Linkerhiston Isoformen bei Caenorhabditis elegans
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Georg- August- Universität zu Göttingen
vorgelegt von Monika Jedrusik-Bode aus Sosnowiec (POLEN)
Göttingen 2001
Korreferent: Prof. Dr. W. Engel
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2001
Herrn Professor Dr. U. Grossbach danke ich für die Arbeitsmöglichkeiten im Labor und für seine wissenschaftliche Unterstützung.
Herr Dr. E. Schulze hat mich in vielerlei Hinsicht tatkräftig unterstützt. Ich danke ihm für die Anregung zu diesem Thema, für stete Hilfsbereitschaft, für die Diskussionen und für
vielfältige Anregungen.
Frau S. Pitzel danke ich für ihre Unterstützung und das angenehme Arbeitsklima, das die Arbeit in einer freundlichen Umgebung ermöglichte.
Frau Dr. S. Steinhoff danke ich für die engagierte Durchführung der DNA-Sequenzierung und ihrer Hilfsbereitschaft.
Herrn Dr. R. Schwanbeck danke ich für die Einführung in die chromatografischen Arbeitsmethoden und für anregende Diskussionen.
Herrn Prof. Baumeister (Universität München) danke ich für die Einführung in
Injektionstechniken bei C. elegans und der Möglichkeit in der Firma EleGene GmbH in Martinsried die Deletionsbibliothek auf Vorliegen der Deletionsmutationen zu testen.
Herrn Prof. Schnabel (Universität Braunschweig) danke ich für den pha-1(e2123) III Stamm, für die Plasmide und seine Diskussionsbereitschaft.
Herrn Dr. A. Coulson (The Sanger Center, England) und Dr. Y. Kohara (National Institut of Genetics, Mishima, Japan) danke ich für die Cosmide und die cDNA Klone, Herrn Dr. A. Fire für das pBK48.1 Plasmid sowie Prof. Dr. K. Weber (MPI für Experimentelle Medizin,
Göttingen) für die IFA Antikörper.
Den Mitarbeitern des III.-Zoologischen Instituts – Entwicklungsbiologie danke ich für die vielfältige Unterstützung und ihrer Bereitschaft, mir jederzeit hilfreich zur Seite zu stehen.
Insbesondere aber danke ich Frau E. Blabusch, Frau B. Rossi und Herrn M. Bahrami für ihre Hilfsbereitschaft.
Zuletzt aber nicht weniger herzlich möchte ich meinen Eltern, meinem Ehemann Thomas Bode und Aneta Oleksy für ihre Unterstützung danken. Ohne ihre Hilfe wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.
INHALTSVERZEICHNIS ...2
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...6
1. EINLEITUNG ...9
2. MATERIAL UND METHODEN ...19
2.1 Material ...19
2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden ...19
2.2.1 Isolierung der Plasmid–DNA aus E. coli...19
2.2.2 Isolierung der Cosmid-DNA ...20
2.2.3 In vivo Umwandlung der λZAP II Klonen ...21
2.2.4 In vivo Umwandlung des λSHLH2 Klones ...22
2.2.5 Bestimmung der Konzentration der DNA und der RNA ...23
2.2.6 Restriktionsverdau von DNA ...23
2.2.7 Agarose-Gel-Elektrophorese...23
2.2.8 Klonierung von Restriktionsfragmenten ...24
2.2.9 Transformation von kompetenten E. coli Zellen...24
2.2.10 Herstellung der Transformationskompetenten E. coli...25
2.2.11 Herstellung der DNA-Fragmente mit überhängenden Enden oder mit stumpfen Enden...25
2.2.12 Sequenzierung der Plasmid DNA ...26
2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...27
2.2.13.1 Standardansatz ...27
2.2.13.2 Amplifikation von RNA, RT-PCR ...29
2.2.14 Herstellung der doppelsträngigen RNA (dsRNA) ...30
2.2.15 Herstellung der H1 'green fluorescence' Reportergene ...31
2.3 Allgemeine proteinchemische Methoden ...33
2.3.1 Herstellung der rekombinanten H1 Proteine...33
2.3.2 Gewinnung der Antiseren und Antikörper...35
2.3.5 'Reversed-Phase' HPLC-Trennungen ...37
2.3.6 SDS-PAGE-Gelektrophorese...37
2.3.7 Analyse der Antikörper durch den dot-blot und den western-blot...38
2.4 Caenorhabditis elegans...40
2.4.1 Umgang mit C. elegans...40
2.4.1.1 Vorbereitung der Platten...40
2.4.1.2 Dekontamination von C. elegans...40
2.4.1.3 Aufbewahrung von C. elegans...41
2.4.1.4 dsRNA Interferenz durch Fütterung mit E. coli...41
2.4.2 Herstellung der transgenen C. elegans Stämme...42
2.4.2.1 Herstellung des Stammes EC107 (let-858::gfp) für die Beobachtung der Derepression in Keimbahnzellen...42
2.4.2.2 Mikroinjektion von C. elegans und die Herstellung der transgenen Tiere...42
2.4.2.3 Injektion von linearisiertem Marker-pRF4 (rol-6), H1.X::gfp und genomischer DNA ...44
2.4.3 'Screening' der Deletionsbibliothek von C. elegans...45
2.4.4 Präparation der Gesamt-DNA, -RNA und Proteine aus C. elegans...48
2.4.4.1 Isolierung der genomischen DNA ...48
2.4.4.2 Isolierung der Gesamt-RNA ...48
2.4.4.3 Präparation der Gesamt-Proteine aus C. elegans...49
2.4.5 X-Gal-Färbung der ß-Galactosidase-Aktivität bei C. elegans...50
2.4.6 Immuncytologie bei C. elegans...51
2.4.6.1 Immuncytologie der Embryonen ...51
2.4.6.2 Immuncytologie der adulten Tiere und Larven ...52
2.5 Saccharomyces cerevisiae...53
2.5.1 Molekularbiologischen Methoden bei S. cerevisiae...53
2.5.1.1 Herstellung der kompetenten Hefezellen, S. cerevisiae...53
2.5.1.2 Transformation in kompetenten Hefezellen ...54
2.5.1.3 Herstellung der sieben H1-Expressionsklone ...54
2.5.1.5 GFP-Fusionen mit H1.1 und H1.4 Histonen in den Hefevektoren
pYX142 und pYX242...55
2.5.2 Proteinchemische Methoden bei S. cerevisiae...57
2.5.2.1 Protein-Extraktion aus Hefen ...57
2.5.2.2 Immunofluoreszenz von Hefetransformanten ...57
2.6 Mikroskopie ...59
2.7 Verwendete Computerprogramme...59
2.8 Medien und Lösungen ...60
2.9 Verwendete primer...68
3. ERGEBNISSE ...72
3.1 Die vollständige Linkerhiston Genfamilie von Caenorhabditis elegans...72
3.1.1 Identifikation der sechs neuen Histon H1-Isoformen ...72
3.2 Vergleich der Linkerhiston Sequenzen von C. elegans...75
3.2.1 Vergleich der Promotorsequenzen ...75
3.2.2 Vergleich der kodierenden DNA-Sequenzen...76
3.2.3 Vergleich der Primärstrukturen der Histon H1-Isoformen ...78
3.2.4 Besondere Sequenzmotive in einzelnen H1-Isoformen ...81
3.3 Einfluß des Histons H1.1 auf Chromatin silencing und die Entwicklung der Keimbahnzellen ...85
3.3.1 Expressionsmuster des Histons H1.1 ...85
3.3.1.1 Charakterisierung des polyklonalen Antiserums gegen H1...85
3.3.1.2 Präsenz aller H1-Isoformen in den gesamten Proteinen (Totallysat) von C. elegans...87
3.3.1.3 Immundetektion des Histons H1 in somatischen Zellen und Keimbahnzellen ...87
3.3.1.4 Expressionsmuster des H1.1::GFP...88
3.3.2 Cytologische Effekte nach der H1 dsRNA Injektion ...89
3.3.3 Einfluß des Histons H1.1 auf die Gen-Repression in der Keimbahn...93
3.3.4 Translationskontrolle des Histons H1.1 durch die 3´UTR Sequenz ...98
in Männchen ...101
3.5.1 Expressionsmuster des H1.4::gfp-Reportergens ...101
3.5.2 H1.4 dsRNA Injektion arretiert die Entwicklung der männlichen Schwanzstrukturen ...102
3.5.3 SON-1 und H1.4 wirken synergystisch in der Morphogenese der männlichen Schwanzstrukturen ...106
3.6 Expressionsmuster des Histons H1.X und seine subzelluläre Lokalisation ...108
3.6.1 dsRNA Phenotyp von H1.X...110
3.7 Beeinflussung der Telomer-Positionseffekt-Variegation in Saccharomyces cerevisiae durch die Expression von C. elegans Histon H1-Isoformen...112
3.7.1 Verschiedenen Überlebensraten der sieben H1-exprimierenden Hefe-Stämme ..112
3.7.2 Einfluß des SIR2 Proteins auf die Gen-Repression in den Keimbahnzellen von C. elegans...116
3.8 Effekte nach der Trichostatin Injektion im Reporterstamm EC107 (let-858::gfp)...117
4. DISKUSSION...118
4.1 Die Histon H1-Gen Familie von C. elegans ist eine 'replacement' Histon-Typ- Genfamilie ...118
4.2 Das Histon H1.1 ist das erste Beispiel im Metazoen Reich für ein Linkerhiston, welches für die Entwicklung der Keimbahn essentiell ist ...119
4.2.1 Hinweise für die Translationskontrolle der Histon-Isoform H1.1 ...125
4.3 Das Histon H1.4 hat einen Einfluß auf die Entwicklung des Sexualdimorphismus in Männchen ...127
4.4 Die H1.X-Isoform ist ein cytoplasmatisches Protein...132
4.5 Homologe-Repressionsmechanismen in C. elegans und S. cerevisiae...137
5. ZUSAMMENFASSUNG ...142
6. LITERATURVERZEICHNIS...144
7. ALIGNMENT UND ABBILDUNGEN...167
APS Ammoniumperoxodisulfat bp Basenpaare
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat BSA Rinderserumalbumin
CAP-Struktur Eine 5‘-5‘ Triphosphat-Bindung an das 5‘- Ende von eukaryontischen mRNAs mit der Sequenz m7G(5‘)ppp(5‘)G
C. elegans Caenorhabditis elegans
CELK Gruppe Eine Gruppe, die sämtliche ESTs für ein Gen enthielt
DNA Desoxyribonukleinsäure
dsRNA Doppelsträngige RNA
DTT Dithiothrietol DEPC Diethyl-Pyrocarbonat
DMF N, N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FOA Fluorooroticsäure
GFP 'green fluorescence protein'
h Stunden hPa Hektopascal
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
kb Kilobasenpaare kDa Kilodalton KPP Kaliumphosphat l Liter
LB-Medium Luria-Bertani-Medium min Minute
NBT 4-Nitro blau tetrazolium chlorid
NZY NZ Amin Yeast Extract-Medium
PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese
PCR Polymerase Kettenreaktion
PEG Polyethylenglykol
pfu/ml Menge der Plaques in Einheiten pro Milliliter
pKS pBluescript II, wo Polylinker von Sac I bis
Kpn I Schnittstelle orientiert ist
pSK pBluescript II SK(+/−)
RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Polymerase Kettenreaktion
rpm Umdreheungen pro Minute
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SC-Leu 'Synthetic Complete' Medium ohne Leucin
SDS Natriumdodecylsulfat S Seite
s Sekunden
SH Essigsäure/Harnstoff SHT Essigsäure/Harnstoff/Triton TAE Tris-Acetat-EDTA
TBE Tris-Borat-EDTA
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TBS-Tween TBS mit 0,5% Tween-20
TE Tris-EDTA TFA Trifluoressigsäure
TEMED N, N, N, N-Tetramethylendiamin
TPEV Die Telomer-Positionseffekt-Variegation
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TTB Tris-Triton Puffer
w/v Gewicht pro Volumen
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactosid
Yac Yeast artificial chromosomes
1. EINLEITUNG
In pro- und eukaryontischen Zellen bildet die DNA mit Proteinen (Nukleoproteinen) einen Chromatin-Komplex. Histone stellen die Hauptmasse der Chromatinproteine dar. Sie teilen sich in zwei Gruppen — 'core' und Linkerhistone.
Die 'core' Histone formen ein Oktamer (Nukleosom) (KORNBERG, 1977). Das Nukleosom entsteht aus einem Tetramer (zwei H4-H3-Dimeren) und zwei Dimeren-H2A und H2B (EICKBUSH und MOUDRIANKIS, 1978). Die DNA ist zweimal um das Nukleosom gewickelt. Nukleosomen sind durch Linker-DNA verbunden und bilden eine Nukleosomenkette. Die Nukleosomenkette wurde in eine 30 nm-Fibrille überführt (VAN
HOLDE, 1989).
Jedes 'core' Histon besitzt N- und C-terminale Domänen. Die dynamische Änderung der Struktur des Chromatins geschieht durch Modifikationen der 'core' Histone in der N- terminalen Domäne. Die 'core' Histone sind hoch konserviert (ISENBERG, 1979) und in fast jeder eukaryontischen Zelle vorhanden. Sie sind wahrscheinlich vom DNA-bindenden Protein Hmf evoluiert, das beim thermophilen Archaeon Methanofermus fervidus gefunden wurde (SANDMAN et al., 1990; KASINSKY et al., 2001).
Das Linkerhiston (Histon H1) der Eukaryonten besitzt drei Domänen. Die zentrale, globuläre Domäne ist von N- und C-terminalen Domänen flankiert. Die globuläre-Domäne bindet das Nukleosom, und die terminalen Domänen interagieren mit der Linker-DNA. Die globuläre Domäne allein ist nicht in der Lage, die Fibrille zu kondensieren (ALLAN et al., 1980). Die C-terminale Domäne faltet dagegen mit der globulären Domäne die polynukleosomale Fibrille besser als das native H1-Protein mit allen drei Domänen (ALLAN et al., 1986). Daraus folgert man, dass die C-terminale Domäne für die Faltung der Fibrillen notwendig ist.
Die kristallografische Struktur der globulären Domäne wurde als ein charakteristisches 'winged helix' Motiv bestimmt (RAMAKRISHNAN et al., 1993). Die Bindungsstelle der zentralen Domäne ist asymmetrisch in der Nähe der Asymmetrie-Achse des Nukleosomes lokalisiert.
Im Vergleich mit den 'core' Histonen sind die Linkerhistone eine divergente Gruppe. Die N- und C-terminalen Domänen unterscheiden sich in der Länge und in ihrer
Aminosäurereste-Komposition erheblich. Nur die Sequenz des 'winged helix' Motives ist relativ konservativ.
Zum ersten Mal wurde die Sequenz des 'winged helix' Motives bei divergenten Gruppen der Protisten (Chlorophyta und Mycetazoa) beschrieben. Bei einigen Protisten (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Tetrahymena, Euplotes) und Prokaryonten (Chlamydia, Bordetella) wurden nur lysinreiche Proteine ohne eine zentrale Domäne gefunden (TORO und GALANTI, 1988; BURRI et al., 1993). Diese Proteine waren den Histon-H1-Proteinen der Eubacteria und der C-terminalen Domäne der H1 Proteine der Tiere und Pflanzen ähnlich, welche die Eigenschaft haben, Linker-DNA zu binden. Bei Archaebacteria wurden keine Linkerhistone gefunden. Dies deutet darauf hin, dass die Histon-H1-Proteine schon bei Eubacteria erschienen sind, aber dass das typische konservative 'winged helix' Motiv erst später bei Protisten entstanden ist, unabhängig von der Abwesenheit der 'core' Histone bei Archaebacteria (KASINSKY et al., 2001).
Die bisher gültigen Theorien und Vorstellungen über das Linkerhiston H1 der letzten Jahre sind als veraltet und überholt zu bezeichnen . Die H1-Knockouts ohne den Phenotyp haben die Vorstellung über die Bedeutung des Linkerhistons stark verändert (SHEN und GOROVSKY, 1996).
Es wurde auch gezeigt, dass das Protein nicht nur mit der Linker-DNA und dem Nukleosom verbunden wurde, sondern auch mit anderen Strukturen: Beim Seeigel ist das Protein mit dem Spermien-Flagellum, bei Paramecium und Chlamydomonas mit Cilien assoziiert (MULTIGNER et al., 1992). Im Vergleich mit den 'core' Histonen wird das H1 Histon nicht mehr als eine statische Komponente des Chromatins betrachtet. Es ist ein dynamischer Teil des Chromatins, das im 'stop-and-go' Mechanismus mit Euchromatin sowie Heterochromatin, unabhängig vom Zellzyklus oder der Fibrille-Fibrille Interaktion, assoziiert ist (LEVER et al., 2000). Das Photobleaching-Experiment (FRAP) wurde verwendet, um die Mobilität des Linkerhistons H1 in lebenden Zellen zu beobachten. Die H1 Moleküle bewegten sich von der ungebleichten Region zur gebleichten Region, was darauf hinweist, dass H1 dissoziiert, durch das Nukleoplasma diffundiert und dann mit Chromatin reassoziiert (LEVER et al., 2000). Das Fluoreszenz-Signal des H1.1::GFP Proteins wurde in der gebleichten Region innerhalb 200-250 s wiederhergestellt (MISTELI
et al., 2000). Dieser Prozeß war unabhängig vom ATP-Energie-Transfer, könnte aber durch Phosphorylierung des Proteins (H1) moduliert sein. Daraus folgert man, dass die
Phosphorylierung des Linkerhistons H1 die Bindung zum Chromatin reduziert und die transkriptionelle Aktivität erleichtert . Die dynamischen Eigenschaften des Linkerhistons H1 können essentiell für die Funktion des H1 als Regulator der Chromatin-Formation und der Struktur des Chromatins sein (MISTELI et al., 2000).
Das Histon H1 tritt in eukaryontischen Zellen in mehreren Varianten auf. Zum Vergleich mit den 'core' Histonen ist es eine sehr divergente Familie mit vielen Varianten. Die H1- Isoformen verschiedener Organismen können sich in folgenden Eigenschaften unterscheiden:
- Sie erscheinen in bestimmten Momenten der Entwicklung des Organismus, - sind gewebespezifisch (RISLEY und ECKHARDT, 1981; BERS et al., 1992),
- unterscheiden sich durch die Verteilung im Chromatin und in Interphase- Chromosomen (HOYER-FENDER und GROSSBACH, 1988; MOHR et al., 1989, BERS et al., 1992;),
- besitzen verschiedene Fähigkeiten, das Chromatin zu kondensieren (LIAO und COLE, 1981a) und die DNA (bzw. bestimmte Sequenzen der DNA) zu binden (LIAO und COLE, 1981b),
- sie können einen spezifischen Einfluß auf die DNA Methylierung haben (STROM et al., 1995).
Man unterscheidet abhängig von den Zelltypen: Testes H1 (H1t), somatisches H1, Differenzierungs-H1 (H5 und H10), stadienspezifisches, embryonales H1 (B4/H1M).
Bei Säugetieren wurden sieben somatische Isoformen identifiziert und beschrieben. Fünf von sieben wurden als H1.1, H1.2, H1.3, H1.4 und H1.5 bezeichnet (DOENECKE et al., 1988). Die Ähnlichkeit der Primärstruktur zwischen den H1-Isoformen ist sehr hoch und beträgt 60 bis 85%. Das Histon H1t wurde gewebespezifisch und nur in primären Pachytän-Spermatocyten in der Prophase I der Meiose exprimiert (DRABENT et al., 1998).
Das Histon H10 ist dem H5 Histon der Vögel ähnlich (DOENECKE et al., 1997) und kommt in differenzierten Säugetier-Zellen vor, die sich nicht mehr teilen. Das Histon H5 wird nur in den Erythrocyten der Vögel und Reptilien exprimiert, wo das Chromatin stark kondensiert und die Transkription inaktiv ist (AFFOLTER et al., 1987). Bei anderen Tieren wurden H1-Isoformen beschrieben, die nur in bestimmten Zellstadien und/oder Keimbahnzellen exprimiert wurden. So sind oocytenspezifische Histone (B4/H1M) bei
Xenopus laevis, 'cleavage-stage' cs-H1 bei Seeigel und H1oo bei Säugetieren (TANAKA et al., 2001) beschrieben worden.
Sämtliche oocytenspezifische mRNAs der H1-Isoformen sind im Gegensatz zu den somatischen H1-Isoformen polyadenyliert. Dies bedeutet, dass sie vom Zellzyklus unabhängig exprimiert sind ('replacement histones'). Somatische Histon-mRNAs haben dem gegenüber eine 3‘-terminale Haarnadelstruktur und sind Zellzyklus-abhängig exprimiert (OSLEY, 1991; HEINTZ, 1991; BIRNSTIEL et al., 1995).
Die Modifikation der Histone durch Phophorylierung, ADP-Ribosylierung und Methylierung hat einen regulatorischen Einfluß auf die Genaktivität (VAN HOLDE, 1989).
Die Rolle der Modifikationen des Linkerhistons H1 in der Organisation des Chromatins ist unzureichend geklärt (ZLATANOVA und VAN HOLDE, 1992; WOLFFE, 1991).
Die Phosphorylierung ist mit der Teilung der Zellen korreliert. Sie findet langsam in der G1-Phase statt und erreicht in der S- und G2-Phase das Maximum. Am Ende der Mitose werden die Phospat-Gruppen entfernt. Es werden Serin und Threonin in den N- und C- terminalen Domänen durch einen Komplex von p34cdc2 und Cyklin B (ARION et al., 1988) phosphoryliert. Die Funktion der Phosphorylierung ist noch nicht genau geklärt.
Während der Apoptose wurde die DNA fragmentiert, die Linkerhistone wurden dephosphoryliert (KRATZMEIER et al., 2000). Man vermutet, dass die Histon H1- Phosphorylierung zur Kondensierung der Chromosomen und zur transkriptionellen Regulation führt.
Anderenseits wurde durch die Substitution der Phosphorylierungs-Stelle (Threonin und Serin) in Tetrahymena thermophila im Makronukleus bewiesen, dass die Phosphorylierung des Linkerhistons H1 für die Lebensfähigkeit in diesem Organismus keine Rolle spielt (MIZZEN et al., 1999).
Die ADP-Ribosylierung kann nicht nur mit der DNA-Reparatur sondern auch mit der Apoptose verbunden sein (YOON et al., 1996). Dieser Prozeß erleichtert den Zugriff der Nukleasen zur DNA zwischen den Nukleosomen.
Zum Vergleich mit dem Linkerhiston sind die 'core' Histone nicht nur phosphoryliert und ADP-ribosyliert, sondern sie werden auch acetyliert, ubiquitiniert und methyliert
(VAN HOLDE, 1989).
Die Modifikationen der N- und C-terminalen Domänen der 'core' Histone haben einen Einfluß auf die DNA-Bindung zum Nukleosom, was auf die regulatorische Funktion des Nukleosomes hinweist (ARENTS und MOUDRIANAKIS, 1995).
Das Histon H3 ist durch Acetyltransferasen in den Lysin-Positionen Lys-9 und Lys-14 modifiziert, das H4 Histon in den Positionen Lys-5, Lys-8, Lys-12 und Lys-16 der N- terminalen Domäne. Das acetylierte Histon Isoform H4 ist in der Lysin-Position Lys-16 mit transkriptionell hochaktivem X-Chromosom der männlichen Zellen von Drosophila verbunden. Das 'core' Histon H4 des inaktiven X-Chromosoms bei Säugetieren ist kaum acetyliert (JEPPESEN und TURNER, 1993). Das gilt auch für die GpC-Inseln in der Nähe der 'housekeeping'-Gene (BROWNELL et al., 1996). Die Acetylierung führt dazu, dass das Chromatin nicht stark kondensiert ist und die Proteine sowie die Transkriptionsfaktoren einen leichteren Zugriff zur DNA haben. Diese Modifikationen sind durch kooperative Funktionen der Histon Acetyltransferasen (HAT) und Deacetylasen (HDAC) kontrolliert.
Für die Acetylierung sind Acetyltransferasen verantwortlich. Sie teilen sich in zwei Gruppen: HAT-A und HAT-B. Die HAT-A-Gruppen sind in den Nuklei lokalisiert und regulieren die Expression der Gene. Zur HAT-A-Gruppe gehören die Proteine HAT-A (bei Tetrahymena) und der ähnliche HATA-A Transkriptionsfaktor der Hefe-Gcn5 (BROWNELL
et al., 1996; KLEFF et al., 1995). Die Proteine HAT-B befinden sich im Cytoplasma und acetylieren die neu entstandenen 'core' Histone (NAKAYAMA und TAKAMI, 2001).
Bei Menschen sind die Proteine p300/CBP, PCAF ('cellular p300/CBP associated factor'), TAFII 230/250 — ein Teil des Transkriptionsfaktors TFIID (MIZZEN, 1996) — und ACTR/SRC-1 ('activator of retinoid receptors') für die Acetylierung der 'core' Histone notwendig.
Zu den Histon-Deacetylasen gehören bei Säugetieren HDAC-1, HDAC-2 und bei Hefen die transkriptionellen Corepressoren Sin3 und Rpd3.
Die Inhibitoren für die Aktivität des HDAC sind Trichostatin (TSA), Trapoxin und Sodium-Butyrat (NAKAYAMA und TAKAMI, 2001).
Die oben beschriebenen Mechanismen haben nicht allein Einfluß auf die Expression der Gene. Es ist aber bekannt, dass die Genregulation in Eukaryonten ein sehr komplexes Wechselspiel zwischen unspezifischen und spezifischen Faktoren, Proteinen und Proteinkomplexen ist. Es gibt Proteine, die die Struktur des Chromatins destabilisieren und
den Zugriff der Transkriptionsfaktoren zur DNA erleichtern. Für diesen 'remodeling'- Prozeß werden Proteinkomplexe benötigt. Gut beschrieben sind die Proteine, die durch die SWI/SNF Gene von S. cerevisiae kodiert sind (WINSTON und CARLSON, 1992). Ohne den SWI/SNF Komplex werden folgende Gene nicht transkribiert: HO (HO kodiert die Endonuklease), INO1 (ein Enzym, das verantwortlich für den Metabolismus der Inozytol ist) und SUC2 (eine Invertase) (CARLSON et al., 1984).
Die SWI/SNF Komplexe interagieren mit den Proteinen des Chromatins und destabilisieren deren Struktur. Ähnliche Eigenschaften haben die menschlichen Gene Brg1 und hBrm (KENNISON und TAMKUN, 1988). Als weitere Chromatin-'remodeling'-Faktoren sind bekannt: NURF Komplex (Nukleosome Remodeling Factor), CHRAC Komplex (Chromatin Accessibility Complex) und ACF (remodeling factor); dieser ist ATP- abhängig und wurde bei Drosophila melanogaster beschrieben (KRUDE und ELGIN, 1996).
Die Änderung der Struktur des Chromatins wirkt nicht nur Gen-aktivierend. Es gibt auch viele Proteine, die auf das Chromatin wirken und die Gene reprimieren. 1947 wurde bei Drosophila eine Gen-Familie entdeckt, welche als Polycomb-Group-Protein (Pc-G) bezeichnet wurde, mit der Funktion, homeotische Gene zu reprimieren.
Die Pc-G Familie entsteht aus ca. 40 Genen (z.B.: Psc-Posterior sex combs, Su(2)Z- Suppressor 2 of zeste, Pc-Polycomb, Ph-Polyhomeotic) (EPSTEIN, 1992). Funktionell vergleichbare Gene wurden bei Mäusen (Gen bmi-1) und bei Menschen (Gen Bmi-1) entdeckt (VAN der LUGT et al., 1994). Die Zerstörung der bmi-1 Funktion bei Mäusen führt zu verschiedenen entwicklungsbiologischen Anomalien (ALKEMA et al., 1995).
Die Repressions-Mechanismen sind sehr gut bekannt und beschrieben bei S. cerevisiae.
Die Regulation der zwei jeweils alternativ aktiven Paarungsgeneloci, welche den Paarungstyp der Hefen bestimmen, wird von der Struktur des Chromatins geregelt.
Die Repression der Transkription des Genes findet in SML (silent mating locus) und in der Nähe der Telomere statt.
Das Silencing der Gene in der Nähe der Telomere hängt von den Histonen H3, H4 und auch von den Proteinen SIR3 und SIR4 ab ('silent information regulator'). Diese Proteine binden die N-terminalen Domänen der Histone H3, H4, mit Proteinen RAP1 und dem ORC-Komplex ('orgin recognition complex') (BUCHMAN et al., 1988).
Das Linkerhiston H1 ist seit einigen Jahrzehnten als genereller Repressor der Transkription in vitro bekannt und ist wahrscheinlich auch an der Regulation der spezifischen Klassen der Promotoren von Genen beteiligt (CAIRNS, 1988).
Anderseits beweisen viele Untersuchungen an dem Linkerhiston H1, dass das H1 Histon kein genereller Repressor der Transkription in vivo ist (PRYMAKOWSKA-BOSAK et al., 1996; SHEN und GOROVSKY, 1996; STEINBACH et al., 1997).
Die elektronenmikroskopische Antikörper-Dekoration hat gezeigt, dass das Chromatin eines hochtranskriptionsaktiven Gens eine vergleichbare Dichte von H1-Molekülen besitzt wie die inaktive 30 nm Fibrille (ERICSSON et al., 1990).
Nach Knockout der H1-Gene von Tetrahymena, Aspergillus nidulans und der H10-Isoform bei Mäusen wurden keine Effekte auf die Proliferation und die Differenzierung der Zellen beobachtet (SHEN und GOROVSKY, 1996; SIROTKIN et al., 1995; RAMON et al., 2000).
Andererseits wird bei Tetrahymena das Linkerhiston H1 für die Repression des ngoA Gens in wachsenden Zellen und die Expression des CyP Gens in 'starved'-Zellen benötigt (SHEN
und GOROVSKY, 1996). Bei Saccharomyces cerevisiae wurde das Hho1p Protein, das dem H1 Protein ähnlich ist, untersucht (ESCHER und SCHAFFNER, 1997; PATTERTON et al., 1998;
PUIG et al., 1999). In dem Knockout-Stamm (ohne HHO1 Gen) wurden keine Effekte beobachtet. Das Protein wird nicht für das 'silencing' der Telomere, der transkriptionellen Repression oder für die Sporulation benötigt.
Auch bei Zerstörung des H1t Gens (anwesend in späten Spermatocyten und frühen Spermatiden) bei Mäusen (FANTZ et al., 2001) war kein Phenotyp festzustellen. Die Null- Mutanten waren fertil, ohne Änderungen der strukturellen chromosomalen Proteine während der Spermiogenesis. Die Menge der Proteine Protamin 1 und 2 hatte sich im Vergleich zur Kontrolle nicht verändert. Das Chromatin (ohne H1t) war funktionell dem Chromatin mit H1t ähnlich, weil die somatischen H1-Isoformen stärker exprimiert wurden.
Auch bei der Überexpression des Histons H10 bei Mäusen wurden keine Effekte beobachtet (TONJES et al., 1997; STEIN und SCHULTZ, 2000).
PRYMAKOWSKA-BOSAK hat durch die Überexpression der somatischen Typen von H1 in Tabak gezeigt, dass die Kondensation des Chromatins durch die doppelte Menge von H1 stark zunimmt — jedoch ohne Erscheinen deutlicher phenotypischer Effekte (PRYMAKOWSKA-BOSAK et al., 1996). Ein geringer Einfluß des Linkerhistons H1 wurde nur in der Morphologie (in Bezug auf die Größe der Zellen) und der Ultrastruktur bei
Arabidopsis thaliana beschrieben (SLUSARCZYK et al., 1999). In BY-2 Suspensionszellen von Tabak bei der Überexpression des Linkerhistons H1 von Arabidopsis thaliana beobachtete man eine Änderung der Zellgröße, die mit der Organisation der cortikalen Mikrotubuli korreliert (CALIKOWSKI et al., 2000).
Andererseits spielt eine der Histon H1-Isoformen bei Tomaten (H1-S) eine potentielle Rolle für die Gen-Regulation und -Expression, die für die Reaktion auf ein Wasserdefizit verantwortlich sind (SCIPPA et al., 2000). In Ascobolus immersus wurde gezeigt, dass das Histon H1 ein Einfluß auf die Lebensspanne hat (BARRA et al., 2000).
In transgenem Tabak ersetzten PRYMAKOWSKA-BOSAK et al. (1999) die Menge der am höchsten exprimierten Histone H1A und H1B durch H1C und H1F, trotzdem war der Effekt auf die Kondensation des Chromatins sichtbar. Der transgene Tabak ist normal gewachsen. Der beobachtete Einfluß wurde in der Blüten-Entwicklung und bei der männlichen Meiose im Pollenkern detektiert. Die Morphologie der Blüten ändert sich und in der männlichen Gematogenese kommen Aberrationen vor.
Bei Xenopus (BOUVET et al., 1994; TOMASZEWSKI und JERZMANOWSKI, 1997) wurde eine spezifische Regulation von Genen durch H1 für die 5SrRNA während der früheren Entwicklung des Frosches nachgewiesen. Das Linkerhiston H1 wurde als Genrepressor für Oocyte-Typen 5SRNA Gene identifiziert (BOUVET et al., 1994; KANDOLF, 1994).
In vitro wies man nach, dass sich das Histon H1 an die AT-reichen-Sequenzen im Chromatin bindet, die Nukleosomen-Entfernung vergrößerte, wodurch die Verteilung der Nukleosomen stabilisiert wurde. Diese stabilisierten Nukleosomen schützten die 5SRNA Gene der Oocyte und führten zur Repression ihrer Transkription in vitro. Die somatische 5SRNA besitzt keine AT-reichen-Sequenzen und ist nicht reprimiert (TOMASZEWSKI und JERZMANOWSKI, 1997).
Da viele Organismen und Zelltypen mehrere Isoformen von H1 besitzen, ist auch die Frage interessant, ob die einzelnen gleichzeitig in einem Zellkern vorhandenen H1-Isoformen verschiedene Funktionen besitzen, oder ob die Heterogenität der H1 Proteine nur anzeigt, welche Variationen der Struktur des Proteins dessen (einheitliche) Funktion zuläßt. Diese Frage ist systematisch bei der Diptere Chironomus untersucht worden. Die Zuckmücke Chironomus thummi hat vier H1-Isoformen, die sich durch die Divergenz einer Variante (H1 I-1) in zwei Klassen einteilen lassen. Es wurde gezeigt, dass diese Isoform eine N-
terminale Insertion der Form (KAP)n besitzt und eine diferentielle Verteilung in den Polytänchromosomen zeigt (SCHULZE et al., 1992; GROSSBACH, 1995; TRIESCHMANN et al., 1997). Ihr Vorkommen ist mit kondensiertem Chromatin korreliert, in dem die repetierte DNA liegt (MOHR et al., 1989). Dieser Dualismus wird auch durch ein anderes, ähnliches Sequenzmotiv (SPAK) konstituiert (SCHULZE et al., 1994). Eine Beteiligung von diesen strukturell andersartigen H1-Isoformen an der Bildung eines kondensierten Chromatinsubtyps wird daher angenommen (SCHULZE et al., 1993; WISNIEWSKI und GROSSBACH, 1996).
Die bisherigen Ergebnisse haben die biologische Funktion des Linkerhistons H1 bis jetzt nicht sicher geklärt. Im Gegensatz zu 'core' Histonen, die essentiell für das Leben sind (HAN et al., 1987), ist das Linkerhiston H1 offenbar entbehrlich.
Die Funktion der eukaryontischen Histone H1 wird in der Kondensierung des Chromatins und der Blockierung des Zuganges anderer Proteine zur nukleosomalen DNA vermutet.
Das Linkerhiston H1 könnte die DNA-Ladung neutralisieren und dynamisch mit Chromatin assoziiert sein, um die Verpackung der DNA und ihre Zugänglichkeit zu ändern.
Um die Rolle des Linkerhistons H1 besser kennenzulernen, wurden die H1-Familien bei Caenorhabditis elegans untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurden sieben H1- Isoformen untersucht mit dem Ziel, die biologische Bedeutung der Linkerhiston Isoformen zu erarbeiten. Zu Beginn der Untersuchung wurde ein 'C. elegans-Laboratorium' mit umfangreichen, neuartigen Methoden etabliert.
Die zwei Histon H1-Proteine H1.1 und H1.2 , wie auch das H1.1 kodierende Gen, wurden schon früher beschrieben (VANFLETEREN et al., 1988; VANFLETEREN et al., 1990;
SANICOLA et al., 1990). Die anderen H1 Proteine werden hier zum ersten Mal beschrieben.
Die Rolle des Histon H1 im lebenden Organismus wurde in diesen früheren Publikationen nicht untersucht.
Der Wurm C. elegans eignet sich als Modellsystem für entwicklungsbiologische Studien besonders gut, da der Zellstammbaum (SCHIERENBERG und CASSADA, 1986), wie auch das Genom vollständig bekannt ist. Die kurze Generationszeit (3 Tage) auf Platten, welche mit dem E. coli Stamm OP50 beschichtet sind, die minimale Länge (ca. 1,5 mm) sowie viele
Nachkommen (300-350) machen den Wurm als biologisches Objekt sehr attraktiv und ermöglichen eine schnelle und vielfältige Suche nach der Funktion des Histons H1.
In dieser Arbeit werden alle H1-Gene und Proteine von C. elegans vergleichend beschrieben. Die Analysen der Funktionen mehrerer einzelner H1-Isoformen wurde vor allem mit der dsRNA-Interferenz durchgeführt. Es wurde herausgefunden, dass H1.1 am Chromatin-kontrollierten silencing von Genen in der Keimbahn beteiligt ist. H1.4 ist für die Entwicklung der Strukturen des männlichen Sexualdimorphismus mit erforderlich und wird auch für die Organogenese benötigt. H1.2 ist ein starker Repressor der genetischen Aktivität in Dauerlarven.
Die Histon H1.X-Isoform wurde als überwiegend cytoplasmatisches Protein identifiziert, das mit den Tonofilamenten der Marginalzellen co-lokalisiert ist. H1.X ist nicht mit den kondensierten Chromosomen im Gegensatz zum Histon H1.1 und H1.4 verbunden.
Linkerhiston-Isoformen von C. elegans, deren Funktion oben beschrieben wurde, wurden auch in dem Telomer-Positionseffekt-Variegation-System der Hefen getestet. Es wurde herausgefunden, dass sie in diesem System funktionieren. Daraus kann man schließen, dass bestimmte molekulare Mechanismen zwischen den Hefen und C. elegans übereinstimmen.
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material
In dieser Arbei wurden folgende Caenorhabditis elegans Stämme verwendet:
N2 (Bristol, UK) als Wildtyp (BRENNER, 1974), pha-1(e2123) III (von R. Schnabel), him-8(e1489) IV, mes-2(bn11) unc-4(e120) / mnC1 dpy-10(e128) unc-52(e444) II, mes- 3(bn21) I, mes-6(bn66) dpy-20(e1282) IV / nT1[unc(n754) let] (IV, V), lin-17(n698) I, egl- 17(e1313) X, Oscheius myriophila, daf-2(e1370) III, ccls4251 I; dpy 20(e1282) IV, lep- 1(bx42) (von Caenorhabditis Genetics Center (CGC)), dpy-20(e1282); syIs20 him- 5(e1490) mit gpa-1::lacZ Fusion, dpy-20(e1282); syIs33; him-5(e1490) mit gpa-1::gfp Fusion, son-1(sy549); dpy20(e1282); syIs20 him-5(e1490) (von P. W. Sternberg).
Es wurden während der Doktorarbeit folgende C. elegans Stämme: EC100 (H1.1::gfp), EC101 (H1.1::gfp::CeH1.1 3´UTR), EC102 (H1.4::gfp), EC103 (H1.X::gfp), EC104 (H1.XK::gfp), EC105 (H1.XK::gfp), EC106 (H1.XK::gfp) und EC107 (let-858::gfp) hergestellt.
Es wurden folgende Escherichia coli Stämme: DH5α, BL21(DE3), OP50, HT115(DE3), LE392, XL1-Blue MRF´, SOLR verwendet. Die Sir2.1 cDNA (yk352g2) und H1 cDNA Klone (yk85b12, yk187f1, yk89f5, yk142d7, yk173g2, yk116f11) als Phagenlösungen kommen von Y. Kohara und λSHLH2 Phagenlösung von A. Coulson. Der Saccharomyces ceraevisiae UCC3505 Stamm wurde von D. E. Gottschling und der S35P-5A Stamm (Wildtyp) von D. Schmitt zur Verfügung gestellt.
2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden
2.2.1 Isolierung der Plasmid–DNA aus E. coli
Zur Isolierung von Plasmid-DNA wurde die alkalische Lysemethode (modifiziert nach BIRNBOIM und DOLY, 1979) verwendet. Dabei wurde die Plasmid-DNA aus jeweils 3 ml Kulturflüssigkeit präpariert (Miniprep): sterile Duran-Reagenzgläser wurden mit 4 ml LB-
Medium gefüllt, dem 16 µl Ampicillin (20 mg/ml) zugesetzt waren. Die Röhrchen wurden nach dem Animpfen mit einzelnen Bakterienkolonien mit Aluminiumkappen verschlossen und über Nacht auf dem Schüttler bei + 37°C inkubiert. Alle weiteren Schritte wurden bei RT ausgeführt. In 1,5 ml Eppendorfgefäßen wurden zweimal jeweils 1,5 ml Zellsuspension 1 min in einer Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert, der Überstand mit einer Pipette sorgfältig entfernt und erneut kurz zentrifugiert. Das Pellet wurde in 0,3 ml P1-Puffer (50 mM Tris/HCl, 10 mM EDTA, 400 µg/ml RNAse A, pH 8,0) resuspendiert und mit 0,3 ml P2-Puffer (200 mM NaOH, 1% SDS - frisch angesetzt) 5 min bei RT lysiert. Danach wurde P3-Puffer (2,55 M KaAcetat, pH 4,8) hinzupipettiert, kräftig geschüttelt und 15 min bei 12000 x g abzentrifugiert. Anschließend wurde die wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt, dort mit 0,8 Vol. Isopropanol versetzt und die DNA durch 15 min Zentrifugation gefällt. Das DNA Pellet wurde zweimal mit kaltem 70% Ethanol gewaschen, in der Vacuumzentrifuge getrocknet und in 60 µl TE-Puffer gelöst. Für Mikroinjektion und Sequenzierung wurde die Plasmid-DNA mittels eines Kits von Genomed, Qiagen oder Machery & Nagel nach den Vorschriften des Herstellers isoliert.
2.2.2 Isolierung der Cosmid-DNA
Das Protokoll ist dem Handbuch eines EMBO-Kurses entnommen und modifiziert worden (HODGKIN, J.; KUWABARA, P.; COULSON, A.; Manual for 1998 EMBO Practical Course on Molecular, Genetic and Informatic Methods for C. elegans; S. 35-36).
Eine einzige Kolonie wurde in 5 ml LB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin angeimpft und über Nacht bei + 37°C im Schüttler inkubiert. Zwei mal 1,5 ml Zellsuspension wurden im Eppendorfgefäß kurz (45 s) abzentrifugiert und das Pellet in 250 µl Lösung I (50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8,0) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. 250 µl Lösung II (0,2 N NaOH, 1% SDS; frisch angesetzt) wurden dazugegeben, 15 mal vorsichtig gemischt und 5 min auf Eis inkubiert. Dann wurden 200 µl Lösung III (3 M NaAcetat pH 4,8) zugegeben, 15 mal vorsichtig gemischt und 30 min auf Eis inkubiert und ab und zu gemischt. Das Pellet wurde 8 min bei RT abzentrifugiert und 600 µl des Überstandes wurden in ein neues Eppendorfgefäß übertragen, mit 0,9 ml kaltem Ethanol gemischt und 10 min bei – 20°C inkubiert. Das Pellet wurde 8 min abzentrifugiert und dann in 200 µl 0,3 mM NaAcetat, 1 mM EDTA resuspendiert, im Vortex gemischt, 15 min
bei RT belassen und dann erneut gemischt. Es wurden 400 µl kaltes Ethanol zum Resuspendat gegeben, 10 min bei – 20°C inkubiert und 8 min bei RT abzentrifugiert. Das Pellet wurde in kaltem 70% Ethanol gewaschen, in der Vacuumzentrifuge getrocknet und mit TE resuspendiert. Die quantitative Lösung der Cosmid-DNA erfolgt über Nacht bei RT. Ungünstige Herstellungsverfahren können Deletionen im Cosmid verursachen. Die enzymatisch verdaute DNA wurde auf einem Agarose-Gel analysiert um festzustellen, ob das Cosmid vollständig war.
2.2.3 In vivo Umwandlung der λZAP II Klonen
Es wurden in 4 Röhrchen je 200 µl von einer Übernachtkultur des E. coli Stammes LE392 (Lambda ZAP II Predigested EcoRI/CIAP – Treated Vector Kit (Stratagene)) pipettiert, dazu 200 µl Magnesiumchlorid (Endkonzentration 10 mM) und jeweils 1 µl, 3 µl, 5 µl, 10 µl Phagensuspension hinzugefügt. Die Röhrchen wurden 30 min bei + 37°C inkubiert.
Nach Zugabe von 3 ml NZY-TopAgar wurde die Suspension auf NZY-Platten ausplattiert.
Die Platten wurden bei + 37°C über Nacht inkubiert, um die Phagen zu vermehren. Dann wurden auf die Platten 1 ml SM Puffer und 40 µl Chloroform gegeben und einige min inkubiert, um die Phagen zu eluieren. Zuletzt wurde die Mischung von Phagen, SM Puffer und Chloroform in ein Eppendorfgefäß pipettiert, 1 min am Vortex gemischt und 1 bis 2 h bei RT oder über Nacht bei + 4°C inkubiert. 250 µl dieser Phagensuspension wurde direkt weiter verwendet während der Rest mit DMSO (Endkonzentration 7%) bei – 80°C eingefroren wurde.
Eine zweite Methode (SCHULZE, pers. Mittlg.) wird weiter unten beschrieben. Vom E. coli Stamm LE392 wurde eine Übernachtkultur angesetzt, 1 ml aus der frischen Übernachtkultur zu 50 ml LB gegeben und 6 h bei + 37°C, bei 220 rpm im Schüttler inkubiert. Nach 6 h wurden die Zellen bei 5000 x g und + 4°C abzentrifugiert und in 25 ml 10 mM Magnesiumchlorid aufgenommen. 250 µl dieser kompetenten Zellen wurden mit 1 µl Phagensuspension versetzt, 30 min bei + 37°C inkubiert, dann 3 ml LB zugegeben und über Nacht bei + 37°C im Schüttler inkubiert. Wenn eine gute Lyse sichtbar war, wurden die Zellen bei 12000 x g abzentrifugiert, ansonsten weitere 4 h bei + 42°C inkubiert. Der Überstand mit Lambda Phagen wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit einem kleinen Tropfen Chloroform konserviert. Die Phagensuspension wurde 30 s bis
1 min am Vortex gemischt, um die verbliebende LE392 Zellen abzutöten. 40 µl Phagensuspension davon wurden mit 1 ml LB verdünnt.
Die XL1-Blue MRF´ und SOLR Zellen wurden in LB mit 0,2% Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat angeimpft und bei + 30°C, mit 220 rpm über Nacht im Schüttler inkubiert. Die Zellen wurden bei 1000 x g abzentrifugiert und mit 10 mM Magnesiumsulfat auf eine optische Dichte von OD 600 nm = 1,0 gebracht. In ein 15 ml Falcon-Röhrchen wurden folgende Komponenten pipettiert:
200 µl XL1-Blue MRF´ Zellen (OD 600 nm = 1,0 )
250 µl Phagensuspension ( 40 µl Phagen in 1 ml LB verdünnt) 1 µl ExAssist helfer Phagen (> 1 x 106 pfu/µl)
und 15 min bei + 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 3 ml LB wurden die Falcon-Röhrchen 2,5 bis 3 h bei + 37°C geschüttelt, anschließend 3 h bei + 65-70°C, 20 min im Wasserbad inkubiert und 15 min bei 1000 x g zentrifugiert. Der Überstand mit pBluescript phagemid wurde in ein neues Röhrchen übertragen und bei + 4°C aufbewahrt. Je 200 µl der frisch gewachsenen SOLR-Zellen (mit 10 mM Magnesiumsulfat auf eine OD 600 nm = 1,0 verdünnt) wurden in zwei Eppendorfgefäße gegeben, dazu 10 µl bzw. 100 µl pBluescript phagemid-Suspension gegeben und bei + 37°C für 15 min inkubiert. 200 µl aus jedem Eppendorfgefäß wurden auf Ampicilin Platten ausplattiert und über Nacht bei + 37°C inkubiert. Eine einzige Kolonie wurde in LB mit Ampicilin angeimpft, über Nacht bei + 37°C geschüttelt und Miniprep und enzymatischer Verdau gemacht, um das Insert in pBluescript II SK(-) nachzuweisen. Die positiven Klone wurden eingefroren bei – 80°C, Midiprep gemacht und das Insert sequenziert. Nach dieser Methode wurden die cDNA Klone der Phagenbibliothek von Y. Kohara isoliert.
2.2.4 In vivo Umwandlung des λSHLH2 Klones
Die pop-out Phagensuspension wurde über Nacht bei + 37°C in LB mit 10 µg/ml Chloramphenicol und 50 µg/ml Kanamycin inkubiert. Danach wurde 10 µl λSHLH2 Phagensuspension (von A. Coulson) mit 100 µl pop-out Phagensuspension und 20 µl M13K07 helfer Phagensuspension zusammen gemischt. Nach 75 min Inkubation bei RT wurden 2 ml 2 x YT und 90 µg/ml Ampicilin zugegeben und über Nacht bei + 37°C inkubiert. 1,2 ml der Übernachtkultur wurde 5 min bei 12000 x g abzentrifugiert. 5 µl vom
Überstand wurden mit 100 µl XL1-blue Zellen, die über Nacht in LB mit 15 µg/ml Tetracyclin inkubiert wurden, gemischt und weiter 75 min bei RT inkubiert. Die Mischung wurde auf Ampicilin (90 µg/ml) / Tetracyclin (15 µg/ml) Platten ausplattiert und über Nacht bei + 37°C inkubiert. So wurde H1.4 cDNA Klon isoliert.
2.2.5 Bestimmung der Konzentration der DNA und der RNA
DNA- und RNA-Konzentrationen wurden spektralphotometrisch bestimmt oder fluorometrisch auf einem Agarose-Gel durch Vergleich mit einem Mengenstandard (Lambda-DNA Marker) abgeschätzt. Zur genauen Bestimmung der DNA- bzw. RNA- Menge wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die Proben wurden mit Wasser verdünnt; die Messung wurde mit einem Spektralphotometer (Uvicon) durchgeführt. Die
C [µg/µl] = OD 260 nm x ε x V
OD 260 nm = optische Dichte bei 260 nm
ε = Extinktionskoeffizient (ds DNA= 0,05 oder RNA=0,04 ) V = Verdünnungsfaktor
2.2.6 Restriktionsverdau von DNA
Für analytische Zwecke wurde DNA mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen geschnitten (BROOKS, 1987) und anschließend gelelektrophoretisch analysiert. Eingesetzt wurden jeweils bis 2 µl DNA in einem Gesamtvolumen von 10 µl, 1 µl 10 x Puffer (je nach Enzym und Hersteller), ein oder mehrere Restriktionsenzyme und H2O. Verdaut wurde für 1 h bis 2 h bei + 37°C bzw. bei + 25°C (Sma I).
2.2.7 Agarose-Gel-Elektrophorese
DNA-Fragmente aus Restriktionsverdau-Ansätzen bzw. PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese (SAMBROOK et al., 1989) getrennt. Verwendet wurde Agarose in einer Konzentration von 0,7%-1,5% in 1 x TAE-Puffer (abhängig von der Produktgröße); die auf ca. + 55°C abgekühlte Gellösung wurde vor dem Gießen 1 µg/ml Ethidiumbromid (Stocklösung) hinzugefügt. Die Proben wurden mit Bromphenolblau-
Lösung (50% Glycerin in TE und 0,2% Bromphenolblau) zur Markierung der Lauffront versetzt. Als Größenstandard diente mit EcoR I / Hind III geschnittene Lambda-DNA. Die Trennung erfolgte bei 108 V in TAE Puffer. Die Analyse des Gels wurde auf einem UV- Transilluminator (254 nm) vorgenommen. Fur präparative Zwecke (Ligation) erfolgte eine Elektrophorese in 0,7% Gelen mit niedrigschmelzender Agarose ( Peqgold Low Melt Agarose, Peqlab). Die Banden wurden in diesem Fall unter einer UV-Lampe bei 350 nm aus dem Gel herausgeschnitten und zur Ligation verwendet.
2.2.8 Klonierung von Restriktionsfragmenten
Die DNA wurde in low-melting-point Agarose-Gel prepariert, die entsprechende Bande aus dem Gel herausgeschnitten und bei + 65°C geschmolzen. Die Bande wurde auf + 37°C abgekühlt, davon 6 µl mit 3 µl Vektor (z.B.: pBluescript II SK (+/−), pUC18, pET3a) gemischt und zu 11 µl Ligationsansatz (2 µl 1 Unit/µl T4-DNA-Ligase, 2 µl 10 x Ligationspuffer, 7 µl steriles H20) gegeben. Die Ligationsreaktion wurde über Nacht bei + 14-18°C inkubiert; anschließend in kompetenten E. coli DH5α oder BL21(DE3) transformiert. Für einige Ligationen wurde eine Dephosphorylierung des Vektors mit alkalischer Phosphatase durchgeführt: Nach dem enzymatischen Verdau des Vektors wurden 1 µl alkalische Phosphatase und entsprechender Puffer in der Verdünnung 1:250 hinzugefügt und 30 min bei + 37°C inkubiert. Nach Trennung im low-melting-point Agarose-Gel wurde die entsprechende Bande ausgeschnitten und für die Ligation verwendet.
2.2.9 Transformation von kompetenten E. coli Zellen
Die kompetenten Zellen E. coli DH5α oder BL21(DE3) wurden auf Eis aufgetaut. Die Gel-Bande aus der Ligationsreaktion wurde bei + 65°C geschmolzen und auf + 37°C gebracht, mit 100 µl Bakteriensuspension auf Eis gemischt und 40 min darauf belassen.
Für den Hitzeschock wurden die Zellen 2 min bei + 42°C im Wasserbad erwärmt, anschließend 10 min bei RT gelassen und mit 1 ml LB-Medium ohne Antibiotika bei + 37°C inkubiert. Durch 30 s Zentrifugation bei 12000 x g wurden die E. coli-Bakterien
konzentriert und 200 µl entweder auf X-Gal-, Ampicilin- oder auf Kanamycin-Platten ausplattiert (Vektor abhängig).
2.2.10 Herstellung der Transformationskompetenten E. coli
1 ml einer frischen Übernachtkultur wurde in 50 ml LB-Medium in sterilen 50 ml Falcon- Röhrchen angeimpft. Nach Erreichen einer OD 600 nm von 0,3 wurden die E. coli Bakterien mit 3000 x g bei + 4°C in vorgekühlter Hettich-Zentrifuge abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 50 mM autoklaviertem CaCl2 (+ 4°C) aufgenommen: zuerst vorsichtig mit 1 ml auf Eis resuspendiert und dann auf 25 ml verdünnt, nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen 10 min mit 3000 x g bei + 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml 50 mM CaCl2 aufgenommen und mit 10-15% sterilem Glycerin (Endkonzentration) versetzt. Aliquots von 200 µl wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei – 80°C für mehrere Monate gelagert. Kompetenz (Transformation pro µg Vektor pUC18) und Hintergrund (Transformation ohne Vektorzugabe) jeder Charge wurden auf Ampicilin- Platten überprüft.
2.2.11 Herstellung der DNA-Fragmente mit überhängenden Enden oder mit stumpfen Enden
Für die Umklonierung oder Klonierung von PCR-Produkten in Vektoren wurden zwei verschiedene Techniken benutzt, mit überhängenden Enden (die Restriktionsenzyme schneiden so, daß an den Insert-Enden die freien Einzelstrang-Überhänge bleiben) oder mit stumpfen Enden (die Enden des Inserts sind stumpf). Das PCR-Produkt wurde mit Taq- Polymerase inkubiert und danach gereinigt. Dafür wurden 50 µl des fertigen PCR- Reaktion-Ansatzes mit 1 Unit Polymerase und 8 µl 0,25 mM dNTP gemischt und 5 min bei + 72°C im Wasserbad inkubiert, anschließend mit 20 µl Chloroform/Isoamylalkohol (96:4) extrahiert, 1 min am Vortex gemischt, die wässrige Phase 1 min abzentrifugiert bei RT, der klare Überstand in ein neues Eppendorfgefäß übertragen und mit 5 µl NaAcetat 3 M pH 5,5, 100 µl EtOH 100% 3 h bei – 20°C präzipitiert. Das Pellet wurde mit 12000 x g für 30 min abzentrifugiert, mit 70% Ethanol (- 20°C) gewaschen und in der Vacuumzentrifuge getrocknet. Das PCR-Produkt wurde in sterilem Wasser oder TE (20 bis
50 µl, abhängig von der Pelletmenge) gelöst. Für blunt-end-Klonierungen wurden 16 µl des PCR-Produkts in ein neues Eppendorfgefäß übertragen, mit 4 µl T4-DNA-Polymerase- Puffer (5 x Konz.), 2 µl 0,25 mM dNTP und 1 Unit T4-DNA-Polymerase versetzt und bei + 12°C 15 min im Wasserbad inkubiert. Zur Inaktivierung der Polymerase wurde 10 min bei + 75°C inkubiert. Der Vektor wurde mit anderen Enzymen, die stumpfe Enden machen - z.B.: Ecl136 II, Sma I, Stu I – verdaut.
Für Klonierungen mit überhängenden Enden wurde das PCR-Produkt und auch der Vektor mit entsprechenden Enzymen z.B. BamH I, Kpn I, Hind III 3 h bei + 37°C verdaut. Das PCR-Produkt - wie auch der geschnittene Vektor - wurden auf einem 0,7% Agarose-Gel (low-melting-point Agarose, Peqlab) bei 108 V elektrophoretisch gereinigt. Die entsprechenden Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und für die Ligation verwendet.
2.2.12 Sequenzierung der Plasmid DNA
Die Methode ist nach SANGER (SANGER et al., 1977) durchgeführt.
Für die Sequenzierung wurden Plasmid-Minipreps mit dem Kit der Firma Genomed durchgeführt. Die DNA wurde in sterilem Wasser gelöst und spektrophotometrisch bestimmt. Pro Sequenzierungsreaktion wurden 0,5-3 µg DNA verwendet und mit dem Kit 'Sequenase Version 2.0' von United States Biochemical (Cleveland) nach den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Pro Reaktion wurden 50000 Bq 35S-dATP (Amersham, Braunschweig) eingesetzt. Die primer wurden in der Konzentration von 5 pmol/µl eingesetzt. Für die Inserts in pUC18 wurden die primer revers
5´ AACAGCTATGACCATG 3´und – 40
5´ GTTTTCCCAGTCACGAC 3´, in pSK die primer T3
5´ AATTAACCCTCACTAAAGGG 3´ und T7 5´ GTAATACGACTCACTATAGGGC 3´
und in pET3a der primer pET7-3a
5´ TAATACGACTCACTATAGGG 3' verwendet.
Zur Sequenzierung der GFP-Konstrukte (Vektor pEGFP-N1 rückwärts) wurde der primer ESSEQ06 5´ CCAGCTCGACCAGGATG 3´ verwendet. Der primer ESSEQ07
5' AA(A,C)TACA(A,C)(G,T)(G,C)T(T,C)GGAGA 3' bindet in der konservierten Region der Histone H1-Gene und erlaubt eine Sequenzierung der N-terminalen Domänen .
Die Elektrophorese wurde in einer S2-Kammer von BRL (Eggenstein) durchgeführt. Eine Glasplatte wurde mit 2% Dichlordimethylsilan in Trichlorethan hydrophobisiert, die zweite mit einer Haftsilanlösung behandelt. Dann wurde zwischen die beiden Platten die Polyacrylamid-Gellösung gegossen, die vorher filtriert und zum Starten der Polymerisations-Reaktion mit 100 µl TEMED und 175 µl 25% Ammoniumperoxodisulfat (APS) versetzt worden war. Die Elektrophorese erfolgte bei 70 Watt und wurde ca. 30 min vor dem Laden der Proben gestartet. Nach einer Laufzeit von 1-6 h wurden die Glassplatten mit dem Gel in 5% Methanol und 5% Essigsäure inkubiert, um den Harnstoff zu eluieren, und im Brutschrank 1 h bei + 130°C getrocknet. Die Exposition auf X-Omat- AR-Röntgenfilm (Kodak) erfolgte über Nacht. Der Film wurde 5 min entwickelt und 5 min fixiert. Während eines langen Laufs wurden ca. 800 bp von einer Sequnzierungsseite gelesen. Für Inserts, die länger als 1500 bp waren, wurden Subklone gebaut, um das ganze Insert im Vektor abzulesen.
2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.2.13.1 Standardansatz
Die Polymerase-Kettenreaktionen (MULIS and FALOONA, 1987) wurden entweder mit der thermostabilen Taq-Polymerase (aus Thermus aquaticus, Fa. Fermentas) oder mit zwei gemischten Polymerasen durchgeführt: thermostabile Taq-Polymerase und Pwo DNA Polymerase (Expand™ Long Template PCR System oder Expand™ High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim); die Wahl der Methode war abhängig vom Zweck (analytische oder präparative PCR) und von der Länge der zu amplifizierenden DNA. Es wurde für einen PCR-Ansatz in folgender Reihenfolge in ein Eppendorfgefäß pipettiert:
8 µl dNTP (Endkonzentration 0,25 mM)
5 µl 10 x Konz. Puffer für verwendete Polymerase 2 µl 25 mM MgCl2
0,5 µl primer (Endkonzentration 1 pmol/µl) 0,1-1 µg DNA1 Unit Polymerase
ad 50 µl steriles Wasser
überschichten mit 30 µl Öl (Sigma, Qualität Molekularbiologie)
Der Standardansatz wurde in einem Gesamtenvolumen von 50 µl durchgeführt.
Spezifität und Produktmenge einer PCR sind u.a. stark abhängig vom verwendeten Puffersystem. Der Puffer der Fa. Amersham zeigte in dieser Hinsicht die besten Ergebnisse. Die Schmelzpunkte der primer wurden nach RYCHLIK und RHOADS (RYCHLIK
und RHOADS, 1989) berechnet. Die Reaktionen wurden in einem Trio-Thermoblock (Fa.
Biometra) ausgeführt. Die jeweiligen Reaktionsbedingungen und primersequenzen wurden variiert. Zur Überprüfung des PCR-Produktes wurden je 5 µl mit 5 µl H20 und 2 µl Proben Puffer auf Parafilm gemischt (Mineralöl bleibt auf dem Parafilm zurück) und auf ein Agarose-Gel aufgetragen.
So wurden die Gene von Histone H1.2 und H1.4 aus der gesamten DNA von C. elegans mit den primern ESMG27/ESMG28 (für H1.2) und ESMG29/ESMG30 (für H1.4) amplifiziert. Die Sequenzen sind unten angegeben:
ESMG27 5´ GGAATTCTGTCCACGCATCGTTCTACA 3´
ESMG28 5´ GGAATTCGGTACCAGTACTCAAGGCATGAG 3´
ESMG29 5´ GGAATTCCACTACTCATCCGTTCAACA 3´
ESMG30 5´ GGAATTCGGTACCATTAATTTGATTATTCACACAATGTG 3´
Für die Amplifikationen:
-von genomischer H1.2 DNA wurde folgendes Programm verwendet:
94°C 1 min 51°C 2 min 72°C 1 min 35 Zyklen
-von genomischer H1.4 DNA das PCR-Programm:
94°C 1 min 51°C 2 min 72°C 1 min 35 Zyklen
Die genomische H1.2 DNA wurde mit Expand Polymerase und Expand Puffer amplifiziert und im Vektor pSK in der EcoR I Schnitstelle einkloniert. Die H1.4 genomische DNA wurde mit Expand Polymerase und Fermentas Puffer amplifiziert und in der Ecl136 II Schnitstelle des Vektors pUC18 einkloniert.
2.2.13.2 Amplifikation von RNA, RT-PCR
Um die gewünschte cDNA aus der Gesamt-RNA zu amplifizieren wurde RT-PCR mittels SUPERSCRIPT II (Gibco) in 5 µl Endvolumen durchgeführt. Es wurden in ein Eppendorfgefäß in dieser Reihenfolge folgende Komponenten pipettiert:
1 µl RNAsin
0,50 pmol spezifischer primer 0,63 mg Gesamt-RNA
ad 3 µl mit DEPC-Wasser
Das Eppendorfgefäß wurde 10 min bei + 70°C inkubiert, schnell auf Eis übertragen und kurz zentrifugiert. Dann wurden die nächsten Komponenten zugegeben:
1 µl first strand-Puffer 0,50 µl 0,1 M DTT
0,25 µl 10 mM dNTP, pH 7,0
und bei + 42°C 2 min inkubiert.
Danach wurde 1 µl (200 Units) SUPERSCRIPT II hinzugegeben, gut gemischt und 50 min bei + 42°C inkubiert. Das Enzym wurde bei + 70°C 15 min inaktiviert.
Um die komplementäre RNA zur cDNA zu zerstören, wurden 1 µl (1 Unit) DNAse-freie RNAse (Promega) und 10 x Transkriptionspuffer (40 mM TRIS-HCl, 6 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM Spermidin und 10 mM DTT) dazugegeben und 15 min bei + 37°C inkubiert. Es folgte eine Extraktion mit 1 Vol. Chloroform/Phenol, eine zweite mit 1 Vol.
Chloroform und die Fällung der RNA mit Ethanol.Die entstandene cDNA wurde als Matrize für PCR benutzt und amplifiziert.Für eine PCR-Reaktion wurde nur 0,2 µl Matrize verwendet. So wurde die fehlende H1.X cDNA aus der gesamten RNA vom C. elegans mit folgenden primern amplifiziert:
ESMG18 5´ CCATCGATGGTGGGAAATCTAAACTACAGGTGTC 3´ und ESMG19 5´ GGATCCAGCATATGACCACTTCGCTCATCCACATGG 3´
und das folgende Programm für PCR verwendet:
94°C 1 min 52°C 2 min 72°C 2 min
45 Zyklen, Expand Polymerase mit Expand Puffer.
Das PCR Produkt war 782 bp lang und wurde in der Ecl136 II Schnittstelle des Vektors pUC18 einkloniert.
2.2.14 Herstellung der doppelsträngigen RNA (dsRNA)
Für die dsRNA-Synthese wurde der 'MEGAscript™ in vitro Transcriptions Kit for Large Scale Synthesis of RNA' (Ambion) verwendet. Die vollständige cDNA von allen H1- Isoformen und die cDNAs von HMG1/2 (KURZ, 1999) und Sir2.1 wurde durch in vivo excision in pBluescript II SK(-) verwandelt. Die durch RT-PCR erhaltene H1.X cDNA wurde aus pUC18 in pBluescript II SK (-) zwischen BamH I und Cla I umkloniert. Für Herstellung der spezifischen H1.1, H1.4, H1.5 dsRNAs wurden Subklone in pBluescript II SK gebaut (die Enzyme sind im Ergebnissteil angegeben). Für die spezifische H1.2 dsRNA wurde eine PCR mit dem primer ESMG71
5´ CGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGCCCTCACTAAAGGGA 3´
zusammen mit dem Standard T7 primer von Stratagene durchgeführt. Als Matrize wurde yk187f1 verwendet. Die cDNA Plasmidklone wurden so verdaut, daß ein linearisierte Konstrukt entstanden war. Der 10 x Transkriptionspuffer, die Nukleotide und Nuklease- freies Wasser wurden aufgetaut und kurz zentrifugiert. Die Komponenten wurden in folgender Reihenfolge in ein Eppendorfgefäß (DEPC behandelt) bei RT gegeben (Endvolumen betrug 20 µl):
2µl Reaktion Puffer
2µl jeweils ATP, CTP, GTP, UTP Lösungen x µl linearisierte Matrize, Menge 1 µg
2 µl Enzym MIX (Mix von T3 und T7 Polymerase) ad 20 µl Nuklease-freies Wasser
Alle Komponenten wurden gut gemischt und zentrifugiert. Die Reaktion wurde im Thermocycler (Biometra) bei + 37°C 6 h inkubiert. Um die DNA zu zerstören, wurde 1 µl RNAse –freie DNAse I (2 U/µl) hinzugegeben, gemischt, kurz zentrifugiert und 15 min bei + 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 115 µl nukleasefreiem Wasser und 15 µl Ammoniumacetat-Stop-Solution gestoppt und die Lösung mit 1 Vol.
wassergesättigtem Phenol (pH 4,0)/Chloroform/Isoamylacohol (25:24:1) extrahiert, gemischt, abzentrifugiert; der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß übertragen und mit 1 Vol. Chloroform/Isoamylacohol nachextrahiert. Die dsRNA wurde mit 1 Vol.
Isopropanol präzipitiert und 15 min bei – 20°C inkubiert. Dann wurde die dsRNA 15 min mit 12000 x g abzentrifugiert, das Pellet kurz in der Vacuumzentrifuge getrocknet und in nukleasefreiem Wasser aufgenommen. Die Konzentration wurde spektrometrisch bestimmt und anhand der Fluoreszenz in einem Agarose-Gel überprüft.
2.2.15 Herstellung der H1 'green fluorescence' Reportergene
Um die gfp-Reportergene herzustellen, wurden die H1.1, H1.4, H1.X DNA mit folgenden primer amplifiziert: die H1.1 DNA aus Cosmid M163 mit primer MJ05/MJ08, die H1.4 DNA aus der Gesamt-DNA von C. elegans mit primer MJ01/ESMG30 und und H1.X DNA aus Cosmid C30G7 mit primer ESMG34/MJ12. Unten sind die Primersequenzen angegeben:
MJ01 5´ CGGGATCCGTCATTTGGTAACAACTATGTTGCG 3´
MJ05 5´ GGGGTACCCCCAGCCACCCACCGC 3´
MJ08 5´ GGAATTCGTCTAGCGCACGCCTCATTTG 3´
MJ12 5´ CGGGATCCCGACAATAGCTCTTTCTGGTTCCGG 3´
ESMG30 5´ GGAATTCGGTACCATTAATTTGATTATTCACACAATGTG 3´
ESMG34 5´ CGGGATCCCGTTCGTCGGTCTCCCAGTC 3´
Es wurden folgende PCR-Programme verwendet:
-für H1.1 DNA Amplifikation 94°C 2 min dann 94°C 10 s 58°C 30 s 60°C 30 s 68°C 5 min 68°C 5 min 5 Zyklen 25 Zyklen
-für H1.4 DNA Amplifikation:
95°C 5 min 51,5°C 2 min 30 s 68°C 8 min 35 Zyklen
-für H1.X DNA Amplifikation:
94°C 1 min dann 94°C 30 s 56°C 2 min 56°C 2 min 72°C 4 min 72°C 4 min 5 Zyklen 30 Zyklen.
H1.1, H1.4 und H1.X DNA wurden mittels Expand™ Long Template PCR System und Puffer Nr 2 amplifiziert. Es wurde 1,75 µl 10 mM dNTP pro 50 µl Reaktion verwendet und die 'hot start' Methode benutzt.
Das H1.1 Produkt (4,727 kb) enthielt sowohl den Promotor H1.1 wie auch der 3´UTR Sequenz des Histon H1 Gens und es wurde in der Schnittstelle Ecl136 II des Vektors pUC18 einkloniert. Dann wurde es mit den Enzymen EcoR I und Stu I ausgeschnitten und in pEGFP-N1 Vektor in EcoR I und Sma I Schnittstellen umkloniert. Die Stu I Schnittstelle des H1.1 Gens wurde mit der Sma I Schnittstelle vom pEGFP-N1 Vektor verbunden.
Durch diese Umklonierung wurde 486 bp vom 4,727 kb H1.1 Produkt abgeschnitten. Das H1.1::gfp Konstrukt enthielt deshalb nicht die 3´UTR Sequenz und das Stopcodon.
Es wurde auch ein zweites Konstrukt H1.1::gfp::CeH1.1 3´UTR konstruiert (von T. Kurz), wo die kodierende GFP-Protein-Sequenz mit den Enzymen Sma I und Not I aus dem pEGFP-N1 Vektor ausgeschnitten wurde und in pSK Vektor in den Sma I und Not I Schnittstellen einkloniert wurde. Dann wurde die GFP-Sequenz mit den Enzymen Sma I und Ecl136 II aus dem pSK Vektor ausgeschnitten und in H1.1 pUC18 Plasmid in der dephosphorylierten Stu I Schnittstelle einkloniert. Die Stu I Schnittstelle des H1.1 pUC18 Plasmides wurde mit den Sma I und Ecl136 II Schnittstellen vom pSK Vektor verbunden.
Das H1.4 Produkt (3,2 kb) wurde in der Schnittstelle Ecl136 II des Vektors pUC18 einkloniert und mit den Enzymen Kpn I und Stu I ausgeschnitten und in pEGFP-N1 zwischen den Schnittstellen Kpn I und Sma I einkloniert. Die Stu I Schnittstelle des H1.4 Gens wurde mit der Sma I Schnittstelle vom pEGFP-N1 Vektor verbunden.
Das H1.4::gfp Konstrukt besaß weder das Stopcodon noch die 3´-nicht kodierende Fragment (3´UTR) von C. elegans.
Das H1.X Produkt (3,8 kb) wurde in der Ecl136 II Schnittstelle des pUC18 Vektors einkloniert und dann mit BamH I ausgeschnitten und in dem dephosphorierten Vektor pEGFP-N1 einkloniert.
Alle Konstrukten wurden sequenziert, um zu prüfen, ob der korekte Leserramen entstanden war.
2.3 Allgemeine proteinchemische Methoden
2.3.1 Herstellung der rekombinanten H1 Proteine
Um die rekombinanten Histone H1 Proteine herzustellen, mußte das Startcodon in eine Nde I Schnittstelle umgewandelt werden. Dies geschah durch PCR-Mutagenese mit den folgenden primern:
für H1.1 mit primer ASMG08
5´ TTGCCCATCCATATGTGTGATTCCGCTGTTGTTG 3´,
für H1.2 mit primer ESMG31 5´ GGATCCAGCATATGTCTGACGTCACCGTTG 3´, für H1.3 mit primer ESMG32 5´ GGATCCAGCATATGTCCGACACCGTCGTTG 3´, für H1.4 und H1.5 mit primer ESMG33
5´ GGATCCAGCATATGTCTGACGTCGCCGTTG 3´, für H1.Q cDNA mit primer ESMG49
5´ GGATCCAGCATATGGCCGCCGTCCAAAAAGC 3´ und jeweils mit einem zweiten primer ExUniForward
5´ TGAATTCGGATCCGACTCACTATAGGG 3´.
Bei Proteinen, gegen die Antikörper hergestellt werden sollten, wurden zusätzlich ein Cystein-Kodon mit primer ESMG62 (für H1.4)
5´ GGATCCAGCATATGTGTTCTGACGTCGCCGTTG 3´ und
ESMG54 (für H1.X Protein mit den letzten 101 Aminosäureresten der C-terminalen Domäne) 5´ GGGAATTCCATATGTCAGAAGTTCGTCAGAAGCTGG 3´
eingefügt. Das PCR-Produkt von jeder H1-Isoform wurde (außer dem Histon H1.X) in der Schnittstelle Ecl136 II des Vektors pUC18 einkloniert und dann wieder in pET3a Vektor in den Schnittstellen Nde I und EcoR I umkloniert.
Die H1.X cDNA (die C-terminale Domäne) wurde in den Schnittstellen Nde I und Hind III des pET3a Vektors kloniert.
Die hergestellten Plasmide wurden in kompetenten Zellen E. coli BL21(DE3) transformiert und auf Ampicillin-Platten ausplattiert. Eine Kolonie wurde benutzt, um die Übernachtkultur (5 ml LB in einem Röhrchen) anzuimpfen. Am nächsten Tag wurden 2 ml von dieser Übernachtkultur in 200 ml LB (in einem 1000 ml-Erlenmeyerkolben) mit 100 µg/ml Ampicillin angeimpft. Das H1.2 Plasmid-Konstrukt, das sehr schlecht in E. coli BL21(DE3) exprimiert wurde, wurde zuerst auf Ampicillin-Platten ausplattiert, über Nacht bei + 37°C inkubiert und dann mit einer Impföse als Tagkultur angeimpft. Die Tagkultur wurde bei + 37°C im Schüttler (220 rpm) inkubiert. Die Kultur wurde ohne Unterbrechung bis OD 600 nm = 0,4 wachsen gelassen (ca. 3 bis 4 h); anschließend wurde 1 mM IPTG zugegeben um die bakterielle Expression zu induzieren. Nach weiteren 2 h bei + 37°C Schütteln wurden die Kolben auf wäßriges Eis (zum Schutz gegen Proteindegradation) gestellt und die Zellen in der vorgekühlten Hettich-Zentrifuge 10 min mit 5000 x g bei + 4°C abzentrifugiert. Die Überstand wurde vorsichtig abgenommen und das Pellet noch einmal 1 min mit 5000 x g bei + 4°C abzentrifugiert, um das restliche LB-Medium abzutrennen. Das Pellet von allen H1-Isoformen (auch H1.X-101) wurde in 5% PCA (Endkonzentration) schnell und gründlich mit einer 1 ml Pipettenspitze auf Eis resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff 3 mal eingefroren und im Wasserbad bei + 37°C wieder aufgetaut. Die resuspendierte Zellen sollten nicht über + 4°C erwärmt werden. Das Suspendat wurde in vorgekühlter Eppendorf-Zentrifuge 1 min 12000 x g abzentrifugiert, der klare Überstand abgenommen und konzentrierte HCl (Endkonzentration 350 mM; 1/37 des Volumens) zugegeben. Dieser Schritt war bei TCA- Fällungen nicht nötig. Das Protein wurde aus dem klaren Überstand entweder mit 3,5 Vol.
Aceton über Nacht bei – 20°C oder mit ¼ Volumen 100% TCA über Nacht bei + 4°C gefällt, dann in der vorgekühlten Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert. Um die Säure zu entfernen, wurde das Pellet 3 mal mit kaltem Aceton (- 20°C) gewaschen und am Ende im Wasser gelöst.
2.3.2 Gewinnung der Antiseren und Antikörper
Als Antigen zur Immunisierung von Kaninchen wurde das gesamte rekombinante H1.4- Protein, der COOH-terminale Bereich des H1.X-Proteins (αH1.X−101) und Peptid Glu- Leu-Arg-Thr-Gly-Thr-Arg-Lys-Ser-Tyr (αH1.X-11) (von P. Claus) verwendet. Das synthetische Peptid wurde mit Hemocyanin gekoppelt. Hemocyanin wurde auch als Antigen für dieses synthetische Peptid verwendet.
Die Proteine wurden für die jeweils erste Injektion der Kaninchen in 1 ml PBS aufgenommen. Auch die zweite Injektion erfolgte mit 0,5-1 mg Protein. Die 3. und 4.
Injektion erfolgte mit ca. 1 mg Protein. Die vier Injektionen wurden im Abstand von einem Monat gegeben. Die Antigen-Injektionen und die Blutentnahmen wurden von der Fa.
Charles River (Kissleg, Deutschland) durchgeführt. Von der zweiten Injektion an wurde Testblut je 10 Tage nach jeder Injektion abgenommen. Die Injektionen erfolgten alle subcutan und die Blutentnahmen aus einer Ohrvene (1-3 ml). Nach dot-blots Untersuchungen dieser Seren wurden die Kaninchen getötet und ausgeblutet. Das Serum der Tieren wurde aliquotiert und bei – 80°C eingefroren.
2.3.3 Reinigung der Immunglobulin G-Fraktionen
Die Immunglobulin G(IgG) Fraktionen wurden mit Hilfe einer Sephadex SG-25 Säule und einem MabTrap GII Kit (Pharmacia) gereinigt. Die Sephadex SG-25 Säule wurde zur Entfernung von störenden Lipiden des Serums benutzt. Eine 5 ml Säule wurde mit PBS äquilibriert und mit Serum - 1:1 verdünnt mit PBS - beladen. Es wurde 2 ml Eluat gesammelt und anschließend mit dem MabTrap GII Kit aufgearbeitet. Das Eluat wurde mit Bindungspuffer 1:1 verdünnt und auf die HiTrap-Affinitäts-Protein G-Säule (gehört zum MabTrap GII Kit, Pharmacia) aufgetragen. Protein G ist ein 30-35 kDa-Protein, das aus der Zellwand von beta-hämolytischen Streptococcen der C- oder G-Stämme gereinigt werden konnte (HARLOW und LANE, 1988). Dieses Protein bindet mit hoher Affinität IgG- Moleküle aus dem Serum. Vor der Beladung wurde die HiTrap-Affinitäts-Protein-G-Säule mit sterilem Wasser gewaschen und mit Bindungspuffer äquilibriert. IgG wurden mit 10 ml Elutionspuffer in 1 ml/ Fraktion eluiert, die Proteinkonzentration bei 280 nm bestimmt und das Eluat mit je 40 µl TRIS/HCl (1 M, pH 9,5) pro 1 ml-Fraktion auf neutralen pH-
