3. ERGEBNISSE
3.3 Einfluß des Histons H1.1 auf Chromatin silencing und die Entwicklung der
3.5.2 H1.4 dsRNA Injektion arretiert die Entwicklung der männlichen
Die Funktion des H1.4 wurde durch die dsRNA Interferenz analysiert. Dazu wurde die Vollänge der H1.4 dsRNA mit der Konzentration von 5 mg/ml in beiden Gonaden des N2-Stammes injiziert. Die injizierten Tiere wurden auf die 'feeding'-Platten gesetzt, um den prozentualen Anteil der betroffenen F1-Tiere zu steigern.
Es wurden 4,8% tote Embryonen im Brezel-Stadium beobachtet (Tabelle 6). Sie besaßen keinen entwickelten Pharynx und Darm (Abb. 17) (SCHNABEL, pers. Mittlg.). Diese Organe bestehen aus MS- und E-Zell-Linien, bei der die H1.4::GFP-Expression nachgewiesen wurde.
Die überlebenden F1-Tiere haben sich weiter entwickelt: Aus dem L4-Stadium sind normale, adulte, gesunde Hermaphroditen entstanden. Insgesamt wurden 1906 Tiere beobachtet. Bei einem Anteil von 0,2% der Männchen im N2-Stamm wurden 5 Männchen im L4-Stadium beobachtet. 3 von 5 Männchen haben sich nicht weiter entwickelt. Die Entwicklung stoppte im L4-Stadium, der Schwanz ähnelte dem Schwanz der Hermaphroditen. Die Strahlen waren reduziert und der ganze Schwanz wurde feminisiert.
Das Männchen besaß einen typischen Stachel (Abb. 18). Die 9 Strahlen waren kürzer und die Spiculae länger als bei dem N2-Stamm.
Die H1.4 dsRNA hat nur einen Einfluß auf die Morphologie des männlichen Schwanzes gehabt. Die männliche Gonade war normal entwickelt, mit normal aussehenden Spermatocyten und Spermien. Es wurde eine Kreuzung zwischen betroffenen Männchen und normalen Hermaphroditen des N2-Stammes eingesetzt. Die Männchen haben kein Interesse an den Hermaphroditen gezeigt, zudem haben sie sich sehr langsam im Kreis bewegt.
Die Form des Schwanzes, die kleineren Strahlen, die längere Spiculae könnten die Kopulation mit den Hermaphroditen behindert haben; was zur Verhinderung der Befruchtung führte.
Die Qualität der Spermien wurde nicht untersucht.
Um die Kreuzreaktivität zwischen der Vollänge der H1.4 dsRNA und anderen H1-Isoformen und den Einfluß auf die sexuelle Entwicklung von Männchen auszuschließen, wurden spezifische H1.4 dsRNA-Fragmente hergestellt und in den him-8 Stamm mit der Konzentration von jeweils 5 mg/ml injiziert.
Es wurden zwei Subklone aus der Vollänge H1.4 cDNA (gesamt 960 bp) hergestellt. Mit den Enzymen EcoR I und Stu I wurde die H1.4 cDNA (ca. 800 bp) ausgeschnitten und in pSK (+) einkloniert. Der zweite Klon – ca. 200 bp – wurde mit den Enzymen Stu I und Sma I ausgeschnitten und in die Sma I Schnittstelle des pSK (+) Vektors kloniert. Dieses Konstrukt hat das Stopcodon und das 3´ -nicht-kodierende Fragment (3´UTR) enthalten.
Als Kontrolle wurde dsRNA eines relevanten Gens injiziert.
Nach der Injektion erschien der beobachtete Phenotyp der H1.4 dsRNAs viel schwächer als bei dem erstem Versuch, wo die Vollänge der H1.4 dsRNA injiziert wurde. Der H1.4-Phenotyp wurde nur bei Männchen beobachtet und sah bei allen 3 Konstrukten von H1.4
dsRNA gleich aus — nur mit einem geringeren prozentualen Anteil der betroffenen Männchen (Tabelle 9).
Tabelle 9
Der prozentuale Anteil der F1-Männchen mit dem H1.4 Phenotyp nach der Injektion der verschiedenen H1.4 dsRNA Längen in him-8 Tieren. Die Längen der Konstrukten sind in Klammern in bp angegeben.
Der H1.4-Phenotyp erschien bei allen 3 Konstrukten von H1.4 dsRNA gleich— nur mit einem geringeren prozentualen Anteil der betroffenen Männchen.
H1.4 dsRNA (bp)
Durch die dsRNA wurde die Entwicklung der Männchen im L4-Stadium gestoppt. Der Stachel wurde nicht so deutlich und lang wie im vorher durchgeführten Experiment.
Die Männchen mit dem H1.4 Phenotyp wurden mit einer lep-1(bx42) Mutante und einer anderen Art von Nematoden − Oscheius myriophila − verglichen, um den Typ des Schwanzes ('leptoderan' oder 'peloderan') zu bestimmen. Der Schwanz war dem männlichem Schwanz der lep-1(bx42) Mutanten ähnlich. Die Strahlen waren kürzer als beim N2-Stamm. Die Spiculae sahen normal aus. Der 'leptoderan' Schwanz (der Name der lep -Mutanten) war nicht so lang wie bei lep-Mutanten (Abb. 19), konnte jedoch beobachtet werden. Die männlichen Gonaden waren normal mit gesund aussehenden Spermien entwickelt. Es wurde auch die Kreuzung mit jungen N2-Hermaphroditen eingesetzt. Die Männchen haben kein Interesse an den Hermaphroditen gezeigt. Die Qualität der Spermien wurde nicht untersucht.
Alle beobachteten F1 Hermaphroditen waren normal entwickelt, mit normal aussehenden Gonaden und haben sich weiter vermehrt. Daraus kann man folgern, dass der Effekt der H1.4 dsRNA nur bei den F1-Männchen beobachtet wurde − nicht jedoch bei Hermaphroditen oder F2.
Bei fem-Mutanten sind nur die Männchen betroffen, die Hermaphroditen jedoch nicht. Die Männchen entwickeln sich zu fruchtbaren Weibchen. Das FEM-Protein ist bei fem-Mutanten für die normale Entwicklung der Gonaden notwendig.
Bei der Suche nach anderen gemeinsamen Eigenschaften zwischen den fem-Mutanten und dem H1.4 Phenotyp, wurde in der Sequenz der H1.4 3'UTR ein PME-Signal entdeckt.
Das fem-3 Gen besitzt eine sogenannte PME-Kontrollsequenz‚ das Pentanukleotid-UCUUG. Dieses Signal diente als Translationskontrolle und wurde auch in der 3´-untranslatierten Region der H1.4 mRNA gefunden (SCHULZE, pers. Mittlg.) (Alignment 5).
Die reprimierende Translationskontrolle des fem-3 Gens findet in der Oogenese statt.
Dieses Signal könnte einen Einfluß auf die Entwicklung des Sexualdimorphismus in Männchen haben.
Alignment 5
Das 3´UTR Fragment der H1.2 und H1.4 mRNA mit dem PME 'translational control signal' (rot) des fem-3 Gens. Alle PME Sequenzen können als 'nanos response elements' (NRE, grün) interpretiert werden. Das NRE-Element ist vom Drosophila Gen 'hunchback' bekannt (LEHMANN und NUSSLEIN-VOLHARD; 1987; WHITE und LEHMANN, 1986;
DRIEVER und NUSSLEIN-VOLHARD, 1989).
C. elegans PME (fem-3): UCUUG
C. elegans H1.2 3’ UTR UCUUGU ---gugGUUGUU.. 97 bp UAUAAA C. elegans H1.4 3’ UTR UCUUGU ---aGGUGUC.. 64 bp AAUGAA D. melanogaster hb 3’UTR CGUUGU ---ccagaAUUGUA.. 416 bp AAUAAA C. elegans fem-3 3’ UTR UCUUGU gucauucacUUUCGA.. 99 bp AAUAAA
Weiterhin wurde ein 'knock-out' des H1.4 Gens versucht, um den kleinen prozentualen Anteil des H1.4 dsRNA Phenotyps zu vermeiden und die H1.4 Mutanten darzustellen.
Dafür wurden die Deletionsbanken M1-8, M9-16, M17-24 der Firma EleGen GmbH gescreent. Es wurden 7000 'nested' PCRs mit 17 verschiedenen primer eingesetzt. In den Deletionsbanken M1-8 und M17-24 wurden mit den primer MJ09/MJ10 2 'Hits' gefunden, in M1-8 mit den primer MJ12/MJ02 2 'Hits', in M17-24 mit primer MJ16/MJ17 ebenfalls 2 'Hits'. In Well-Lysaten wurde kein Treffer gefunden, deshalb war es nicht möglich, die gewünschten H1.4 Mutanten zu identifizieren und zu isolieren. Bei einem Erfolg des Experimentes wären erstmals Mutanten dargestellt worden, deren Linkerhiston Isoformen einen Einfluß auf die sexuelle Entwicklung gehabt hätten.