Originalarbeiten
Nutzung der induzierbaren Genexpression des Nematoden Caenorhabditis elegans als Biomonitor
R a l p h Menzel, Kerstin Reichert und Rudolf Achazi
Freie Universit~it Berlin, Institut f/.ir Biologie, Okotoxikologie und Biochemie, Ehrenbergstraf~e 26-28, D-14195 Berlin Korrespondenzautor: Dr. Ralph Menzel; e-mail: ramenzel@zedat.fu-berlin.de
DOI: http://dx.doi.orcJ/10.1065/uwsf2002.03.008
Zusarnmenfassung. Der Bodennematode Caenorhabditis elegans gilt als das einfachste mehrzellige Tier mit dem Status eines Labormodels. Basierend auf seinem entschli.isselten Ge- nom konnte die bemerkenswerte Zahl von 80 Cytochrom P450 Genen (CYP) und eine Vielzahl weiterer Gene, welche ffir En- zyme der Biotransformation kodieren, identifiziert werden. Die differentielle Genexpression von C. elegans nach Schadstoff- zugabe wurde in Fliissigkulturen mit 18 Xenobiotika aus un- terschiedlichen Schadstoffgruppen untersucht. Anschlieflend wurde die mRNA Expression mit DNA Arrays und semi-quan- titativer RT-PCR bestimmt. IB-Naphthoflavone, PCB52 and Lansoprazol erwiesen sich dabei als die wirksamsten Indukto- ren und konnten unter anderen alle CYP 35 Isoformen stark induzieren. Mit diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die schadstoffinduzierte Genexpression in C. elegans ein adSquates System ist, um sowohl Detoxifikationsmechanismen zu untersuchen als auch ein Biomonitorscreening aufzubauen.
Schlagw6rter: Biomonitoring, Nematoden; Biotransforma- tionssysteme; Caenorbabditis elegans; Cytochrom P450; DNA Arrays; Genexpression, induzierbare; Okotoxikologie; RT-PCR (Reverse Transkription - Polymerasekettenreakton)
Abstract. Use of the Induced Gene-Expression in the Soil Ne- matode Caenorhabditis elegans as a Biomonitor
The soil nematode Caenorbabditis elegans is one of the simplest animals having the stares of a laboratory model. Its already completely sequenced genome contains the remarkable number of 80 cytochrome P450 genes (CYP) and many further genes coding for enzymes involved in biotransformation. In order to study xenobiotically induced gene expression in C. elegans, li- quid cultures were exposed to different, well-known xenobiotic inducers. The mRNA expression was detected by two different types of DNA arrays and semi-quantitative RT-PCR. 13-naph- thoflavone, PCB52 and lansoprazol were the most active and, in particular, induced almost all CYP35 isoforms strongly. In conclusion, the xenobiotic dependent gene expression of C.
elegans is a useful tool to reveal defense mechanisms against potential damaging substances as well as for developing a biomonitoring system.
Ke~ords: Biomonitoring, nematodes; biotransformation sys- tems; Caenorhabditis elegans; Cytochrome P450; DNA arrays;
ecotoxicology; gene-expression, induced; RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)
Einleitung
Nematoden stellen in ihren aquatischen und terrestrischen Lebensrfiumen die zahlenmfit~ig arten- und individuenreichste Organismengruppe der Metazoen dar. Sie k6nnen als per- manente Bewohner ihres Lebensraumes bei einem Schadstoff- eintrag nicht flachten und sind somit gut far 6kologische und 6kotoxikologische Untersuchungen geeignet [1-3].
Caenorhabditis elegans lebt als Saprobiont im Bodenporen- wasser und wurde erstmalig von Sydney Brenner in den sechziger Jahren far Laboruntersuchungen eingesetzt [4].
Mittlerweile wird C. elegans schon seit einigen Jahren auch far klassische Biotests, wie Mortalit/its- und Reproduktions- test, mit Erfolg verwendet [3,5-11]. Im Rahmen der bier vorgestellten Arbeit ist untersucht worden, inwiefern die Xenobiotika induzierte Genexpression in C. eIegans als Biomonitor genutzt werden kann. Neben den Vorteilen sei- ner leichte Zachtbarkeit, Handhabbarkeit und kurzen Generationszeiten, l~isst vor allem die Entschlfisselung der gesamten Erbinformation C. elegans als Testorganismus ffir solche Untersuchungen als besonders geeignet erscheinen.
Doch welche Gene werden in C. elegans aberhaupt durch Xenobiotika in ihrer Expression signifikant verfindert und sind somit potentiell far ein Biomonitoring geeignet? Haupt- kandidaten sind Vertreter des Biotransformationssystems.
Eine Vielzahl von vor allem lipophilen, anthropogenen und natfirlichen Chemikalien werden von Lebewesen aufgenom- men und akkumulieren zu toxischen Konzentrationen, so- fern sie nicht zu besser wasserl6slichen Verbindungen metabolisiert und ausgeschieden werden. Dabei stellen Pha- se I u n d II Enzyme des Biotransformationssystems die Schliisselenzyme dieser Detoxifikation dar. Die wichtigsten Vertreter der Phase I sind Cytochrom P450 Enzyme. Sie bil- den eine der gr6t~ten, im Organismenreich bekannten Multi- genfamilien und lassen sich ubiquitfir in Bakterien, Pflan- zen, Pilzen und Tieren nachweisen [12]. Sowohl die Cyto- chrom P450 Proteine als auch Phase II Enzyme sind im all- gemeinen in nur geringer Konzentration in den Zellen vor- handen, k6nnen aber massiv als Antwort auf die Pr~sens yon xenobiotischen Induktoren induziert werden. So weit
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9 ecomed verlagsgeseiischaft AG & Co. KG, D-86899 Landsberg und Ft. Wo~h/TX, USA 9 Tokyo, Japan ~ Mumbai, India ,, Seoul, Korea
Originalarbeiten 6. SETAC-Tagung
bisher bekannt, erfolgt die Induktion fast ausschlief~lich auf Transkriptionsebene If/Jr ldbersichtsarbeiten siehe 13-17[.
Damit sind sowohl P450 Formen als auch die vergleichbar regulierten Phase II Gene gut f/it ein Monitoring der diffe- rentiellen Genexpression geeignet.
Das Genom des Nematoden C. elegans besteht aus rund 19.000 Genen [18], 80 von ihnen konnten durch Sequenz- vergleiche als P450 Gene identifiziert werden [19, verglei- che auch http://drnelson.utmem.edu/elegans.html]. Ein/ihn- lich hohe Zahl an Isoenzymen gibt es auch ftir Proteinfamilien der Phase II, so den Glutathion-S-transferasen und UDP- Glucuronosyltransferasen. Hier konnten dutch Homolo- giestudien 48 bzw. 66 Enzymformen in C. elegans gefunden werden. Basierend auf den genomischen Daten ist jetzt eine systematische Untersuchung der induzierbaren Genexpres- sion beginnend mit einzelnen Genfamilien bis bin zur genom- weiten Analyse m6glich. Im Rahmen dieser Arbeiten wer- den nur Daten fiir die C. elegans P450 Gene und erste gesamtgenomische Untersuchungen vorgestellt. Das Test- system vergleicht jeweils unbehandelte und mit Xenobiotika behandelte C. elegans Fli.issigkulturen, wobei die isolierte mRNA mittels DNA Arrays bzw. semiquantitativer RT-PCR quantifiziert wurde.
1 Material und Methoden 1.1 Kultivierung
Fiir alle Experimente wurde der Wildtyp Caenorhabditis elegans N2 Bristol eingesetzt und in F1/.issigmedium bei 20~
kultiviert [20,21], als Futterquelle dienten gefriergetrockne- te Escherichia coli OP50 Bakterien. F~r die gesamt- genomischen DNA Array Experimente wurde mit synchro- nisierten Nematoden gearbeitet (Behandlung mit Natrium- hypochlorid nach Emmons et al. [22]), fiir alle anderen Ex- perimenten wurden Mischpopulationen verwendet. 24 h nach Beginn der Kultur erfolgte die Zugabe der unterschied- lichen Xenobiotika (gel6st in DMSO; die resultierende DMSO Endkonzentration im Medium betrug 0,5% v/v). Die jeweils genutzte Xenobiotikakonzentration entsprach dabei einer zuvor bestimmten niedrigsten Effektkonzentration, welche im Bereich der EC10 f~r die Reproduktion lag (Er- gebnisse bier nicht gezeigt). Die folgenden Substanzen wur- den in den angegebenen Konzentrationen eingesetzt:
Benzo[a]pyren (0,25 mg/1); Fluoranthen (0,5 mg/1); Isoniazid und Pyrazol (1,0 mg/1); [3-Naphthoflavon, Benzen und Hexadekan (5,0 rag/l); Clofibrat, Lansoprazol, PCB52 und Rifampicin (10,0 mg/l); Primaquin (20,0 mg/1); Atrazin (25,0 mg/1); Phenobarbital (50,0 mg/l); Toluen (0,04% v/v); 2- Propanol (0,10% v/v); Aceton (0,25% v/v) und Ethanol (0,75% v/v). Als Kontrollen dienten jeweils ein Ansatz ohne Zus/itze und ein Ansatz mit 0,5% v/v DMSO im Medium.
Die Induktionszeit betrug in der Regel 72 h. Fi]r die RTo PCR Versuche wurden 13-Naphthoflavon und Lansoprazol zus~itzlich in weiteren Verd/innungen eingesetzt (siehe Abb.
2). Nach der Ernte wurden die Nematoden einer Standard- reinigungsprozedur unterzogen um anhaftende Bakterien, tote Tiere und Zellbruchst6cke zu entfernen [20,21].
1.2 P450 spezifischer DNA Genfilter
Unter Verwendung Cytochrom P450 unterfamilien- spezifischer Primer wurden exonreiche Fragmente in der Gr6f~e von rund 500-1.500 bp aus dem C. elegans Genom amplifiziert und mittels Restriktionsanalyse und partieller Sequenzierung charakterisiert. Jeweils 200 ng der zusam- mengefassten P450 unterfamilienspezifischen DNA wurden auf eine Nylonmembran (Hybond-XL; Amersham Pharma- cia) mit Hilfe einer SlotBlot Apparatur (Hoefer Scientific Instruments) aufgetragen. Als interne Kontrollen dienten in Duplikat aufgetragene Reihen genomischer DNA (50, 100, 200 and 500 ng) und ein Aktinspot (200 ng act-1 cDNA).
Anschlief~end wurde der Genfilter fiir 5 rain mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI behandelt; mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,2), 1,5 M NaCI, 1 mM EDTA neutralisiert; f/Jr 10 min bei 80~ gebacken und f[ir 2 min mit UV-Licht bestrahlt.
1.3 RNA Pr¶tion und Hybridisierung
Die Extraktion der mRNA erfolgte aus den mit Glaskugeln aufgeschlossenen Nematoden unter Nutzung eines QIAGEN mRNA Kits. Zur cDNA Synthese wurde 1 ~tg mRNA mit Oligo (dT), Superscript reverse transcriptase (GIBCO/BRL) und [32p]dCTP fi;lr 90 min bei 37~ inkubiert. Die Sonden wurden anschlief~end fiber Sephadex G-50 S~iulchen gerei- nigt. Die Hybridisierung der Genfilter erfolgte unter Ver- wendung des Rapid-hyb buffer (Amersham Pharmacia) ent- sprechend dem beigelegten Protokoll. Zur Auswertung der Genfilter wurden ein Fuji BAS 2000 Reader und die Soft- ware TINA 2.08e (Raytest) verwendet. Es erfolgte in jedem Fall eine Normalisierung der Werte in Bezug auf die gesamtgenomischen DNA Kontrollen.
1.4 Gesamtgenomischer DNA Microarray
Fi~r diese Experimente wurde mRNA aus jungen, adulten Nematoden isoliert und fiir 48 h mit 5,0 mg/1 f3-Naph- thoflavone, 10,0 mg/1 Clofibrat bzw. 0,5% DMSO (Kon- trolle) versetzt. Sowohl die cDNA Synthese (mit Fluoreszenz- markierung) als auch die Herstellung und Hybridizierung der DNA Microarrays wurde freundlicherweise im Labor von Dr. Stuart Kim (Stanford University, USA) durchgefi~hrt.
Ein methodischer l]berblick wurde in Reinke et al. publi- ziert [23]. Die Auswertung der Ergebnisse folgte den Instruk- tionen unter http://cmgm.stanford.edu/~kimlab/wmdirectory big.html.
1.5 Semiquantitative RT-PCR
Unter Verwendung der unter Kapitel 1.3 gewonnenen cDNA wurde in einem ersten Schritt act-1 spezifische DNA als in- terner Standard in verschiedenen Konzentrationsstufen am- plifiziert (HotStarTaq DNA Polymerase System von QIA- GEN). Zur Quantifizierung der amplifizierten DNA wur- den die PCR Ans~itze mit Gelstar Fluoreszenzfarbstoff (Biozym) mit einer Endkonzentration von 1 : 1.000 versetzt, in einem Agarosegel aufgetrennt und unter Blaulicht mit ei- nero Alphalmager 2200 (Alpha Innotech Corp.) vermessen.
Die Fluoreszenz war linear in einem Bereich von 10-120 ng
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pro Slot. Nach Abgleich der einzelnen Proben wurden fiir die folgenden PCRs CYP35 spezifische Primern eingesetzt, die Auswertung der Ans~tze erfolgte wie beschrieben. Im Ergebnis konnte eine relative Zu- bzw. Abnahme an CYP- spezifischer mRNA in Bezug auf Aktin mRNA errechnet wer- den.
2 Ergebnisse
2.1 DNA-Genfilter Screening nach Schadstoff-induzierbaren Cytochrome P450 Genen
Im Genom des Nematoden C. elegans sind nach Sequenz- analysen 80 verschiedene Cytochrom P450 Gene identifi- ziert worden, welche zusammen 16 Familien (~ 40%
Homologie auf Proteinebene) und 25 Unterfamilien (> 55%
Homologie) repr~isentieren (Nomenklatur nach Dr. D. Nel- son; http://drnelsonutmemedu/eleganshtml). 0ber die Funk- tionen der kodierten Proteine ist bisher nur sehr wenig be- kannt. Um einen m6glichst systematischen I)berblick zu er- halten, wurde mit Hilfe von unterfamilienspezifschen Primern die Amplifizierung von exonreichen DNA Fragmenten er- reicht, welche anschlief~end auf eine Nylonmemebran auf- getragen wurden. Jeder Spot repr~isentiert dabei eine CYP Unterfamilie. Dariiber hinaus dienten genomische DNA in
unterschiedlichen Verdiinnungen und act-1 cDNA als inter- ne Kontrollen und Bezugsgr6f~en. Mit Hilfe dieses Genfilters war ein erstes Untersuchsystem geschaffen, welches eine ver- gleichsweise schnelle Priifung yon Schadstoffen auf ihre gen- induzierende Eigenschaften erm6glicht. Insgesamt 18 ver- schiedene Xenobiotika (Kap. 1.1) wurde im Rahmen dieser Untersuchungen getestet. Die im Testsystem eingesetzten Schadstoffkonzentrationen orientierten sich an der jeweils niedrigsten Effektkonzentration, die in einem vorgeschalte- ten Reproduktionstest ermittelt wurde (Daten nicht gezeigt).
Abb. 1 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen. Bei Ver- wendung der aufgefiihrten Aufwandkonzentrationen konn- ten sowohl durch PAKs (I3-Naphthoflavon, Benzo[a]pyren, Fluoranthen), PCB52, Pharmaka (Lansoprazol, Pheno- barbital, Clofibrat) als auch durch das Pestizid Atrazin eine Induktion von CYP Genen beobachtet werden. Interessan- terweise induzieren dabei sowohl PAKs als auch PCB52 und Lansoprazol eine starke Expression yon CYP35A und CYP35C Genen, Phenobarbital und Atrazin dagegen die Unterfamilie 31A. Durch den Lipidsenker Clofibrat wird dagegen CYP29A und partiell CYP35A induziert. Das L6- sungsmittel DMSO, verwendet in einer Endkonzentration yon 0,5% [v/v] im Medium, war allein nicht in der Lage eine CYP Induktion auszul6sen. Die anderen unter Kap. 1.1
Induktor
Kontrolle + 0,5 % DMSO
I I ; I ! I
I i t i ! 1 Fluoranthen
(0,5 rag/I)
i 1 ~ 1 ~ 1
! t t ~ t t i l i 1 i
Atrazin (25,0 mg/I)
C Y P induziert
act-1
35C act- 1
31A act- 1
Faktor
• STABW
1,0•
2,5 • 0,2 0,9 • 0,3
2,1 • 0,6 1,2 • 0,2
Induktor
6-Naphthoflavon (5 mg/I)
1 11 t l t t I t t l l t l
I q I I I t ~ Lansoprazol
(10,0 rag/I)
~ I , i , ! 1 R I 1 1 1 I I I ~ I ~ I
Phenobarbital (50,0 rag/I)
. I I i
I ~ ~ ~ ~ |
C Y P induziert
35C 35A act- 1
35C 35A act-1
31A act- 1
Faktor
• STABW
6 , 4 2 2 , 0 3 , 3 •
1 , 2 •
4,3 • 1,6 2,2 • 0,4 1,3 • 0,4
2 , 9 • 0,9•
Induktor
Benzo[a]pyren (0,25 rag/I)
" t | , ~ 1
l l l l ' ~ i l l
PCB 52 (10,0 mg/I)
i l l J g l
Clofibrat (10,0 mg/I)
| |
o
| i
CYP Faktor induziert • STABW
35C 2,1 • 0,2 35A 2,3 • 0,1 act-1 1,1 • 0,4
35C 3,2 • 1,5 35A 2,3 • 0,6 act-1 1,0 • 0,2
29A 2,3 • 0,9 35A 1,7 *_ 0,5 act-1 1,0 • 0,2
Abb. 1 : Quantifizierung der CYP Genfilter. Dargestellt ist immer ein typischer, hybridisierter Genfilter und die Auswertung yon drei unabh&ngigen Ver- suchen. CYP steht fer die induzierte Unterfamilie, Faktor f0r die relative Vervietfachung an quantifizierter mRNA bezogen auf die Kontrolle (+ 0,5%
DMSO)
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aufgefiihrten Xenobiotika induzierten keine reproduzierbar signifikante Steigerung an detektierbarer CYP Genexpres- sion.
2.2 G e n o m w e i t e s D N A Microarray Screening nach Schadstoff-induzierbaren Genen
Fiir die Induktoren i3-Naphthoflavon und Clofibrat wurde zus~itzlich zu den Genfilterexperimenten ein DNA Micro- array Screeening mit in die Untersuchungen einbezogen. Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. S. Kim (Stanford University, USA) war es damit m6g- lich, eine genomweite Suche nach Schadstoff-induzierbaren Genen in C. elegans durchzufiihren. Fiir diese Untersuchun- gen wurde mit synchronisierten Kuhuren gearbeitet. Im Ver- gleich zu den mit 32p markierten Genfilterproben erlaubt die Arbeit mit Microarrays auf Grund der Verwendung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (hier Cy3 und CyS) eine gemeinsame Hybridisierung der cDNA Proben auf einem Chip. Wie zu erwarten erwiesen sich Gene, die fiir Enzyme des Biotransformationssystems kodieren, als am st~irksten induzierbar. Dabei waren neben Cytochrom P450 Formen vor allem Phase II Enzyme kodierende Gene deut- lich in ihrer Expression verstfirkt.
Aus Griinden der Obersichtlichkeit werden in Tabelle 1 nur die Gene aufgefiihrt, welche sowohl durch 13-Naphthoflavon als auch dutch Clofibrat nachweislich in mehreren unab- h~ingigen Versuchen induziert wurden. Diese Gene sind in Hinsicht auf eine m6glicherweise allgemeine Schadstoff- antwort von C. elegans interessant. Dariiber hinaus konn- ten jedoch auch eine Reihe yon Gene identifiziert werden, deren Expression ganz spezifisch durch 13-Naphthoflavon oder durch Clofibrat erh6ht wurde. In Ubereinstimmung mit
den Ergebnissen der Genfilterexperimente, die bereits CYP35A als stark ([3-Naphthoflavon) bzw. partiell (Clofibrat) induzierbar anzeigten, konnten bier eine erh6hte Expression der individuellen Gene CYP35A1 und A2 ge- zeigt werden. Interessanterweise waren jedoch die weiteren 35A Vertreter A3-5 als auch 35C1 nur durch 13-Naph- thoflavon stark induzierbar (vergleiche Kap. 2.3). Eine In- duktion dieser Gene durch Clofibrat konnte in keinem Ver- such nachgewiesen werden. Zus~itzlich zu den CYP35 For- men konnte mit CYP34A9, 14A5 und 33A1 drei weitere CYP Gene als potenziell Xenobiotika induzierbar charakte- risiert werden. Weiterhin konnten vier Glutathion S-trans- ferasegene, vier UDP-Glucuronosyltransferasegene, zwei Carboxylesterasegene und ein Metallothioningen als sowohl durch 13-Naphthoflavon als auch durch Clofibrat induzierbar identifiziert werden.
2.3 CYP35 spezifische RT-PCR zum Nachweis gering konzentrierter Xenobiotika
Nachdem fiir mindestens acht der getesteten 18 Xenobiotika bei einer Aufwandmenge im Bereich der
EC10
eine Indukti- on von Genen des Biotransformationssytems nachgewiesen werden konnte, sollte im weiteren untersucht werden, ob auch deutlich geringere Schadstoffkonzentrationen hinrei- chend sind, eine deutlich erh6hte Genexpression zu bewir- ken.Fiir diese Untersuchungen wurde mRNA aus Nematoden- kuhuren isoliert, welche fiir 48 h mit 13-Naphthoflavon bzw.
Lansoprazol versetzt worden waren. Die Aufwandmengen wurden dabei bis auf 1/50 bzw. 1/100 der geringsten, im Reproduktionstest effektiven Konzentration herabgesetzt.
Die anschliefgend durchgefiihrten semiquantitativen RT-PCRs
Tabelle 1: Genomweiter 0berblick der am st&rksten sowohl durch b-Naphthoflavon ats auch durch Clofibrat induzierten Gene des Biotransformationssystems
Gensynomym Protein a Induktion b (I]-Naphthoflavon) Induktion b (Clofibrat)
C03G6.15 C03G6.14 B0213.15 F08F3.7 F28G4.1 R03D7.6 K01D12.11 C02D5.3 M176.2 AC3.7 C08Fll .8 ZC443.6 ZC455.6 F13H6.3
35A2 35A1 Cytochrome P450 34A9 14A5 33A1
Glutathion S-transferasen
UDP-Glucuronosyltransferasen
Carboxylesterasen
9,9 7,5 79,2 47,5 6,5
3,6 3,4 14,8 35,6 - -
8,4 2,2 8,4 10,9 - 3,3
3.5 3,4 2,2 0,9 3,7 3,9
0,6 2,8 2,9 2,8 2,0
2,8 1,3 5,4 3,1 3,5 -
2,8 2,1 1,6 1,2 3,1 4,0
1,4 3,2 2,2 1,4 3,7 1,5
2,2 0,8 3,0 0,9 3,3 2,5
3,1 2,5 4,0 2,9 2,1
2,0
4,1
2,3 1,2 8,5 5,0 1,6 3,2
0,9 4,9 3,8 6,1 0,5 1,5
4,5 7,6
2,3 2,6
5,2 7,6
2,5 2,7 2,8
0,8 5,4
C17H12.4 1.3 3,2 2,6 1,3 2,4 2,2
K11G9.6 Metallothionin 3,1 17,1 3,7 3,7 2,5 5,3
Experiment: 1 2 3 1 2 3
- nicht bestimmt a vorhergesagt nach Homologievergleichen b relativer Induktionsfaktor im Vergleich zum jeweiligen Medium)
Kontrollexperiment (0,5% DMSO im
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[ng/ml]
Aktin
13-Naphthoflavone Lansoprazol
0 a 0 0,1 0,5 1,0 5,0 0 a 0 0,1 0,5 2,0 10,0
35A1 35A2 35A3 35A4 35A5 35C1
Abb. 2: Cytochrom P450 spezifische semiquantitative RT-PCR in Ab- h&ngigkeit der eingesetzten Schadstoffkonzentrationen, Dabei entspricht der jeweils h6chste gewgthlte Wert der niedrigsten Effektkonzentration im Reproduktionstest
(Abb. 2) erlauben einen relativen Vergleich des Gehaltes an CYP spezifischer mRNA in Bezug auf das in seiner konsti- tutiven Expression nicht ver/inderte Aktingen act-1. Wie in Abb. 2 gezeigt, konnten CYP35A1-5 und 35C1 sowohl durch [3-Naphthoflavon als auch Lansoprazol konzentrations- abhfingig in ihrer Expression induziert werden. Dabei be- wirkte im Falle von [3-Naphthoflavon noch ein Fiinfzigstel der bisher eingesetzten geringsten Effektkonzentration eine Geninduktion, bei Lansoprazol noch ein Fiinftel. Als am sensitivsten in Bezug auf eine Induktion erwiesen sich die Gene CYP35A2 und 35A5.
3 Diskussion
Die Geff.hrdung von Einzelorganismen, Populationen und Lebensgemeinschaften durch Chemikalien, die in geringem Ausmafg in der Umwelt bioverfiigbar sind, ist durch Biotests niedriger Rangstufen, wie Mortalit~its- und Reproduktions- tests, in der Regel nur schwer zu erfassen und zu quantifizie- ren. Potenzielle Gefahren miissen daher mit Hitfe von Biotests h6herer Rangstufen erfasst werden, die sch~digende Ereig- nisse auf zellulfirer und subzellul~irer Ebene quantitativ ab- bilden. Zu solchen Tests z/ihlt neben der Erfassung der DNA- Sch/idigung, der Immunantwort, der Expression von Hitze- schock-Proteinen und des Vitellogeninspiegels auch die Er- fassung der durch Umweltchemikalien induzierten Gen- antwort. Er stellt im Vergleich zu den vorgenannten Test- systemen eine Weiterentwicklung dar, da er die Antwort des Organismus schon auf der DNA-Ebene genspezifisch erfasst und im Gegensatz zu anderen Biomarkern Genexpressionen gut quantifizierbar sind.
Die hier vorgestellten Arbeiten zeigen, dass die Xenobiotika induzierbare Genantwort des Nematoden C. efegans ein sen-
sitives Mittel ist, biologische Wirkungen auch gering kon- zentrierter Schadstoffe anzuzeigen. Im besonderen Mafge erwiesen sich Genfamilien des Biotransformationssytems, wie Cytochrome P450, Glutathion S-transferasen und UDP- Glucuronosyltransferasegene, als stark induzierbar. Dabei konnten sowohl Gene identifiziert werden, die durch ver- schiedene Xenobiotika induziert werden als auch welche, die nur durch einen einzelnen Schadstoff in ihrer Expression verst~irkt wurden.
Fiir die Nutzung der Genexpression als Biomonitor existiert ftir C. elegans bisher nur ein etabliertes System. P. Candido und Mitarbeiter entwickelten Genfusionen zwischen Pro- moterelementen des hsp-16 Gens (kodiert fiir ein kleines Hitzeschockprotein in C. elegans) und dem Reportergen lacZ (kodiert fiir ~8-Galaktosidase aus E. coil) und exprimierten die Konstrukte transgen in den Tieren [24,25[. In diesem System werden die transgenen Tiere selbst zum Stressmonitor, eingesetzt sowohl in aquatischen als auch terrestrischen Umgebungen. Dabei wird das Potential des hsp-16 Promotors genutzt, auf eine Vielfalt unterschiedlicher Stressfaktoren (z.B. chemischer Stress, Kfilte- oder Hitzestress, Mikrowel- len) mit einer starken Induktion der Genexpression zu ant- worten. Interessanterweise konnte auch gezeigt werden, dass C. elegans auf die Pr~isenz yon Hormonen (z.B. Estradiol- 1713) als auch endokrinen Disruptoren (wie Bisphenol-A, Vincrozolin) mit einer massiv verst~irkten Expression von Vitellogenin mRNA [26] und einer Reihe von weiteren Ge- nen [27] reagiert. Seit kurzem liegen auch erste Untersuchun- gen zum potenziellen Ostrogenrezeptors von C. elegans vor [28].
Die Anwendung der hier vorgestellten DNA Array Techno- logie fokussiert sich in der C. elegans Forschung bisher meist auf Gebiete der Grundlagenforschung. So konnten zum Bei- spiel mit Erfolg Gene identifiziert werden:
- die im Verlauf der Ontogenese differentieU exprimiert wer- den [29],
- die fiber TGBq3 (transforming growth factorq3) reguliert werden [301,
- die eine Keimbahn-spezifische Expression zeigen [23],
- die nach Zugabe von S/iugetiersexualhormonen verst~rkt gebildet werden [27].
Als Vorteile eines zu etablierenden 'Okotox-Genchip' sind zu erwarten:
- die kurze Testdauer (rund 1 Woche),
- der differenzierbare Nachweis verschiedener Substanz- klassen, wie PAKs oder endokrinen Disruptoren
- die Vergleichbarkeit mit der toxischen Wirkung bei In- sekten und Wirbeltieren auf Grund des Vorhandenseins homologer Gene und Signaltransdukti~
- die Obertragbarkeit der Daten aus dem aquatischen in den terrestrischen Bereich, da C. elegans Bewohner der Boden- wasserphase ist sowie
- sein Potenzial zu einem sp/iteren Zeitpunkt fiir die Ent- wicklung yon Pharmaka und Pflanzenschutzmitteln ver- wendbar zu sein.
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Danksagung. Die Autoren danken Martine Foret und Angelika Seyfarth for ihre exzellente technische Assistenz. Im besonderen Mal}e sind wir Kyle Duke and Dr. Stuart Kim vonder Stanford Universit~it (USA) for die gesamtgenomischen DNA Microarray Hybridisierungs- experimente dankbar. Diese Arbeit wurde zum Tell durch die F6rde- rung der ,Kommission fQr Forschung und Wissenschaftlichen Nach- wuchs" (FNK) an der Freien Universit&t Berlin (FNK 45/010/99) und durch das Umweltbundesamt (UBA, FKZ 201 67 428) unterst0tzt.
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