Vergleich der Sensibilisierungskinetik von Effektorzellen der Typ I-Allergie bei der Katze während wiederholter Exposition mit Ctenocephalides felis in hoher und geringer Intensität

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Vergleich der Sensibilisierungskinetik von Effektorzellen der Typ I-Allergie bei der Katze während wiederholter Exposition

mit Ctenocephalides felis in hoher und geringer Intensität

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Matthia s S ydo w

Berlin

Hannover 2009

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Georg von Samson-Himmelstjerna Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. Wolfgang Leibold Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Georg von Samson-Himmelstjerna

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Reinhard Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2009

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Für meine Mutter

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Inhalt

1 Einleitung und Zielsetzung... 13

2 Literaturübersicht... 16

2.1 Allergie ... 16

2.1.1 Übersicht über die verschiedenen Allergietypen ...17

2.1.2 Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I...25

2.1.3 Arthropoden als Auslöser von Typ I-Immunantworten...28

2.2 Allergiediagnostik ... 30

2.2.1 In vivo-Verfahren ...31

2.2.2 In vitro-Verfahren...32

2.3 Flohallergie-Dermatitis ... 36

2.3.1 Allgemeines ...36

2.3.2 Biologie des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis...37

2.3.3 Ätiologie und Pathogenese der FAD...38

2.3.4 Diagnostik...39

2.3.5 Therapie und Parasitenbekämpfung ...40

3 Geräte, Material und Methoden ... 49

3.1 Geräte ... 49

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3.2 Material ... 51

3.2.1 Klinikbedarf...51

3.2.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterial...52

3.2.3 Reagenzien ...54

3.2.4 Puffer und Lösungen ...55

3.2.5 Antikörper und Sera...57

3.2.6 Antigene ...57

3.2.7 Software ...57

3.3 Versuchstiere ... 58

3.3.1 Katzen ...58

3.3.2 Katzenflöhe ...59

3.4 Methoden ... 59

3.4.1 Verlaufsuntersuchung...59

3.4.2 Blutentnahme ...60

3.4.3 Herstellung und Aufbereitung der Antigene ...61

3.4.4 Funktioneller in vitro Test (FIT) zum Nachweis Typ I-allergischer Effektorzellen...63

3.4.5 Intrakutantest (IKT) ...67

3.4.6 Radio Immuno Assay (RIA) ...69

3.4.7 Parasitologische Untersuchungen ...73

3.4.8 Statistik...74

4 Ergebnisse ... 77

4.1 Optimierung des FIT für die Allergiediagnostik bei der Katze... 77

4.1.1 Verdünnung der Blutproben...78

4.1.2 Optimierung der Ca-Konzentration im Freisetzungspuffer...80

4.1.3 Lagerung und Transport von Blutproben...82

4.1.4 Titration der Antikörperkonzentration ...84

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4.2 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung ... 86

4.2.1 Flohinfestation ...86

4.2.2 Koproskopische Untersuchung ...92

4.2.3 Funktioneller in vitro-Test (FIT) ...92

4.2.4 Intrakutantest...125

4.2.5 Übereinstimmung der Ergebnisse aus FIT und IKT ...134

5 Diskussion ... 137

5.1 Methodik des FIT... 137

5.1.1 Modulation der Spontanfreisetzung von Basophilen der Katze ...137

5.1.2 Reaktionsbereitschaft von Basophilen im Hinblick auf Lagerungsdauer und Temperatur...139

5.2 Sensibilisierungskinetik von Basophilen und Mastzellen auf C. felis- Antigen ... 141

5.2.1 Zusammenhang zwischen Intensität der Flohinfestation und Antigenexposition ...145

5.2.2 Einfluss der Expositionsintensität auf die Sensibilisierungskinetik...146

5.3 Beurteilung der Reaktion der Basophilen im FIT auf die verwendeten Flohantigen-Präparationen... 149

5.4 Vergleich des Reaktionsverhaltens von Basophilen und Mastzellen... 151

6 Zusammenfassung... 154

7 Summary ... 156

8 Literaturverzeichnis ... 158

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Verzeichnis der Abkürzungen und Glossar der Fachtermini

ad. us. vet. ad usum veterinarium, (Arzneimittel) zum veterinärmedizinischen Gebrauch

ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity, antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität Advantage^® Handelsname für ein spot-on Präparat mit dem

Wirkstoff Imidacloprid zur Flohbekämpfung

Ag Antigen

Ag-Freisetzung Antigeninduzierte Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten

Ak Antikörper

Ak-Freisetzung Antikörperinduzierte Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten

Aliquot Teilprobe

APC Antigen presenting cells, antigenpräsentierende Zellen

arithm. arithmetisch(er)

ATP Adenosintriphosphat

Ausgangsquaddel Quaddel, die beim Intrakutantest an der Injektionsstelle allein durch das injizierte Volumen der Antigenlösung hervorgerufen wird

A. dest. Aqua destillata, destilliertes Wasser

A. tridest. Aqua tridestillata, dreifach destilliertes Wasser

B Probe im RIA, deren Histamingehalt bestimmt werden soll

B0 Vergleichsprobe im RIA ohne zugesetzten

Histaminstandard, die ausschließlich 125

I- Histamintracer enthält

B / B0 Quotient, der die Höhe der Aktivität des 125

I-

Histamintracer in der zu untersuchenden Probe B im Verhältnis zur Kontrollprobe B0 angibt

BCA™ Bicinchoninic Acid, 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure Boxplot Diagrammform zur Darstellung der Verteilung

numerischer Daten

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BSA Bovines Serumalbumin

Bq Becquerel, Einheit für radioaktive Zerfälle pro Sekunde

CaCl2 Calciumchlorid

CDC complement dependent cytotoxicity,

komplementabhängige Zytotoxizität

Cf Ctenocephalides felis-Antigen

C. felis Ctenocephalides felis, Katzenfloh

cpm counts per minute, Zählimpulse pro Minute

Da Dalton

DαG Donkey-anti-goat, Esel-anti-Ziege-Ig-Antikörper

DMSO Dimethylsulfoxid

Donkey anti goat Serum Esel-anti-Ziege Ig-Immunserum

early onset Kinetik Sensibilisierungsmuster, bei dem bereits in der Frühphase der Antigenexposition eine funktionelle Sensibilisierung im FIT nachweisbar wird

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay,

enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

EDTA Ethylendiamintetraacetat

Fc Fragment crystallizable, kristallinisierbares Fragment eines Antikörpers

FcR Fc-Rezeptor, Molekül auf der Zelloberfläche von Immunzellen, welches Antikörper über deren Fc-Teil binden kann.

FIT Funktioneller in vitro-Test zum Nachweis der Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen Flohinfestation Besiedlung eines Wirtes mit Flöhen

flohnaiv Zustand, wenn ein Tier bisher keiner Flohinfestation ausgesetzt war

Freis. Freisetzung

GABA γ-Amino-Buttersäure

Gαh Goat anti histamine, Ziege-anti-Acylhistamin-Antikörper

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generelle Sensibilisierung Fähigkeit der basophilen Granulozyten, durch Vermittlung ihrer membranständigen Antikörper auf eine Antikörperstimulation zu reagieren. Die generelle Sensibilisierung kann mit Hilfe der Ak-Freisetzung überprüft werden.

geringe Exposition Belastung mit einer geringen Flohantigenmenge

gesaugte Flöhe Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen haben, was sich im Stereomikroskop durch den Nachweis von Erythrozytenhämoglobin im Verdauungstrakt bestimmen lässt

HCl Salzsäure

Histaminstandard Lösung mit definierter Histaminkonzentration zur Anwendung im RIA

hohe Exposition Belastung mit einer hohen Flohantigenmenge

Ig Immunglobulin

IgG (H+L) Immunglobulin G (heavy + light, schwere und leichte Kette)

125I-Histamintracer ¹²⁵I-konjugiertes Histamin, welches im RIA zur kompetitiven Bestimmung des Histamingehaltes einer Probe verwendet wird

IKT Intrakutantest

K Kalium

KCl Kaliumchlorid

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

Kodan^® Desinfektionsspray zur Hautdesinfektion

late onset Kinetik Sensibilisierungsmuster, bei dem erst in einer späteren Phase der Antigenexposition eine funktionelle

Sensibilisierung im FIT nachweisbar wird

MAC Membrane attacking complex, Membran attackierender Komplex

Max Maximalfreisetzung: gesamte zur Verfügung stehende Histaminmenge, die durch basophile Granulozyten freigesetzt und nachgewiesen werden kann

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MFO mixed function oxidase, Oxidasen, die unter Bildung von H2O 2 Substrate gleichzeitig oxidieren: AH2 + BH + O2 werdenunter der Wirkung solcher Oxidasen zu A + BOH + H2O

MgCl2 Magnesiumchlorid

MHC Major Histocompatibility Complex,

Haupthistokompatibilitätskomplex

MW Mittelwert

n.a. nicht auswertbar

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

(NH4)HCO3 Ammoniumbikarbonat

NaN3 Natriumazid

NaOH Natriumhydroxyd (Natronlauge)

NSB nichtspezifische Bindung: Kontrollansatz für nicht antikörpergebundenes Histamin im RIA

NHS-Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin

PBS Phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PEG Polyethylenglykol

Pipes Piperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic]acid pH potentia Hydrogenii, negativer dekadischer

Logarithmus der H⁺-Ionenkonzentration einer Lösung

rF relative Feuchte

RαC Rabbit anti Cat, Kaninchen-anti-Katzen-IgG Antikörper Reaktionsquaddel Quaddel, die sich beim Intrakutantest infolge der

Reaktion auf die injizierten Substanzen / Antigene bildet

ROS Reactive oxygen species, freie Sauerstoffradikale

SD standard deviation, Standardabweichung

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spezifische Sensibilisierung Vorhandensein von Antikörpern einer bestimmten Spezifität auf der Oberfläche von basophilen Granulozyten oder Mastzellen, die ein Antigen

spezifische erkennen und nach ausreichender Bindung (bridging) eine Ag-induzierte Freisetzung vermitteln können.

Spon Spontane Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten, die ohne eine stimulierende Substanz (wie Antigen oder Antikörper) unter schonenden Inkubationsbedingungen auftritt.

spot on Präparat bzw. Applikationsverfahren, bei dem der Wirkstoff durch Auftropfen auf die Haut angewendet wird

Stamm „G“ Laborstamm von C. felis, der bei Greer Labs zur Herstellung des Antigenextrakts WBE-G verwendet wurde

Stamm „H“ Laborstamm von C. felis, der im Institut für

Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Herstellung des Antigenextrakts WBE-H

verwendet wurde

T Tracer:hier ¹²⁵Iod-Histamin-Tracer

t0 Zeitpunkt 0, zu dem im Intrakutantest der Durchmesser der Ausgangsquaddel ermittelt wird

TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover

Triton X 100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol Trizma^® Base Tris[hydroxymethyl]aminomethan Tween 20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

verd. verdünnt

WBE-G Whole Body Extract-Greer (Ganzkörperextrakt von Flöhen des “Stammes G” von Greer Laboratories, USA)

WBE-H Whole Body Extract-Hannover (selbsthergestellter Ganzkörperextrakt von Flöhen des “Stammes H”) Whisker vertikale Linie in einem Boxplot

w/v weight per volume, Gewicht pro Volumen

Ziege-anti-Acylhistamin von Ziegen stammende Antikörper mit Spezifität gegen Acylhistamin

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E I N L E I T U N G U N D Z I E L S E T Z U N G

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1 Einleitung und Zielsetzung

Das Auftreten von Allergien ist ein Phänomen, welches mit zunehmender Häufigkeit nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Tieren zu beobachten ist. Trotz der steigenden Relevanz dieses vielfältigen Krankheitsbildes ist eine ursächliche Therapie bislang nicht gefunden.

Zwar sind wichtige Immunmechanismen bekannt, die zu der klinischen Symptomatik führen, was aber die über eine schützende Immunantwort hinausgehende Reaktion eines Individuums gegen ein oder mehrere Antigene auslöst und wie diese beeinflusst werden kann, ist Gegenstand der Forschung. Die am häufigsten auftretende Form der Allergie ist die Typ I-Allergie, welche auch als Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp bezeichnet wird.

Grundvoraussetzung für die Ausprägung einer Typ I-Allergie ist eine ausreichende Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen (basophilen Granulozyten und Mastzellen) mit geeigneten Antikörpern gegen eine bestimmte Substanz (Antigen). Um dies zu erreichen, muss ein Individuum zuerst spezifische Antikörper gegen antigene Teilstrukturen (Epitope) von Antigenen bilden, die zudem auf Grund ihres konstanten Teiles (Isotyp) geeignet sind, an membranständige Fc-Rezeptoren von Typ I- Effektorzellen in ausreichender Dichte zu binden. Derart sensibilisierte Basophile (vorwiegend im Blut) oder Mastzellen (vorwiegend in Haut und Schleimhaut) können nun von einem Antigen aktiviert werden, indem dieses gleichzeitig von mindestens zwei sensibilisierenden Antikörpern, somit an mindestens zwei Epitopen, gebunden wird und dadurch zur Vernetzung (bridging) von mindestens zwei Fc-Rezeptoren führt (KNOL 2006). Vernetzte Fc-Rezeptoren lösen in den Zellen Signalkaskaden aus, die zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren führen können. Abhängig von der Art und Stärke der Mediatorausschüttung werden von subjektiv nicht spürbaren, lokalen Entzündungsreaktionen, über deutlich spürbare, meist heftig juckende lokal überschießende allergische Reaktionen bis hin zu systemisch wirksamen Symptomen wie dem lebensbedrohlichen anaphylaktischen Schock, verschiedene Ausprägungen beobachtet. Die Regulationsmechanismen, die entscheiden, ob aus

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der Sensibilisierung gegen ein spezifisches Antigen eine klinisch manifeste Typ I- Allergie entsteht, sind komplex und bis dato nicht geklärt.

Eine Typ I-Allergie kann zum Beispiel neben Pollen und Futtermittelinhaltsstoffen auch gegen Antigene von Arthropoden gerichtet sein. Im Bereich der Kleintiermedizin ist hier vor allem der Katzenfloh, Ctenocephalides felis, als häufigster Ektoparasit von Hund und Katze zu nennen (REEDY et al. 1997). Neben der direkten Schädigung des Wirts durch Juckreiz, Verletzung der Haut und Blutverlust wird beim Saugakt Speichel in die Wunde injiziert, dessen Proteinkomponenten beim Wirt eine Typ I- Allergie auslösen und die Symptome einer Flohallergie-Dermatitis (FAD), wie Pruritus, Alopezie, Erytheme, Papeln und Exkoriationen hervorrufen können. Diese gehen oft mit einer miliaren Dermatitis einher. Die FAD ist eine der häufigsten dermatologischen Erkrankungen beim Kleintier (DRYDEN u. BLAKEMORE 1989).

Ein Verfahren zur Diagnostik der Flohallergie-Dermatitis ist der Intrakutantest (IKT), bei dem nach intradermaler Applikation des Antigens die Ödematisierung des Gewebes als lokale Reaktion der Mastzellen an der Applikationsstelle abgelesen und hieraus eine Aussage über den Sensibilisierungsstatus abgeleitet wird. Wegen des erhöhten Aufwands und gelegentlichen Schwierigkeiten bei der Interpretation der Ergebnisse (VROOM 2000) werden in der Praxis auch serologische Verfahren eingesetzt, die auf dem Nachweis von spezifischen Antikörpern im Patientenserum mittels eines ELISA beruhen. Diese sind jedoch klinisch weit weniger relevant als der Intrakutantest, da nur die auf den Mastzellen (wie auch den Basophilen) gebundenen sensibilisierenden Antikörper eine Zellaktivierung vermitteln und dadurch eine klinische Symptomatik auslösen können.

Als weiteres Testverfahren steht seit einigen Jahren der funktionelle in vitro-Test (FIT) zum Nachweis der Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen zur Verfügung, der im Gegensatz zu serologischen Tests darauf beruht, die Sensibilisierung der basophilen Granulozyten aus dem Blut des Patienten generell und gegen spezifische Antigene zu untersuchen (KAUL 1998; STUKE 2005).

Da das Verständnis über die Regulation der Typ I-Immunantwort noch unzureichend und der Nutzen einer spezifischen Immuntherapie zur Behandlung der FAD fraglich

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ist (PATERSON 2000; LAFFORT-DASSOT et al. 2004), zielt die gängige Behandlungsstrategie auf die Eradikation des Flohbefalls und somit auf die Verminderung oder Vermeidung einer Exposition von Flohantigenen ab (DRYDEN u.

BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; CARLOTTI u. JACOBS 2000; RUST 2005).

Hierzu steht ein breites Spektrum an Substanzen mit unterschiedlichem Wirkmechanismus und Applikationsart zur Verfügung.

Über den Einfluss der Antigenmenge auf das Sensibilisierungsverhalten von Effektorzellen der Typ I-Allergie bei der Katze ist bisher nichts bekannt. Daher sollte in dieser Arbeit die Entwicklung der spezifischen Sensibilisierung von nicht sensibilisierten und vorsensibilisierten Katzen gegen Antigene des Flohspeichels von Ctenocephalides felis mit Hilfe des funktionellen in vitro-Tests (FIT) untersucht werden, welcher unabhängig von einer klinischen Symptomatik anhand der membranständigen Antikörper eine funktionelle Sensibilisierung der Basophilen gegen Flohantigene nachweisen kann.

Dabei standen insbesondere folgende Fragestellungen im Vordergrund:

1. Wie kann der FIT für die Katze methodisch optimiert werden?

2. Welchen Einfluss hat die mehrmonatige, wöchentliche Applikation einer hohen bzw. einer deutlich geringeren Antigenmenge durch Exposition mit C. felis auf den Grad und die Kinetik der Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen?

3. Welche Aussagen können anhand des FIT hinsichtlich der benötigten Antigenmenge zur Induktion einer Sensibilisierung gegen C. felis gemacht werden?

4. Wie korrelieren die Resultate des funktionellen in vitro-Tests (FIT) mit dem Intrakutantest (IKT) als in vivo-Testverfahren?

5. Wie unterscheiden sich verschiedene Antigenpräparationen von Ctenocephalides felis in der Reaktionsbereitschaft der Basophilen im FIT bzw. der Mastzellen im IKT?

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L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T

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2 Literaturübersicht

2.1 Allergie

Bei der Interaktion des Organismus mit seiner Umwelt wird dieser mit biotischen und abiotischen Faktoren konfrontiert. Vom Immunsystem eines Individuums werden von all diesen Faktoren nur diejenige mit einer Immunreaktion beantwortet, die die vom Immunsystem zu überwachende genetisch vorgegebene „innere Ordnung“ stören.

Geschieht diese „Störung“ durch körpereigene Strukturen, die der Organismus eliminieren möchte (falsch ausdifferenzierte, geschädigte oder funktionsgestörte Zellen bzw. Tumorzellen), so setzt das Immunsystem dazu ein breites Spektrum an Immunmechanismen ein. Diese wünschenswerten Immunreaktionen werden als

„Autoimmunität“ bezeichnet. Autoimmunität ist somit nicht schädlich, sondern sogar lebensnotwendig. Sollten jedoch dieselben Immunmechanismen statt unerwünschter funktionsfähige und deshalb erhaltenswerte Zellen angreifen und zerstören, so wird diese immunologische Selbstzerstörung als „Autoaggression“ bezeichnet. Es können klinische Symptome entstehen, die dann als „Autoaggressionserkrankung“ oder synonym als „Autoimmunerkrankung“ bezeichnet werden. Vergleichbar ist es bei Störung der inneren Ordnung durch von außen kommende (exogene) Strukturen.

Prinzipiell die gleichen Immunmechanismen, die eine schützende Autoimmunität oder eine pathogene Autoaggression bewerkstelligen, können gegen störende exogene Strukturen einerseits schützende Immunantworten („Immunität“) oder andererseits überschießende pathogene Immunreaktionen entwickeln. Diese können zu klinischen Symptomen führen, die als „Allergie“ bezeichnet werden. Warum es im Einzelfall statt einer Autoimmunität zu einer unerwünschten Autoaggression gegen körpereigene Strukturen kommt, ist ebenso unbekannt wie die Ursachen der Entstehung einer pathogenen Allergie statt einer schützenden Immunität gegen körperfremde Strukturen.

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Strukturen, die vom Immunsystem erkannt werden, nennt man „Antigen“. Reagiert ein Individuum auf ein körperfremdes Antigen mit einer überschießenden Immunreaktion, die zu klinischen allergischen Symptomen führt, so stellt dieses Antigen für dieses Individuum ein „Allergen“ dar. Somit macht erst die überschießende Immunreaktion eines Individuums ein Antigen zum „Allergen“. Es ist jedoch nicht zu übersehen, dass einige Antigene häufiger und andere seltener mit überschießenden Immunreaktionen beantwortet werden, also häufiger bzw. seltener als „Allergene“ in Erscheinung treten. (JANEWAY et al. 2002).

2.1.1 Übersicht über die verschiedenen Allergietypen

Bei schützenden wie überschießenden Immunantworten ist prinzipiell das gleiche Spektrum an Immunreaktionen beteiligt. Abhängig von der Art der Störung der

„inneren Ordnung“ werden jedoch unterschiedliche Komponenten und Mechanismen des Immunsystems eingesetzt, was zu sehr verschiedenen Abläufen und klinischen Symptombildern führen kann.

GELL und COOMBS versuchten im Jahr 1968 unterschiedliche Formen von allergischen Immunreaktionen mit den beteiligten Komponenten und Mechanismen zu „ordnen“, indem sie sie in „Reaktionstypen“ einteilten. Da die gleiche Einteilung sich auch für schützende Immunreaktionen eignete, spricht man heute generell von Immunreaktionstypen und nicht mehr nur von „Allergietypen“.

Die Immunreaktionstypen I, II und III beschreiben unterschiedliche zelluläre Immunreaktionen in Interaktion mit Antikörpern und/oder Komplementkomponenten.

Der Immunreaktionstyp IV wird allein von Immunzellen ohne Beteiligung von Antikörpern oder Komplement durchgeführt. Der nachträglich hinzugekommene Immunreaktionstyp V wird allein von Antikörpern ohne Beteiligung von Zellen oder Komplement bewerkstelligt.

Die Typ I-Allergie, die auch als Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp bezeichnet wird, kann binnen Minuten bis Stunden nach Antigenkontakt zu einer klinischen Reaktion führen. Diese geht mit Vasodilatation, erhöhter

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Gefäßpermeabilität, und Juckreiz einher und kann bis zum allergischen Schock führen. Ausgelöst wird dies von Mediatorsubstanzen (Entzündungsmediatoren, Zytokinen und Chemokinen) aus aktivierten Effektorzellen der Typ I-Immunreaktion, basophilen Granulozyten und Mastzellen. Diese „Typ I-Effektorzellen“ haben selbst keine spezifischen Erkennungsmöglichkeiten wie B-Lymphozyten (selbst gebildete membranständige Antikörper) oder T-Lymphozyten (selbst gebildete membranständige Antigenrezeptoren). und können deshalb alleine auch keine Antigenstrukturen spezifisch erkennen. Werden die Typ I-Effektorzellen unspezifisch aktiviert, z. B. durch die Komplementkomponenten C3a, C5a (auch als Anaphylatoxine bezeichnet) oder durch eine Reihe von Medikamenten, so spricht man von einer „allergoiden“ oder pseudoallergischen Reaktion.

Sollen die Typ I-Effektorzellen spezifisch gegen Antigenstrukturen (Epitope) reagieren können, müssen sie zuvor mit Antikörpern ausgestattet werden, die diese Epitope mit ausreichender Bindungsstärke (Affinität) erkennen. Um solche Antikörper wirkungsvoll aufzunehmen, sind Mastzellen und Basophile mit Fc-Rezeptoren ausgestattet, die besonders stark IgE-Ak (Fcε-Rezeptor I: FcεRI) aber auch bestimmte IgG-Ak (Fcγ-Rezeptor II und III: FcγRII, FcγRIII) binden können. Unter immunologischer „Sensibilisierung“ ist die Bindung geeigneter Ak-Isotypen an Fc- Rezeptoren von Typ I-Effektorzellen zu verstehen. Erst dadurch werden diese Zellen in die Lage versetzt, eine spezifische Typ I Immunreaktion auszulösen, die im überschießenden Falle zu den Symptomen einer Typ I-„Allergie“ führt.

Werden beim Erstkontakt mit einem Antigen spezifische Antikörper dagegen gebildet, so sind es stets zuerst Antikörper vom IgM Isotyp. Da die Typ I- Effektorzellen keine geeigneten Fc-Rezeptoren für IgM ausbilden, eignen sich IgM- Ak nicht als sensibilisierende Antikörper für Typ I-Immunreaktionen. Entwickelt ein Individuum Antikörper mit gleicher Spezifität, jedoch anderen Isotypen als IgM, so hat es zu diesem Isotypwechsel die Zytokinhilfe von T-Helferzellen in Anspruch genommen. Wirken dabei überwiegend Zytokine (bevorzugt IL-4) von T-Helferzellen 2 (Th2) auf die Ak-produzierenden B-Lymphozyten ein, so werden sie vom nicht sensibilisierenden IgM zu den sensibilisierenden Ig-Isotypen IgG4 (beim Menschen) und IgE wechseln. Dominiert hingegen der Einfluss der T-Helferzelle 1 (Th1) mit

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ihrem Zytokin IFN-γ, so wird ein Wechsel zu sensibilisierenden Isotypen gehemmt, aber dafür andere, nicht sensibilisierende Isotypen wie IgG1, 2 oder 3 (beim Menschen) ausgebildet. Somit kann es gegen ein Antigen Antikörper mit gleicher Epitopspezifität, jedoch unterschiedlichen, sensibilisierenden und nicht sensibilisierenden Isotypen geben. Dies ist eine Ebene, die darüber entscheidet, ob ein Individuum gegen ein bestimmtes Antigen Typ I allergisch wird oder nicht, denn ohne eine ausreichende Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen kann sich keine Typ I-Allergie entwickeln. Zu weiteren Mechanismen von Typ I-Immunreaktionen und ihrer Regulation s. 2.1.2.

Es gibt Individuen, die gegen eine Reihe von Antigenen sensibilisiert sind und auf diese vermehrt mit Typ I-Allergien reagieren. Dieses als Atopie bezeichnete Krankheitsbild kann bei Hunden bestimmter Rassen häufiger auftreten (TIZARD 2004).

Verbreitete Beispiele für Typ I-Allergien sind die Flohallergie-Dermatitis bei Hund und Katze, das Sommerekzem (Insektendermatitis) sowie die Pollenallergie bei Pferden (eine Ursache des Headshakings) und bei Menschen (Heuschnupfen). Insgesamt sind Typ I-Allergien gegen ein wachsendes Spektrum an Antigenen an einer zunehmenden Zahl sehr unterschiedlicher Erkrankungen beteiligt.

An Typ II-Immunreaktionen sind als Effektorzellen Natürliche Killerzellen (NK- Zellen) und Phagozyten (Makrophagen, Monozyten, neutrophile und eosinophile Granulozyten) beteiligt. Sie sind sowohl mit Fc-Rezeptoren (FcγR I, II, III) für aktivierte Fc-Teile mehrerer IgG-Isotypen als auch mit Rezeptoren (die Komplementrezeptoren: CR1, CR3 & CR4) für die aktivierten bzw. inaktivierten C3 Komplementkomponenten C3b bzw. iC3b ausgestattet.

Sobald ein Antikörper, der durch seine spezifische Bindung an ein Epitop auf einer Zelle, einem Gewebe oder einem Partikel (Zell- oder Gewebsfragment, Virus, Bakterium, Parasit) seinen Fc-Teil „aktiviert“, d.h. so umstrukturiert, dass er nun direkt und ausreichend stark an einen der Fc-Rezeptoren dieser Effektorzellen binden kann, wird er zum „opsonisierenden“ Antikörper: Er markiert seine partikuläre Zielstruktur für die Typ II Effektorzellen. Binden mindestens zwei opsonisierende

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Antikörper auf einem Partikel an zwei FcR einer Effektorzelle („bridging“), so kann diese aktiviert werden. Dies führt entweder zur Phagozytose des opsonisierten Partikels (durch Makro- oder Mikro-Phagen) oder zum Abtöten (zytotoxische Aktivität) durch NK-Zellen in Form der ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity = Ak-abhängige zelluläre Zytotoxizität) z. B. von opsonisierten Tumorzellen. Sehr effizient tragen zu Typ II-Immunreaktionen auch IgM-Ak bei, obwohl kaum eine dieser Effektorzellen dafür einen Fc-Rezeptor (FcµR) besitzt.

Bindet das meist als Pentamer im Serum vorkommende IgM spezifisch an ein partikuläres Epitop, aktiviert es seine Fc-Teile und kann nun auf Grund seiner Pentamerstruktur sehr effizient die Komplementkaskade klassisch aktivieren (beginnend mit C1q), so dass seine aktivierten Fc-Teile sehr schnell mit C3b- Molekülen umgeben sind. Damit wird IgM samt C3b zum „opsonisierenden“ Komplex für das Partikel, auf dem das IgM ein oder mehrere Epitope spezifisch erkannt hat. Er kann nun an Komplementrezeptoren auf den Typ II-Effektorzellen binden und sie - bei ausreichendem „bridging“ - zur Phagozytose oder zur zytotoxischen Wirkung aktivieren.

Sind keine Effektorzellen rechtzeitig am Ort der Opsonisierung (obwohl sie durch Komplementspaltprodukte, insbesondere C5a, chemotaktisch herangelockt werden), kann eine Komplementkaskade, ausgelöst durch die primäre spezifische Bindung eines IgM oder eines komplementbindenden IgG-Isotyps, über C3 hinaus bis zum Membran-attackierenden Komplex (MAC: C5b-C6-C7-C8-C9) ablaufen und intakte Partikel (Zellen, Bakterien, Parasiten) dadurch so weit schädigen, dass sie inaktiviert bzw. abgetötet werden (CDC: complement dependent cytotoxicity = komplementabhängige Zytotoxizität). In der Frühphase einer Immunreaktion gegen ein partikuläres Epitop, zu der noch keine oder zu wenige Antikörper gebildet wurden, kann eine Typ II-Reaktion auch direkt von Komplementkomponenten ausgelöst werden: Über den „Lektinweg“ oder den „alternativen“

Komplementaktivierungsweg können unspezifische Strukturen auf (meist körperfremden) Partikel die Komplementkaskade auch ohne initiale Antikörper auslösen und zu einer C3b- und C5a-vermittelten Aktivierung von Typ II Effektorzellen oder zur CDC führen (JANEWAY et al. 2002; TIZARD 2004).

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Somit stehen dem Immunsystem mit den Mechanismen der Typ II-Reaktionen flexible und vielseitige Möglichkeiten zur Kontrolle unerwünschter Zellen und Gewebe, samt ihrer partikulären Fragmente und Eindringlinge von außen (Fremdkörper, Viren, Bakterien, Parasiten) für eine permanente und lebensnotwendige Immunüberwachung seines Organismus (Autoimmunität) zur Verfügung.

Werden diese Typ II-Mechanismen vom Immunsystem zu nicht erwünschten

„überschießenden“ Reaktionen gegen intakte Zellen und deren Zerstörung eingesetzt, z. B. gegen autologe Epitope auf intakte Erythrozyten oder intakten Thrombozyten, so führt diese Autoaggression zur autoimmunhämolytischen Anämie (AIHA, „primäre“ Anämie) oder autoimmunen Thrombopenie (AITP, „primäre“

Thrombopenie). Setzen sich jedoch auf den Erythrozyten bzw. Thrombozyten körperfremde (xenogene) Strukturen wie Medikamente (z. B. Penicillin, Sulfonamide, Chinine) oder Komponenten von Erregern (z. B. Bakterien) ab, gegen die das Immunsystem Antikörper gebildet hat, so werden diese Zellen über art- und körperfremde (xenogene) Epitope durch Antikörper und / oder Komplement zur Phagozytose oder ADCC opsonisiert bzw. durch CDC zerstört. Dies sind Beispiele einer Typ II-Allergie, die hier zur immunbedingten hämolytischen Anämie (IMHA,

„sekundäre“ Anämie) oder immunbedingten Thrombopenie (ITP, „sekundäre“

Thrombopenie) führen können. Abhängig davon, auf welchen Zellen oder Geweben autologe Strukturen zu überschießenden Typ II-Autoaggressionsreaktionen oder abgelagerte xenogene Strukturen zu überschießenden Typ II allergischen Reaktionen führen, können sehr unterschiedliche Erkrankungsbilder entstehen.

Unter Typ III-Immunreaktionen werden Komponenten und Mechanismen zusammengefasst, die in vielen Aspekten Typ II-Reaktionen entsprechen: Typ III- Effektorzellen sind ebenfalls gekennzeichnet durch die konstitutive Expression von Fcγ- bzw. Fcε-Rezeptoren und / oder Rezeptoren für die Komplementkomponenten C3b bzw. C3a, C4a, C5a. Somit umfassen sie alle Typ II-Effektorzellen, erweitert um Basophile, Thrombozyten, dendritische Zellen und B-Lymphozyten. Beteiligt können alle Ak-Isotypen sein, für die entweder FcR vorhanden sind und / oder die nach

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Aktivierung durch Ag-Bindung Komplement aktivieren können. D. h. alle Ig-Isotypen, mit Ausnahme des IgA, können sich wirkungsvoll an Typ III Immunreaktionen beteiligen.

Diese bestehen darin, dass – im Gegensatz zu Typ II – nicht partikulär gebundene Epitope, sondern Epitope auf löslichen Strukturen im Körper durch freie Antikörper spezifisch gebunden werden. Diese primär löslichen Immunkomplexe können sekundär mit den aktivierten Fc-Teilen ihrer Antikörper direkt an Typ III-Effektorzellen mit geeigneten FcR andocken und diese zu einer Eliminationsreaktion, Auslösung einer Entzündungsreaktion bzw. Induktion einer spezifischen Immunantwort aktivieren. Teilweise ist das auch indirekt möglich, indem aktivierte Fc-Teile komplementbindender Ak-Isotypen in solchen Immunkomplexen die klassische Komplementkaskade aktivieren und so Zellen mit C3b-Rezeptoren aktivieren. Zum Repertoire von Typ III-Immunreaktionen gehört zusätzlich, dass - meist xenogene - lösliche Substanzen auch ohne vorherige Bindung durch Antikörper über den Lektin- oder alternativen Weg das Komplementsystem aktivieren und so über Zellen mit geeigneten Komplementrezeptoren eine Eliminations- oder Entzündungsreaktion auslösen (JANEWAY et al. 2002; TIZARD 2004).

Treten „überschießende“ Typ III-Reaktionen gegen körpereigene lösliche Strukturen auf, so kommt es zu Typ III-Autoaggressionsreaktionen wie beim Lupus erythematodes oder bei rheumatoiden Erkrankungen mit Bildung von Rheumafaktoren und vermehrt Immunkomplexen. Werden „überschießende“ Typ III- Immunreaktionen gegen körperfremde lösliche Strukturen von physiologischer, prophylaktischer oder therapeutischer Bedeutung entwickelt (z. B. schützende allogene oder xenogene Antikörper in Form einer passiven Immunisierung), so können diese eine Typ III Allergie bedingen. Sie kann nur lokal ausgeprägt sein (Arthus-Reaktion) oder systemisch (Serumkrankheit). Bevor geeignete Antibiotika zur Verfügung standen, wurde zur Therapie von lebensbedrohlichen bakteriellen Infektionen des Menschen Antiserum von zuvor immunisierten Pferden eingesetzt, welche gegen die Erreger Antikörper gebildet hatten. Dabei trat als Komplikation sieben bis zehn Tage nach Behandlung mit dem Antiserum eine

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immunkomplexbedingte Überempfindlichkeitsreaktion mit Fieber, Vaskulitis, Glomerulonephritis und Arthritis auf.

Während bei Immunreaktionen der Typen I, II und III eine spezifische Epitoperkennung durch den Fab-Teil des Antikörpers erfolgt und alle nachfolgenden Funktionen durch den Fc-Teil der Antikörper vermittelt werden, ist dies bei Immunreaktionen der Typen IV oder V nicht der Fall: Bei Typ IV Immunreaktionen sind Antikörper nicht beteiligt und bei Typ V spielt allein der Fab-Teil des Antikörpers die funktionelle Rolle.

Obwohl bei den Typ IV-Immunreaktionen nur Zellen beteiligt sind, wird auch hier ein Spektrum unterschiedlicher Immunmechanismen zusammengefasst. Ihnen ist gemeinsam, dass sie lokal reagieren, mit begrenzter systemischer Auswirkung.

Abhängig vom Auslöser und den beteiligten Zellen können sich Typ IV- Immunreaktionen innerhalb von 24 Stunden oder später entwickeln und über mehrere Wochen anhalten. Zur Kontrolle bestimmter löslicher Substanzen, die selbst chemotaktisch wirken oder die Freisetzung chemotaktischer Substanzen induzieren (z. B. Hautdesinfektionsmittel, Pilz- oder Insektengifte) wandern lokal primär basophile Granulozyten ein, bald gefolgt von Lymphozyten und Monozyten. Diese Typ IV-Form wird auch als „Jones-Motes-Reaktion“ bezeichnet.

Bestimmte Antigene (wie Komponenten von Mykobakterien oder metallische Haptene wie Nickel und Chrom auf körpereigenen oder körperfremden Proteinen als Träger) werden von dendritischen Zellen aufgenommen und MHC-präsentiert.

Vorwiegend MHC-restringierte T-Helferzellen (CD4⁺), aber auch zytotoxische T- Zellen (CD8⁺) werden dadurch aktiviert und so die Proliferation epitop- bzw.

haptenspezifischer Zellen ausgelöst. Diese Gedächtniszellen können bei erneutem Auftreten „ihrer“ Epitope innerhalb von 24-72 h lokale Schwellungen in Form von zellulären Papeln durch Einwanderung, Proliferation sowie mittels Chemokinen angelockten Lymphozyten und Monozyten ausprägen. Diese Typ IV-Form wird als Tuberkulin- bzw. Kontaktreaktion bezeichnet.

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Dauert die lokale „Reizung“ der T-Lymphozyten über längere Zeit an, so kann sich eine als Granulomreaktion bezeichnete Typ IV-Form entwickeln. Sie hält über Wochen an und ist durch Hinzukommen von Makrophagen, Riesenzellen sowie Epithelzellen mit anschließender Fibrosierung gekennzeichnet.

Beispiele für Autoaggressionsreaktionen durch „überschießende“ Typ IV- Mechanismen gegen autologe Epitope sind der insulinabhängige Diabetes mellitus (zytotoxische T-Zellen gegen ß-Zellen des Pankreas), multiple Sklerose (CD4⁺ T- Zellen gegen basisches Myelinprotein) sowie CD4⁺ T-Zellen gegen Autoantigene die zur Progression der rheumatoiden Arthritis beitragen. „Überschießende“ Typ IV- Mechanismen gegen ein weites Spektrum an körperfremden Strukturen wie Bakterien, Pilze, Parasiten, Pflanzen und als Haptene wirksame chemische Substanzen (Farbstoffe, Reinigungs- bzw. Desinfektionsmittel, Medikamente und Repellentien) können zu Typ IV-Allergien führen. Überschießende Typ IV-Reaktionen können auch bei der Spätform der FAD des Hundes von Bedeutung sein (TIZARD 2004).

Während bei Typ IV-Immunreaktionen die Zerstörung und Elimination von Zellen und Substanzen im Vordergrund stehen, dominiert bei Typ V-Immunmechanismen die regulative Wirkung im Sinne einer Ak-bedingten Stimulation oder Hemmung. Bildet das Immunsystem Antikörper gegen Zelloberflächenrezeptoren, so können diese den natürlichen Liganden imitieren. Sie aktivieren somit den Rezeptor, unterliegen jedoch nicht der Feedback-Kontrolle wie der Ligand. So kann es zu einer überschießenden Ak-bedingten Aktivierung der Rezeptoren für das Thyreoidea stimulierende Hormon (TSH-R) der Schilddrüsenepithelzellen kommen. Diese produzieren daraufhin überschießend viel Schilddrüsenhormone (T3, T4), was zur Hyperthyreose (Morbus Basedow oder Grave´s disease) führen kann. Ein Beispiel für eine hemmende Typ V Reaktion ist die Myasthenia gravis. Werden Antikörper gegen den Acetylcholinrezeptor auf Muskelzellen gebildet, die die Anlagerung neurogenen Acetylcholins blockieren, so kommt es zur schlaffen Muskellähmung, da eine ausreichende neuromuskuläre Erregung unterbleibt. Am selben Rezeptor kann es sogar zur Ak-bedingten Hemmung und Stimulation kommen, abhängig von der

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Bindungsstelle (Epitop) des Ak am Rezeptor: So können Antikörper gegen den Insulinrezeptor derart binden, dass sie die Anlagerung von Insulin blockieren. In Folge dessen wird keine Glucose in die Zellen aufgenommen und es entwickelt sich das Bild eines insulinresistenten Diabetes mit Hyperglykämie und Ketoazidose.

Bindet der Antikörper jedoch an einem anderen Epitop desselben Rezeptors, so imitiert er eine permanente Bindung von Insulin, stimuliert damit eine gesteigerte Aufnahme von Glucose in die Zelle, was zu einer Hypoglykämie führt. (JANEWAY et al. 2002)

Werden diese Antikörper direkt gegen autologe funktionsfähige Strukturen gebildet, so wirken sie mit ihrer Hemmung oder Stimulation autoaggressiv. Sie stellen jedoch eine Typ V-Allergie dar, wenn sie gegen körperfremde Strukturen (z. B. Epitope auf Tollwutviren) induziert werden und anschließend gegen autologe Epitope kreuzreagieren (z. B. mit dem Acteylcholinrezeptor) (JANEWAY et al. 2002).

2.1.2 Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I

Die Effektorzellen der Typ I-Allergie, Basophile und Mastzellen, entwickeln sich aus Knochenmarksstammzellen. Während Basophile bereits ausdifferenziert sind, wenn sie das Knochenmark verlassen, treten Mastzellen im Blutkreislauf nur als Vorläuferzellen auf, jedoch bereits mit zelltypischen Charakteristika (RODEWALD et al. 1996). Die endgültige Differenzierung geschieht in der Peripherie (ENERBACK 1997). Basophile und Mastzellen binden freies IgE hochaffin an den Fcε-Rezeptor I (FcεRI) (ISHIZAKA u. ISHIZAKA 1977). Frei im Serum befindliches IgE hat mit bis zu zwei Tagen die kürzeste Halbwertszeit aller Antikörper-Isotypen. Das an FcεRI von Basophilen und Mastzellen gebundene IgE ist über mehrere Wochen bis Monate stabil. Die Anwesenheit von IgE im Serum fördert zusätzlich die Expression von FcεRI auf Basophilen und Mastzellen und übt einen stabilisierenden Effekt auf den Rezeptor aus (SAINI u. MACGLASHAN 2002; KITAURA et al. 2003; KUBO et al.

2003). Zudem konnte gezeigt werden, dass die Immunglobulin-Rezeptor-Komplexe die Zelle in vitro vor Apoptose schützen (KAWAKAMI u. GALLI 2002). Werden

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mehrere membranständig gebundene spezifische IgE durch das entsprechende Antigen quervernetzt (bridging), kommt es zu einer Zusammenlagerung der FcεRI der Zelle. Dies ermöglicht die Phosphorylierung der in den γ-Ketten des FcεRI befindlichen Immunorezeptor assoziierten tyrosinbasierten Aktivierungsmotive (ITAMs) durch Protein-Tyrosinkinasen. Diese katalysieren die Phosphorylierung der Phospholipase C-γ, die durch hydrolytische Spaltung die beiden second messenger Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) bildet, was zur Freisetzung von intrazellulärem Ca²⁺ und der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) und schließlich zur Degranulation der Mastzelle oder des Basophilen führt (KNOL 2006). Neben der Aktivierung der Zelle induziert das bridging bei Mastzellen des Menschen auch die Expression von Bfl-1, einem Survival-Gen, das die Lebensdauer der sensibilisierten Zelle erhöht und somit zur Aufrechterhaltung der allergischen Reaktionsbereitschaft beiträgt (XIANG et al. 2006).

Neben aktivierenden Fc-Rezeptoren (FcεRI, FcγR I, IIA & III) spielen inhibierende FcR, wie die FcγRII-B1 und B2, wichtige regulatorische Rollen: Statt einer ITAM- Sequenz ist ihr zytoplasmatischer Teil mit einem Immunorezeptor-assoziierten tyrosinbasierten Inhibierungsmotiv an Aminosäuren (ITIM) ausgestattet. Findet eine antigenbedingte Quervernetzung von einem aktivierenden FcεRI (vermittelt durch membranständiges IgE) mit einem inhibierenden FcγRII-B (vermittelt durch ein IgG) statt, so kommt es nicht zu einer Aktivierung der Typ I Effektorzellen, keiner Mediatorfreisetzung und somit auch nicht zu einer Typ I Immun- oder Allergiereaktion, obwohl die Zelle mit antigenspezifischem IgE sensibilisiert ist. Dies könnte einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Zukunft darstellen (GALLI et al. 2005).

Neben dem auf Basophilen und Mastzellen exprimierten, hochaffinen Fcε-Rezeptor I existiert auf B-Zellen ein weiterer, als CD23 oder Fcε-Rezeptor II bezeichneter Ligand für IgE, der regulatorisch auf die IgE-Produktion wirkt, indem er IgE mit niedriger Affinität bindet. Es konnte gezeigt werden, dass Mäuse, denen CD23 fehlt, deutlich höhere IgE-Titer gegen ein spezifisches Antigen bilden als solche mit normaler CD23-Expression (YU et al. 1994).

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Das Vorhandensein von freiem IgE, einem der sensibilisierenden Ak-Isotypen, im Serum ist bei weitem nicht ausreichend für eine Aussage, ob das von dem IgE-Ak erkannte Antigen (z. B. in einem diagnostischen ELISA-Verfahren) zu einer Allergie gegen dieses Antigen führt. Dazu sind eine Reihe weiterer Voraussetzungen erforderlich:

• Eine ausreichende Anzahl an Basophilen und / oder Mastzellen, die mit spezifischen Antikörpern gegen ein Antigen sensibilisiert sind;

• Eine ausreichende Dichte an sensibilisierenden Antikörpern pro Typ I Effektorzelle, damit ein „bridging“ durch ein Antigen erfolgen kann;

• Eine überwiegende Sensibilisierung von aktivierenden Fc-Rezeptoren mit spezifischen Antikörpern gegen ein Antigen pro Effektorzelle.

Erst wenn diese Voraussetzungen in Form einer „funktionellen Sensibilisierung“

gegeben sind, kann es zu einer wirkungsvollen Aktivierung von Typ I-Effektorzellen kommen. Erst dann werden bei Antigenkontakt präformierte und in Granula gespeicherte Entzündungsmediatoren (Histamin, Heparin, Serotonin, TNF-α) und Enzyme (Chymase, Tryptase, Carboxypeptidase und Cathepsin) kurzfristig freigesetzt. Gleichzeitig wird die Neubildung wichtiger Mediatoren induziert. Hierzu zählen Arachidonsäuremetaboliten, vor allem die Leukotriene B4 und C4 sowie Prostaglandine D2 und E2, aber auch Chemokine wie CCL3 und Cytokine wie TNF-α, GM-CSF, IL-3, IL-5 sowie insbesondere IL-4 und IL-13. Letztere wirken verzögert, so dass sich eine Typ I Immunreaktion von wenigen Minuten (Sofortreaktion) bis zu 24 h hinziehen kann (Spätreaktionen), abhängig von den beteiligten Mediatoren. Eine funktionelle Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen ist eine unabdingbare Voraussetzung zur Entwicklung einer Typ I-Allergie. Sie allein löst jedoch nicht zwingend – auch in Anwesenheit des „passenden“ Antigens - eine klinische Symptomatik aus. Ohne funktionelle Sensibilisierung gegen ein spezifisches Antigen ist die Auslösung Typ I allergischer Symptome durch dieses Antigen sicher auszuschließen.

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2.1.3 Arthropoden als Auslöser von Typ I-Immunantworten

Hämatophagen Insekten kommt in der Veterinärmedizin eine große Bedeutung als Verursacher von Typ I-Allergien zu. Bei der Blutmahlzeit werden Speichelkomponenten injiziert, gegen die der Wirt sensibilisierende Antikörper entwickeln kann.

Flöhe

Von den mehr als 2000 Arten der Ordnung Siphonaptera ist der Katzenfloh (Ctenocephalides felis felis, Bouché 1835) bei Hund und Katze am weitesten verbreitet. In mehreren Studien (REEDY et al. 1997) wurde gezeigt, dass im Speichel des Katzenflohs Antigene Komponenten enthalten sind, die bei befallenen Tieren eine Sensibilisierung auslösen können. Sensibilisierte Tiere können eine Flohallergie-Dermatitis (FAD) entwickeln, die durch Juckreiz, Alopezie und papulokrustöse Hautveränderungen gekennzeichnet ist. Im Intrakutantest kann die Injektion eines Antigenextraktes aus ganzen Flöhen oder deren Speicheldrüsen bei sensibilisierten Tieren eine Typ I-Reaktion der Haut auslösen (2.3) .

Milben

Die Ohrmilbe Otodectes cynotis verursacht bei der Katze und seltener auch beim Hund die sogenannte Ohrräude. Sie ernährt sich von Lymphe und Blut ihres Wirtes.

Ein Otodectes-Befall kann symptomlos bleiben, in einigen Fällen aber auch zu einer pruriginösen Otitis mit Exsudatbildung führen. Bei Katzen, die von O. cynotis parasitiert wurden, konnten spezifische Antikörper nachgewiesen und im Intrakutantest eine Typ I-Reaktion auf einen Otodectes-Extrakt gezeigt werden (POWELL et al. 1980).

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Mücken

Mücken verursachen bei Pferden eine weltweit verbreitete, saisonal auftretende Dermatitis, die als Sommerekzem, Queensland itch, sweet itch oder kasen bekannt ist. Sie ist durch intensiven Juckreiz charakterisiert, in dessen Folge es zu selbstinduzierten Hautläsionen kommt, die primär an der ventralen Körperseite, Mähne und Schweif auftreten (ANDERSON et al. 1988). Mithilfe von Intrakutan- und in vitro-Tests konnten neben anderen saugenden Insekten oft verschiedene Culicoides-Arten als Hauptverursacher des Sommerekzems identifiziert werden, deren Antigene zu Typ I-Reaktionen bei betroffenen Tieren führten (FADOK u.

GREINER 1990; ANDERSON et al. 1993; KAUL 1998) Inwieweit Mücken an der Genese von Typ I-Allergien bei Hund und Katze beteiligt sind, ist wenig erforscht.

MASON und EVANS (1991) berichten über Katzen, die Symptome einer saisonalen Form des eosinophilen Granuloms zeigten. Zwei von vier untersuchten Tieren reagierten im Intrakutantest auf Antigene aus einem Mückenextrakt positiv.

Zecken

Bei Hunden und Meerschweinchen sind Typ I- Überempfindlichkeitsreaktionen gegen einen Antigenextrakt der braunen Hundezecke Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) bekannt (SZABO et al. 1995). Anders als die Hunde entwickelten die Meerschweinchen nach 24 Stunden zusätzlich eine deutliche Reaktion vom verzögerten Typ, was bei der Immunantwort auf Zeckenbefall der entscheidende Mechanismus der Resistenzentwicklung ist. Auch bei Rindern sind Typ I-Reaktionen gegen Zecken nachgewiesen worden. Vorsensibilisierte Tiere zeigten eine Typ I- Reaktion der Haut nach intrakutaner Applikation eines Extraktes von Rhipicephalus appendiculatus (BINTA u. CUNNINGHAM 1984).

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2.2 Allergiediagnostik

Die Bezeichnung „Allergietest“ im Sinne des Wortes ist mit Ausnahme des in vivo Provokationstests für alle heute verfügbaren Testverfahren irreführend, da sie bestenfalls eine Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen erfassen oder freie Antikörper gegen verdächtige Antigene oder Epitope nachweisen. Allergietests sollten aus diesem Grund nicht als Screeningmethode an einem an Pruritus leidenden Patienten eingesetzt werden (DEBOER u. HILLIER 2001a). Eine Allergie als Ursache bestimmter klinischer Symptome wird häufig im Ausschlussverfahren und unter Einbeziehung eines „Allergietests“ diagnostiziert. Falls Antigene als Ursache für ein Krankheitsbild im Verdacht sind, sollte zunächst gegen bakterielle Sekundärinfektionen und Parasitenbefall behandelt werden. Ein weiteres Ausschlusskriterium ist das Füttern einer Eliminationsdiät über mindestens zwei Monate. Bei Besserung der Symptome kann die verdächtige Futterkomponente erneut angeboten werden (Provokationstest), um die Diagnose abzusichern (NOLI 2006).

Die zur Diagnostik der Typ I-Allergie zur Verfügung stehenden Testverfahren können grob unterteilt werden in in vivo und in vitro-Methoden.

In vivo durchgeführte Tests basieren auf der Exposition des Patienten mit dem verdächtigen Antigen und erfordern in der Veterinärmedizin oft eine Sedierung oder Narkose des zu untersuchenden Tieres. Zur Diagnosestellung ist die Auslösung allergischer Symptome am Patienten erforderlich, weshalb diese Verfahren eine größere Belastung darstellen als in vitro Tests, für deren Durchführung nur eine Blutprobe benötigt wird.

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2.2.1 In vivo-Verfahren

2.2.1.1 Intrakutantest

Beim Intrakutantest wird eine definierte Menge Antigen intradermal appliziert und zu unterschiedlichen Zeiten danach die Reaktion der Mastzellen der Haut anhand des Durchmessers der sich bildenden Quaddel abgelesen.

Wichtig für die diagnostische Aussage des Intrakutantests ist die Verwendung von Antigenen und Kontrollsubstanzen (Lösungsmittel, Histamin) in Konzentrationsstufen, in denen eine Hautreaktion auf eine Testsubstanz eindeutig als Typ I-Reaktion erkannt werden kann. Liegt die Konzentration der Testsubstanz über dieser sogenannten Schwellenkonzentration, ist eine positive Reaktion auf eine unspezifische Irritation an der Injektionsstelle zurückzuführen. AUSTEL et al. (2006) definierten Schwellenkonzentrationen für 48 verschiedene Antigenpräparationen und Histamin, wobei jedes Antigen in vier Konzentrationsstufen an gesunden Katzen getestet wurde. Die diagnostische Aussagekraft einer positiven Reaktion auf ein Arthropodenantigen in einer definierten Konzentrationsstufe kann nach WILLIS et al.

(1996) nur bestimmt werden, wenn die Prävalenz positiver Reagenten bei gesunden Tieren bekannt ist.

Sowohl in der Veterinär- wie in der Humanmedizin werden Fälle beschrieben, in denen klinisch unauffällige Probanden auf das entsprechende Antigen eine positive Reaktion im Intrakutantest zeigten (LINDBLAD u. FARR 1961; CODNER u.

LESSARD 1993). In einer Untersuchung an 65 Hunden, die an Atopie litten, reagierten 58 positiv auf Antigene von Dermatophagoides farinae, wobei jedoch in der Kontrollgruppe 22 von 24 Tieren ebenfalls ein positives Ergebnis zeigten (LIAN u.

HALLIWELL 1998).

KRISTENSEN und KIEFFER (1978) verglichen klinische und histologische Befunde sowie das Vorhandensein von Flohbefall und Eosinophilie bei 143 Hunden und Katzen, die an pruriginöser Dermatitis litten und testeten die Tiere im Intrakutantest auf Flohantigen. Sie folgerten, dass die Spezifität des Intrakutantests dessen Einsatz

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bei Verdacht auf Flohallergie rechtfertigt. COLOMBINI et al. (2001) konnten unterdessen keine Korrelation zwischen klinischer Symptomatik und Intrakutantestergebnissen feststellen.

Weitere Studien verschiedener Arbeitsgruppen an atopischen Hunden, deren Reaktionsverhalten auf Pollenextrakte und andere Umweltallergene von Schimmelpilzen und Hausstaubmilben im Intrakutantest ermittelt wurde, erbrachten sehr unterschiedliche Ergebnisse in der Prävalenz positiver Reaktionen, die nicht ausschließlich durch biologische Variation erklärbar sind (HILL u. DEBOER 2001).

Obwohl dies teilweise auf geographische Besonderheiten im Antigenspektrum zurückzuführen ist, fehlen dennoch standardisierte Verfahren und entsprechende Antigenextrakte, welche zur Verbesserung von Sensitivität und Spezifität des Intrakutantests beitragen könnten (DEBOER u. HILLIER 2001b). Ein entsprechender Grad an Standardisierung könnte den Nutzen des Intrakutantests als quantitatives Verfahren deutlich erhöhen (NORMAN et al. 1973).

2.2.2 In vitro-Verfahren

2.2.2.1 Serologische Tests (ELISA)

Diese Methoden basieren auf der Detektion von allergenspezifischen freien IgE- Antikörpern im Serum. Dabei wird Patientenserum mit an eine feste Phase gebundenem Testantigen inkubiert, so dass sich gebundene Antigen-Antikörper- Komplexe bilden. Nicht reagierende Antikörper werden weggewaschen und die Menge an Antigen-Antikörper-Komplexen mithilfe eines möglichst für IgE spezifischen Bindungspartners (Anti-IgE-Antikörper oder FcεRIα-Kette) quantifiziert, an den je nach Testverfahren fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Substanzen oder Enzyme gekoppelt sind. Die Höhe der Farbintensität, Radioaktivität oder die Menge an enzymatisch umgesetztem Substrat entspricht der Serumkonzentration der antigenspezifischen Antikörper. Werden für die Detektion dieser Antikörper Anti-

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IgE-Ak verwendet, kann es zu Kreuzkompetition mit Antikörpern anderen Isotyps ohne klinische Relevanz kommen, wenn die Spezifität dieser Antikörper unzureichend ist, weil Kreuzreaktionen gegen andere Isotypen ggf. über leichte Ig- Ketten vorkommen können. LORCH et al. (2001) zeigten in einer Untersuchung an Pferden, dass die Befunde eines ELISA, der sensibilisierende Antikörper mit Hilfe der α-Untereinheit des Fcε-Rezeptor I detektiert, eine höhere Übereinstimmung mit den klinischen Befunden aufwies als ein ELISA auf Basis von Anti-IgE-Antikörpern.

Insgesamt waren jedoch die serologischen Untersuchungsverfahren einem simultan durchgeführten Intrakutantest unterlegen.

Die erste beschriebene Anwendung in der Kleintiermedizin diente der Immundiagnostik der atopischen Dermatitis des Hundes (HALLIWELL u. KUNKLE 1978). Eine vergleichende Untersuchung mit drei ELISA-basierten Tests an gesunden und atopischen Hunden ergab eine sehr geringe Spezifität dieser Verfahren. Die Autoren zweifelten deren Nutzen für die Diagnostik der Atopie beim Hund daher an (BOND et al. 1994). Auch bei Hunden mit Flohallergie war der Median der im ELISA gemessenen spezifischen IgE-Antikörper gegen Flohantigen nicht signifikant höher als bei nicht allergischen Tieren. Verglichen mit gleichzeitig durchgeführten Intrakutantests zeigte sich keine signifikante Übereinstimmung (CODNER u. LESSARD 1993). Die Serumspiegel von allergenspezifischem IgE bei Katzen korrelierten ebenfalls nicht mit einem Intrakutantest (GILBERT u.

HALLIWELL 1998). In einer Verlaufsstudie zur Flohallergie bei Katzen war zwischen klinischen Symptomen und den Ergebnissen eines Fcε-Rezeptor-basierten Assays statistisch kein Zusammenhang erkennbar (COLOMBINI et al. 2001).

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2.2.2.2 Zellbasierte Tests

Während die vorher beschriebenen in vitro Verfahren frei im Serum befindliche Antikörper detektieren, werden bei zellbasierten Tests Mediatoren bestimmt, die von Zellen durch Stimulation mit dem Testantigen freigesetzt werden. Im Gegensatz zu serologischen Tests berücksichtigen zellbasierte Tests nur Antikörper, die auf den Effektorzellen gebunden und an der Freisetzung der Mediatoren beteiligt sind.

Funktioneller in vitro Test zum Nachweis der Typ I-Sensibilisierung von Basophilen (FIT)

Der von KAUL (1998) zur Diagnostik von Typ I Allergien beim Pferd entwickelte FIT basiert auf der Messung von Histamin, welches im Blut unter den hier gewählten Bedingungen nur von Basophilen freigesetzt wird. Der Test wird mit gewaschenem Vollblut durchgeführt, so dass freie Antikörper weitgehend entfernt sind und nur auf den Effektorzellen gebundene, sensibilisierende Antikörper an der Reaktion teilnehmen. Anschließend erfolgt eine Provokation der mit spezifischen Antikörpern besetzten Effektorzellen mit Testantigenen über 60 Minuten. Liegt eine funktionelle Sensibilisierung gegen ein Testantigen vor, kann dies anhand der Höhe der Histaminfreisetzung festgestellt werden. Setzt man das Antigen in mehreren Konzentrationsstufen ein, kann die funktionelle Sensibilisierung zudem graduell quantitativ bewertet werden. Das Verfahren wurde inzwischen auch für die Katze etabliert (STUKE 2005). Die Befunde des FIT korrelierten in der Untersuchung von STUKE (2005) weitgehend mit einem Intrakutantest jedoch nicht mit einem FcεRIα- ELISA.

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Indirekter Histaminfreisetzungstest

Der indirekte Histaminfreisetzungstest ist eine Kombination aus serologischem und zellbasiertem Test. Dabei werden humane oder equine, nicht vom Patienten stammende Basophile mit Antikörpern aus dem Patientenserum inkubiert und mit Antigen stimuliert. Anschließend wird, analog zum Prinzip der direkten Tests wie dem FIT, die freigesetzte Histaminmenge gemessen. Die diagnostische Relevanz dieses Tests ist ähnlich wie bei den serologischen Tests fraglich (PRÉLAUD u. GILBERT 2000), da er keine Aussage über die individuelle Reaktionsbereitschaft der Effektorzellen des zu untersuchenden Probanden erlaubt.

Cellular Allergen Stimulation Test (CAST)

Der CAST wurde von DE WECK et al. (1993) eingeführt. Anders als beim FIT, bei dem selektiv der gespeicherte Basophilenmediator Histamin als Reaktionsparameter dient, wird beim CAST die Freisetzung von Sulphidoleukotrienen (sLT) gemessen.

Vor der eigentlichen Antigenprovokation erfolgt eine Vorstimulation der Zellen mit IL- 3. Sulphidoleukotriene sind im Gegensatz zu Histamin, das in präformierten, intrazellulären Granula gespeichert vorliegt, neu synthetisierte Mediatoren. Die Korrelation von CAST und klinischer Symptomatik unterscheidet sich je nach Allergieform und Antigen. Die Ergebnisse von Histamin Release Tests und CAST korrelieren relativ gut, während Intrakutantest und CAST eine geringere Korrelation aufweisen (r=0,4-0,6) (DE WECK u. SANZ 2004). Allerdings ist zu beachten, dass Sulphidoleukotriene außer von Typ I-Effektorzellen auch von anderen Immunzellen des Blutes wie Monozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten freigesetzt werden können, die mit einer Typ I-Allergie wenig zu tun haben. Im Gegensatz dazu stellt Histamin einen für die Effektorzellen der Typ I Immunreaktionen (Basophile und Mastzellen) spezifischen Mediator dar (TIZARD 2004).

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2.3 Flohallergie-Dermatitis

2.3.1 Allgemeines

Zur Ordnung der Flöhe (Siphonaptera) gehören mehr als 2000 weltweit verbreitete Arten und Unterarten (REEDY et al. 1997). Die am häufigsten bei Hund und Katze gefundene Spezies ist der Katzenfloh, Ctenocephalides felis felis (C. felis) (Bouché 1835), wie Studien in Europa und Nordamerika zeigten (HARMAN et al. 1987;

VISSER et al. 2001; AKUCEWICH et al. 2002; RINALDI et al. 2007). In Neuseeland war der Hundefloh, C. canis bei Hunden häufiger anzutreffen als C. felis (GUZMAN 1984). Neben C. felis als Hauptverursacher der Flohallergie-Dermatitis (FAD) werden gelegentlich auch C. canis, Archaeopsylla erinacei, Xenopsylla cheopsis, Pulex irritans sowie Echidnophaga gallinacea auf Hunden und Katzen gefunden.

Obwohl von Juni bis September auf der nördlichen Hemisphäre höhere Prävalenzen an Flohbefall beobachtet werden, sind jahreszeitliche Schwankungen ansonsten wenig ausgeprägt vorhanden (AKUCEWICH et al. 2002; BECK et al. 2006; RINALDI et al. 2007). Dies ist in gemäßigten Klimazonen auf die eng mit dem Menschen verbundene Lebensweise von als Haustier gehaltenen Hunden und Katzen zurückzuführen. BECK et al. (2006) konnten auch bei Hunden und Katzen aus ländlichen oder städtischen Umgebungen in Deutschland keine regionalen Unterschiede in den Befallsprävalenzen feststellen.

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2.3.2 Biologie des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis

Der Katzenfloh (C. felis) zeigt keine Wirtsspezifität und wird auf vielen Wild- und Haustierspezies gefunden. Adulte Katzenflöhe haben eine permanente Lebensweise auf ihrem Wirt entwickelt. Die Lebensdauer auf dem Wirt beträgt mindestens 113 Tage (DRYDEN 1989), wobei diese durch Elimination der Flöhe bei der Fellpflege eingeschränkt wird. Die im Fell der Tiere präsenten Flöhe stellen etwa ein Prozent der gesamten Flohpopulation aus Eiern, Larven und Puppen in der Umgebung sowie Adulten auf dem Tier dar. Die Bedeutung der Wirt-zu-Wirt-Übertragung von adulten Katzenflöhen ist geringer als die Neu- oder Reinfestation aus der Umgebung durch frisch aus Puppen geschlüpfte Exemplare. In einer von BECK (2007) durchgeführten Studie, in der die Übertragung von mit durchschnittlich 43 Flöhen infestierten Katzen auf nicht infestierte Tiere untersucht wurde, konnten auf den nicht befallenen Tieren nach drei bis neun Tagen durchschnittlich zwei Flöhe gefunden werden. Als hämatophage Insekten sind die Weibchen im adulten Stadium auf Blutmahlzeiten zur Fortpflanzung angewiesen (REEDY et al. 1997; HSU u. WU 2001). Nach CADIERGUES (2000) saugen nahezu alle Flöhe innerhalb der ersten Stunde nach Wirtsfindung Blut. Die Eiablage erfolgt ca. 24-48 h nach der Blutmahlzeit auf dem Wirt, wobei ein Weibchen täglich im Durchschnitt ca. 27 und maximal bis ca. 50 Eier legt. Nachdem die Eier vom Wirt abfallen, entwickeln sich die Larven in der Umgebung. Ruhe- und Schlafplätze des Tieres sind dabei besonders betroffen, Teppiche stellen ebenfalls ein geeignetes Mikrohabitat dar. Die Entwicklungsdauer der Eier wird maßgeblich durch die klimatischen Bedingungen beeinflusst. Bei einer relativen Feuchte von über 50% und 16 bis 27 °C Umg ebungstemperatur entwickeln sich ca. 70-100% der Eier in ein bis sechs Tagen zu Larven (SILVERMAN et al.

1981).

Die larvale Entwicklung verläuft über drei Stadien, die Nahrung in Form von den Adulten ausgeschiedenem Kot (verdautes Blut) benötigen. Die Dauer der Entwicklung beträgt abhängig von Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und Nahrungsangebot acht bis 34 Tage (SILVERMAN et al. 1981). Nach der Verpuppung

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verlassen die Imagines nach fünf Tagen den Kokon, können unter ungünstigen Umweltbedingungen jedoch bis zu 140 Tage überdauern (REEDY et al. 1997).

2.3.3 Ätiologie und Pathogenese der FAD

Die Flohallergie-Dermatitis ist die klinische Manifestation einer Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I gegen den Speichel, den der Floh beim Saugakt in die Wunde injiziert. Flohspeichel ist ein Gemisch aus Peptiden, Aminosäuren, aromatischen Verbindungen, Phosphor und fluoreszierenden Stoffen (YOUNG et al. 1963) und besitzt gerinnungshemmende Eigenschaften. Während Experimente der Arbeitsgruppe um MICHAELI (1966) an Meerschweinchen ein an Kollagen gebundenes Hapten als Antigen identifizierten, ergaben neuere Versuche, dass der Flohspeichel komplette Antigene in Form von Proteinen enthält (GREENE et al. 1993). In Untersuchungen mit aus dem Speichel chromatographisch aufgetrennten Proteinfraktionen konnte nach intrakutaner Injektion bei Hunden, die vorher mit Flöhen infestiert wurden, eine Überempfindlichkeitsreaktion ausgelöst werden (LEE et al. 1999). Dabei reagierten die Hunde auf Proteine mit Molekülmassen von 12 bzw. 40 kDa besonders empfindlich. MCDERMOTT et al.

(2000) identifizierten, klonierten und charakterisierten mit dem 18 kDa großen Cte f 1 Protein ein Flohspeichelantigen, welches bei flohallergischen Hunden eine Überempfindlichkeitsreaktion auslöste.

Mithilfe einer zweidimensionalen gelelektrophoretischen Auftrennung von Flohspeichel und anschließendem Immunoblot konnte NADLER (2001) 38 unterschiedliche Proteinfraktionen mit Molekulargewichten zwischen 21,5 und 95 kDa identifizieren, gegen die an FAD erkrankte Katzen Antikörper gebildet hatten.