Ausschluss einer cis/trans-Isomerie am Prolin

'D GDV XQWHUVFKLHGOLFKH FKURPDWRJUD¿VFKH9HUKDOWHQ YRQABC_1 und ABCB QDFKZHLVOLFK QLFKW DXV HLQHU FKHPLVFKHQ 0RGL¿NDWLRQ GHU 3URWHLQ6WUXNWXU EHUXKW NRPPW QHEHQ HLQHU XUVSUQJOLFK YHUPXWHWHQ IHKOHUKDIWHQ$PLQRVlXUH6HTXHQ] DOV ZHLWHUH 8UVDFKH IU GLH %LOGXQJ zweier Ligations-Produkte das Vorliegen von Isomeren in Frage

Da sich in der Sequenz vom ȕ₂0LNURJOREXOLQPHKUHUH3UROLQHEH¿QGHQ ZXUGH ]XQlFKVW YHUPXWHW GDVV HV VLFK EHLABC_1 und ABC_2 um VWDELOH FLVWUDQV,VRPHUH DP 3UROLQ KDQGHOW (V ZXUGHQ 53+3/&

0HVVXQJHQ EHL ƒ& XQG ƒ& GXUFKJHIKUW GD 0ROHNOH YHUVFKLHGHQH5HWHQWLRQV]HLWHQGDQQDXIZHLVHQZHQQGLH5HOD[DWLRQV]HLW GHU ,VRPHULVLHUXQJ JU|‰HU LVW DOV GLH 'DXHU GHU +3/&7UHQQXQJ^[118]. 6LJQL¿NDQWHÄRQ&ROXPQ³,VRPHULVLHUXQJHQN|QQHQ]XP%HLVSLHOGXUFK HLQH JHHLJQHWH 7HPSHUDWXUZDKO XQWHUGUFNW ZHUGHQ^[119] So sind bei JHULQJHQ 7HPSHUDWXUHQ ƒ& ƒ& GLH VWDELOHQ ,VRPHUH GHXWOLFK VLFKWEDUXQGEHLKRKHQ7HPSHUDWXUHQ ƒ& ƒ&NDQQHLQHLQ]HOQHU

Fragment Masse berechnet Masse gefunden Spaltenzym

4-10^a* 848.5 848.5 beide

20-41^a* 2497.3 2497.3 Trypsin

27-41^a* 1655.9 1656.0 beide

59-75^a* 2203.0 2203.1 Trypsin

76-81^a* 756.3 756.3 Trypsin

82-91^a* 1122.6 1122.7 Trypsin

Tabelle 2:

Gefundene Fragmente nach Verdau von ABC_2

Messungen mittels MALDI-MS D«LP3HSWLGH0RGH E«LP/LQHDU0LGGOH Mass Mode

«QDFKYHUGDXW

Fragment Masse berechnet Masse gefunden Spaltenzym

1-10^a 1245.7 1245.7 Chymotrypsin

1-19^a 2222.2 2222.2 Trypsin

1-23^a 2683.4 2683.4 Chymotrypsin

88-99^a 1502.8 1502.8 Chymotrypsin

1-41^b 4700 4705 Trypsin

1-45^b 5157 5159 Trypsin

1-48^b 5527 5529 Trypsin

7-45^b 4433 4437 Trypsin

20-48^b 3324 3328 Trypsin

41-63^b 2801 2801 Chymotrypsin

42-94^b 6340 6344 Trypsin

76-97^b 2657 2661 Trypsin

4-10^a* 848.5 848.5 beide

7-12^a* 765.4 765.5 Trypsin

20-41^a* 2497.3 2497.3 Trypsin

59-75^a* 2203.0 2203.2 Trypsin

manchmal breiter Peak erhalten werden.^[119][120] Dies wurde für prolinhaltige Peptide oft gezeigt.[118]-[120] Bei solchen Peptiden ist das IUKHU HOXLHUHQGH 0ROHNO PHLVW LQ JHULQJHUHP 0D‰H YRUKDQGHQ^[118]

Dieses Molekül sollte das cis-Isomer 18 YRP 3UROLQ VHLQ GD HV DXI

*UXQG GHU 6HLWHQNHWWHQ9HUOLQNXQJ DP Į1$WRP $EELOGXQJ weniger stabil als das trans-Isomer 19 ist.^[118]

Liegt also beim ABC3URGXNW*HPLVFK FLVWUDQV,VRPHULHDP3UROLQYRUVRVROOWHEHL ƒ& GDV 9HUKlOWQLV GHU 3HDN)OlFKHQ YRQ ABC_1/ABC_2 variieren. Da aber im Vergleich ]XU0HVVXQJEHL57QDKH]XNHLQH9HUlQGHUXQJ GHV'RSSHOSHDNVEHL ƒ&]XEHREDFKWHQZDU

$EELOGXQJ LVW HLQH VROFKH ,VRPHULH DP Prolin nicht wahrscheinlich.

1DFK GHP $XVVFKOXVV HLQHU FLVWUDQV,VRPHULH DQ HLQHP 3UROLQ N|QQWHQĮ-/ȕ-Isomere oder L-/D(SLPHUHGHQ8QWHUVFKLHG]ZLVFKHQGHQ beiden ABC3URGXNWHQ DXVPDFKHQ 'LHVHU 8QWHUVFKLHG ZlUH GXUFK 06$QDO\VH HLQHV WU\SWLVFKHQ 9HUGDXV QLFKW GHWHNWLHUEDU HV VHL GHQQ die Isomerie betrifft enzymatische Spaltstellen und erzeugt dadurch HLQ YHUlQGHUWHV )UDJPHQWPXVWHU 6ROOWHQ VROFKH ,VRPHUH YRUOLHJHQ VR VWHOOWVLFKGLH)UDJHQDFKGHUHQ8UVSUXQJ=XVlW]OLFK]XGHQ]ZHLABC-3URGXNWHQVLQGEHLGHU]ZHLWHQ1&/1HEHQUHDNWLRQHQDXIJHWUHWHQVLHKH

$EELOGXQJ GLHLP)ROJHQGHQGHWDLOOLHUWXQWHUVXFKWZXUGHQ

4.1.3.3. Nebenprodukt-Bildung während der NCL

,P9HUODXIGHU1&/YRQA-SR und BC wurde neben der Bildung der Ligations-Produkte (ABCB XQG HLQHV ]X HUZDUWHQGHQ +\GURO\VH 3URGXNWHV GHV 7KLRHVWHUV A2+ EHUUDVFKHQG HLQ 1HEHQSURGXNW

Abbildung 23:

Cis/trans-Isomerie am Prolin innerhalb eines Peptides

25 °C 60 °C Abbildung 24:

Untersuchungen zur cis/

trans-Isomerie am Prolin vom ABC-Gemisch

53+3/&

&KURPDWRJUDPPH (UV-Detektion: 220 nm) vom ABC*HPLVFKEHL ƒ&OLQNV ƒ&

(rechts)

PDVVHQVSHNWURPHWULVFK QDFKJHZLHVHQ ZHOFKHV HLQH XP 'D YHUULQJHUWH0DVVH LP9HUJOHLFK ]XU HQWVSUHFKHQGHQ3HSWLGVlXUHA2+

aufweist (AVLHKH$EELOGXQJ

%HUHLWV LP 5DKPHQ YRQ 9RUDUEHLWHQ 'LSORPDUEHLW 6 $EHO^[64]) ZXUGH XQWHUVXFKW RE HLQH .RUUHODWLRQ ]ZLVFKHQ GHP $XIWUHWHQ GHU 1HEHQUHDNWLRQHQ XQG GHP S+:HUW GHU /LJDWLRQV/|VXQJ EHVWHKW 'D]X ZXUGH GLH 6WDELOLWlW YRP 7KLRHVWHU6HJPHQW A-SR) unter YHUVFKLHGHQHQS+:HUWHQDQDO\VLHUW'LHVH([SHULPHQWHKDEHQHUJHEHQ GDVV GLH %LOGXQJ GHV 1HEHQSURGXNWHVA HLQGHXWLJ S+DEKlQJLJ LVW ZREHL HLQ QLHGULJHUHU S+:HUW ]X ZHQLJHU 1HEHQSURGXNW

%LOGXQJ IKUWH 7DEHOOH ^[64] 0|JOLFKH 1XNOHRSKLOH GLH S+:HUW DEKlQJLJ HLQHQ LQWUDPROHNXODUHQ $QJULII LPA-SR HLQJHKHQ N|QQHQ VLQG GLH IXQNWLRQHOOHQ 6HLWHQNHWWHQ*UXSSHQ YRQ +LV₁₃ JUQ Lys₁₉ (violett)^[121] &WHUPLQDOHP $VQ₂₄ (rot)^[122] XQG GHU &DUER[\O 6DXHUVWRII GHU EHQDFKEDUWHQ 3HSWLG%LQGXQJ ;& 2$VQ₂₄ (blau)^[123]

(Abbildung 25).

8P GDV 1HEHQSURGXNW A GHU LQWUDPROHNXODUHQ =\NOLVLHUXQJ DP 7KLRHVWHU6HJPHQWA-SR ]X LGHQWL¿]LHUHQ ZXUGH HV LVROLHUW XQG DQVFKOLH‰HQGEHU1DFKWPLW7U\SVLQLQHLQHP3XIIHUPLWS+YHUGDXW 'LH /&06$QDO\VH GHV 9HUGDXV ZLHV GLH HUZDUWHWHQ )UDJPHQWH YRQ A2+ DXI $EELOGXQJ DEHU HV ZXUGH NHLQ )UDJPHQW PLW HLQHU

Tabelle 3:

pH-Abhängigkeit der Nebenprodukt-Bildung während der 2. NCL nach einer Stunde Reaktionszeit

pH 7.4 6.4 5.4

Abbildung 25: A-SR

Schema der gewünschten NCL und der möglichen Nebenreaktionen von A-SR

'LH6HLWHQNHWWHQZHOFKH einen nukleophilen

$QJULIIDXVIKUHQN|QQHQ und deren resultierende 1HEHQSURGXNWH HLQVFKOLH‰OLFKGHP +\GURO\VH3URGXNWGHU 6lXUHVLQGJH]HLJW 5¹5⁵«HQWVSUHFKHQGH AS-Sequenz bis zur fraglichen AS

0DVVHGLIIHUHQ]YRQ 'DJHIXQGHQ'LHV]HLJWGDVVHLQH+\GURO\VH des zyklischen Produktes unter den schwach basischen Bedingungen des tryptischen Verdaus stattfand. Interessanterweise wurden im Verdau zwei Peptide mit identischen Massen (m/z) des entsprechenden

&WHUPLQDOHQ)UDJPHQWHVYRQA2+LGHQWL¿]LHUW>0+@⁺ 'D ZHOFKH 'LDVWHUHRPHUH VHLQ N|QQHQ 'LH (SLPHULVLHUXQJ PVVWH DP

&WHUPLQDOHQ$VQDXVGHPLQWHUPHGLlUHQ]\NOLVFKHQ3URGXNWHQWVWHKHQ :HJHQGHUOHLFKWHQ+\GURO\VLHUEDUNHLWVFKHLGHWIUA(-18) eine Laktam-Bildung über die Lysin-Seitenkettengruppe aus.

0|JOLFKH]\NOLVFKH=ZLVFKHQSURGXNWHGLHGXUFKPLOGH+\GURO\VHHLQ ,VRPHUHQ*HPLVFK HUJHEHQ ZUGHQ VLQG ,PLGD]ROLG XQG 2[D]RORQ (L-/D'LDVWHUHRPHUHVRZLHHLQ$VSDUWLPLGDP&WHUPLQDOHQ$VSDUDJLQ (Į-/ȕ-Peptide & L-/D-Diastereomere). Der Ursprung der Isomeren-Bildung am Imidazolid 20 N|QQWH LQ GHU UlXPOLFKHQ 1lKH GHV XUVSUQJOLFKHQ ,PLQ6WLFNVWRIIV OLHJHQ 'LHVHV N|QQWH EHU HLQHQ JOLHGULJHQ hEHUJDQJV]XVWDQG21 das Proton am Į-Kohlenstoff-Atom abstrahieren 22 und somit zu einem Verlust der stereochemischen 5HLQKHLWIKUHQ$EELOGXQJ

Abbildung 26:

LC-MS-Analyse des tryptischen Verdaus von A(-18)

*HVWDIIHOWH(6,7R)06 Spektren der partiellen ,RQHQ&KURPDWRJUDPPH der tryptischen

Fragmente (oberen

&KURPDWRJUDPPHXQG 6XPPHGHU(6,7R)06 Spektren nach Verdau von A(-18) (unteres

&KURPDWRJUDPP

$XV HLQHP LQWHUPHGLlUHQ $VSDUWLPLG23 N|QQHQ VRZRKO Įȕ-Peptide als auch L-/D'LDVWHUHRPHUHHQWVWHKHQ'LHĮȕ-Peptide resultieren aus HLQHP QXNOHRSKLOHQ $QJULII VRZRKO DP &DUERQ\O.RKOHQVWRII$WRP GHV XUVSUQJOLFKHQ &7HUPLQXV Į3HSWLG24 DOV DXFK DP &DUERQ\O Kohlenstoff-Atom der vorhergehenden AS-Seitenkette (ȕ-Peptid 25

$EELOGXQJ 'HU 9HUOXVW GHU RSWLVFKHQ 5HLQKHLW NDQQ GXUFK GLH HUK|KWH &+$]LGLWlW DP 3URWRQ DPĮ-Kohlenstoff-Atom wegen der EHQDFKEDUWHQ,PLG*UXSSHKHUYRUJHUXIHQZHUGHQ

'LH ÄVWHDG\VWDWH³ .RQ]HQWUDWLRQ GHV 2[D]RORQV26 NDQQ GD]X IKUHQ GDVVHLQH.HWR(QRO7DXWRPRULH27VWDWW¿QGHWZHOFKH]XHLQHP9HUOXVW GHVVWHUHRFKHPLVFKHQ=HQWUXPVIKUW^[124][125] (Abbildung 29).

Abbildung 27:

Schema der L-/D -Epimer-Bildung am Imidazolid 5µ«$66HLWHQNHWWH

L-Epimer ^D-Epimer

+ NuH + NuH

Abbildung 28:

6FKHPDGHUĮȕ Isomeren-Bildung am Aspartimid

Die Bildung von Į-/ȕ,VRPHUHQ NDQQ GXUFK GLH +\GURO\VH YRQ

$VSDUWLPLG DP &WHUPLQDOHQ $VQ KHUYRUJHUXIHQ ZHUGHQ^[122] Um die 0|JOLFKNHLW HLQHU LQWHUPHGLlUHQ $VSDUWLPLG%LOGXQJ PLW VROFK HLQHU QDFKIROJHQGHQQXNOHRSKLOHQgIIQXQJ]XXQWHUVXFKHQZXUGHGDV0RGHOO

%HQ]R\O/1DFHWDPLGRSKHQ\O 7KLRHVWHU %]/165 V\QWKHWLVLHUW XQG GHVVHQ 5HDNWLRQ PLW

%HQ]\ODPLQDOV1XNOHRSKLOVWXGLHUW :LHYHUPXWHWIKUWHGLHVH5HDNWLRQ ]X ]ZHL HQWVSUHFKHQGHQ %]/1 EHQ]\ODPLGHQ ZHOFKH PLWWHOV 53+3/& JHWUHQQW XQG /&06 LGHQWL¿]LHUW ZXUGHQ 8P ]X HUPLWWHOQREHVVLFKEHLGHQEHLGHQ

%]/1EHQ]\ODPLGHQ XP L-/D -Diastereomere oder Į-/ȕ-Isomere

KDQGHOW ZXUGHQ 105

8QWHUVXFKXQJHQGXUFKJHIKUW(LQH entsprechende Auskunft sollte dem 52(6<6SHNWUXP DOVR GHP ]ZHL dimensionalen Protonen-Spektrum für Kopplungen von Kernen durch GHQ 5DXP ]X HQWQHKPHQ VHLQ Würden Į-/ȕ,VRPHUH YRUOLHJHQ VR

sollte in einem der beiden Spektren für das ȕ-Isomer die Kopplung vom

Abbildung 29:

Schema der L-/D -Epimer-Bildung aus dem Oxazolon

5µ«$66HLWHQNHWWH

L-Epimer D-Epimer

O

β^α-Isome-Isomer 29

L-Isomer

D-Isomer

Abbildung 30:

Strukturformeln der verschiedenen Benzoyl-LN-benzylamid-Isomere

Kennzeichnung der zu erwartenden Protonen-Kopplungen mit dem

%HQ]\ODPLG1+RUDQJH blau) & der Kopplungen PLWGHQ%HQ]\ODPLG&+_Į -Protonen (rot/grün) im

1+¹+52(6<6SHNWUXP für die Į-/ȕ-Isomere

%HQ]\ODPLG1+XQGYRQGHQ%HQ]\ODPLG&+_Į3URWRQHQ]XGHQ$VQ&+_ȕ-Protonen (blau/grün) JU|‰HUVHLQDOV]XP$VQ&+_Į-Proton (orange/rot) (Abbildung 30). Für das Į-Isomer 28 sind die .RSSOXQJHQYRP%HQ]\ODPLG1+XQGYRQGHQ%HQ]\ODPLG&+_Į3URWRQHQ]XP$VQ&+_Į-Proton HQWVSUHFKHQGJU|‰HUDOV]XGHQ$VQ&+_ȕ-Protonen. Da die vorliegenden Spektren (Abbildung 32 GHU]ZHL9HUELQGXQJHQEHLGHDOVĮ-Isomer 28]XLQWHUSUHWLHUHQVLQGLVWNHLQȕ-Isomer 29 HQWVWDQGHQ=XGHPGHXWHWGLHVFKZlFKHUH%HQ]\ODPLG1+]X$VQ&+_Į-Kopplung (orange) vom IUKHUHOXLHUHQGHQJHJHQEHUGHPVSlWHUHOXLHUHQGHQ%]/1EHQ]\ODPLGGDUDXIKLQGDVVNHLQH VWHULVFK LGHQWLVFKHQ 9HUELQGXQJHQ YRUOLHJHQ 'LH $XVZHUWXQJ GHU 105'DWHQ HUJLEW GDVV Diastereomere vorhanden sein müssen. Da keine Indikation auf die Bildung eines Į-/ȕ-Isomers zu

¿QGHQZDULVWGLHVHU5HDNWLRQVZHJEHUHLQ$VSDUWLPLG]LHPOLFKXQZDKUVFKHLQOLFK(KHUVFKHLQW GLH %LOGXQJ YRQ 'LDVWHUHRPHUHQ DXV GHU (SLPHULVLHUXQJ GLUHNW DXV GHP UHDNWLYHQ $U\O 7KLRHVWHU^[126] RGHU EHU HLQ DXV GHP 7KLRHVWHU JHELOGHWHV $VSDUWLPLG RGHU 2[D]RORQ^[123][127]

VWDWW]X¿QGHQ)UGHQGLUHNWHQ:HJDXVGHP7KLRHVWHUVSULFKWVHLQHĮ&+$]LGLWlWZHOFKH]X HLQHU5D]HPLVLHUXQJIKUHQNDQQ^[121](LQH(SLPHULVLHUXQJEHUHLQ$VSDUWLPLGDOV=ZLVFKHQVWXIH LVW ZHJHQ VHLQHU K|KHUHQĮ&+$]LGLWlW HKHU GHQNEDU 7URW]GHP NDQQ HLQH (SLPHULVLHUXQJ HEHQIDOOVDXVGHUÄVWHDG\VWDWH³.RQ]HQWUDWLRQHLQHV2[D]RORQVHQWVWHKHQ^[124][125] Dagegen ist eine Isomerisierung zum Į-/ȕ3HSWLG*HPLVFK EHU HLQH $VSDUWLPLG%LOGXQJ DXV GHP 7KLRHVWHU ZlKUHQGGHU1&/VHKUXQZDKUVFKHLQOLFK

Abbildung 31:

1+¹ H-ROESY-NMR-Spektren (600 MHz) vom früher eluierenden (a)

& später eluierenden Bz-LN-Amid (b) mit den hervorgehobenen möglichen Kopplungen vom Benzylamid-CH_Į zum Asn-CH_Į (rot) & Asn-CH_ȕ (grün)

Asn-CH_ȕ‘s

Benzylamid-CH_ĮµV Leu-CH_Į Asn-CH_Į

Leu-NH Asn-NH Benzylamid-NH

a)

Asn-CH_ȕ‘s

Benzylamid-CH_ĮµV Leu-CH_Į Asn-CH_Į

Leu-NH Asn-NH Benzylamid-NH

b)

8P GLH 0|JOLFKNHLW HLQHU LQWUDPROHNXODUHQ =\NOLVLHUXQJ EHU QXNOHRSKLOH 6HLWHQNHWWHQ)XQNWLRQHQ ]X XQWHUVXFKHQ ZXUGHQ VHFKV 3HSWLG7KLRHVWHU0RGHOOH V\QWKHWLVLHUW XQG XQWHUVXFKW 'LHVH 0RGHOOH basieren auf einer verkürzten Sequenz des Segmentes A-SR und beinhalten einzelne oder mehrere Substitutionen durch Ala von für eine

=\NOLVLHUXQJLQ)UDJHNRPPHQGHU$6V

Abbildung 32:

1+¹ H-ROESY-NMR-Spektren (600 MHz) vom früher eluierenden (a)

& später eluierenden Bz-LN-Amid (b) mit den hervorgehobenen möglichen Kopplungen vom Benzylamid-NH zum Asn-CH_Į (orange) &

Asn-CH_ȕ (blau)

1H

1H

Benzylamid-CH_ĮµV Leu-CH_Į

Asn-CH_Į

Asn-CH_ȕ‘s

Benzylamid-CH_ĮµV Leu-CH_Į Asn-CH_Į

b)

Asn-CH_ȕ‘s

Benzylamid-CH_ĮµV Leu-CH_Į Asn-CH_Į

Benzylamid-CH_ĮµV Leu-CH_Į

Asn-CH_Į

a)

$FHW\O65+3$(1*.61)/A65 065

$FHW\O65+3$(1*A61)/165 065

$FHW\O65A3$(1*.61)/165 065

$FHW\O65+3$(1*.61)/165 065

$FHW\O65A3$(1*A61)/A65 065

$FHW\O65APA A1*A61)/A65 065

)UMHGHV0RGHOOZXUGHGLH1HEHQSURGXNW%LOGXQJXQWHU1&/%HGLQJXQJHQLQS+$EKlQJLJNHLW S+JHSUIWXQGDXVJHZlKOWH1HEHQSURGXNWHLVROLHUWPLW7U\SVLQYHUGDXWXQGPLW +LOIHYRQ/&06XQG0606DQDO\VLHUW

8QWHUVXFKXQJHQSHU53+3/&XQG/&06GHV0RGHOOV065VFKZDU]LQGHPDOOHIUDJOLFKHQ

$6PLWQXNOHRSKLOHQ6HLWHQNHWWHQJHJHQ$ODDXVJHWDXVFKWVLQG]HLJHQNHLQHVLJQL¿NDQWH%LOGXQJ GHV1HEHQSURGXNWHV0$EELOGXQJ DEHUGLH%LOGXQJ]ZHLHU3HSWLGVlXUHQ02+

$XVGHU7DWVDFKHGDVVGLH$QZHVHQKHLWQXNOHRSKLOHU*UXSSHQLQ3HSWLG6HLWHQNHWWHQ]XU%LOGXQJ YRQ0;IKUWLVW]XVFKOLH‰HQGDVVGLHDXVJHWDXVFKWHQ$6DXFKIU=\NOLVLHUXQJV3URGXNWH von ADP7KLRHVWHU6HJPHQWA-SRYHUDQWZRUWOLFKVHLQN|QQWHQ'DEHLNDQQ*OXWDPLQVlXUH HUZDUWXQJVJHPl‰ DXVJHVFKORVVHQ ZHUGHQ ZLH HLQ 9HUJOHLFK GHU (UJHEQLVVH YRQ 065 URWXQG 065 ]HLJW 'DVV HV VLFK EHL GHQ 3HSWLGVlXUH3DDUHQ IU 02+ XQG 02+ XP HQWVSUHFKHQGH'LDVWHUHRPHUHKDQGHOWGLHGXUFK(SLPHULVLHUXQJDP&WHUPLQDOHQ$ODHQWVWDQGHQ VLQG YHUGHXWOLFKW HLQ FKURPDWRJUD¿VFKHU9HUJOHLFK PLW GHQ HQWVSUHFKHQGHQ9HUJOHLFKVSHSWLGHQ

$EELOGXQJ 'LHVH (SLPHULVLHUXQJ UHVXOWLHUW DXV HLQHP 9HUOXVW RSWLVFKHU 5HLQKHLW GHV 7KLRHVWHUVVHOEVWRGHUXQGHLQHULQWHUPHGLlUHQ2[D]RORQ%LOGXQJ

Abbildung 33:

Gegenüberstellung der RP-HPLC-Chromatogramme der Nebenreaktionen der Modelle M(1-6)-SR

Dargestellt sind von oben nach unten die

&KURPDWRJUDPPH (Detektion: 220 nm) vom 0RGHOO065ELV065 LQ 01D₂+32₄ bei S+ QDFKPHKUDOV 6WXQGHQ5HDNWLRQV]HLW 'LH',&$DWS$GGXNWH EHLGHQ0RGHOOHQ065 065HQWVWDQGHQ ZlKUHQGGHU7KLRHVWHU Bildung und konnten von den Modellen nicht getrennt werden.

Sie hatten aber auch NHLQHQ(LQÀXVVDXIGLH Untersuchungen.)

Abbildung 34:

RP-HPLC-Chromatogramme der co-eluierten L-/D-Säuren der Modelle M(1-6)SR

53+3/&

&KURPDWRJUDPPH (Detektion: 220 nm) 02+PLW

&WHUPLQDOHQL-AS P2+PLW

&WHUPLQDOHQD-AS

6LQG GDJHJHQ ZLH LP 0RGHOO3HSWLG7KLRHVWHU 065 RUDQJH ,PLGD]RORGHU$PLQRJUXSSHQLQGHQ6HLWHQNHWWHQYRUKDQGHQZLUGHLQH VROFKH (SLPHULVLHUXQJ QLFKW EHREDFKWHW VLHKH $EELOGXQJ ZHLO HQWZHGHU GHU7KLRHVWHU RGHU GDV GDUDXV JHELOGHWH 2[D]RORQ RKQH RGHUPLWZHVHQWOLFKJHULQJHUHU(SLPHULVLHUXQJPLWGLHVHQQXNOHRSKLOHQ

*UXSSHQ UHDJLHUW 'DV PDFKW VFKRQ GHXWOLFK GDVV PLW (SLPHULVLHUXQJ QXU]XUHFKQHQLVWZHQQNHLQ1XNOHRSKLODQZHVHQGLVW%HLP9HUJOHLFK GHU (UJHEQLVVH IU XQVHUH 0RGHOO3HSWLGH N|QQHQ ZLU IU 0;65 PLW

; XQG/DNWDP%LOGXQJHUZDUWHQGLHIU; XQGQLFKW P|JOLFKLVW'HP]XIROJHKDQGHOWHVVLFKEHLGHP0;3URGXNWPLW K|KHUHU5HWHQWLRQFDt_R = 15 min in Abbildung 33) wahrscheinlich XPGDVJHELOGHWH/DNWDP8PGLHV]XEHZHLVHQZXUGHQVSH]LHOOGLHVH 0;)UDNWLRQHQ 0 0 PLWWHOV 53+3/& LVROLHUW PLW 7U\SVLQ YHUGDXW XQG SHU /&06 DQDO\VLHUW $EELOGXQJ ,P Kontrast zum tryptischen Verdau des ȕ₂-M-Segmentes A-SR (siehe

$EELOGXQJ ZXUGH KLHU HLQ +DXSWIUDJPHQW DQ GHU /\V 3RVLWLRQ QLFKW JHVSDOWHQ >0+@²⁺ = 634 Da). Dies deutet auf eine LQWUDPROHNXODUH =\NOLVLHUXQJ DP /\V XQWHU GHU %LOGXQJ YRQ /DNWDP KLQ GD GLHVH 0RGL¿NDWLRQ YRP 7U\SVLQ QLFKW HUNDQQW XQG JHVSDOWHQ ZHUGHQ NDQQ =XVlW]OLFK ]XP WU\SWLVFKHQ 9HUGDX ZXUGH GDV LVROLHUWH 1HEHQSURGXNWSHU0606YHUPHVVHQ$EELOGXQJ 'LH$XVZHUWXQJ PDFKWGHXWOLFKGDVVGLHE)UDJPHQWHELV]XU$6$VQ₇ genauso wie die

\)UDJPHQWHGHVDQJHQRPPHQHQ/DNWDPVELV]XU$6+LV₃GRPLQLHUHQ ZDV GLH 3RVLWLRQ GHU$66HLWHQNHWWH ZHOFKH HLQH LQWHUQH =\NOLVLHUXQJ HLQJHKHQNDQQDXIGDV/\VHLQJUHQ]W,QVJHVDPWEHVWlWLJHQGLH5HVXOWDWH GLH %LOGXQJ YRQ /DNWDP IU GDV VSlWHU HOXLHUHQGH 1HEHQSURGXNW 0;

Abbildung 35:

LC-MS-Analyse des tryptischen Verdaus vom später eluierenden 0GHP

vermutlichen Laktam

*HVWDIIHOWH(6,7R)06 Spektren der partiellen ,RQHQ&KURPDWRJUDPPH der tryptischen

Fragmente (oberen

&KURPDWRJUDPPHXQG 6XPPHGHU(6,7R)06 Spektren nach Verdau von M1(-18) (unteres

&KURPDWRJUDPP

,QWHUHVVDQWHUZHLVH ELOGHW DXFK 065 HLQ 03URGXNW 'LHVHV 3URGXNW VROOWH NHLQ 2[D]RORQ VHLQ ZHLO HLQ 2[D]RORQ ZLH LP )DOO YRQ 065 K\GURO\VLHUW ZHUGHQ ZUGH 0|JOLFKHUZHLVH ELOGHW VLFK HLQ ]\NOLVFKHV ,PLGD]ROLG 'DV LVW LQVRIHUQ EHUUDVFKHQG ZHLO DXFK 065HLQ]ZHLWHV03URGXNWELOGHWREZRKOHVNHLQ,PLGD]ROLG ELOGHQNDQQDOVROHGLJOLFKHLQH/DNWDP%LOGXQJ]HLJHQVROOWH'HQNEDU ZlUH KLHU DEHU GDVV GLH %LOGXQJ HLQHV $VSDUWLPLGV ]X GHP ]ZHLWHQ M3(-18)-Produkt führt. Bei Annahme einer Aspartimid-Bildung für 065 VROOWH PDQ HLQ $VSDUWLPLG DXFK IU 065 ¿QGHQ 'DV NDQQ QLFKW DXVJHVFKORVVHQ ZHUGHQ ZHQQ $VSDUWLPLG XQG ,PLGD]ROLG HLQH JOHLFKH 5HWHQWLRQ LQ GHU 53+3/& ]HLJHQ (LQ $VSDUWLPLG NDQQ QXQ ZLHGHUXPQLFKWYRQ065JHELOGHWZHUGHQ$EHUDXFK065ELOGHW ]ZHL03URGXNWHZREHLHVVLFKEHLPIKHUHOXLHUHQGHQ3HDNXP ,PLGD]ROLGKDQGHOQN|QQWH'LHHQWVSUHFKHQGHQ)UDNWLRQHQ0XQG 0PLWJHULQJHUHU5HWHQWLRQZXUGHQPLWWHOVSUlSDUDWLYHU53+3/&

LVROLHUW PLW7U\SVLQYHUGDXWXQGPLWWHOV/&06DQDO\VLHUW,Q$QDORJLH zum ȕ₂-M-Segment A-SR weisen beide Verdaue keine tryptischen )HKOVSDOWVWHOOHQ DXI IKUHQ DEHU HEHQIDOOV ]X ]ZHL &WHUPLQDOHQ )UDJPHQWHQ 61)/;2+ $EELOGXQJ GLH HLQH (SLPHULVLHUXQJ EHOHJHQ ,Q DOOHQ )lOOHQ LVW HLQH 5LQJ|IIQXQJ GXUFK GLH EDVLVFKHQ

%HGLQJXQJHQGHVWU\SWLVFKHQ9HUGDXVHUIROJWZREHLKLHURIIHQEOHLEHQ PXVVZHOFKH$QWHLOH,PLGD]ROLGXQG$VSDUWLPLG%LOGXQJGDEHLKDEHQ (VZLUGDEHUDXVGHP9HUJOHLFKGHU(UJHEQLVVHIU065XQG065 GHXWOLFKGDVVGHU&WHUPLQDOH$OD$VQ7DXVFKHLQHQHUKHEOLFKHQ(IIHNW DXI GLH %LOGXQJ GHV 0;3URGXNWHV PLW JHULQJHUHU 5HWHQWLRQ KDW VLHKH$EELOGXQJ ZDV DXI$VSDUWLPLG%LOGXQJ IU 065 VFKOLH‰HQOlVVW

Abbildung 36:

MS/MS-Spektrum vom später eluierenden 0GHPYHUPXWHWHQ Laktam

6SHNWUXPYRP>0+@²⁺ -Ion vom Laktam

und seinen b- und y-Fragmenten mit den GD]XJHK|ULJHQ0DVVHQ

)U HLQH 1&/ LVW GLH /DNWDP%LOGXQJ RKQH )ROJHQ ZHQQ PDQ GHQ 9HUOXVW DQ 7KLRHVWHUNRPSRQHQWH DX‰HU $FKW OlVVW 'LH $VSDUWLPLG

%LOGXQJ KlWWH GLH .RQVHTXHQ] HLQHU SRWHQ]LHOOHQ (SLPHULVLHUXQJ XQG Į-/ȕ3HSWLG%LOGXQJ:LHIUGLH$PLQRO\VHYRQ%]/165REHQJH]HLJW ZXUGH VROOWH GLHĮ-/ȕ3HSWLG%LOGXQJ IU HLQH 1&/ YHUQDFKOlVVLJEDU VHLQ ,PLGD]ROLG%LOGXQJ N|QQWH DEHU ZLH 2[D]RORQ%LOGXQJ LQ HLQHU (SLPHULVLHUXQJUHVXOWLHUHQGHUHQ$XVPD‰EHVWLPPWZHUGHQPXVV

6RZXUGHQ8QWHUVXFKXQJHQKLQVLFKWOLFKGHU(SLPHULVLHUXQJGHV3HSWLG 7KLRHVWHUV YRP ȕ₂-M-Segment A-SR PLWWHOV JDVFKURPDWRJUD¿VFKHU

*&$QDO\VH GXUFKJHIKUW $EELOGXQJ 'LHVHV9HUIDKUHQ LVW HLQ 6WDQGDUG9HUIDKUHQ]XU(UPLWWOXQJGHUL- und D-Isomere von AS.[128]-[130]

:lKUHQG GHU VDXUHQ +\GURO\VH XQG 'HULYDWLVLHUXQJ ZHUGHQ XQWHU GHQ YRUKHUUVFKHQGHQ %HGLQJXQJHQ GLHVHV 9HUIDKUHQV $VQ XQG *OQ LQ $VS XQG*OXXPJHZDQGHOW'DGLH$66HTXHQ]YRQA-SRNHLQ$VSDXIZHLVW PXVVGLHVKLHUQLFKWEHUFNVLFKWLJWZHUGHQ=XQlFKVWZXUGHGLHGXUFKGLH Derivatisierung bedingte Isomerisierung^[131] von freiem Asn untersucht JUQXQG]X EHVWLPPW,P]ZHLWHQ9HUVXFKZXUGHGHU7KLRHVWHU A-SRVDXHUK\GURO\VLHUWSLQNXQGGLH$QDO\VHHUJDEGDVVIUGLHVHQ 7KLRHVWHU ,VRPHULVLHUXQJJHIXQGHQZXUGHQGDHLQ$QWHLOYRQ an D$VQEHVWLPPWZXUGH:LUGGHU3HSWLG7KLRHVWHUGHQ%HGLQJXQJHQ GHU1&/IUHLQH6WXQGHXQWHUZRUIHQ]HLJWHGLHDQVFKOLH‰HQGH$QDO\VH ROLYHLQH(UK|KXQJGHV$QWHLOVDQD$VQDXI 'LHVH8QWHUVXFKXQJ PDFKW GHXWOLFK GDVV EHL GHU 1&/ GLHVHV 3HSWLG7KLRHVWHUV GHXWOLFKH

Abbildung 37:

LC-MS-Analyse des tryptischen Verdaus vom früher eluierenden M3(-18)

*HVWDIIHOWH(6,7R)06 Spektren der partiellen ,RQHQ&KURPDWRJUDPPH der tryptischen

Fragmente (oberen

&KURPDWRJUDPPHXQG 6XPPHGHU(6,7R)06 Spektren nach Verdau von M3(-18) (unteres

&KURPDWRJUDPP

(SLPHULVLHUXQJLP%HUHLFKYRQ QLFKWDXV]XVFKOLH‰HQLVWDXFKZHQQ PDQ GLH %HGLQJXQJHQ RKQH HLQ &\VWHLQ3HSWLG DOV /LJDWLRQV3DUWQHU HLQHU/LJDWLRQQLFKWJOHLFKVHW]HQGDUI*OHLFK]HLWLJ]HLJWGLHVHV(UJHEQLV GDVV VHOEVW EHL %LOGXQJ YRQ LQWHUPHGLlUHQ &\FORSHSWLG3URGXNWHQ ZLH LP %HLVSLHO GHU 03HSWLGH JH]HLJW HLQH (SLPHULVLHUXQJ PD[LPDO HUUHLFKHQVROOWH

4.1.3.4. Epimerisierung von Asn₂₄ in der NCL

'LH VRZHLW HUKDOWHQHQ +LQZHLVH DXI YHUVFKLHGHQH 1HEHQSURGXNWH EHL GHU 1&/ GLH ]X HLQHU (SLPHULVLHUXQJ GHU &WHUPLQDOHQ $PLQRVlXUH GHV 3HSWLG7KLRHVWHUV IKUHQ N|QQHQ HUIRUGHUWHQ HLQH HQWVSUHFKHQGH

Abbildung 38:

GC-FID-Chromatogramme (Lipodex E) der Stereoisomerie-Untersuchungen der einzelnen AS von A-SR

$QDO\VH XP ]X SUIHQ RE HLQH 8UVDFKH IU GLH (QWVWHKXQJ YRQ ]ZHL PDVVHQVSHNWURPHWULVFK LGHQWLVFKHQ OLQHDUHQȕ₂03URGXNWHQABC_1 und ABCB LP 9HUOXVW GHU RSWLVFKHQ 5HLQKHLW YRQ $VQ₂₄ bestehen N|QQWH 'D]X ZXUGH GDV 3URWHLQ HQ]\PDWLVFK VR JHVSDOWHQ GDVV HLQ kurzes Peptid-Fragment mit Asn₂₄ HQWVWHKW GDV KLQVLFKWOLFK VHLQHU RSWLVFKHQ,QWHJULWlWDQDO\VLHUWZHUGHQNRQQWH

(LQ 7U\SVLQ9HUGDX HUZLHV VLFK DOV XQJQVWLJ GD GDV HQWVWHKHQGH )UDJPHQW ]XP HLQHQ ]LHPOLFK JUR‰ LVW XQG ]XP DQGHUHQ SHU /&06QLFKWGHWHNWLHUWZHUGHQNRQQWH'DKHUZXUGHHLQ&K\PRWU\SVLQ Verdau des ABCB*HPLVFKHVGXUFKJHIKUWZREHLGDVIUDJOLFKH$VQ₂₄ LQGHP)UDJPHQW/1&<_23-26 vorkommt. Um einen Vergleich bezüglich GHU 5HWHQWLRQV]HLWHQ GHUL- bzw. D'LDVWHUHRPHUH ]LHKHQ ]X N|QQHQ ZXUGHQ HQWVSUHFKHQGH 3HSWLGH V\QWKHWLVLHUW =XP 9HUJOHLFK PLW GHP chymotryptisch verdauten ABC*HPLVFK URW ZXUGHQ GLH 6HJPHQWH /1&</Q&<LQHLQHP9HUKlOWQLVYRQFRHOXLHUWVFKZDU]'DQDKH]X kein Fragment mit einem D$VQLQGHPYHUGDXWHQ*HPLVFKQDFKZHLVEDU ZDU $EELOGXQJ VROOWH KLHU

DXVJHVFKORVVHQ ZHUGHQ N|QQHQ dass die beiden erhaltenen ABC-Produkte Diastereomere UHSUlVHQWLHUHQ 1LFKWVGHVWRWURW]

NDQQ QLFKW DEJHVFKlW]W ZHUGHQ ZHOFKHQ (LQÀXVV HLQH D-AS in 1DFKEDUVFKDIW]XU6SDOWVWHOOHDXI

den Verdau und endsprechende Bildung von Fragmenten hat.

'LHVHV (UJHEQLV ZLGHUOHJW GLH 9HUPXWXQJ GDVVABC_1 und ABC_2 XQWHUVFKLHGOLFKH6WUXNWXUHQDXI*UXQGHLQHUYHUVFKLHGHQHQ.RQ¿JXUDWLRQ von Asn₂₄DXVELOGHQ(VNDQQMHGRFKQLFKWDXVJHVFKORVVHQZHUGHQGDVV VFKRQHLQVHKUJHULQJHUZHLOQLFKWYROOVWlQGLJDEWUHQQEDUHU$QWHLOHLQHV GLDVWHUHRPHUHQ 3URWHLQV EHZLUNW GDVV VLFK GLH GHP UHNRPELQDQWHQ Protein entsprechende Struktur für die ABC-Produkte nicht bilden kann.

=XVDPPHQJHIDVVWYHUGHXWOLFKHQGLHGDUJHOHJWHQ(UJHEQLVVHGDVVIUGHQ

$FHWDPLGRSKHQ\O7KLRHVWHUYRQ3HSWLGHQVHOEVWEHLHLQHUVHKUODQJVDP YHUODXIHQGHQ/LJDWLRQPLW&\V3HSWLGHQZLHGHU.XSSOXQJYRQA-SR mit BCGLHLQWHUPHGLlUH%LOGXQJYRQ,PLGD]ROLG,PLGXQG2[D]RORQ QLFKW DXVJHVFKORVVHQ ZHUGHQ NDQQ VHOEVW ZHQQ GLH %LOGXQJ HLQHV /DNWDPVKLHUQLFKWEHREDFKWHWZXUGH'LHQDFKZHLVEDUH(SLPHULVLHUXQJ

Abbildung 39:

LC-MS-Analyse vom Chymotrypsin-Verdau vom ABC-Produkt-Gemisch (oben/rot) und den co-eluierten synthetisierten LNCY/

LnCY-Segmenten

(6,7R)066SHNWUHQ der partiellen

Ionen-&KURPDWRJUDPPHYRP chymotryptischen Verdau vom ABC*HPLVFKXQG YRQGHU&R(OXWLRQGHU synthetisierten Fragmente /1&</Q&<LP

9HUKlOWQLV

für Asn₂₄LP3URGXNW*HPLVFKGHU/LJDWLRQNDQQMHGRFKYHUQDFKOlVVLJW ZHUGHQ ZRPLW GDV (QWVWHKHQ ]ZHLHU OLQHDUHUȕ₂-Mikroglobuline nicht auf verschiedene Isomere zurückgeführt werden kann. Infolgedessen VROOWH XQWHUVXFKW ZHUGHQ RE GHU 8QWHUVFKLHG ]ZLVFKHQABC_1 und ABCBGXUFKGLIIHULHUHQGH6HNXQGlU6WUXNWXUHQKHUYRUJHUXIHQZLUG

4.1.3.5. Unterschiede in der Sekundär-Struktur

)U 8QWHUVXFKXQJHQ GHU 6HNXQGlU6WUXNWXU GHU EHLGHQ OLQHDUHQ Ligations-Produkte ABC_1 und ABC_2 wurden die hierfür üblichen 0HVVYHUIDKUHQ GLH =LUFXODUGLFKURLVPXV &'6SHNWURVNRSLH XQG GHU )RXULHUWUDQVIRUPDWLRQV,5)7,56SHNWURVNRSLHJHQXW]W

Sowohl für ABC_1 (rot) als auch für ABC_2 (schwarz) weisen GLH &'6SHNWUHQ &KDUDNWHULVWLND YRQ ȕ-Faltblatt-Strukturen auf

(Abbildung 40).[132]-[134] Sie haben eine negative Bande bei 210-220 nm und eine positive Bande bei 190-200 nm.^[132][133]

-HGRFK ]HLJHQ GLH &'6SHNWUHQ GHXWOLFKH 8QWHUVFKLHGH DXI ZDV EHGHXWHWGDVVVLFKGLHȕ-Faltblatt-Strukturen der beiden ABC3URGXNWH VLJQL¿NDQW XQWHUVFKHLGHQ RKQH GDVVKLHUHLQH4XDQWL¿]LHUXQJGHU8QWHUVFKLHGHHUIROJHQNDQQ

(LQ DQDORJHV (UJHEQLV HUEUDFKWHQ )7,5VSHNWURVNRSLVFKH 0HVVXQJHQ EHLGHU 3URWHLQH GLH HLQGHXWLJ DOV ȕ)DOWEODWW6WUXNWXUHQ LGHQWL¿]LHUW wurden. Im Bereich 1620-1635 cm^-1ZHOFKHUIUȕ-Faltblatt-Strukturen FKDUDNWHULVWLVFKH%DQGHQ]HLJWVLQGZLHGHUXPVLJQL¿NDQWH8QWHUVFKLHGH für ABC_1 (grün) und ABC_2 (rot) zu erkennen (Abbildung 41).

+LHU VLQG ]ZDU GLH %DQGHQ IU DQWLSDUDOOHOH ȕ-Faltblatt-Strukturen vorhanden[76]-[78][133] DEHU IU ABC_1 liegt die starke Bande bei 1626 cm^-1 und für ABC_2 bei 1630 cm^-1. Des Weiteren befindet sich die schwache Bande von ABC_1 bei 1683 cm^-1 und von ABC_2 bei 1681 cm^-1(VVLQGDOVR8QWHUVFKLHGHLQQHUKDOEGHUMHZHLOVYRUKDQGHQHQ antiparallelen ȕ-Faltblatt-Strukturen von ABC_1 und ABC_2 zu erkennen. Darüber hinaus war keines der beiden chemosynthetischen

Abbildung 40:

CD-Spektren von ABC_1 (rot) & ABC_2 (schwarz)

Produkte identisch mit dem rekombinanten ȕ₂0LNURJOREXOLQVFKZDU]

dessen charakteristische Banden für die antiparallele ȕ-Faltblatt-Struktur bei 1633 cm^-1 bzw. 1682 cm^-1 liegen.

'LH(UJHEQLVVHGHUVSHNWURVNRSLVFKHQ$QDO\VHQEHOHJHQHLQGHXWLJGDVV ABC_1 und ABC_2 unterschiedliche ȕ)DOWEODWW6WUXNWXUHQELOGHQGLH GDV DEZHLFKHQGH FKURPDWRJUD¿VFKH 9HUKDOWHQ GHU EHLGHQ /LJDWLRQV 3URGXNWH HUNOlUHQ N|QQHQ 6LH OLHIHUQ MHGRFK NHLQHQ +LQZHLV DXI GLH 8UVDFKH GHU YHUVFKLHGHQHQ 6HNXQGlU6WUXNWXUHQ 'LHV EHGHXWHW MHGRFK DXFK GDVV QLFKW GDV JHVXFKWH 3URGXNW XQG GHVVHQ .RQ¿JXUDWLRQV ,VRPHU YRUOLHJHQ N|QQHQ GHQQ GDQQ PVVWH HLQHV GHU EHLGHQ ABC-Produkte das gewünschte lineare ȕ₂-Mikroglobulin sein und sich somit analog dem rekombinanten ȕ₂-M verhalten. Das andere ABC-Produkt müsste dann das entsprechende Isomer sein und demzufolge andere (LJHQVFKDIWHQDXIZHLVHQ'DDEHUNHLQHVGHUEHLGHQ/LJDWLRQV3URGXNWH eine zum rekombinanten ȕ₂0LNURJOREXOLQNRQJUXHQWH6WUXNWXUDXIZHLVW LVW GDV 9RUOLHJHQ HLQHV VROFKHQ ,VRPHUHQ*HPLVFKHV ]XYHUOlVVLJ DXV]XVFKOLH‰HQ 8P OHW]WOLFK HLQH )DOWXQJ GHU V\QWKHWLVFKHQ ABC-Produkte mit der Struktur des rekombinanten ȕ₂0 KHUEHL]XIKUHQ VROOWH HV YRQ 9RUWHLO VHLQ YRQ HLQHU XQJHIDOWHWHQ )RUP DXV]XJHKHQ Daher wurden Bedingungen für eine Denaturierung der beiden ABC-Produkte untersucht.

Abbildung 41:

FTIR-Spektren vom ABCBJUQ ABCBURW UHNȕ₂-M (schwarz)

4.1.3.6. Denaturierung der linearen ȕ₂-M-Produkte

8P GLH XQWHUVFKLHGOLFKHQ 6HNXQGlU6WUXNWXUHQ YRQABC_1 und ABCB DXI]XEUHFKHQ ZXUGH GDV *HPLVFK GHQDWXULHUHQGHQ %HGLQJXQJHQ DXVJHVHW]W ' K GDVV YRUKHUUVFKHQGH .UlIWH ]ZLVFKHQ YHUVFKLHGHQHQ %HUHLFKHQ ZHOFKH GLH 6WUXNWXUHQ ]XVDPPHQKDOWHQ JHVW|UW ZHUGHQ VROOWHQ+LHUVROOWHHLQHFKHPLVFKH'HQDWXULHUXQJPLWWHOVYHUVFKLHGHQHU/|VXQJVPLWWHOJHVFKHKHQ

=XPHLQHQVROOWHHUPLWWHOWZHUGHQRES+bQGHUXQJHQGHU/|VXQJHLQHQ(LQÀXVVKDEHQXQG]XP DQGHUHQ VROOWH GHU (IIHNW XQWHUVFKLHGOLFKHU 'HQDWXULHUXQJVPLWWHO ZLH *XDQLGLQ‡+&O +DUQVWRII +H[DÀXRULVRSURSDQRO+),3XQG7)$VWXGLHUWZHUGHQ(VVROOWHDOVRXQWHUVXFKWZHUGHQRELQ

$EKlQJLJNHLW GHV S+:HUWHV XQG GHU GDPLW HLQKHUJHKHQGHQ /DGXQJVYHUVFKLHEXQJ LP 3URWHLQ HLQH .RQIRUPDWLRQVbQGHUXQJ ]X EHREDFKWHQ LVW +LHUIU ZXUGH GDV ABC*HPLVFK GUHL YHUVFKLHGHQHQS+:HUWHQ!DXVJHVHW]W,PVDXUHQ0LOLHXLVWHLQhEHUVFKXVVDQ3URWRQHQ YRUKDQGHQ ZDV ]X HLQHU$QODJHUXQJ GLHVHU DQ GHU &DUER[\OJUXSSH IKUW 'LHV KDW ]XU )ROJH dass im Protein vorhandene negative Ladungen eliminiert werden und somit keine ionischen :HFKVHOZLUNXQJHQ]ZLVFKHQGHQ&DUER[\OJUXSSHQXQGGHQSRVLWLYHQ/DGXQJHQLP3URWHLQPHKU P|JOLFKVLQG=XVlW]OLFKZHUGHQYHUHLQ]HOW:DVVHUVWRII%UFNHQ%LQGXQJHQJHVW|UW*HQDXVRZLH LP6DXUHQOLHJWEHLHLQHPEDVLVFKHQ0LOLHXHLQHDQGHUH,RQHQ=XVDPPHQVHW]XQJYRU+LHULVWGLH

$PLQRJUXSSHYRQ/\VLQXQGGLH&DUER[\OJUXSSHGHSURWRQLHUWZDV]XHLQHUK|KHUHQQHJDWLYHQ Ladung innerhalb des Proteins führt. Sind also die verschiedenen Strukturen von ABC_1 und ABC_2 auf unterschiedliche ionische Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brücken-Bindungen ]XUFN]XIKUHQGDQQVROOWHXQWHUHLQHPGHUGUHLS+:HUWHGLH6WUXNWXUDXIJHEURFKHQZHUGHQ 1DFKNXU]HU9HUZHLOGDXHU KGHVABC*HPLVFKHVHUIROJWHOHGLJOLFKLP%DVLVFKHQJUQHLQ PLQLPDOHU6KLIWLQGHQ53+3/&&KURPDWRJUDPPHQLQ5LFKWXQJGHVABC_1 (Abbildung 42a).

1DFKGHP GDV ABC*HPLVFK GHQ YHUVFKLHGHQHQ S+:HUWHQ OlQJHUH =HLW DXVJHVHW]W ZDU

EHU 1DFKW EHVWlWLJWH VLFK GHU 6KLIW LQ GHU 53+3/& YRPABC_2 zum ABCB IU S+ !

EHU 1DFKW EHVWlWLJWH VLFK GHU 6KLIW LQ GHU 53+3/& YRPABC_2 zum ABCB IU S+ !

Im Dokument Kombination chemischer, gentechnischer und enzymatischer Methoden zur Darstellung schwer synthetisierbarer Proteine (Seite 38-60)