUGHXWOLFKWGDVVHLQH5HLKHYRQ 1HEHQSURGXNWHQ HQWVWHKW GLH LQ der Folge massenspektrometrisch LGHQWL¿]LHUW ZHUGHQ NRQQWHQ (V handelte sich dabei um einen ÄLQWHUQHQ³ 7KLRHVWHU ABC$

welcher durch Acylierung GHV LQWHUQHQ &\VWHLQV &\V₈₀) mit A-SR am Ligations-Produkt ABC HQWVWDQG =XGHP ZXUGH GLH 6lXUHA2+ GHV HLQJHVHW]WHQ 7KLRHVWHUV A-SR LGHQWL¿]LHUW hEHUUDVFKHQGHUZHLVH ZXUGH ]XVlW]OLFK QRFK GDV (QWVWHKHQHLQHVZHLWHUHQ1HEHQSURGXNWHVEHREDFKWHW'LHVHVZLHVHLQH 0DVVHGLIIHUHQ]YRQ 'DLQ%H]XJDXIGLH6lXUHIRUPGHV6HJPHQWHV ADXIA(-18).

Abbildung 18:

Nebenreaktionen während der 2. NCL zur Bildung von ABC

53+3/&

&KURPDWRJUDPP (UV-Detektion: 220 nm) ZDVGLH1HEHQSURGXNW

%LOGXQJGHU1&/

nach zwei Stunden 5HDNWLRQV]HLW]HLJW

(33)

:lKUHQG GHU $XIDUEHLWXQJ GHU /LJDWLRQV/|VXQJ ZXUGHQ XQHUZDUWHW ]ZHLPDVVHQVSHNWURPHWULVFKLGHQWLVFKHDEHUPLWWHOV53+3/&WUHQQEDUH 3URGXNWH PLW GHU IU GDV =LHOSURWHLQABC charakteristischen Masse LGHQWL¿]LHUW$EELOGXQJ 'LH*HO¿OWUDWLRQHUZLHVVLFKQLFKWQXUIU GLH 7UHQQXQJ GLHVHU EHLGHQ

3URGXNWH VRQGHUQ DXFK IU GLH Abtrennung der anderen 1HEHQSURGXNWH DOV ZHVHQWOLFK LQHI¿]LHQWHU DOV GLH 53+3/&

XQGVWHOOWVRPLWLP*HJHQVDW]]X früheren Befunden (Diplomarbeit S. Abel^[64]) keine Alternative dar.

4.1.3. Charakterisierung der zwei Ligations- Produkte ABC

'DV (QWVWHKHQ ]ZHLHU PDVVHQVSHNWURPHWULVFK VFKHLQEDU LGHQWLVFKHU ABC/LJDWLRQV3URGXNWH EHL GHU 1&/ YRQA-SR und BC warf die )UDJH DXI RE EHLGH 3URGXNWH EHGLQJW GXUFK GLH /LPLWLHUXQJHQ GHU verwendeten massenspektrometrischen Methode nicht unterscheidbar ZDUHQRGHUREHVVLFKXPLVRPHUH3URWHLQHKDQGHOQN|QQWH(VN|QQWH VLFKDXVHLQHUFKHPLVFKHQ0RGL¿]LHUXQJZLHHWZDGXUFKHLQH2[LGDWLRQ GHV &WHUPLQDOHQ 0HWKLRQLQV^[114] RGHU HLQH 'LVXO¿G%LOGXQJ EHU GLH

&\VWHLQ6HLWHQNHWWHQ HLQH JHULQJH 0DVVHGLIIHUHQ] HUJHEHQ GLH PLWWHOV 0$/',06 IU JURH 0ROHNOH LQQHUKDOE GHV )HKOHUV GHU 0HWKRGH liegt.

4.1.3.1. Absicherung der Primär-Struktur

8PDE]XNOlUHQREGHU'RSSHOSHDNLQGHU53+3/&QDFKGHU1&/VLHKH

$EELOGXQJ PLW HLQHU 2[LGDWLRQ DP 0HWKLRQLQ 0DVVHGLIIHUHQ]

'D ]X EHJUQGHQ LVW ZXUGH GDV *HPLVFK EHLGHUABC-Produkte PLWWHOV 7ULPHWK\OVLO\OEURPLG XQG (WKDQGLWKLRO ]XU 5HGXNWLRQ HLQHV potentiellen Sulfoxides behandelt^[114]'DGLHVNHLQHPHVVEDUH9HUlQGHUXQJ GHV 'RSSHOSHDNV EHL GHU $QDO\VH PLWWHOV 53+3/& KHUYRUULHI QLFKW JH]HLJW KDQGHOWH HV VLFK EHL NHLQHP GHU EHLGHQ /LJDWLRQV3URGXNWH XPHLQ2[LGDWLRQV3URGXNWDP0HWKLRQLQ=XUZHLWHUHQ8QWHUVXFKXQJ wurden die beiden ABC-Produkte ABC_1 (früher eluierendes ABC- Produkt) und ABCB VSlWHU HOXLHUHQGHV ABC-Produkt) mittels

Abbildung 19:

ABC-Produkt-Gemisch nach der 2. NCL

53+3/&

&KURPDWRJUDPP (UV-Detektion: 220 nm)

(34)

SUlSDUDWLYHU 53+3/& LVROLHUW 'LH YHUZHQGHWH 0$/',060HWKRGH im Linear Middle Mass Mode für den Bereich von Molekular-Massen zwischen 2 000 und 30 000 Da weist einen Messfehler von bis zu

DXI 'LHV VSLHJHOW VLFK DXFK LQ GHQ 0$/',0DVVHVSHNWUHQ von ABC_1 und ABC_2 wider (Abbildung 20a). Ausgehend von einer durchschnittlichen theoretischen Masse von 11 731 Da für das lineare ȕ₂-Mikroglobulin ist die Abweichung in den per MALDI-MS gemessenen Massen für ABC_1 mit 4 Da und die für ABC_2 mit 'D]ZDUJHULQJHUDOVGHUDQJHJHEHQH7ROHUDQ]EHUHLFKDEHULPPHU QRFK QLFKW DXVVDJHNUlIWLJ JHQXJ %HVVHU LVW KLHU GLH 0HVVPHWKRGH GHU HOHNWURQVSUD\LRQL]DWLRQWLPHRIÀLJKW06(6,7R)06ZHOFKHHLQH

$XÀ|VXQJ YRQ SSP KDW +LHU LVW DXVJHKHQG YRP >0+@¹⁰⁺- Peak eine Masse von 11 730 Da für ABC_1 (rot) und ebenfalls von 11 730 Da für ABC_2 (schwarz) bestimmt worden (Abbildung 20b).

=XGHP LVW GLH 7DWVDFKH GDVV GLH (6,7R)0DVVHVSHNWUHQ QDKH]X

EHUHLQVWLPPHQ HLQH %HVWlWLJXQJ GDIU GDVV NHLQHV GHU EHLGHQ 3URGXNWHHLQR[LGLHUWHV0HWKLRQLQEHVLW]W'XUFKGDV(UJHEQLVGHU(6, 7R)06 NDQQ IU HLQH 'LIIHUHQ]LHUXQJ ]ZLVFKHQABC_1 und ABC_2 ]ZDU HLQH FKHPLVFKH 0RGL¿NDWLRQ DXVJHVFKORVVHQ ZHUGHQ GLH HLQH 0DVVHGLIIHUHQ]YRQPHKUDOV 'DEHZLUNHQZUGHMHGRFKNRQQWHDXI

*UXQG GHU$XÀ|VXQJ GHV YHUZHQGHWHQ (6,7R)06*HUlWHV ]ZLVFKHQ IUHLHQ 7KLROHQ XQG HLQHU LQWHUQHQ 'LVXO¿G%UFNH QLFKW XQWHUVFKLHGHQ ZHUGHQ8PGLHV]XSUIHQZXUGHQGDVUHNRPELQDQWHȕ₂-Mikroglobulin XQGGHVVHQ5HGXNWLRQVSURGXNWYHUPHVVHQ(LQ9HUJOHLFKGHV6SHNWUXPV des reduzierten rekombinanten ȕ₂-M (rot) mit dem des rekombinanten ȕ₂-M (schwarz) zeigt ein nahezu übereinstimmendes Peak-Muster

$EELOGXQJ F ZHVKDOE HLQH 'LIIHUHQ]LHUXQJ ]ZLVFKHQ GHQ EHLGHQ )RUPHQ 'LVXO¿G%UFNH YRUKDQGHQ RGHU IUHLH &\VWHLQH YRUKDQGHQ XQP|JOLFKLVW

Abbildung 20:

Masse-Spektren der ABC-Produkte und des rekombinanten ȕ₂-Mikroglobulin

a) MALDI-Massespektren vom ABC_1 (links)

& ABC_2 (rechts) (Messungen im Linear Middle Mass Mode)

$XIGHUIROJHQGHQ6HLWH«

a) ABC_1 ABC_2