Synthese-Strategie - Ligations-Methoden

2. S TAND DER F ORSCHUNG

2.1. Ligations-Methoden

2.2.1. Synthese-Strategie

Die Synthese des ȕ₂-Mikroglobulins wurde in zwei vorhergehenden Arbeiten (Dissertation B. Briand^[63] & Diplomarbeit S. Abel^[64]) mit folgender Synthese-Strategie bereits angegangen.

Bei den zu synthetisierenden ȕ₂0'HULYDWHQ VROO MHZHLOV HLQ 7\URVLQ GHVVHQ 6HLWHQNHWWH LQ GDV ,QQHUH GHV 3URWHLQV ]HLJW DQ GHU &3RVLWLRQ GHV 3KHQRO5LQJHV¹³&PDUNLHUW ZHUGHQ XP GXUFK 9HUlQGHUXQJHQ GHU >¹³&@7\U%DQGH ZlKUHQG ,5VSHNWURVNRSLVFKHU 8QWHUVXFKXQJHQ 5FNVFKOVVHDXIGLH8PJHEXQJGLHVHU7\URVLQH]LHKHQ]XN|QQHQ^[76]-[78]. Das ȕ₂-Mikroglobulin EHVLW]WLQVJHVDPWVHFKV7\URVLQH^[67][68]ZREHLOHGLJOLFKGLH6HLWHQNHWWHQGHU7\URVLQHDQ3RVLWLRQ 66 und 78 in die Struktur hinein weisen^[67][68]VLHKH$EELOGXQJ XQGVRPLWYRQ5HOHYDQ]IU faltungskinetische Untersuchungen sind.

'LH7DWVDFKHGDVVGDVȕ₂0DQGHQ3RVLWLRQHQXQG&\VWHLQHDXIZHLVW^[67]OHJWHLQH6\QWKHVH 6WUDWHJLH QDKH GLH DXI GHU QDWLYHQ FKHPLVFKHQ /LJDWLRQ DXIEDXW $EELOGXQJ 0LW GHP .RQ]HSWGHU1&/HUJHEHQVLFKIUGDVȕ₂0LNURJOREXOLQUHWURV\QWKHWLVFKGUHL3HSWLG6HJPHQWH ZHOFKHPLWWHOVDXWRPDWLVLHUWHU6336V\QWKHWLVLHUWZHUGHQN|QQHQ^[63][64]

'LHVH 6HJPHQW DXV GHQ VLFK GDV ȕ₂0 ]XVDPPHQVHW]W VLQG GDV 1WHUPLQDOH 3HSWLGA (Seg_1-24 GDV PLWWOHUH 6HJPHQWB (Seg_25-79) und GDV &WHUPLQDOH 6HJPHQWC (Seg_80-99 )U GLH /LJDWLRQHQ SHU 1&/

ZHOFKH EOLFKHUZHLVH LQ &ĺ15LFKWXQJ YROO]RJHQ ZHUGHQ PXVV GDV 1WHUPLQDOH&\VWHLQGHVPLWWOHUHQ6HJPHQWHVB geschützt werden (B*).

+LHUZXUGHGDV7KLRD]ROLGLQDXVJHZlKOWHLQDOV3VHXGRSUROLQJHVFKW]WHV

&\VWHLQ^[48]=XU$NWLYLHUXQJGHU&7HUPLQLGHV1WHUPLQDOHQ6HJPHQWHV A und des mittleren Segmentes B* wurde der literaturbekannte

para-$FHWDPLGRSKHQ\O7KLRHVWHU JHELOGHW A-SR B*-SR).[44][79]-[85] Da im 5DKPHQ HUVWHU$UEHLWHQ 3URPRWLRQ % %ULDQG GLH$XVEHXWHQ IU GLH EHLGHQ 1&/V QXU MHZHLOV EHWUXJHQ^[63] VROOWH GDUDXI DXIEDXHQG GLH(LQVHW]EDUNHLWGHU*HO¿OWUDWLRQIUHLQHYHUOXVWlUPHUH$XIUHLQLJXQJ DQVWDWW GHU EOLFK YHUZHQGHWHQ 53+3/& XQWHUVXFKW ZHUGHQ (Diplomarbeit S. Abel^[64]).

2.2.2. Vorarbeiten zur Darstellung vom ȕ₂-M

,P5DKPHQYRUDQJHJDQJHQHU$UEHLWHQLQXQVHUHP/DERU'LVVHUWDWLRQ B. Briand^[63]) wurde 1.2 mg gefaltetes synthetisches ȕ₂-Mikroglobulin GDUJHVWHOOW ZDV IU GLH JHSODQWHQ VSHNWURVNRSLVFKHQ 8QWHUVXFKXQJHQ nicht ausreichend war. Dies war den geringen Ausbeuten der beiden /LJDWLRQHQ JHVFKXOGHW ZHOFKH QDFK 5HLQLJXQJ MHZHLOV QXU Ausbeute hervorbrachten.^[63] Dieses synthetische ȕ₂0EHVDGLHIUGDV natürliche ȕ₂0LNURJOREXOLQ FKDUDNWHULVWLVFKHQ ,5VSHNWURVNRSLVFKHQ Banden für die antiparallele ȕ)DOWEODWW6WUXNWXUVFKZDFKH§ FP^-1 VWDUNH§ FP^-1XQGHLQH%DQGHZHOFKHYHUPXWOLFKDXIHLQHWXUQ DUWLJH6WUXNWXU]XUFN]XIKUHQLVWVFKZDFKH§ FP^-1).^[78]$XIIlOOLJ ZDU GDVV GDV V\QWKHWLVFKH ȕ₂-M Unterschiede zum rekombinanten (rek.) ȕ₂0 LQ GHU ,5VSHNWURVNRSLVFKHQ &KDUDNWHULVLHUXQJ ]HLJWH (Abbildung 9)^[63] 'DUDXV PXVV JHVFKORVVHQ ZHUGHQ GDVV GDV

A-SR B*-SR C

1. NCL Entschützung (B*C → BC), 2. NCLB*C

ABC

SR Seg_81-99

O H₂N

Abbildung 8:

Synthese-Strategie für das ȕ₂-Mikroglobulin

SPPS der Peptid-Segmente (A-SRB*-SRC Schrittweise Kupplung der einzelnen Segmente per 1&/

DQVFKOLHHQGH$XVELOGXQJ GHU'LVXO¿G%UFNHXQG Proteinfaltung

synthetische Protein nicht ausreichend sauber war. Dies zeichnete sich in den Spektren der matrix-unterstützten Laser-Desorption/Ionisation JHNRSSHOW PLW HLQHU WLPH RI ÀLJKWWLPH RI ÀLJKW06 0$/',06 DE (Abbildung 10)^[63] +LHU ZDUHQ QHEHQ GHP ]XP ȕ₂-Mikroglobulin JHK|ULJHQJHNHQQ]HLFKQHWHQ0DVVH3HDNm/zYRQ 'D>0+@⁺ GLH GD]XJHK|ULJHQ ]ZHLIDFK § 'D XQG HYHQWXHOO GUHLIDFK

§ 'D XQG YLHUIDFK § 'D JHODGHQHQ 3HDNV ]X VHKHQ 2EZRKO OHW]WHUH VWDUNH $EZHLFKXQJHQ EH]JOLFK LKUHU WKHRUHWLVFKHQ 0DVVHDXI]HLJWHQ=XVlW]OLFKZLHVGDV0DVVH6SHNWUXPGHVFKHPLVFKHQ 6\QWKHVH3URGXNWHV HLQ ZHLWHUHV 6LJQDO 0DVVH3HDN m/z) von ca.

'D DXI GDV DXI HLQH HQWVSUHFKHQGH 9HUXQUHLQLJXQJ GHU 3UREH hindeutete.

Abbildung 9:

FTIR-Spektren vom V\QWKHWLVFKHQȕ₂-M von B.

Briand (rot) & vom rek.

ȕ₂-M (schwarz)

Abbildung 10:

MALDI-Massespektrum YRPV\QWKHWLVFKHQȕ₂-M aus der Dissertation B. Briand^[3]

:HJHQ GHU JHULQJHQ 3URWHLQ$XVEHXWH XQG XQ]XUHLFKHQG DQDORJHQ ,5VSHNWURVNRSLVFKHQ (LJHQVFKDIWHQ ]XP UHNRPELQDQWHQȕ₂-M (Promotion B. Briand^[63] ZXUGH GLH DXWRPDWLVLHUWH SPPS der einzelnen Peptid-Segmente optimiert (Diplomarbeit S. Abel^[64]). Des Weiteren wurden GDEHLGLHFKHPLVFKHQ/LJDWLRQHQKLQVLFKWOLFKLKUHU$XVEHXWHQYHUEHVVHUWXQGGLH*HO¿OWUDWLRQDOV

$OWHUQDWLYH]XUEOLFKHQ53+3/&5HLQLJXQJGHU3URGXNWHXQWHUVXFKW

'LH 2SWLPLHUXQJ GHU )PRF6336 GHU 3HSWLG6HJPHQWH IKUWH GD]X GDVV GLH 6\QWKHVH GHU Segmente A-SR und B*-SR unter Verwendung von Pseudoprolin-Dipeptiden[48][86][87] durchgeführt ZXUGH RKQH GLH EHL EHLGHQ 6\QWKHVHQ HLQ KRKHU$QWHLO DQ$EEUXFKVHTXHQ]HQ DXIWUDW ZDV IU B*-SRPLWHLQHU/lQJHYRQ$PLQRVlXUHQ]XHUZDUWHQLVW)UGLH6\QWKHVHGHU$VSKDOWLJHQ Peptid-Segmente B*-SR und C wurden zur Inhibition der Aspartimid- und Piperidid-Bildung^[88][89]

GDV7HQWD*HO6&KORUWULW\OFKORULG+DU]&O7UW&O+DU]^[90]GLHtert-Butyl (tBu)-Schutzgruppe für Asp^[91] XQG HLQ =XVDW] YRQ +&22+ )$ LQ GHU LJHQ 3LSHULGLQ$EVSDOW /|VXQJ YHUZHQGHW^[92]. Im Fall des Segmentes B*-SR ZXUGH GLH ]HLW XQG VHTXHQ]DEKlQJLJH 7ULÀXRUDFHW\OLHUXQJ^[93] QDFK GHU 7ULÀXRUHVVLJVlXUH 7)$YHUPLWWHOWHQ $EVSDOWXQJ GXUFK DQVFKOLHHQGH%HKDQGOXQJLPZlVVULJHQ0LOLHXUFNJlQJLJJHPDFKW'LH6WHUW%XW\OVXOIRQLXP Bildung am Methionin des Segmentes CZlKUHQGGHUVDXUHQ6FKXW]JUXSSHQ$EVSDOWXQJZXUGH GXUFK%HKDQGOXQJEHLHUK|KWHU7HPSHUDWXULQ:DVVHUHEHQIDOOVXPJHNHKUW^[94][95].^[64]

'LHHUVWH1&/]XU%LOGXQJYRQB*CYHUOLHIRKQH3UREOHPHDEHUIUGLH]ZHLWH1&/]XU.XSSOXQJ von A-SR mit BCZXUGHGLH%LOGXQJHLQHV1HEHQSURGXNWHVEHREDFKWHWGHVVHQ,GHQWLWlWQLFKW JHNOlUWZHUGHQNRQQWH)UGLH]ZHLWH1&/ZXUGHZHLWHUKLQEHREDFKWHWGDVVHLQH+HUDEVHW]XQJ GHV S+:HUWHV DXI HLQH K|KHUH (I¿]LHQ] HUJLEW )U GLH 5HLQLJXQJ GHU 3URGXNWH QDFK GHQ 1&/VHUEUDFKWHGLH$QZHQGXQJGHU*HO¿OWUDWLRQIUGLHHUVWH1&/HLQHJXWH$XVEHXWHIUGLH ]ZHLWH1&/ZDUVLHDEHUGHXWOLFKZHQLJHUHUIROJUHLFK'LH/LPLWLHUXQJGHU*HO¿OWUDWLRQEHVWHKW KLHUGDULQGDVVGLHVDXUHQ%HGLQJXQJHQIUGDVȕ₂-M zu einer Initiierung von Aggregation und Fibrillen-Bildung führt.^[64]

,P (UJHEQLV JHODQJ HV DXFK LP 5DKPHQ GLHVHU $UEHLWHQ 'LSORPDUEHLW 6 $EHO^[64] QLFKW ausreichende Mengen von ȕ₂-Mikroglobulin (1.6 mg ungefaltetes ȕ₂-M/ABC) darzustellen.

=XGHPZDUGDV/LJDWLRQV3URGXNWABCDXFKKLHUQLFKWUHLQZLHGHVVHQ0$/',0DVVHVSHNWUXP zu entnehmen ist (Abbildung 11)^[64] 1HEHQ GHP 0DVVH3HDN m/z) für das Produkt mit 'D LVW LP 0DVVHEHUHLFK XP 'D HLQ 1HEHQSURGXNW QDFKZHLVEDU 'LHVHU 3HDN N|QQWHDXI9HUXQUHLQLJXQJGHV=LHOSURWHLQVGXUFKGDV6HJPHQWBC hinweisen.

2.3. CRF1-Mimetika

'HU &RUWLFRWURSLQ5HOHDVLQJ )DFWRU 5HFHSWRU 7\S &5) JHK|UW ]X GHQ HLQJHKHQG LQ LKUHU %HGHXWXQJ XQWHUVWULFKHQHQ *3URWHLQ JHNRSSHOWHQ 5H]HSWRUHQ *3&5V^[1][96] ZHOFKH HLQH JURH hEHUIDPLOLH DQ 5H]HSWRUHQ ELOGHQ GLH 6LJQDOH EHU GLH =HOOPHPEUDQ KLQZHJ LQ GDV=HOOLQQHUHOHLWHQ^[2][97]. Das Signal kann dabei u. a. ein Photon oder HLQ 3HSWLG/LJDQG VHLQ 'LHV IKUW ]X HLQHU LQWUD]HOOXOlUHQ ,QWHUDNWLRQ GHV 5H]HSWRUV PLW HLQHP *3URWHLQ XQG HLQHU DQVFKOLHHQGHQ

$NWLYLHUXQJ HLQHV 6HNXQGlU0HVVHQJHUV $EELOGXQJ ^[98][99] Im )DOOHGHV&5)LVWGLHVHU/LJDQGGDV+RUPRQ&RUWLFRWURSLQ5HOHDVLQJ )DFWRU &5+^[96] oder verwandte Peptide wie das Urocortin^[100] oder Sauvagin^[101]. Im zytosolischen Bereich wird nach Interaktion mit GHP *3URWHLQ XQWHU DQGHUHP GHU 0HWDEROLVPXV GHV ]\NOLVFKHQ Adenosinmonophosphates aktiviert[96][100][101] ZDV LQ HLQHU YHUPHKUWHQ

$XVVFKWWXQJ YRQ &RUWLFRWURSLQ UHVXOWLHUW^[102] 'LHV IKUW OHW]WHQ (QGHV zu einer breiten Spanne von Stress-Anpassungen.^[96][102]

Abbildung 11:

MALDI-Massespektrum von ABC aus der Diplomarbeit S. Abel^[64]

'HU &5) LVW DXV $6 DXIJHEDXW XQG EHVWHKW ZLH DOOH *3&5V DXV HLQHP HLQ]LJHQ 6WUDQJ GHU VLHEHQ 0DO GLH =HOOPHPEUDQ GXUFKOlXIW^[98] $EELOGXQJ XQG VRPLW VLHEHQ 7UDQVPHPEUDQ 'RPlQHQDXIZHLVW^[102].[96][103][104] Daraus ergibt sich ein Aufbau aus vier LQWUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ GUHL /RRSV XQG GDV &WHUPLQDOH (QGH XQG YLHU H[WUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ (&' GDV 1WHUPLQDOH (QGH (&' XQGGLHGUHLH[WUD]HOOXOlUHQ/RRSV(&/

'LH H[WUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ UHSUlVHQWLHUHQ ZDKUVFKHLQOLFK GLH +DXSWELQGXQJVVWHOOH IU GLH SHSWLGLVFKHQ /LJDQGHQ ZDV GXUFK HLQH Vielzahl von experimentellen Befunden gesichert ist.[105]-[107] Die 3UREOHPH EHL GHU *HZLQQXQJ DXVUHLFKHQGHU 3URWHLQPHQJHQ ]XU

Abbildung 12:

GPCR-Zyklus

%LQGXQJ*3URWHLQV /LJDQG5H]HSWRU Komplex Ausbildung 5H]HSWRU$NWLYLHUXQJ

*3URWHLQ$NWLYLHUXQJ

*3URWHLQ'LVVR]LDWLRQ und Signaltransduktion

*3URWHLQ,QDNWLYLHUXQJ^[5]

Abbildung 13:

Schematische Darstellung des CRF1

(&'«H[WUD]HOOXOlUH 'RPlQH

(&/«H[WUD]HOOXOlUHU Loop

,&/«LQWUD]HOOXOlUHU/RRS 70«

7UDQVPHPEUDQ'RPlQH^[4]

VSHNWURVNRSLVFKHQ6WUXNWXUDQDO\VHYRQ*3&5VLPEHVRQGHUHQ0DHLP )DOOGHU.ODVVH%IKUWH]XU(QWZLFNOXQJHLQHV3URWHLQPRGHOOVIUGLH H[WUD]HOOXOlUHQ %LQGXQJVVWHOOHQ EDVLHUHQG DXI HLQHU .RPELQDWLRQ GHU H[WUD]HOOXOlUHQ 'RPlQHQ (&' (&/ DXI HLQHP OLQHDUHQ 3HSWLG 7HPSODW^[65][66] (Abbildung 14). Besonders interessant war dabei der

%HIXQGGDVVHLQVROFKHV.RQVWUXNWHLQHQDQRPRODUH%LQGXQJVNRQVWDQWH für den natürlichen Liganden Urocortin-1 zeigt.^[65][66]

'DQRFKNHLQHH[SHULPHQWHOOHQ'DWHQIUGLH6WUXNWXUGLHVHU5H]HSWRU .ODVVH EHNDQQW VLQG VROOWH GLHVHV 7HPSODW NHLQH VWUXNWXUHOOHQ (LQVFKUlQNXQJHQ DXIZHLVHQ^[65][66] 'DKHU ZXUGH JURHU :HUW DXI GLH )OH[LELOLWlWGHUHLQ]HOQHQ'RPlQHQJHOHJWZDVHLQH6HOEVWRUJDQLVDWLRQ GXUFK VSH]L¿VFKH :HFKVHOZLUNXQJHQ XQWHUHLQDQGHU XQG LQ *HJHQZDUW GHV /LJDQGHQ HUP|JOLFKHQ VROOWH^[65][66] *UXQGEDXVWHLQH IU GDV OLQHDUH 7HPSODW GHV &5)0LPHWLNXPV ZHOFKHV QDFK GHP .RQ]HSW WHPSODW assoziierter Konstrukte^[108][109] DXIJHEDXW ZXUGH ZDUHQ *O\ /\V XQG

*OX $EELOGXQJ ^[65][66] =XGHP ZXUGH %LRWLQ ]XU )L[LHUXQJ IU DQVFKOLHHQGH%LQGXQJV$VVD\VHLQJHEDXW^[65][66]

Abbildung 14:

Schematische Darstellung des CRF1-Konstruktes

Abbildung 15:

Gerüst des linearen Templates vom CRF1-Mimetikum

0K[«

0DOHLPLGRKH[DQVlXUH

$K[«İ$PLQRKH[DQVlXUH

=«%HQ]\OR[\FDUERQ\O Schutzgruppe

Mhx Ahx Gly Glu Gly Lys Gly Glu Gly Lys Gly Glu Gly

Lys Gly Glu Gly Lys Biotin NH₂ Z Gly Gly Gly Gln

Dde

'DV 7HPSODW ZXUGH GXUFK 6WDQGDUG6336 V\QWKHWLVLHUW 'LH H[WUD]HOOXOlUHQ /RRSV ZXUGHQ

EHU GLH 7KLRO0DOHLPLG/LJDWLRQ DQ HLQHP 0DOHLPLGRKH[DQVlXUH 0K[5HVW GHU EHU HLQHQ DNWLYLHUWHQ (VWHU DQ GHQ /\V6HLWHQNHWWHQ HLQJHEUDFKW ZDU JHNRSSHOW %HL GHQ (&/ ZXUGH GHVVHQ 7RSRORJLH EHLEHKDOWHQ G K GDVV VLH LKUHU QDWUOLFKHQ $66HTXHQ] HQWVSUHFKHQ /HGLJOLFK LQWHUQH &\VWHLQH ZXUGHQ JHJHQ$OD E]Z 6HU DXVJHWDXVFKW^[65][66] ZDV IU GHQ QDWLYHQ 5H]HSWRUNHLQHQ(IIHNWDXIGHVVHQKRFKDI¿QH%LQGXQJ]XP3HSWLG/LJDQGHQKDW^[110]. Dies war Q|WLJGDGLH/RRSVQDFK$XIEDXLKUHU$66HTXHQ]EHU)PRF6336SHU1&/EHUHLQH*&*

Ligations-Stelle zyklisiert werden sollten.^[65][66]$XFKKLHUZXUGH]XU$NWLYLHUXQJGHV&7HUPLQXV GHU$FHWDPLGRWKLRSKHQRO(VWHUJHQXW]WVLHKHREHQ^[65][66]'LH]XU7KLRO0DOHLPLG/LJDWLRQGHU (&/RUWKRJRQDOH(LQIKUXQJGHV17HUPLQXVZXUGHGXUFKHLQH6RUWDVH$YHUPLWWHOWH/LJDWLRQ UHDOLVLHUWZRIUDP17HUPLQXVGDVIUGLH6RUWDVH$]ZLQJHQGQRWZHQGLJH(UNHQQXQJV0RWLY^[56]

LQGHU$6$EIROJH/3.7*HLQJHIKUWZXUGH^[65][66]'LH6\QWKHVHGHVODQJHQ17HUPLQXVZXUGH biosynthetisch durchgeführt.[65][66][107]

%LQGXQJV8QWHUVXFKXQJHQ PLWWHOV HLQHV 6FLQWLOODWLRQ3UR[LPLW\ $VVD\V 63$ KDEHQ JH]HLJW GDVV GDV &5).RQVWUXNW VRZRKO 8URFRUWLQ DOV DXFK 6DXYDJLQ ELQGHW^[65][66] Letzteres ist EHPHUNHQVZHUWGDGHU5H]HSWRU17HUPLQXVNHLQH%LQGXQJJHJHQEHU6DXYDJLQDXIZHLVW^[107](V NRQQWH]ZDUHLQHKRKH$I¿QLWlW]XP8URFRUWLQPLWHLQHPK_d § Q0EHVWLPPWZHUGHQ^[65][66]

MHGRFK LVW GLHVH VFKOHFKWHU DOV GLH GHV &5) LP *3URWHLQXQJHNRSSHOWHQ =XVWDQG +(.

=HOOHQK_d § Q0^[111] 7URW]GHP ERW GLHVHV 0LPHWLNXP HLQH JXWH *UXQGODJH IU ZHLWHUH Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkung einer strukturellen Stabilisierung des Konstruktes GXUFKHLQ]\NOLVFKHV7HPSODW:HJHQGHUKRKHQ$I¿QLWlWGHV3URWHLQ0RGHOOVIUGLHQDWUOLFKHQ 3HSWLG/LJDQGHQ ZlUH HV YRQ EHVRQGHUHP ,QWHUHVVH PLWWHOV VSHNWURVNRSLVFKHU 0HWKRGHQ ZLH 1056SHNWURVNRSLH RGHU 5|QWJHQEHXJXQJV$QDO\VH HLQHQ (LQEOLFN LQ GLH VWUXNWXUHOOHQ 9RUDXVVHW]XQJHQ GHU /LJDQG5H]HSWRU:HFKVHOZLUNXQJ ]X HUKDOWHQ XP LQ GHU )ROJH HLQ HUVWHV

%LQGXQJVPRGHOOIUGLHVH5H]HSWRU.ODVVH]XHQWZLFNHOQ

Im Dokument Kombination chemischer, gentechnischer und enzymatischer Methoden zur Darstellung schwer synthetisierbarer Proteine (Seite 19-27)