Die Kupfferzellen der Leber als Vertreter des Monozyten- Makrophagensystems und ihre Rolle in der Pathogenese von Lebererkrankungen. Berücksichtigung von Versuchsergebnissen der Thioacetamid-induzierten Leberzirrhose bei der Ratte.

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Abschlußarbeit Postgradualstudium Toxikologie, Universität Leipzig

eingereicht von: DC Brigitte Mohr

Medizinische Akademie Dresden Klinik für Innere Medizin

Dresden, d. 30.06.92

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Verwendete Abkürzungen

G-CSF Granulozyten-Kolononie stimulierender Faktor GSSG oxidiertes Glutathion

GSH Glutathion

GSH-POD Glutathionperoxidase HFR Hauptforschungsrichtung

IL-1 Interleukin l

IL-6 Interleukin 6 KAT Katalase

M-CSF Monozyten/Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor

MPO Myeloperoxidase

PAF Plättchen-aktivierender Faktor PGE2 Prostaglandin E2

SOD Superoxiddismutase TAA Thioazetamid

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Gliederung

1. Einleitung 2. Versuchsaufbau

1.l Einordnung der Versuche 2.2 Tiermodell

2.3 Erläuterungen zu den getesteten Präparaten 2.4 Isolierung der Kupfferzellen

3 . In vitro - Untersuchungen an Kupfferzellen 1.l Oxidativer Stoffwechsel

3.1.1 Oxidativer Stoffwechsel von Monozyten/Makrophagen, allgemein

3.1.2 Ergebnisse eigener Untersuchungen zur 02"-Bildung 3.1.2.1 Beschreibung der Methode

3.1.2.2 Versuchsergebnisse und Diskussion 3.1.2.2.1 Männliche Tiere

3.1.2.2.2 Weibliche Tiere 3.2 Lipidperoxidation

3.2.1 Der biochemische Prozeß der Lipidperoxidation, allgemeine Grundlagen

3.2.2 Messung der Lipidperoxidation (Malondialdehyd-Methode) 3.2.2.1 Beschreibung der Methode

3.2.2.2 Versuchsergebnisse und Diskussion 3 . 3 Sekretion lysosomaler Enzyme

3.3.1 Allgemeine Grundlagen

3.3.2 Bestimmung der Aktivität lysosomaler Enzyme 3.3.2.1 Untersuchungsmethode/Untersuchungsmaterial 3.3.2.2 Versuchsergebnisse und Diskussion

4. Zusammenfassung

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Anlagenverzeichnis Tabelle l

Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4 Tabelle 5

Tabelle 6

Tabelle 7

Tabelle 8 Tabelle 9

Hydroxyprolingehalte des Lebergewebes nach verschiedenen Versuchsbedingungen

Extinktionswerte nach unterschiedlichen in vivo- Versuchsbedingungen

Stimulationsfaktoren F für die INT-Reduktion nach 20, 30 und 50 Minuten Inkubation

Lipidperoxidation des Lebergewebes

Stimulationsfaktoren für die INT-Reduktion.

Weibliche Tiere

Intrazelluläre Aktivität der sauren Phosphatase bei isolierten Kupfferzellen nach verschiedenen in vivo Versuchsbedingungen (weibliche Tiere) Intrazelluläre Aktivität der ß-Glucuronidase bei isolierten Kupfferzellen nach verschiedenen in vivo Versuchsbedingungen (weibliche Tiere)

Aktivität an ß-Glucuronidase im Rattenserum (in U/l)

Aktivität an ß-Glucuronidase im Lebergewebe (in U/g Eiweiß)

Abbildung l Gegenüberstellung von spontaner und stimulierter INT-Reduktion Abbildung 2

Eichkurve Lipidperoxidation

Lipid-Peroxidation (Kurzbeschreibung des Versuchsansatzes) Literaturverzeichnis

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l. Einleitung

Die metabolische Umwandlung von lipophilen Endo- und Xenobiotika in leichter eliminierbare Konjugate stellt eine der wesentlichen Funktionen der Leber dar. Endo-und Xenobiotika können in die Leber über eine zweifache Blutversorgung durch die Leberarterien sowie das Portalsystem gelangen. Über beide erreicht der Blutstrom das Netzwerk der Sinusoide, die von Endothelzellen, Kupfferzeilen, Fettspeicherzellen, Pit-cells ausgekleidet werden. Die Parenchymzellen der Leber sind in Platten angeordnet, deren Dicke gerade eine Zelle ausmacht; die Sinusoide liegen zwischen diesen Platten.

Als Kupfferzeilen werden die Gewebemakrophagen der Leber bezeichnet. Makrophagen gehören zum mononukleären Phagozytensystem und nehmen eine zentrale Rolle bei der Induktion und Regulation von Immunantworten ein. In der Vergangenheit wurde die Rolle der Kupfferzeilen bei der Abwehr von infektiösen Agentien oder Tumorzellen zunächst nur im Zusammenhang mit ihren Phagozytose-Fähigkeiten gesehen, erst in den letzten Jahren wurde bekannt, daß der Makrophage auch eine sekretorische und zytotoxische Zelle ist. (Vuittom et al. 1988) Die 4 Hauptfunktionen der Makrophagen bestehen in - Antigenpräsentation -Phagozytose

-unspezifischer Immunresponse (Immunmodulation) - biochemischer Attacke. (Decker 1990)

In diesem Sinne ist auch die Funktion der Kupf/erzellen in der Leber zu verstehen. Wegen ihrer besonderen topografischen Position sind sie eine der ersten Makrophagen des Organismus, die mit Fremdstoffen oder Noxen zusammenkommen.

Es ist anzunehmen, daß die Kupfferzeilen eine wichtige Rolle in der Pathogenese verschiedener Lebererkrankungen spielen, indem sie über Mediatoren sowohl Hepatozyten als auch Fettspeicherzellen beeinflussen (Jones et al. 1988) sowie durch Zytokine oder Stimuli selbst zu Proliferation und gesteigerter

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können.

Makrophagen gehen aus dem im Knochenmark gebildeten Monozyten hervor bzw. können sich durch Mitosen selbst erneuern, wobei unter normalen (nicht pathologischen) Bedingungen der Mitoseindex sehr niedrig ist. (ca. 0,06%, Gendrault et al. 1988) Nach einer Zirkulation von 20-40 Stunden treten Monozyten aus dem Blut ins Gewebe über, wo sie zu Makrophagen reifen können.

Ihre extravaskuläre Lebensdauer kann mehrere Monate oder manchmal sogar Jahre betragen. (Hoffbrand et al. 1989) Nach Stimulation ist eine Erweiterung der Kupfferzellpopulation

möglich, wobei dabei sowohl Mitosen der bereits vorhandenen Kupfferzeilen als auch vermehrte Einwanderungen von Monozyten in das Gewebe eine Rolle spielen.

2. Versuchsaufbau

2.l Einordnung der Versuche

Bis zur Auflösung der Hauptforschungsrichtung Gastroenterologie im Jahre 1990 waren unsere Untersuchungen als von Prof.

Fleischer geleitetes Thema unter der Kurzbezeichnung

"Kupfferzellen" Bestandteil dieser HFR.

Um die Arbeiten zukünftig fortführen zu können, wurde 1991 gemeinsam mit dem Institut für Pathologische Biochemie der Medizinischen Akademie Dresden bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft ein Antrag auf Sachbeihilfe gestellt.

Das Ziel des geplanten Forschungsthemas besteht in einer weiteren Aufklärung von Mechanismen der Aktivierung von Kupfferzellen, da sich aus der gezielten Veränderung des Funktionszustandes der Lebermakrophagen therapeutische Möglichkeiten zur Beeinflussung der Leberzirrhose ergeben können. Bei den Untersuchungen soll die Rolle von Eikosanoiden berücksichtigt werden. Eikosanoide können den Aktivierungsgrad von Makrophagen, deren Zytokinfreisetzung sowie die Zytokinwirkung auf andere Zellen beeinflussen.

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7

Der Antrag befindet sich derzeitig noch in der Begutachtungsrunde.

2.2 Tiermodell

Als Modell für die Untersuchung der Zirrhoseproblematik wurde die Induktion einer Leberentzündung und Bildung einer kleinknotigen Zirrhose bei der Ratte durch Thioazetamid (TAA) gewählt.

Männlichen bzw. weiblichen 200 bis 250 g schweren Wistar-Ratten einer konventionellen Haltung wurde über 12 Wochen im Trinkwasser TAA verabreicht. Die TAA-Dosis betrug 25 mg pro kg Körpergewicht.

Zur medikamentösen Beeinflussung der Fibrogenese-Vorgänge wurden folgende Versuchsreihen realisiert:

1.Negativkontrolle (unbehandelte, gesunde Tiere) 2.Tiere mit TAA-Applikation (12 Wochen)

3.Tiere mit TAA-und Clofazimin-Applikation (0,6 mg Clofazimin pro kg Körpergewicht, 5 mal wöchentlich oral, über 12 Wochen) 4.Tiere mit Zymosan-Applikation (20 mg Zymosan pro kg

Körpergewicht, l mal wöchentlich i.p., über 12 Wochen)

S.Tiere mit TAA-, Clofazimin - und Zymosan - Applikation (Dosen s.o., über 12 Wochen) 6.Tiere mit Clofazimin- und Zymosan - Applikation (Dosen s.o.,

über 12 Wochen) 7.Tiere mit 12 Wochen TAA-Applikation, anschließender Clofazimin

-Zymosan-Behandlung (ohne TAA, Dosen s.o., über 8 Wochen) S.Tiere mit 12 Wochen TAA-Applikation, anschließend bis

Versuchsabbruch 8 Wochen ohne Behandlung gehalten

Im Rahmen dieser Versuche zeigte sich, daß die kombinierte Anwendung von Clofazimin mit Zymosan den pathophysiologischen Prozeß der thioazetamidinduzierten Leberzirrhose günstig b e e i n f l u ß t . D a s k a n n d u r c h d i e U n t e r s c h i e d e i m

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Hydroxyprolingehalt (Tab. 1) , histologische sowie makroskopische Befunde belegt werden.

Nach 12 Wochen TAA wurde der höchste Hydroxyprolingehalt gemessen.

Die Aminosäure Hydroxyprolin ist im Organismus nahezu ausschließlich im Kollagen gebunden. Kollagen ist ein wichtiger Bindegewebebestandteil und zeigt eine charakteristische Aminosäurezusammensetzung, wobei Hydroxyprolin mit 14 g / 100 g Protein (Rapoport 1987) beteiligt ist.

Der nach TAA-Schädigung erhöhte Hydroxyprolingehalt widerspiegelt das Anwachsen des totalen Kollagenvolumens im Lebergewebe. Die Stimulation der Bindegewebesynthese ist eine Folge der Leberzellschädigung.

2.3 Erläuterungen zu den getesteten Präparaten

Clofazimin wird als Präparat der Fa. Ciba-Geigy Limited, Basel, unter dem Handelsnamen Lamprene 50 vertrieben. Clofazimin ist die Kurzbezeichnung für 3-(p-Chloranilino)-10-(p-chlorphenyl)- 2,10-dihydro-2-(isopropylimino)-phenazin. Chlofazimin wurde als Lepratherapeutikum entwickelt und besitzt neben dieser speziellen Wirkung eine immunosuppressive Aktivität sowie antientzündliche Effekte. Bei den beiden letzten Mechanismen soll die Stimulation von neutrophilen Granulozyten, Monozyten, Makrophagen zur Freisetzung bestimmter Modulatoren (z.B. PGE2, antiinflammatorisch, immunosupressiv) eine Rolle spielen.

(Firmenschrift Ciba-Geigy)

Zymosan ist als Makrophagenstimulator aus der Literatur bekannt.

Es handelt sich dabei um ein Hefeextrakt, das über den Mannose- Rezeptor an den Makrophagen gebunden wird. (Jones et al. 1988)

2.4 Isolierung der Kupfferzeilen

Wegen der fehlenden Möglichkeit einer Zentrifugal-Elutriation wurde eine spezielle Methode der Kupfferzellisolierung mit Hilfe

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einer Kollagenase-Hylase-Perfusion der Leber, anschließendem Percoll-Dichtegradienten und Ausnutzung des Adhärenzvermögens der Zellen an Glasoberflächen entwickelt. (Mundra et al. 1985) Die Kupfferzeilen konnten mit einer Reinheit und Vitalität von jeweils über 90% gewonnen werden.

3. In vitro - Untersuchungen an Kupfferzellen 3.l Oxidativer Stoffwechsel

3.1.1 Oxidativer Stoffwechsel von Monozyten/Makrophagen, allgemein

Bei Phagozytose, Kontakt mit Antigen-Antikörper-Komplexen oder bestimmten bakteriellen Bestandteilen durchlaufen Monozyten, Makrophagen und neutrophile Granulozyten eine sprunghafte Zunahme des oxidativen Stoffwechsels der Glukose, was als respiratorischer "burst" bezeichnet wird. (Ostendorf 1991) Dabei wird eine membranständige NADPH-abhängige Oxidase aktiviert, die aktive Sauerstoffmetaboliten bildet. Diese Sauerstoffmetaboliten gehen teilweise durch Folgereaktionen (Reduktionen oder Anregungen) auseinander hervor. Zusammengefaßt finden folgende Übergänge statt:

4.-0:0 't 'O, 0:6': H .. .. ^2 ., ..

i e e e e

02 ---> O/ --- > H₂O2 ---> OH' --- > H₂O

f-Ö-Ö-f "Ö'-O: H: Ö-O -E -CT-H H'-O'.H

Die Einzelreaktionen verlaufen in den meisten Fällen enzymkatalysiert. Wichtig sind folgende Umsätze:

Oxidase

2 O2 + NADPH --- > 2 O2" + NADP+ + H ⁺

Ein Teil der erzeugten Superoxidanionen wird zu H2O2

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d i s p r o p o r t i o n i e r t , e n t w e d e r s p o n t a n o d e r d u r c h Superoxiddismutase katalysiert. Dieser Prozeß dient sowohl der Erzeugung anderer wichtiger mikrobicider Produkte als auch dem Schutz der Phagozyten vor oxidativer Schädigung:

(SOD)

2 H+ + 2 Q{ ---> 02 + H2O2

Ein Übermaß an Wasserstoffperoxid kann durch Katalase kontrolliert werden:

KAT

2 H202 --- > 2 H20 + 02

Wasserstoffperoxid kann auch in die Myeloperoxidase-Reaktion einbezogen sein:

MPO

H

₂

o

₂

+ e r ---> H

₂

o + o c r

o. anderes Halogen

Dieser Reaktion kann die Bildung weiterer aggressiver Spezies folgen:

ocr + o,- +

H⁺

--- > o

₉

+

OH

+ er

./2

! 2

Singulettsauer stoff entsteht auch bei der spontanen Disitiutation von Superoxidanionen (Chung et al. 1988) und ist besonders reaktionsfreudig, weil die Verschiebung eines ungepaarten Elektrons des Sauerstoffs im Grundzustand in ein Orbital höherer Energie unter Spinumkehr erfolgte. (Klebanoff 1988)

Ein Abbau von Wasserstoffperoxid kann auch durch Glutathionperoxidase katalysiert werden:

GSH-POD

H2O2 + 2 GSH --- > 2 H2O + GSSG

ocr +

H

,

O

,

---> 'o, +

H

,

O

+ er

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11

Ein besonders aggressives Sauerstoffderivat stellt neben Singulettsauerstoff das Hydroxylradikal dar, das auch nach der Haber-Weiss-Reaktion gebildet wird:

r t: -r ^2

•C¹£a24- 4, W *"\ -m te + H₂ü₂

O7 + H2O2 --- > O2 + OH" + OH'

Diese reaktiven Sauerstoffmetaboliten werden sowohl

- intrazellulär in den Phagolysosomen freigesetzt als auch - in den extrazellulären Raum abgegeben. (Arthur 1988)

Desweiteren können auch die Peroxidasen (z.B. MPO) nach außerhalb sezerniert werden, bzw. sie werden infolge Zellyse extrazellulär wirksam. (Klebanoff 1988)

Damit wird deutlich, daß einerseits die Bildung dieser Sauerstoffspezies für die Abwehr und Vernichtung von Mikroorganismen und Tumorzellen sehr bedeutsam ist, andererseits aber ein Übermaß bzw. eine extrazelluläre Sekretion zu Zellschäden ( Peroxidation von Membran lipiden, Proteinveränderungen, Depolymerisation von Nukleinsäuren, Depolymerisation von Glykosaminoglykanen, Zerstörung weiterer Bindegewebebestandteile) mit Entzündungsfolge führen können.

3.1.2 Ergebnisse eigener Untersuchungen zur O2"-Bildung 3.1.2.1 Beschreibung der Methode

Der quantitative Superoxidanionennachweis erfolgte indirekt über d i e M e s s u n g d e r T e t r a z o l i u m r e d u k t i o n . (lodonitrotetrazoliumchlorid, INT) Dabei wird INT durch Superoxidanionen zu Formazan reduziert, während das Reduktionsmittel 02~ einer Oxidation zu Sauerstoff unterliegt.

Diese Reduktion ist unter biologischen Bedingungen irreversibel, da sich Formazane nur durch starke Oxidationsmittel reoxidieren lassen.

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Bei unserer Methodik handelt es sich um eine Modifikation nach Müller. (Müller et al. 1987; Mohr et al. 1991)

Bei derartigen Untersuchungen ist es üblich, sowohl die Spontanfreisetzung als auch die nach Stimulatorzugabe (Aktivierung des Phagozyten) zu messen. Das Konzept des aktivierten Makrophagen beruht auf der Beobachtung, daß viele zelluläre Leistungen und Fähigkeiten erst durch Interaktion mit Stimulatoren exprimiert werden. (Ostendorf 1991) Bei unseren Versuchsansätzen wurde die in vitro - Stimulation der Zellen mit opsoniertem Zymosan vorgenommen und dabei verschiedene Inkubationszeiten verglichen (20, 30 bzw. 50 Minuten). Nach Reaktionsstop wurde das umgesetzte INT durch Fest-Flüssig- Extraktion isoliert und bei 620 nm am Spekol 11 (Carl Zeiss Jena) gemessen.

3.1.2.2 Versuchsergebnisse und Diskussion 3.1.2.2.1 Männliche Tiere

Diese Versuchsreihen zeigten, daß die Erzeugung und Messung der Superoxidanionen als biochemischer Marker für den Aktivitätszustand von Lebermakrophagen herangezogen werden kann.

Die Kupfferzeilen wurden nach vorangegangenen Tierversuchen (s.

2.2 Tiermodell) isoliert und bezüglich spontaner und stimulierter Superoxidanionenbildung untersucht, wobei Unterschiede zwischen gesunden und behandelten Tieren festgestellt werden konnten.

Es zeigte sich, daß durch den Einfluß des toxischen Agens TAA die Kupfferzeilen in ihrem Sauerstoffmetabolismus beeinflußt wurden. In Tabelle 2 sind die Extinktionswerte für die INT- Reduktion dargestellt. (Der Einfachheit genügend wird die O2~- Bildung als Extinktion, Einheit mE, angegeben, da sich bei der Eichung zeigte, daß im untersuchten Konzentrationsbereich Linearität zwischen gemessener Extinktion und Superoxidanionenbildung besteht.) (Mohr et al. 1991) Die scheinbar höchsten Werte wurden nach 50 Minuten in vitro-

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Zymosanstimulation bei der Versuchsgruppe "12 Wochen Zymosan + Clofazimin + Leitungswasser" erreicht. Eine statistische Auswertung (t-Test, p=0,05) zeigte aber, daß die Unterschiede zur "gesunden Vergleichsgruppe" nicht signifikant sind. Bei der Gegenüberstellung von spontaner und stimulierter INT-Reduktion (Abb. 1) wird deutlich, daß bei der unbehandelten Tierversuchsreihe (gesunde Vergleichsgruppe) sowie auch bei der Gruppe "12 Wochen Zymosan, Clofazimin, Leitungswasser" sich zu keiner der Inkubationszeiten diese Werte signifikant voneinander unterscheiden. Anders bei den Gruppen mit TAA-Beteiligung:

- 12 Wochen TAA (Inkubationszeit 30 min. zeigt signifikante Verringerung der spontanen gegenüber der stimulierten Reaktion)

- 12 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan (Inkubationszeit 20 min., signifikante Verringerung der spontanen gegenüber der

stimulierten Reaktion)

- 12 Wochen TAA, Clofazimin (Inkubationszeit 30 min., signifikante Verringerung der spontanen gegenüber der stimulierten Reaktion)

Durch Einführung eines Stimulationsfaktors F Extinktion stimuliert

T? — __ — ___««_.»«. — _.«*»«.___._..

Extinktion sontan

zeigte sich bei der Auswertung der in vitro-Ergebnisse, daß die Stimulierbarkeit der Kupfferzellen in der Versuchsgruppe "12 Wochen TAA" am ausgeprägtesten ist. (Tab. 3) Es konnten die höchsten Stimulationsfaktoren berechnet werden und nach 30 sowie 50 Minuten unterscheiden sich diese Faktoren signifikant von denen aller anderen 12 Wochen Versuche. Das deutet darauf hin, daß nach 12 Wochen TAA-Applikation im Rahmen unseres Tiermodells die Lebermakrophagen ihre Superoxidanionenbildung pro Zeiteinheit am stärksten steigern können. Bei den medikamentös beinflußten Tiergruppen sowie den gesunden unbehandelten liegen die Stimulationsfaktoren F30, F50 in gleicher Größenordnung vor, d.h., die entsprechenden Kupfferzellen stimmen annähernd in der Aktivierbarkeit des respiratory burst nach Stimulation überein.

D a r a u s k ö n n t e n s i c h u . U . K o n s e q u e n z e n f ü r e i n e

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Parenchymschädigung durch übersteigerte Sauerstoffmetaboliten- Bildung ergeben für deren in vivo-Bildung in der Leber neben eingewanderten neutrophilen Granulozyten und Monozyten die residenten Kupfferzellen in Frage kommen würden.

3.1.2.2.2 Weibliche Tiere

Nach Vorliegen der ersten Ergebnisse zum Sauerstoffmetabolismus (3.1.2.2.1) sowie zum Hydroxyprolingehalt (2.2 sowie Tab.l) stellten wir unsere nächsten Versuchsprogramme in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Jorke (Universität Jena) auf, mit dem Ziel, die unterschiedliche Parenchymschädigung durch weitere physiologische Parameter zu charakterisieren. Wegen dieser Kooperation führten wir unsere Untersuchungen nunmehr an weiblichen Tieren durch. Neben der besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch Ausschaltung der geschlechtsspezifischen Unterschiede, war ein weiterer Grund die Erfahrung der Jenaer Kollegen, daß bei weiblichen Tieren die TAA-spezifische Zirrhose rascher und nachhaltiger ausgeprägt wird. Dieser Umstand war besonders wichtig für die Testung der therapeutischen Wirkung von Clofazimin und Zymosan nach vorrangegangener Schädigung, (s.a. 2.2. Tiermodell, betrifft Versuchsreihen Nr. 7. und 8.) Es wurden wiederum die Stimulationsfaktoren für die INT- Reduktion berechnet. (Tab. 5) Die sich beim Vergleich der Mittelwerte ergebenden Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsbedingungen erwiesen sich bei Prüfung mit dem statistischen t-Test, p=5%, nicht als signifikant. Dafür muß die teilweise geringe Fallzahl verantwortlich gemacht werden. Einige Tiere gingen durch vorzeitigen Tod der Versuchsauswertung verloren, bzw., es stand nicht genügend Untersuchungsmaterial zur Verfügung, da die Rattenlebern für die zusätzlichen Messungen in Jena portioniert werden mußten.

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15 3 .2 Lipidperoxidation

3.2.1 Der biochemische Prozeß der Lipidperoxidation, allgemeine Grundlagen

Die nicht enzymatisch ablaufende Lipidperoxidation ist eine Kettenreaktion, in deren Verlauf polyungesättigte Fettsäuren oxidativ zu niedermolekularen Spaltprodukten wie Malondialdehyd abgebaut werden. Ausschlaggebend für die Initiierung derartiger Prozesse sind vor allem freie Sauerstoffradikale. (Hölig et al.

1989) Der Begriff "freies Sauerstoffradikal" wird zur Charakterisierung aller Sauerstoffderivate benutzt, deren Elektronenverteilung auf die verschiedenen Energieniveaus gegenüber Sauerstoff im Grunzustand abweicht. (s.a. 3.1.1, Grundzustand: 2 Valenzelektronen sind in verschiedenen Orbitalen lokalisiert und haben parallele Spins, d.h., eine Spinumkehr ist zunächst erforderlich, wenn die Valenzelektronen des Reaktionspartners als Paar mit entgegengesetztem Spin vorliegen und beide leeren Plätze in den Außenorbitalen des Sauerstoff aufgefüllt werden.) "Sauerstoffradikale" besitzen eine hohe Reaktionsfreudigkeit, besonders auch gegenüber Makromolekülen der Zellmembran, wie Phospholipiden mit ihren polyungesättigten Fettsäuren.

3.2.2 Messung der Lipidperoxidation (Malondialdehyd-Methode) 3.2.2.1 Beschreibung der Methode

In Anlehnung an Satoh (Satoh 1978) bestimmten wir den M a l o n d i a l d e h y d g e h a l t im 2 0 - p r o z e n t i g e n Leberhomogenisat.(modifizierte Methode s. Anlage) Dazu wurden die Proben im Potterhomogenisator in physiologischer NaCl-Lösung bearbeitet. Die Extraktion der Lipid-Peroxide (20%

Trichloressigsäure) und Reaktion mit Thiobarbitursäure wird zur gleichen Zeit bei 95 °C ausgeführt. Die Na2SO4-Zugabe zum Nachweisreagenz dient zur Verhinderung der Emulsionsbildung

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während der Extraktion des biologischen Materials mit dem organischen Lösungsmittel (n-Butanol). Die Eichkurve wurde mit l, l,3,3-Tetramethoxypropan aufgestellt. Im untersuchten Konzentrationsbereich besteht Linearität. (Abb. 2)

3.2.2.2 Versuchsergebnisse und Diskussion

Unter pathologischen Versuchsbedingungen (12 Wochen TAA bzw 12 Wochen TAA mit anschließenden 8 Wochen Applikationspause) trat die höchste Lipidperoxidation des Lebergewebes auf. (Tabelle 4, Ergebnisse beziehen sich ausschließlich auf die Untersuchung weiblicher Tiere) Der 12 Wochen-TAA-Versuch fiel bereits bei den ersten INT-Messungen (3.1.2.2.1) durch die höchste in vitro- Stimulierbarkeit der Kupfferzeilen zur Bildung von Superoxidanionen auf. Im Gegensatz dazu wies die Therapiegruppe

"12 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan" keine signifikanten Unterschiede zu den Normaltieren im Lipidperoxidationsgrad des Lebergewebes und in der in vitro O2"-Bildung der Kupff erzeilen auf. (3.1.2.2.1)

3.3. Sekretion lysosomaler Enzyme 3.3.1 Allgemeine Grundlagen

Neben Zytokinen (wie IL-1, IL-6, M-CSF, G-CSF usw) , Sauerstoffmetaboliten, biologisch aktiven Lipiden (wie PGE2, Leukotriene, PAF) sind Enzyme wichtige sekretorische Produkte von Monozyten/Makrophagen. Die lysosomalen Enzyme liegen im Ruhe-Makrophagen gebunden in bestimmten Zellorganellen, den Lysosomen, vor. Nach Bildung von Phagolysosomen (Verschmelzung von phagozytischen Vakuolen mit Lysosomen, die ihren Inhalt in erstere entleeren) liegen die lysosomalen Enzyme in aktivierter Form vor. Dieser Vorgang kann u.a. initiiert werden durch: - gesteigerten Zellkatabolismus -Ischämie

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17

-bakterielle und virale Infekte

-Antigen-Antikörper-Reaktion mit Komplementaktivierung.

Die Funktion der Phagolysosomen besteht in der -intrazellulären Verdauung

-aktiven Sekretion lysosomaler Enzyme in das Zellplasma bzw. aus der Zelle heraus

und kann in der Freisetzung aller lysosomalen Bestandteile und damit im Zelluntergang gipfeln.

Desweiteren ist bekannt (Rapoport 1987), daß die Lysosomenmembran gegen Peroxide und radikalbildende Prozesse sehr empfindlich ist, womit sich Korrelationen zu den Versuchsergebnissen der Superoxidbildung und Lipidperoxidation ergeben könnten. Wir untersuchten die saure Phosphatase und ß- Glucuronidase.Die saure Phosphatase spaltet Proteine und die ß- Glucuronidase ist am Abbau von Glycosaminoglycanen beteiligt.

3.3.2 Bestimmung der Aktivität lysosomaler Enzyme 3.3.2.1 Untersuchungsmethode/Untersuchungsmaterial

Die Enzymaktivitäten wurden nach Keck (Keck 1990) gemessen.

Zur Untersuchung der intrazellulären Aktivität mußten die Kupfferzellen aufgeschlossen werden. In Vorversuchen hatten wir ermittelt, daß die Reproduzierbarkeit der Meßwerte unter folgenden Versuchsbedingungen am günstigsten ist: -saure

Phosphatase: Zellen zum Aufschluß 20 Minuten in 0,05 % Triton X100 inkubieren (Raumtemperatur) -ß-Glucuronidase:

Zellen zum Aufschluß 10 Minuten in 0,05 % Triton X100 inkubieren (Raumtemperatur)

Zusätzlich dazu wurde in Jena (Prof. Jorke) die Aktivität der ß- Glucuronidase im Serum sowie Lebergewebe der Versuchstiere bestimmt. (Methode wie bei Keck 1990)

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3.3.2.2 Versuchsergebnisse und Diskussion

Tabelle 6 (saure Phosphatase) sowie Tabelle 7 (ß-Glucuronidase) zeigen die Aktivität der betreffenden intrazellulären Enzyme der KupfferZellen. Leider stand nicht in ausreichenden Fällen Untersuchungsmaterial für diese spezielle Messung zur Verfügung, so daß die Ergebnisse nur orientierend diskutiert werden können.

Wie zu erwarten (Standardabweichung, Fallzahl), ergaben sich im t-Test (p=5%) keine statistischen Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Die höchsten bzw. niedrigsten zellzahlbezogenen intrazellulären Aktivitäten lagen bei folgenden Versuchsreihen vor:

tendentiell höchste Werte

tendentiell niedrigste Werte saure Phos-

phatase

"Normaltier" "12 Wochen TAA"

"12 Wochen TAA, 8 Wo.

Clofazimin u.Zymosan"

ß-Glucuroni- dase

"12 Wochen TAA, 8 Wo, ohne Behandlung"

"12 Wochen TAA"

d.h., der Versuch "12 Wochen TAA" ist bei beiden Enzymen durch den geringsten intrazellulären Gehalt charakterisiert.

Tabelle 9 zeigt die in Jena bestimmten Aktivitäten des Lebergewebes an ß-Glucuronidase. (Die entsprechenden Proben unserer Versuchstiere wurden nach Jena gesandt.) Nach 12 Wochen TAA wurde die höchste Aktivität im Gewebe gemessen, im Vergleich dazu beim Normaltier die niedrigste. Zwischen der intrazellulären Aktivität der Kupfferzeilen und der Gewebeaktivität ergibt sich für die ß-Glucuronidase folgende Korrelation:

erniedrigte intrazelluläre Aktivität <--> erhöhte Gewebeaktivität, (s. 12 Wochen TAA)

normale intrazelluläre Aktivität <—> normale Gewebeaktivität (s. Normaltier)

Der erniedrigte intrazelluläre Gehalt könnte auf eine stimulierte Enzymsekretion durch die Kupfferzeilen zurückgeführt

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20

reaktiver Sauerstoffspezies und katabolischer Enzyme ein potentiell schädigender Effekt auf Hepatozyten ausgeübt werden kann.

(6) Nach pathologischen Versuchsbedingungen (12 Wochen TAA) war die in vitro-Stimulierbarkeit zur Superoxidanionenbildung signifikant (männliche Tiere) gegenüber den übrigen

Versuchsbedingungen erhöht.

(7) Die intrazelluläre Aktivität der lysosomalen Enzyme war beim TAA-Versuch tendentiell gegenüber dem Normaltier verringert, was möglicherweise durch eine Erhöhung der sekretorischen Aktivität verursacht wird. Bei den

Therapiegruppen traten Aktivitäten auf, die größenordnungsmäßig zwischen der unbehandelten Vergleichsgruppe sowie der geschädigten lagen.

(8) Die Gewebeuntersuchungen korrelieren bezüglich

Lipidperoxidationsgrad (höchster Wert nach TAA) mit der erhöhten Stimulierbarkeit zur Superoxidanionenbildung und bezüglich intrazelluläre Hydrolasen deuten sich die

Zusammenhänge "normale Sekretion -- > normaler (hoher) intrazellulärer Gehalt + normaler Beitrag zur Gesamt- Enzymaktivität im Gewebe" (gesunde Vergleichsgruppe) bzw.

"erhöhte Sekretion -- > erniedrigter intrazellulärer Gehalt + erhöhter Beitrag zur Gesamt-Aktivität im Gewebe" an.

(9) Pathologische Veränderungen in der Leber sind komplexer Natur.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß Zusammenhänge zwischen gesteigerter Kupfferzellaktivität infolge toxikologischer Stimuli (TAA) und pathologischen

Parenchymveränderungen der Leber bestehen. Der Einfluß der Kupfferzeilen ist jedoch nur ein Teilaspekt im

Gesamtnetzwerk. Neben autokrinen Regelkreisen am Hepatozyten werden die pathologischen Veränderungen auch durch die Kommunikation und arbeitsteilige Abhängigkeit von anderen Zellsystemen, wie Endothelzellen, Fettspeicherzellen usw., moduliert.

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werden, die zu einer Reduzierung der lysosomalen Reserven führt und anteilmäßig zur Erhöhung der Gesamt-Gewebeaktivität beiträgt. (Die von den Kupfferzeilen sezernierten Enzyme können einen potentiell schädigenden Effekt auf Hepatozyten ausüben.) Desweiteren wird wegen der Erhöhung des Abbaus von Bindegewebekomponenten bei TAA-Schädigung und Leberfibrose eine Steigerung der ß-Glucuronidase-Aktivität im Gewebe meßbar.

(Abbau von Glycosaminoglykanen), (Lindner 1982) Das steht nicht im Widerspruch zu der Tatsache, daß für fortschreitende Fibröse eine Zunahme des totalen Volumens der Bindegewebematrix charakteristisch ist, da das physiologische Gleichgewicht zwischen Abbau und Synthese auf ein höheres Niveau gehoben wird u n d s i c h l e t z t e n d l i c h z u g u n s t e n d e r S y n t h e s e v o n Biomatrixkomponenten verschiebt.

Die Serum-Aktivitäten sind für die ß-Glucuronidase in Tabelle 8 enthalten. Es waren signifikante Unterschiede zwischen der gesunden Vergleichsgruppe und dem Versuch "12 Wochen TAA"

festzustellen.

4. Zusammenfassung

(1) Durch ihre sekretorischen und zytotoxischen Fähigkeiten sind die Kupfferzellen als Einflußfaktor für die Pathogenese von entzündlichen Lebererkrankungen zu berücksichtigen.

(2) In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Kupfferzellen im Modell der TAA-induzierten Zirrhose untersucht sowie Möglichkeiten einer therapeutischen Beeinflussung getestet.

(3) Im Tierversuch kamen neben der Noxe TAA die Makrophagen- Modulatoren Clofazimin und Zymosan zum Einsatz.

(4) Die Ausbildung der TAA-Leberzirrhose konnte durch

gleichzeitige Gabe von Clofazimin und Zymosan eingeschränkt, aber nicht vollständig verhindert werden.

(5) Der Funktionszustand der Kupfferzellen wurde am Ende des Tierversuches in vitro untersucht. Gemessen wurde die Superoxidanionenbildung (INT-Test) und der Gehalt an lysosomalen Enzymen, weil durch gesteigerte Sekretion

(25)

21

Tabelle l Hydroxyprolingehalte des Lebergewebes nach verschiedenen Versuchsbedingungen (in mg / g Trockenmasse)

Versuchsbedingungen Mediän Stand . afow=

Fall- zahl

12 Wochen TAA 1,6 0,4 18

6 Wochen TAA 1,2 0,2 10

12 Wochen TAA, Clofazimin 1,2 0,2 17

12 Wochen TAA,Clof az . , Zymosan 1,0 0,1 23

12 Wochen Zymosan, Leitungswass. 1,1 0,2 10

Normaltiere 0,9 0,2 16

Signifikanztest (t-Test, Irrtumswahrscheinlichkeit p=5%)

signifikante Differenz signifikante Differenz 12 Wochen TAA verglichen mit

12 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan 12 Wochen TAA verglichen mit

Normaltier

(26)

(27)

Tab.2. Extinktionswerte nach unterschiedlichen in vivo-Versuchsbedingungen Table2. Extinction values after different in vivo conditions

Versuchsbedingungen spontan stimuliert

E 20 E 30 E 50 E 20 E 30 E 50

gesunde Vergleichsgruppe 90 133 219 142 ¹⁸⁰ 265

± ± ± ± ± ±

48 86 98 79 110 120

n = 8 n = 22 n = 8 n = 8 n = 22 n = 8 1 2 Wochen Zymosan + Clofa- 128 176 268 208 213 310

zimin + Leitungswasser ± ^± ± ± ± ±

71 114 192 105 ¹²⁷ 169

n = 5 n = 5 n = 5 n = 5 ^{n = 5} n = 5

2-6 Wochen TAA ₅₈ 63 111 85 ⁹⁷ ₁₆₅

± ± ± ± ± ±

34 30 22 51 31 58

n = 10 _{n = 11} n = 9 n = 10 ^{n = 1 1} _{n = 10}

12 Wochen TAA ⁷² 63 124 110 ¹³⁰ 188

± ± ± ± ± ±

37 32 79 46 58 69

n=10 n = 18 n=11 n = 9 ^{n = 18} n = 10

12 Wochen TAA + Clofazimin 66 ¹¹⁵

± ±

21 ⁵⁰

n = 12 ^{n = 13}

2-6 Wochen TAA + Clofazi- 60 61 126 82 71 163

min + Zymosan ± ± ± ± ± ±

33 39 60 43 51 50

n = 8 n = 8 n = 8 ^{n = 7} n = 8 n = 8

1 2 Wochen TAA + Clofazimin ⁶¹ 72 128 ⁸⁵ 88 160

+ Zymosan ± ± ± ± ± ±

35 38 72 36 38 78

n = 18 n = 23 n = 20 n = 19 n = 24 n = 20

Tab. 3. Stimulationsfaktoren F für die INT-Reduktion nach 20, 30 und 50 Minuten Inkubation (F20, F30, F50) Table J. Stimulation factors F for INT reduction after incubation for 20, 30 and 50 minutes (F 20, F 30, F 50)

Versuchsbedingungen F20 F30 F50

gesunde Vergleichsgruppe 1,6

±0,4 n

= 8

1,4 ±0,4 n = 22

1,2

±0,2

12 Wochen Zymosan, Clofazi- min, Leitungswasser

1,7

±0.2 n

= 5

1,3

±0,2 n

= 5

1,2

±0,3 n

= 5

12 Wochen TAA 2,0

±1.0 n

= 10

2,3 ±1,0 n =»18

1,8 ±0,5 n = 10

1 2 Wochen TAA, Clofazimin 1,4 ±0,3

n = 12

1 2 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan

1,6

±0,7 n= 1 9

1,4 ±0,7 n = 24

1,3 ±0,3 n = 18

(28)

(29)

23

Tabelle 4: Lipidperoxidation des Lebergewebes (Werte als Extinktion in mE)

Versuchsbedingungen Mediän Standard- abweich.

F a l l z a h l

Normaltier ¹⁶⁴ ²⁶ ⁹

12 Wochen TAA 215 61 14

12 Wochen TAA, 8 Wochen ohne Behandlung

221 90 4

12 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan

176 24 8

12 Wochen TAA, 8 Wochen Clofazimin, Zymosan

172 29 12

Die ermittelten Unterschiede verhielten sich im statistischen t- Test (Irrtumswahrscheinlichkeit p= 5%) wie folgt:

Normaltier verglichen mit 12 Wochen TAA

signifikante Unter- schiede

Normaltier vergl. mit 12 Wochen TAA anschl. 8 Wo. ohne Behandlung

keine Signifikanz

12 Wochen TAA vergl. mit 12 Wochen TAA anschl. 8 Wo. ohne Behandlung

keine Signifikanz

Normaltier vergl. mit 12 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan

keine Signifikanz

Normaltier vergl. mit 12 Wochen TAA, 8 Wochen Clofazimin, Zymosan

keine Signifikanz

12 Wochen TAA 8 Wo. Clofa., Zymos.

verglichen mit 12 Wochen TAA 8 Wo.

ohne Behandl.

keine Signifikanz

(30)

(31)

24

Tabelle 5: Stimulationsfaktoren für die INT-Reduktion. Weibliche Tiere

Versuchsbed. F 30 SD 30 N 30 F 50 SD 50 N 50

Normaltier 1,7 0,4 7 1,2 0.3 5

12 Wo. TAA 2,1 1,2 7 3,2 2, 0 3

12 Wo. TAA, 8 Wo.

ohne Behandlung

1,4 0,5 6 1,3 0,2 3

12 Wo. TAA,

Clofaz. Zymosan

2, 0 0, 8 9 2,0 0,8 7

12 Wo. TAA, 8 Wo.

Clofaz. Zymosan

1,3 0,8 8 1/3 0,4 7

F 30 Mediän für den Stimulationsfaktor nach 30 Minuten Inkubation F 50 Mediän für den Stimulationsfaktor nach 50

Minuten Inkubation SD 30 Standardabweichung für den Stimulationsfaktor nach 30

Minuten Inkubation SD 50 Standardabweichung für den Stimulationsfaktor nach 50

Minuten Inkubation

N 30 Untersuchte Fälle 30 Minuten Inkubation N 50 Untersuchte Fälle 50 Minuten Inkubation

(32)

(33)

25

Tabelle 6: Intrazelluläre Aktivität der sauren Phosphatase bei isolierten Kupfferzellen nach verschiedenen in vivo Versuchsbedingungen (weibliche Tiere)

6.l Auswertung der Aktivität als nkat/g Eiweiß (Lowry-Methode) Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

Normaltier 268,2 206 4

12 Wochen TAA 218,1 172,4 2

322,7 272 ,4 3

12 Wochen TAA, 8 Wochen Clofazimin u. Zymosan

63,8 28,2 6

359,2 188,2 6

6.2 Auswertung der Aktivität als pkat/10⁶ Zellen Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

Normaltier 92,4 47,2 4

12 Wochen TAA 25,3 8,6 2

58,0 37,1 3

25,2 18, 1 6

46,7 25,4 6

6.3 Auswertung der Aktivität als pkat/10⁶ vitale Zellen (Auswertung über Acridinorange-Ausschlußtechnik) Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

Normaltier 104,5 52, 1 4

12 Wochen TAA 35,1 19,9 2

66,9 42,0 3

31,0 16,7 6

57,8 32,4 6

(34)

(35)

26

Tabelle 7: Intrazelluläre Aktivität der ß-Glucuronidase bei isolierten Kupfferzellen nach verschiedenen in vivo Versuchsbedingungen (weibliche Tiere)

7.1 Auswertung der Aktivität als pkat/g Eiweiß (Lowry-Methode) Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

12 Wochen TAA 267,3 137,0 2

824,2 484,8 3

111,3 45,9 6

566, 3 289,1 6

7.2 Auswertung der Aktivität als fkat/10⁶ Zellen Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

12 Wochen TAA 33,9 0,4 2

82,4 38,0 3

39,7 22,1 6

72,0 33,3 6

7.3 Auswertung der Aktivität als fkat/10⁶ vitale Zellen (Auswertung über Acridinorange-Ausschlußtechnik) Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

12 Wochen TAA 45,0 11,0 2

94,9 36,7 3

52,2 24,8 6

89,3 43,4 6

(36)

(37)

27

Tabelle 8: Aktivität an ß-Glucuronidase im Rattenserum (in U/l) Versuchsbedingung Mediän Standard-

abweichg.

Fallzahl

12 Wochen TAA 1,7 0,44 8

2,0 0,22 5

2,22 0,62 9

2,03 0,39 6

signifikanter Unterschied zwischen "Normaltier" und "12 Wochen TAA"(t-Test, p=5%)

Tabelle 9: Aktivität an ß-Glucuronidase im Lebergewebe (in U/g Eiweiß)

Versuchsbedingung Mediän Standard- abweichg.

Fallzahl

12 Wochen TAA 6,7 1, 38 14

3,8 1,92 9

4,8 1,18 12

5,7 1,87 11

Signifikanz-Untersuchung (t-Test, p=5%):

1. "Normaltier" signifikant erniedrigt gegenüber - "12 Wochen TAA"

- "12 Wochen TAA, Clofazimin, Zymosan"

- "12 Wochen TAA, 8 Wochen Clofazimin, Zymosan"

2. "TAA-Tier" signifikant erhöht gegenüber - "Normaltier"

- "12 Wochen TAA, 8 Wochen ohne Behandlung"

- "12 Wochen TAA, 8 Wochen Clofazimin u. Zymosan"

(38)

(39)

20 30 50

Inkubationszeit in Minuten

Versuchsgruppe:

x 12 Wochen TAA

12 Wo.TAA,Clo.

+• Zymosan

12 Wo.TAA.C1o.

x stimulierter Wert bei entspr. Zeit signifikant gegenüber spontanem erhöht, die Versuchsgruppen

- gesunde Vergleichsgruppe,

- 12 Wochen Zyrnosan, Clofazimin, Leitungswasser,

zeigen zu keiner der untersuchten Zeiten entsprechende signifikante Unterschiede

Abb. 4 •' öegenÜberfettung von

(40)

(41)

2:

f 500

v ^

l 4

⁵⁰

_c

l 4 0 0 350 300 250 200 150 100- 50

6 ~7 § tj 13 15 17 1'9 21 23 25 27 S 31~

Malondialdehyd (nmol/ml)

(42)

(43)

Literaturverzeichnis

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(45)

Modifizierte Methode zur Bestimmung der Lipidperoxidation von Lebergewebe

Leerwert und Probe werden jeweils in 20 ml-Reagenzgläsern angesetzt

PROBE LEERWERT

Die Kupfferzellen der Leber als Vertreter des Monozyten- Makrophagensystems und ihre Rolle in der Pathogenese von Lebererkrankungen. Berücksichtigung von Versuchsergebnissen der Thioacetamid-induzierten Leberzirrhose bei der Ratte.

H

o

+ e r ---> H

o + o c r

ocr + o,- +

--- > o

+

+ er

ocr +

,

,

---> 'o, +

,

+ er

11

Abb. 4 •' öegenÜberfettung von

2:

f 500

l 4

_c

l 4 0 0 350 300 250 200 150 100- 50

6 ~7 § tj 13 15 17 1'9 21 23 25 27 S 31~

Malondialdehyd (nmol/ml)

Gewebehomogenisät 0,25 ml 0,25 ml 8,1 % Na-Dodecylsulfat 0,40 ml 0,40 ml 20 % Trichloressigsäure 1,00 ml 1,00 ml 0,67 % Thiobarbitursäure mit

2M Na

SO

1,00 ml

Glasperlen zugeben

Mischung im Wasserbad 45 Minuten bei 95 °C kochen

am Reaktionsende sofort unter fließendem Wasser kühlen

10 Minuten bei 1400 g zentrifugieren

Absorption bei 535 nm gegen n-Butanol messen