Etablierung und Einsatz eines Enzymimmunassays für Testosteron-, Östrogen- und Glukokortikoidmetaboliten
im Kot europäischer Wölfe (Canis lupus) mit Lagerungsexperiment
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Claudia Wiese
Stuttgart
Hannover 2014
Zoo Osnabrück
2. Univ.- Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken, Klinik für Kleintiere
1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Böer
2. Gutachterin/Gutachter: JProf. Dr. Marion Piechotta
Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2014
In Zusammenarbeit mit dem Hormonlabor des Deutschen Primatenzentrum, Göttingen
Meinen Eltern
Man merkt nie, was schon getan wurde, man sieht immer nur, was noch zu tun bleibt.
Marie Curie
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... 8
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht ... 13
2.1 Verhalten ... 13
2.1.1 Rudelstruktur ... 13
2.1.2 Sexualverhalten ... 14
2.2 Glukokortikoide ... 16
2.3 Sexualhormone ... 21
2.3.1 Testosteron ... 21
2.3.2 Östrogene ... 24
2.4 Geschlechtsbestimmung anhand von steroidalen Sexualhormonen (SSHs) ... 25
2.5 Sexualhormone und Altersbestimmung ... 25
2.6 Quantitative Erfassung von Steroidhormonen ... 26
2.6.1 Hormonnachweis aus dem Kot ... 26
2.6.2 Hormonausscheidung ... 28
2.6.3 Validierung von Enzymimmunassays ... 28
2.7 ACTH-Test ... 29
2.7.1 Funktion ACTH-Test ... 29
2.7.2 Testdurchführung ... 30
2.8 Probenkonservierung ... 31
2.9 Lagerungsexperiment ... 32
3 Material und Methode ... 33
3.1 Probanden ... 33
3.1.1 Zoo Osnabrück ... 35
3.1.2 Wolfcenter Dörverden ... 35
3.1.3 Sababurg ... 35
3.1.4 Springe ... 36
3.1.5 Wingst ... 36
3.1.6 Einbeck ... 36
3.2 Probensammlung ... 40
3.3 Probenaufbereitung ... 40
3.4 Hormonquantifizierung ... 41
3.4.1 Prinzip Enzymimmunassay ... 41
3.4.2 Präparation der Mikrotiterplatten ... 41
3.4.3 Quantifizierung von Kortikosteron, Testosteron und Östrogen ... 42
3.4.4 Validierung ... 44
3.5 Statistik ... 47
4 Ergebnisse ... 48
4.1 Ergebnisse der Methodenvalidierung ... 48
4.1.1 Validierung der Kontrollparameter der einzelnen Assays ... 48
4.1.2 Validierung der Assays ... 50
4.1.3 Androgene ... 50
4.1.4 Östrogene ... 52
4.1.5 Glukokortikoide ... 56
4.2 Ergebnisse der Hormonauswertung ... 66
4.2.1 Testosteron ... 68
4.2.2 Glukokortikoide ... 73
4.2.3 Lagerungsexperiment ... 77
5 Diskussion ... 81
5.1 Methodenvalidierung ... 81
5.2 Biologische Validierung ... 81
5.2.1 Androgene ... 82
5.2.2 Östrogene ... 83
5.2.3 Glukokortikoide ... 84
5.3 Einflüsse von Fremdmaterial und Wasser auf die Hormonkonzentration ... 88
5.4 Testosteron im Zusammenhang mit Geschlecht und Rang ... 89
5.4.1 Geschlechterunterschiede ... 89
5.4.2 Rangunterschiede ... 90
5.5 Glukokortikoide im Zusammenhang mit Geschlecht, Rang und Gehegegröße .. 92
5.5.1 Geschlechterunterschiede ... 92
5.5.2 Rangunterschiede ... 92
5.5.3 Gehegegröße ... 95
5.6 Lagerungsexperiment ... 96
5.7 Ausblick ... 97
6 Zusammenfassung ... 99
7 Summary ... 101
8 Literaturverzeichnis ... 103
9 Anhang ... 117
9.1 Anhang 1: Liste aller Geräte: ... 117
9.2 Anhang 2: Liste aller verwendeten Chemikalien und Hormonassays ... 118
9.3 Anhang 3: Kreuzreaktivitäten aller verwendeten Assays: ... 123
9.4 Anhang 4: Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen : ... 125
9.4.1 Abbildungen ... 125
9.4.2 Tabellen ... 127
9.5 Anhang 5: Test auf Normalverteilung: ... 129
9.5.1 Kortikosteron: ... 129
9.5.2 Östradiol ... 129
9.5.3 Testosteron: ... 130
9.6 Anhang 6: Validierungsergebnisse Androgene ... 131
9.7 Anhang 7: Einzelprofile KKST der acht deutschen Schäferhunde ... 133
Abkürzungsverzeichnis
3α,11oxo-CM 11oxo-Etiocholanolon 3α,11ß-dihydroxy-CM 11ß-Hydroxyetiocholanolon
α alpha Rang
aAndro 5α-Androstanolon
Abb. Abbildung
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AG Antigen
AK Antikörper
B baseline/Basalwert
Beob. Beobachtung
bzw. beziehungsweise
C Celsius
ca. circa
CM Kortisol Metabolit
CV Koeffizient der Variation
CRH Corticotropin Releasing Hormone
dt. deutscher
EIA Enzymimmunassay
ELISA Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay
Epi Epiandrosteron
et al. Lat.: et alii
GK Glukokortikoid
GnRH Gonadotropin Releasing Hormone
Häuf. Häufigkeit
HCL Chlorwasserstoff
HPA-Achse Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HRP Horseraddish Peroxidase
i. injectionem
IgG Immunglobulin G
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
KKST Kortikosteron
Kum. kumulativ
l Liter
M mittlerer Rang
m männlich
MAX Maximum
MED Median
mg Milligramm
MIN Minimum
min Minuten
MIT Mittelwert
ml Milliliter
N molar
N. Narkose
n Stichprobengröße
NaCl Natriumchlorid
ng Nanogramm
Ω omega Rang
Ö Östrogene
o.g. oben genannt
OD Differenz der Doppelmessungen
p. post
p Irrtumswahrscheinlichkeit
P Progesteron
PGK Peak-GK-Konzentration
PBS Phosphatpuffer
pg Picogramm
POD Streptavidin Peroxidase
QC Qualitätskontrolle
r Korrelationskoeffizient
Stda. Standardabweichung
SRO Geschlechterspezifische Rangordnung
T Testosteron
Tab. Tabelle
TMB Tetramethylbenzidine
U Unit (Einheit)
U/min Umdrehungen pro Minute
vgl. vergleiche
w weiblich
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
µg Mikrogramm
11 1 Einleitung
Der Mythos Wolf ruft in vielen Menschen kontroverse Gefühle hervor, die oft subjektiv und emotional belastet sind (TREVES et al., 2013). Die Emotionen gegenüber dem Wolf reichen dabei von offenkundigem Hass und Ablehnung bis hin zu tiefem Respekt und Ehrerbietung (BRUSKOTTER et al., 2007). Schon seit vielen hundert Jahren verbindet man mit dem Wolf negative Eigenschaften wie Heimtücke und Verschlagenheit, wobei er sogar als Vorbote des Bösen angesehen wird (MECH et al., 2010). Diese Attribute werden ihm im Besonderen durch Märchen und Sagen angedichtet, welche in jeder europäischen Kultur vertreten sind (MECH et al., 2010). An dieser Stelle ist speziell das in ganz Europa bekannte Märchen vom Rotkäppchen hervorzuheben in dem der Wolf die Großmutter auffrisst, sich als diese verkleidet um Rotkäppchen zu täuschen und sie im Anschluss daran fressen möchte (RITZ, 2013). Somit ist es nicht verwunderlich, dass viele Menschen den Wolf für ein blutrünstiges und verschlagenes Wesen halten. Diese Meinung ist so weit verbreitet, dass der Wolf immer wieder als Sündenbock in der Geschichtsschreibung auffällt. So wurde 1948 von einem besonders gefährlichen Exemplar berichtet, welches als „Würger vom Lichtenmoor“ bekannt geworden ist. Allein im Sommer 1948 soll der Wolf -alias der Würger- 58 Rinder und hundert Schafe gerissen haben. Retrospektiv stellte man fest, dass viele Tiere, die angeblich gerissen wurden, glatte Wundränder aufwiesen und teilweise sogar ganz aus der Haut gelöst waren.
Dies und auch die Anzahl der erlegten Tiere spricht gegen das Verschulden durch einen Wolf. Die vielen erlegten Tiere können besser durch die Lebensmittelknappheit und Rationierung durch die Briten nach dem Zweiten Weltkrieg erklärt werden. Viele Menschen hungerten zu der Zeit, wodurch die illegale Wilderei stark zunahm. Doch durch großes Medieninteresse und die generell negative Einstellung der Bevölkerung dem Wolf gegenüber konnte das Gerücht eines riesigen Raubtieres aufrecht gehalten werden (WIBORG, 2007).
Dieses Beispiel veranschaulicht die Angst und das Misstrauen, welche viele Menschen gegen den Wolf empfinden und macht deutlich, wie wenig die Bevölkerung über den Wolf weiß.
Daher ist es essentiell, mehr über diese Tiere zu wissen, insbesondere seitdem sich der Wolf im Jahr 2000 erfolgreich wieder in Deutschland angesiedelt und vermehrt hat (https://www.nabu.de/aktionenundprojekte/wolf/woelfeindeutschland/). Seither weckt das Thema die öffentliche Aufmerksamkeit und es ist von besonderer Wichtigkeit, den
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europäischen Wolf speziell in Deutschland zu erforschen, um konkrete Aussagen über den Verlauf der Wiederansiedlung in Deutschland treffen zu können. Konkrete Daten über Vermehrung, Ausbreitung und Gesundheitszustand sind essentiell, um die Wolfspopulation zu schützen, aber auch um die Öffentlichkeit aufklären zu können, damit die Angst und Vorbehalte ausgeräumt werden können (BARJA et al., 2008b).
Eine Studie von BATH (2001) besagt diesbezüglich, dass in Gegenden Europas, in denen der Wolf stets heimisch war, eine größere Akzeptanz der Tiere besteht als in den Gegenden, in die der Wolf neu eingewandert ist, sodass der Umgang mit dem Wolf als natürlicher Bestandteil des Ökosystems in Deutschland möglicherweise erst wieder erlernt werden muss. Um an die oben aufgeführten Informationen zu gelangen, werden Methoden benötigt, die ein Monitoring der deutschen Wolfspopulation möglich machen, ohne die Wölfe in ihrer natürlichen Lebensweise zu stören, insbesondere da der Wolf durch seine Erfassung im Naturschutzgesetz und die Berner Konvention besonders geschützt ist (MUSIANI et al., 2009). Da der Wolf jedoch ein sehr scheues Tier ist, sich die Reviere einzelner Wölfe auf sehr große Flächen erstrecken können und die Tiere extrem weite Strecken zurücklegen, ist eine Erfassung der oben genannten Parameter durch reine Beobachtung kaum vorstellbar. Daher ist es Ziel dieser Arbeit, mithilfe eines Enzymimmunassays (EIA) Steroide im Kot europäischer Wölfe zu erfassen, um damit - nicht-invasiv - Aussagen über Gesundheitszustand, Geschlecht, Reproduktionsstand und Rudelhierarchie treffen zu können. Auch sind anhand von Glukokortikoid-Messungen Aussagen über Haltungsbedingungen und Gesundheitszustand von in Gehegen gehaltenen Tieren sowie zu ethologischen und ökologischen Fragestellungen denkbar (MONFORT et al., 1998 u MÖSTL et al., 2002 u MCKENZIE et al., 2005).
Folgende Ziele sollen dabei verfolgt werden:
1) Validierung und Etablierung eines Enzymimmunassays zur nicht-invasiven Qualifizierung und Quantifizierung der Metaboliten von Testosteron, Östrogen und Kortisol aus dem Kot europäischer Wölfe
2) Erfassen physiologischer Werte der oben genannten Hormonkonzentrationen 3) Möglichkeit der hormonellen Geschlechtsbestimmung
4) Darstellung möglicher Zusammenhänge zwischen Glukokortikoidexkretion und Stress 5) Durchführung eines Lagerungsexperiments um mögliche Zusammenhänge zwischen Konzentrationen gemessener Metaboliten und Alter der Proben darzustellen
13 2 Literaturübersicht
2.1 Verhalten 2.1.1 Rudelstruktur
Der Wolf gilt als Rudeltier, wobei eine klare Hierarchie innerhalb dieses Rudels besteht (ASA et al., 1990). Je größer die Differenz zwischen den einzelnen Freiheitsräumen der Rudelmitglieder, desto größer ist der Rangunterschied (ZIMEN, 1980). Es gibt eine nach Geschlechtern getrennte Rangordnung (SRO), aber auch unter den Jungtieren ist eine eigene Rangordnung etabliert (SCHENKEL, 1947 u RABB, 1967 u MCLEOD et al., 1995 u ZIMEN, 1980). Die höchstrangigen und dominanten Tiere im Rudel, sogenannte Alphas, zeichnen sich durch Imponierverhalten und Markieren des Reviers aus (MORAN, 1982 u ZIMEN, 1980). Omegatiere, an der Basis der SRO, zeigen deutliche Verhaltensmuster der Unterwerfung gegenüber Höherrangigen. Alphatiere verlieren am wenigsten Kämpfe, Omegatiere die meisten (MECH et al., 2010). Der soziale Rang eines Wolfes ist optisch an der Mimik und der Körperhaltung zu erkennen (ZIMEN, 1980).
Die SRO etabliert sich durch Auseinandersetzungen, wobei es auch zu Kämpfen und Machtdemonstrationen zwischen zwei und mehr Rudelmitgliedern kommen kann (ZIMEN, 1980). Die Aggressivität des Rudels nimmt von Ende Herbst bis zur Paarungszeit (Ranzzeit) Ende Februar zu und verringert sich schlagartig am Ende der Ranz (Anfang Mai) (RABB, 1967 u DERIX et al., 1993 u MCLEOD et al., 1995 u ZIMEN, 1980). Während ZIMEN (1980) in der intraspezifischen Aggression einen Zusammenhang zwischen endogenen Veränderungen und sozialen Ursachen sieht, konstatiert SCHENKEL (1947), dass das soziale Gefüge des Wolfsrudels keineswegs definitiv und klar ist und dass die Dominanz-Status- Beziehung situationsbedingt ist und sich durch äußere Einflüsse wie Gehegegröße oder Rudelzusammenstellung ändern kann.
Die Forschungen bezüglich des Verhaltens von Wölfen basieren zumeist auf Gehege- Beobachtungen. MECH (1999) konstatiert, dass frei lebende Wölfe andere Verhaltensweisen zeigen und die Rudel anders strukturiert sind, wobei ein Rudel in freier Wildbahn aus einem Familienverband besteht, in dem die Elterntiere die Aktivitäten des Rudels navigieren und eine Arbeitsteilung der einzelnen Familienmitglieder besteht. Trotzdem sollen laut FRANK et
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al. (1987) die Verhaltensdaten aus Gehegen hilfreich sein, um Wölfe in freier Wildbahn besser zu verstehen.
2.1.2 Sexualverhalten
Wölfe sind mit ca. zwei Jahren geschlechtsreif, gelegentlich auch früher (SEAL et al., 1979).
Die Geschlechtsreife spiegelt sich hormonell in einem Anstieg der Sexualhormone Östrogen (SEAL et al., 1979) und Testosteron wieder (VON ENGELHARDT et al., 2005).
Der Zyklus der monoöstrischen Wölfin wird eingeteilt in Proöstrus, Östrus, Met- oder Diöstrus und Anöstrus (SEAL et al., 1979).
Der Proöstrus beginnt mit dem ersten Tag der Läufigkeitsblutung (RABB, 1967 u SEAL et al., 1979) und dauert 15,7 +/- 1,6 Tage bis 6 Wochen an (SEAL et al., 1979 u ASA et al., 2006). Im Weiteren steigt Östrogen an, welches eine Ödematisierung und Sekretion der Vaginalschleimhaut sowie eine blutige Abschilferung des Uterusepithels und Vulvaschwellung bewirkt, wobei Östrogenpeaks (Östradiol-17-β) von 30-70 pg/ml im Plasma beschrieben sind (SEAL et al., 1979). Auf diesen Östrogenpeak folgt ein LH-Peak (15-30 ng/ml), welcher die Ovulation auslöst (SEAL et al., 1979). Ab diesem Zeitpunkt befindet sich die Wölfin im Östrus, der 7 Tage (ASA et al., 1986) bzw. 9 +/- 1,2 Tage andauert (SEAL et al., 1979). Zu dieser Zeit ist die Wölfin empfängnisbereit und lässt eine Paarung zu. Nach der Ovulation steigt der Progesteron-Spiegel stetig an und bleibt auf einem hohen Level (über 3 ng/ml im Plasma mit Peakkonzentrationen von 22-40 ng/ml 11-14 Tage nach der Ovulation) für 60-68 Tage (ASA et al., 2006), bzw. 63 +/- 3 Tage (SEAL et al., 1979). Beim Rotwolf sind von WALKER et al. (2002) 64-65 Tage, 65 Tage beim Mähnenwolf laut VELOSSO et al. (1998) bzw. 63 Tage laut WASSER et al. (1995) gemessen worden. Die Zeit nach der Ovulation ohne erfolgreiche Verpaarung ist ebenfalls durch den Anstieg von Progesteron charakterisiert. Diese Gelbkörperphase ist hormonell nicht von einer Trächtigkeit zu unterscheiden und wird daher auch als Pseudogravidität bei nicht-tragenden Tieren bezeichnet (ASA et al., 1998).
Weiterhin folgt im Anöstrus eine Phase hormoneller Ruhe (Östrogenkonzentrationen unter 10 pg/ml im Blut) (PACKARD et al., 1985) bis zum Frühjahr des darauffolgenden Jahres (ASA et al., 1998). Diesen Zyklus durchlaufen alle geschlechtsreifen Weibchen im Rudel, was
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höchstwahrscheinlich die Bereitschaft bei der Welpenaufzucht mitzuhelfen, erhöht, wobei einige von ihnen sogar laktieren ohne tragend gewesen zu sein. Dieses Verhalten stellt laut ASA et al. (1998) einen wichtigen Bestandteil des sozialen Gefüges eines Wolfrudels dar.
DERIX et al. (1993) konstatieren hingegen, dass die Ovulation bei allen Weibchen außer der Alphawölfin unterdrückt wird. Da sich in der Regel nur das Alphapaar verpaart, müsste die Alphawölfin die anderen geschlechtsreifen Wölfinnen sozial derart unter Druck setzen, dass stressbedingt eine Ovulation verhindert wird (DERIX et al., 1993). Dies könnte dadurch gelingen, indem das Alphaweibchen sich sehr aggressiv gegenüber den anderen geschlechtsreifen Weibchen verhält und sie damit unter Stress setzt (RABB, 1967 u DERIX et al., 1993).
Auch der Alpha-Rüde muss verhindern, dass sich niederrangige Rüden mit der Alphawölfin paaren. Um dieses Ziel zu erreichen, verfolgt er das Weibchen während der Paarungszeit auf Schritt und Tritt, markiert mit ihr zusammen das Gehege und wehrt jeden Versuch eines anderen Männchens sich mit dem Weibchen zu verpaaren, aggressiv ab (RABB, 1967 u ASA et al., 1990).
Weibliche Wölfe zeigen dabei generell mehr aggressives Verhalten untereinander, als Männchen (DERIX et al., 1993 u VAN KESTEREN et al., 2012).
Nach dem Eisprung kopuliert das Alphapaar mehrmals zwecks einer festeren Bindung zwischen den beiden und einer größeren Wahrscheinlichkeit eines Reproduktionserfolges (RABB, 1967).
In der freien Wildbahn verbleiben Welpen meist bis zu einem Alter von 10-54 Monaten im Rudel (GESE et al., 1991). Dann jedoch finden sie entweder einen Platz im Rudel, sofern ein weiteres Mitglied des Rudels akzeptiert wird -oder ein anderes Rudelmitglied verdrängt wird-, sie wandern freiwillig ab und suchen sich ein anderes Rudel, oder aber sie werden durch aggressives Verhalten aktiv aus dem Rudel vertrieben, was oftmals bei Weibchen der Fall zu sein scheint (ZIMEN, 1980).
In Gehegen gehaltene Wölfe haben diese Wahlmöglichkeiten jedoch nicht; auch kann ein Rudel nicht nur aus einem Familienverband wie in der Wildbahn, sondern aus verschiedenen Wölfen unterschiedlicher Herkunft bestehen. Dies hat zur Folge, dass sich sehr deutliche Rudelhierarchien aufbauen, die instabil sein können und dann durch Aggressionen gekennzeichnet sind. Oftmals gibt es dann in diesen Rudeln einen sogenannten
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‚Prügelknaben’, der immer wieder von einzelnen Rudelmitgliedern oder von einer Gruppe angegriffen wird (RABB, 1967). Dieser Prügelknabe kann aus dieser Situation nicht entweichen und es kann sogar bis zum Tod dieses Wolfs führen (SCHENKEL, 1947). Dass solche Situationen zu chronischem Stress bei einem Tier führen können, ist leicht nachzuvollziehen (CREEL, 2001).
2.2 Glukokortikoide
Stress äußert sich zum einen in einer vermehrten Aktivität der Hypothalamus-Hypophysen- Nebennierenrinden-Achse (HPA), zum anderen durch die Aktivierung des Sympatho- Adrenomedullären-Systems, welches die Ausschüttung von Epinephrin und Norepinephrin bewirkt (MUNCK et al., 1984 u MÖSTL et al., 2002 u LUNDBERG, 2005 u PALME, 2005 u KEAY et al., 2006 u SHERIFF et al., 2011 u JOHNSTONE et al., 2012). Stress bewirkt im Hypothalamus die Ausschüttung von Corticotropin Releasing Hormon (CRH), wodurch die Hypophyse ihrerseits Adrenocorticotropes Hormon (ACTH) ausschüttet, das schließlich die Nebennierenrinden (NNR) veranlasst, Glukokortikoide (GKs) in die Blutbahn zu entlassen (PALME et al., 2005). Die Glukokortikoide erreichen dann bei einem akuten Stressor nach circa 30 Minuten ihre maximale Blutspiegelkonzentration. Kortisol, welches das vorwiegend ausgeschüttete GK beim Hund ist, beeinflusst den Zellmetabolismus, regt die Fettverbrennung an und unterdrückt das Immunsystem (HOFFMAN et al., 2011). Zudem wirkt es als negatives Feedback auf die Sekretion von ACTH und reguliert seine Ausschüttung somit selbst. Falls dieses System bei chronischem Stress durch ständige Reaktivierung nicht ausgeglichen ist, sind kardiovaskuläre Probleme, Typ-2-Diabetes, reduzierte Immunfunktion, verminderte Reproduktionsleistung, Verhaltensänderungen und kognitive Beschwerden oft die Folge (CARLSTEAD et al., 1993 u LUNDBERG, 2005 u SAPOLSKY, 2005). Auch bei Krankheit steigen GKs an, wie es LAVER et al. (2012) bei Zebramangusten zeigten, welche mit Mykobakterien infiziert waren. Jede Störung der Homöostase des Tieres resultiert in einer vermehrten Ausschüttung von Glukokortikoiden. In niedrigen Dosen katabolisieren GKs die Reaktion des Körpers auf Stress, was eine erhöhte Stressresistenz zur Folge hat (MUNCK et al., 1984).
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Die Menge der ausgeschütteten GKs durch die NNR ist dabei von vielen Faktoren wie der Tierart, der metabolischen Belastung des Organismus, der Tageszeit, dem Wohlbefinden, dem ultradianen Rhythmus, der Ernährung sowie Umwelteinflüssen abhängig (VON DER OHE et al., 2003 u PALME, 2005 u MARKOVIĆ et al., 2011). Hierdurch ergibt sich eine erhebliche Schwankungsbreite, weshalb auch große interindividuelle Unterschiede möglich sind (HOWELL-STEPHENS et al., 2012).
Die Glukokortikoide gelangen im weiteren Verlauf in die Leber und werden dort metabolisiert, konjugiert und mit der Galle in den Darm oder über den Urin ausgeschieden (MÖSTL et al., 2002). Die Ausscheidung mit der Galle ist abhängig von mehreren Faktoren (Futterqualität und -quantität, Anästhesie, Existenz einer Gallenblase) und kann nicht als konstant eingestuft werden. Auch Rezirkulation und Metabolisierung der Hormone spielen hierbei eine Rolle, wobei die genauen Mechanismen nicht bekannt sind (LEPSCHY et al., 2010). Hormonmetaboliten, die in den Darm gelangt sind, werden entweder mit dem Kot ausgeschieden, oder werden wieder dekonjugiert und durchlaufen den enterohepatischen Kreislauf (vgl. Abb. 1). Die Erstgenannten kann man im Folgendem mittels Enzymimmunassays (EIAs) im Kot nachweisen (MÖSTL et al., 2002).
Abbildung 1: Schema der Sekretion, des Metabolismus und der Exkretion von Glukokortikoiden (MÖSTL et al., 2002)
Die Unterscheidung zwischen akutem (kurzfristige Aktivierung der HPA) und chronischem Stress (lange andauernde, rezidivierende Aktivierung der HPA) ist von besonderer Wichtigkeit, wenn GKs im Kot nachgewiesen werden sollen (JOHNSTONE et al., 2012). Die
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akute Stressantwort ist eine natürliche Reaktion des Körpers auf eine momentane, ungewohnte Situation/Stressor, die dem Tier eine schnelle Verfügbarkeit von Energie innerhalb von Sekunden gewährleisten soll, wonach die Hormonkonzentrationen schnell wieder auf ein normales Maß absinken. Ist das Tier jedoch einem Stressor oft oder über einen längeren Zeitraum ausgesetzt, so sinkt die Hormonkonzentration nur sehr langsam bis gar nicht wieder auf ihre physiologischen Ruhewerte ab (JOHNSTONE et al., 2012). Da die Blutabnahme bei einem Wildtier immer mit Stress verbunden ist, ist es schwer anhand von Blutwerten den physiologischen Basalwert für Kortisol zu bestimmen (BROWN et al., 1993 u MÖSTL et al., 2002). Zudem unterliegt der Blut-Kortisol-Spiegel circadianen Rhythmen, sodass ein einzelner Blutwert nur einen kurzen, momentanen Wert darstellen kann. Daher bietet der Enzymimmunassay (EIA) eine gute Alternative, über Kotproben, die nicht-invasiv gesammelt werden können, die Ausscheidung von Glukokortikoidmetaboliten über einen längeren Zeitraum zu überwachen, um chronischen Stress diagnostisch darstellen zu können (KEAY et al., 2006 u HULSMAN, 2009). Die Kontrolle der Glukokortikoidkonzentration mittels EIA spielt auch eine immer größere Rolle bei der Überwachung des Wohlbefindens und Stress von Gehegetieren (MÖSTL et al., 2002 u MCKENZIE et al., 2005 u LEPSCHY et al., 2010).
SANDS et al. (2004) zeigten, dass alle untersuchten Individuen eines Rudels nordamerikanischer Wölfe während der Paarungszeit erhöhte GK-Werte aufwiesen. Auch bei anderen Tierarten stiegen die GK-Konzentrationen zur Paarungszeit an und fielen erst wieder nach der Laktation bzw. zum Winterschlaf hin ab [Degus: KENAGY et al. (1999) Baummarder: BARJA et al. (2011) Streifenhörnchen: KENAGY et al. (2000)].
Aber auch individuelle Exkretionsmuster bei Rudelmitgliedern sind denkbar, da einige Tiere mehr aggressives Verhalten zeigen als andere. Jedoch haben SANDS et al. (2004) keinen Zusammenhang zwischen GK-Konzentrationen im Kot und aggressiven bzw. agonistischen Verhaltensweisen feststellen können, ebenso wenig zwischen Rang und Aggressivität; jedoch hatten dominante Tiere (männliche, als auch weibliche) höhere GK-Level als Subdominante (Subdominante: 876 +/- 286,7 ng/g Kot; Dominante: 1413 +/- 222,1 ng/g Kot) (SANDS et al., 2004). VAN KESTEREN et al. (2012) fanden bei ranghohen männlichen äthiopischen Wölfen deutlich höhere GK-Werte sowie auch höhere Testosteronwerte im Kot als bei
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Niederrangigen, was die Autoren auf vermehrt aggressive Verhaltensweisen dominanter Tiere zurückführten.
Auch BARJA et al. (2008a) und SCHOECH et al. (1997) fanden heraus, dass iberische Alphawölfe höhere GK-Konzentrationen im Kot aufwiesen als die Subdominanten. Sie untersuchten, ob eine erhöhte Belastung des Körpers durch hohe Kortisolkonzentrationen der Grund für die physiologische Kastration der niederrangigen Tiere sein könnte, da sich diese subdominanten Tiere nur in Ausnahmefällen verpaaren. Es wird auch in anderen Arbeiten ein Zusammenhang zwischen sozialem sowie ernährungsbedingtem Stress und Reproduktionsunterdrückung vermutet (PACKARD et al., 1985).
Diese Theorie lässt sich laut SANDS et al. (2004), BARJA et al. (2008a) und VAN KESTEREN (2011) jedoch nicht belegen und eine hormonelle Unterdrückung der Fortpflanzung bei niederrangigen Tieren wird demnach wahrscheinlich nicht über Glukokortikoide gesteuert. Selbiges konstatieren auch MCLEOD et al. (1995) bei Timberwölfen, die in Gefangenschaft gehalten wurden.
SANDS et al. (2004) fanden mittels Radioimmunassays heraus, dass zwischen Reproduktionsunterdrückung und GK-Werten kein Zusammenhang bestand und in ihrer Studie verpaarten sich auch subdominante Wölfinnen und bekamen Junge.
Bei einigen Arten der „cooperative breeder“ (in Gruppen lebende Tiere, welche die Welpen nur eines dominanten Paares gemeinsam aufziehen) wiesen die dominanten Tieren höhere GK-Werte auf, sodass erhöhte GK-Werte in Zusammenhang mit einem hohen Rang gesehen werden könnten. Diese Ergebnisse beruhen auf Studien der GK-Werte im Kot afrikanischer Wildhunde, Zwergmangusten und Grauwölfen (CREEL et al., 1991 u 1995 u 2013 u CREEL, 2001 u 2005).
Die GK-Werte subdominanter und dominanter äthiopischer Wölfinnen (Canis simensis) zeigten keinen signifikanten Unterschied der verschiedenen Ränge während der Paarungszeit, wohingegen die dominanten Männchen deutlich höhere Werte aufwiesen als subdominante Männchen (VAN KESTEREN, 2011). Da äthiopische Wölfe auch „cooperative breeder“ sind, stimmen die Ergebnisse bei den Männchen, nicht jedoch bei den Weibchen mit Creels Theorie überein (CREEL et al., 1991 u 1995 u 2013 u CREEL, 2001 u 2005).
Die bisher beschriebenen Ergebnisse entstammen zumeist Untersuchungen an freilebenden nordamerikanischen, äthiopischen und iberischen Wölfen. In einer Studie von MCLEOD et
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al. (1995) wurden GK-Metaboliten im Urin von in Gehegen gehaltenen Timberwölfen gemessen. Der Beta-Rüde hatte die höchsten GK-Werte der Männchen, bei den Weibchen das Omegatier. Zudem bestand unter den Weibchen eine stärkere Aggressionsneigung als bei den Männchen; die Fähen attackierten niederrangige Weibchen heftiger, frequenter und auch öfter zusammengeschlossen in Gruppen. MCLEOD et al. (1995) schließen daraus, dass nicht der Rang an sich mit hohen GK-Werten korreliert, sondern der Grad der Labilität einer Rangposition, d.h. das erhöhte Risiko, den Rang zu verlieren. Die hohen GK-Werte in seiner Studie korrelierten hierbei auch mit der Anzahl aggressiver Verhaltensweisen. Auch CREEL (2001) konstatiert, dass in Gefangenschaft keine Fluchtmöglichkeit für niederrangige Rudelmitglieder besteht und diese somit, im Gegensatz zu frei lebenden Tieren eine deutlichere Stressantwort zeigen.
Bei afrikanischen Wildhunden hingegen wurde gar kein Zusammenhang zwischen Rang und GK-Konzentration festgestellt (DE VILLIERS et al., 1997). Lediglich eine negative Korrelation von Alter und Kortisol-Konzentrationen im Blut wies signifikante Ergebnisse auf.
Laut DE VILLIERS et al. (1997) sind Kortisolwerte oft Folge des individuellen Empfindens der Situation, sodass ältere Tiere eventuell routinierter sind und dadurch weniger Stress bei Auseinandersetzungen empfinden.
Beim Nerz waren hohe GK-Werte im Kot positiv mit Stereotypien korreliert, was der Autor auch durch ein höheres Stressempfinden der verhaltensauffälligen Tiere erklärte (MALMKVIST et al., 2011).
BARJA et al. (2011) fanden höhere GK-Konzentrationen bei männlichen Baummardern im Vergleich zu den Weibchen, sodass auch ein geschlechtsspezifischer Unterschied in der GK- Ausscheidung denkbar ist.
In einer anderen Studie untersuchten GOYMANN et al. (2003) die GK-Werte männlicher Tüpfelhyänen und fanden heraus, dass es keine Korrelation zwischen Rang und GK-Werten gab, was durch die wenigen Rangauseinandersetzungen der Männchen zu erklären sei, da ihre Rangfolge meist allein durch ihr Alter bestimmt wird. Männchen aus größeren Rudeln hatten signifikant höhere GK-Werte als Männchen aus kleineren Rudeln, was die Autoren auf die relativ größere Wahrscheinlichkeit von sozialen Interaktionen zurückführten (GOYMANN et al., 2003).
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GK-Werte müssen jedoch nicht zwangsläufig mit dem sozialen Gefüge des Rudels korrelieren. So hatten weibliche Tüpfelhyänen höhere GK-Werte, wenn ihre Umwelt für sie eine größere Herausforderung darstellte. Hyänen in stabilen territorialen Gebieten mit genügend Beutetieren zeigten niedrigere GK-Werte als Hyänen aus kleinen Territorien, die sich oftmals mit anderen Territorien kreuzten und nicht genügend Beutetiere aufwiesen (GOYMANN et al., 2001).
Einen ähnlichen Zusammenhang zwischen Umwelteinflüssen und GK-Werten fanden auch VAN METER et al. (2009), wobei GK-Werte im Kot von Tüpfelhyänen in einem Territorium mit Ackerbau und zu Zeiten von vermehrter Aggressivität im Rudel höher waren, jedoch nicht bei touristischer Aktivität. Sowohl biotische, als auch abiotische Umwelteinflüsse wie die Nähe zu Löwen, aber auch das Futterangebot und die Niederschlagsmenge beeinflussten die GK-Werte nicht signifikant.
Bei Jungtieren zeigte sich eine höhere Stressantwort weiblicher dominanter Hyänenenwelpen im Gegensatz zu männlichen dominanten Welpen, wobei die Subdominanten höhere GK- Werte aufwiesen als die Dominanten, was auf Nahrungskarenz und eine höhere Frustrationsrate der jungen Hyänen zurückzuführen sei (BENHAIEM, 2012).
2.3 Sexualhormone 2.3.1 Testosteron
Das männliche Sexualhormon Testosteron (T), welches das Hauptandrogen darstellt, wird beim Rüden vor Allem in den Leydig’schen Zwischenzellen produziert und sorgt für die Ausbildung des männlichen Phänotyps, Aufbau von Muskelmasse und Spermienproduktion (VON ENGELHARDT et al., 2005). Auch soll Testosteron einen Einfluss auf das Sozialverhalten von Tieren haben, hierbei insbesondere aggressives Verhalten bei Rangauseinandersetzungen fördern (VOM SAAL et al., 1975). Seine Ausschüttung erfolgt pulsatil; somit ist es nicht möglich, mit nur einer einzigen Blutentnahme und Analyse pro Tag die hormonelle Situation eines Organismus objektiv darzustellen (HODGES et al., 2010). Die Untersuchung der Metaboliten von Testosteron im Kot bietet hingegen die Möglichkeit, einen aussagekräftigeren Tages-Mittelwert zu ermitteln, da Androgene ähnlich wie GKs und auch
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Östrogene in der Leber metabolisiert und danach über Kot und Urin ausgeschieden werden.
PACKARD et al. (1985) beschrieben eine Basalkonzentration von Testosteron bei männlichen Wölfen von 106-408 ng/ml im Plasma.
Die Konzentration von Testosteron und seiner Metaboliten im Kot spiegelt die Konzentration der Hormone im Organismus über einen Zeitintervall von mehreren Stunden wieder (HODGES et al., 2010). Die Ausscheidung von Testosteron erfolgte beim Mähnenwolf laut VELOSSO et al. (1998) zu 97 % mit dem Kot und die Passagezeit der Testosteronmetaboliten dauerte zwischen 5 und 16 Stunden, wobei 70,6 % der Metaboliten unkonjugiert vorlagen.
Beim Rotwolf soll die Kotanalyse einen Aufschluss über die Hormonkonzentrationen der letzten 12-24 Stunden geben laut WALKER et al. (2002), bei der Hyäne sogar über ein bis drei Tage (DLONIAK, 2004).
Es ist bereits bekannt, dass sozialer Status und Rang Einflüsse auf die Gesundheit und den Reproduktionserfolg in einem sozialen Gefüge wie dem Wolfsrudel haben können und dass Veränderungen des Ranges durch Veränderungen der endokrinen Funktionen hervorgerufen werden können (SAPOLSKY, 2005).
Ein zugewandertes Tüpfelhyänenmännchen hatte beispielsweise höhere Testosteronwerte als im Rudel geborene Männchen, sodass sich höhere Reproduktionschancen vermuten ließen (DLONIAK, 2004).
Mit der Muttermilch dominanter Hyänenweibchen wurden vermehrt Androgene ausgeschieden. Die Welpen dieser Muttertiere neigten vermehrt zu aggressivem Verhalten, was ihnen mehr Futter und eine bessere Chance auf Reproduktionserfolg versprach (DLONIAK et al., 2006).
Testosteronkonzentrationen variieren im Laufe des Jahres und können daher neben Verhaltensparametern Aufschluss über die Paarungsbereitschaft geben. So hatten afrikanische Wildhunde im Sommer eine höhere Testosteronkonzentration als im Winter was mit dem Östrus der Weibchen korrelierte (NEWELL-FUGATE et al., 2012). Auch WALKER et al.
(2002) konstatieren, dass Rotwölfe eine deutliche Saisonalität der Hormonausschüttung zeigten. So stieg die Konzentration von Testosteron im Kot von September bis Februar stetig an (136,3-838,2 ng/g), wohingegen die mittleren Konzentrationen von Mai bis Oktober niedrig waren (103,1 +/- 6,3 ng/g). Der Höhepunkt der Testosteronkonzentration war hierbei positiv korreliert mit der Zunahme der Tageslichtlänge, der Spermaproduktion und dem
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Beginn des Östrus der Weibchen. Auch männliche afrikanische Wildhunde hatten eine höhere Ausschüttung von Testosteron in der Paarungszeit von Juli bis September (MONFORT et al., 1997).
Im Gegensatz zu oben Genanntem zeigte sich beim männlichen Mähnenwolf laut VELLOSO et al. (1998) keine Saisonalität der Hormonausschüttung, jedoch wurde in einer neueren Studie von MAIA et al. (2008) sowohl bei wildlebenden Männchen als auch bei in Gefangenschaft gehaltenen Mähnenwölfen eine Saisonalität der Sexualhormonausschüttung (Testosteron und Progesteron) festgestellt. Auch beim äthiopischen Wolf konnte keine Saisonalität der Testosteronkonzentration nachgewiesen werden, jedoch zeigten dominante Männchen signifikant höhere Testosteronkonzentrationen als subdominante (VAN KESTEREN et al., 2012).
Bei der Untersuchung von Sexualhormonen im Kot iberischer Wölfe fiel auf, dass Männchen in der Ranz höhere Testosteronkonzentrationen aufwiesen (T: 1724,1 ng/g Kot in der reproduktiven Phase zu 809,2 ng/g Kot in der nicht-reproduktiven Phase) und während dieser Zeit die Konzentration von Östrogenen und Progesteron sank (BARJA et al., 2008b). Laut MONFORT et al. (1997) existiert beim afrikanischen Wildhund ein signifikanter Unterschied in der Testosteronkonzentration im Kot zwischen Männchen unterschiedlichen Ranges, sodass dominante Männchen eine durchschnittliche Testosteronkonzentration von 234,4 +/- 14,3 ng/g Kot und subdominante von 195,4 +/- 9,6 ng/g Kot aufwiesen.
In Gefangenschaft gehaltene nordamerikanische Wölfe zeigten eine positive Korrelation zwischen Markierverhalten mittels Urinieren und Serum-Testosteronkonzentrationen bei dominanten Tieren beiderlei Geschlechts. Im Gegensatz zu Testosteron korrelierten Östrogene nicht mit dem Markierverhalten, sodass ein sexuell stimuliertes Markieren unwahrscheinlich ist. Vielmehr scheint vermehrtes Markieren mit dem Sozialgefüge zusammenzuhängen. Männliche dominante Wölfe markierten allgemein wesentlich öfter als Weibchen (ASA et al., 1990).
24 2.3.2 Östrogene
Die Zielorgane der Östrogene sind Vulva, Vagina, Uterus und Eileiter. Hier bewirken sie eine Ödematisierung, Proliferation der Genitalmukosa und eine gesteigerte Durchblutung. Die Maximalwerte der Östrogene (17β-Östradiol) werden bei der Hündin am Ende der Follikelphase gemessen (GÜNZEL-APEL et al., 1994).
Die Passagezeit der Östrogene und ihrer Metaboliten vom Blut in den Darm betrug beim afrikanischen Wildhund 18-48 Stunden. Höchstwerte wurden nach 18 Stunden festgestellt, wobei 58,9 % aller Östrogene mit dem Kot ausgeschieden wurden. Diese waren beim Wildhund nach MONFORT et al. (1997) und beim Rotwolf laut WALKER et al. (2002) zu 60% unkonjugiertes Östradiol und Östron. Die Ausscheidung von Östrogenmetaboliten mit dem Kot korrelierte dabei zeitlich mit Verhaltensdaten von MONFORT et al. (1997), wonach während der Ranz im Juli bis September der Östrogen-Spiegel anstieg und somit Hinweise auf die Zyklusaktivität der saisonal monoöstrischen Wildhunde gab.
Bei Mähnenwölfen ging ein präovulatorischer Östrogenpeak ( 231,8 +/- 68,2 ng/g) der Ovulation voraus (WASSER et al., 1995).
Nur die dominanten Fähen iberischer Wölfe kamen zur Paarungszeit in den Östrus und wiesen höhere Östradiolwerte auf als Subdominante. Die Alphaweibchen verpaarten sich mit dem Alphamännchen, wobei es große interindividuelle Unterschiede hinsichtlich der Menge des ausgeschiedenen Östradiols gab (2,6- bis 9-facher Anstieg) (VAN KESTEREN, 2011).
Weibliche iberische Wölfe produzierten deutlich mehr Sexualhormone in der Ranzzeit als zu anderen Zeiten (T: 238,0; P: 354,6; Ö: 180,0 in der Ranz; T: 190,2; P: 274,9; Ö: 116,2 ng/g außerhalb der Ranz) (BARJA et al., 2008a). So zeigten auch weibliche Mähnenwölfe in der Ranz eine höhere Konzentration von Testosteron und Progesteron als ausserhalb der Ranz (MAIA et al., 2008).
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2.4 Geschlechtsbestimmung anhand von steroidalen Sexualhormonen (SSHs)
Da sich das Geschlecht eines Wolfes nicht sicher aus der Distanz optisch feststellen lässt, und insbesondere die Körpergröße kein zuverlässiges Merkmal darstellt, kann die Geschlechtsbestimmung anhand von Steroidhormonen im Kot eine sichere, nicht-invasive Methode bedeuten (SHAW et al., 2003).
Laut BARJA et al. (2008b) ist es anhand der oben genannten Sexualhormone möglich, Kotproben von Weibchen von denen eines Männchens zu unterscheiden. Rüden wiesen dabei im Allgemeinen höhere Konzentrationen an Sexualhormonen auf (Androgene: 1136,4 +/- 209,7, Östrogene: 538,1 +/- 133,5, Progesteron: 1469,3 +/- 199,2 ng/g) als Weibchen (T:
226,6 +/- 44,4, Ö: 164,8 +/- 65,9, P: 335,7 +/- 35,5 ng/g). VELOSSO et al. (1998) nennen T, T/E und P/T als gute Geschlechtsindikatoren im Kot von Mähnenwölfen, wobei das P/T- Verhältnis nur im Östrus eine sichere Differenzierung gewährleistete. Auch eine PCR- Analyse von DNA-Bestandteilen ist mithilfe von Kotproben möglich, jedoch ist dieses Verfahren sehr kostenintensiv, zudem wird die DNA im Kot schnell abgebaut, sodass sich nur wenige Proben dann noch für eine PCR-Analyse eignen (CREEL et al., 2003 u MURPHY et al., 2007 u SASTRE et al., 2008).
2.5 Sexualhormone und Altersbestimmung
SEAL et al. (1979) beschrieben in ihrer Studie über den Zyklus der Wölfin, dass zwei von drei weiblichen Jungtieren (ein Jahr alt) keine Anzeichen von Läufigkeit zeigten, was durch Progesteronwerte unter 2 pg/ml, fehlende Östrogenpeaks (immer 5-15 pg/ml) und fehlende Vaginalblutungen gekennzeichnet war. Im Gegensatz dazu zeigte ein weibliches Jungtier alle diese Kennzeichen, was darauf zurückzuführen sei, dass die Alphawölfin dieses Rudels starb und erstgenanntes Weibchen als ranghöchstes der Jungtiere, den Platz der Alphawölfin einnahm. Auf Grund dessen muss es einen hormonellen Mechanismus geben, welcher den Östrus früher einleiten konnte. Im Gegensatz zum domestizierten Haushund wird der erste Östrus bei Wölfen normalerweise erst nach 22 Monaten beobachtet, obwohl 10 Monate alte Jungtiere schon 80-100 % ihres Endgewichts erreicht haben (SEAL et al., 1979).
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Im späten Anöstrus liegen die Östrogenwerte bei geschlechtsreifen Weibchen bei 5-20 pg/ml, im Östrus bei 30-70 pg/ml (SEAL et al., 1979). Im Vergleich zu den Werten bei Jungtieren lassen sich Altersunterschiede vermutlich nur im Östrus feststellen.
VAN METER et al. (2008) beschreiben bei Tüpfelhyänen, dass Östrogene im Kot ab einem Alter von 23 Monaten einen Grenzwert von 100 ng/g Fäzes überstiegen und dass anhand dieser Werte eine Altersdifferenzierung möglich war. Im Blut waren die Östrogenwerte bei Jungtieren und laktierenden Weibchen signifikant niedriger als bei trächtigen Tieren. Auch waren die Östrogenkonzentrationen individueller Weibchen höher nach dem Beginn ihrer Reproduktionsfähigkeit.
Beagle-Rüden wiesen im Alter von sieben Monaten und somit in der Pubertät zwar erhöhte LH-Konzentrationen im Blut auf, die Testosteronkonzentrationen waren jedoch deutlich niedriger als bei älteren Tieren (GÜNZEL-APEL et al., 1994).
Laut einer unveröffentlichten Studie von SEAL et al. können die Östrogen- und die Testosteronkonzentrationen bei jungen Wölfen jedoch bis zu einem Alter von 5 Jahren noch ansteigen (MECH et al., 2010).
2.6 Quantitative Erfassung von Steroidhormonen
Die bisher zitierten Quellen lassen den Schluss zu, dass qualitative Untersuchungen zu fäkalen GKs und Sexualhormonen mittels Enzymimmunassay (EIA) bei europäischen Wölfen noch nicht durchgeführt wurden. In dieser Arbeit erstmalig durchgeführte Analysen sollen folglich erste grundlegende Daten liefern.
2.6.1 Hormonnachweis aus dem Kot
Hormone sind in vielen biologischen Medien wie Speichel, Urin, Blut und Kot vorhanden und können somit auch dort gemessen werden (FUJITA et al., 2001 u HODGES et al., 2010 u ERBER, 2012 u KUMAR et al., 2013). Hormone aus dem Kot geben einen Aufschluss über die Hormonkonzentration eines längeren Zeitraums, da die Hormone immer mit einer gewissen Verzögerung ausgeschieden werden. Beim EIA-Verfahren findet durch die Bindung
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von Antikörpern an Hormonmetabolite eine fotometrisch nachweisbare Farbreaktion statt.
Dabei unterscheiden sich die Hormonmetaboliten der Androgene und des Kortisols anhand ihrer funktionellen Gruppen an den Bindungsstellen der C-11 Position des Steroids (MÖSTL et al., 2002).
Dass nur wenig Korrelation zwischen gemessenen Hormonkonzentrationen im Kot und im Blut besteht, liegt daran, dass im Blut sowohl die an Globuline gebundene, als auch die nicht- gebundene Hormonfraktion gemessen wird und im Kot lediglich die freie, biologisch aktive Fraktion (NINNES et al., 2010). Hierdurch entsteht auch eine gewisse Ungenauigkeit in der Messung von Glukokortikoiden, die an Globuline gebunden sind, da der Anteil an Globulinen sich innerhalb kürzester Zeit ändern kann und damit die Anzahl biologisch aktiver, freier Moleküle sinkt, dies jedoch in der Messung oft nicht berücksichtigt wird (LEVINE et al., 2007). Im Widerspruch dazu fanden ISHIKAWA et al. (2002) beim Hokkaido-Braunbär und SCHIDELER et al. (1993) beim Javaneraffen eine deutliche Korrelation der Blutwerte von Testosteron und Progesteron mit den gemessenen Werten im Kot. Allerdings ist diese Korrelation bei den Östrogenen der Braunbären nicht gegeben, was laut der Autoren an der Zeitverzögerung der Ausscheidung der Östrogene liegt (ISHIKAWA et al., 2002).
Um Hormone aus Medien wie Speichel, Urin und Kot zu quantifizieren, werden Radioimmunassays und Enzymimmunassays (EIAs) verwendet (VASCONCELLOS et al., 2011). Diese Techniken sind bereits weit verbreitet und werden als gute Methoden angesehen, um Steroidhormone aus dem Kot zu detektieren (SCHWARZENBERGER, 2007). Da der EIA den Vorteil hat ohne radioaktives Material zu arbeiten, stellt er die günstigere und weniger aufwendige Methode dar (HODGES et al., 2010). Gruppenspezifische Antikörper kreuzreagieren und binden bei gruppenspezifischen EIAs an einige Hormonmetaboliten mit ähnlichen Bindungsstellen und sind daher gut geeignet, wenn die Haupt-Metaboliten des ausgeschiedenen Hormons nicht bekannt sind.
Das Resultat ist eine Farbreaktion, aus der die entsprechende Hormonkonzentration errechnet werden kann. Die Gruppenspezifität trägt dazu bei, die Fehlerrate durch die verschiedenen Hormonmetabolisierungen zu verringern und die Assays können dadurch für ein weiteres Spektrum verschiedener Tierarten angewandt werden (HODGES et al., 2010).
Eine frequente und gleichmäßige Probenentnahme ist essentiell, um kurzfristige Anstiege der Hormonmetaboliten wie GKs beobachten zu können, wie es bei akuten Stresssituationen der
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Fall ist (PALME, 2005). Die Gewinnung einzelner Proben über einen langen Zeitraum bei einer großen Anzahl an Tieren kann jedoch hilfreich sein, um störende Einflüsse durch den Menschen im Rahmen von GK-Messungen bei Wildtierpopulationen zu evaluieren (LEPSCHY et al., 2010) und somit längerfristige Einflüsse wie chronischen Stress auf die Hormonkonzentrationen erkennen zu können (MÖSTL et al., 2002).
2.6.2 Hormonausscheidung
Nicht alle Hormonmetaboliten werden im gleichen Maße im Kot wie im Urin ausgeschieden.
SCHATZ et al. (2001) konstatieren für den Haushund, dass dieser Katecholamine und Glukokortikoide nur zu einem Prozentsatz von 23 +/- 4 % mit dem Kot ausscheidet.
Die tierspezifische Ingestapassagezeit, von Duodenum bis Rektum, lässt Rückschlüsse auf die Korrelation von Hormonkonzentrationen mit physiologischen Ereignissen zu. Sie beträgt je nach Spezies 6-24 Stunden und kann auch innerhalb eines Individuums variieren, wobei Ernährung, Stress und Gesundheitszustand Einfluss hierauf ausüben (PALME, 2005 u KEAY et al., 2006 u HULSMAN, 2009 u HODGES et al., 2010). Beim Hund wurden Zeitverzögerungen von 24 +/- 4 Stunden (SCHATZ et al., 2001) bzw. 12–48 Stunden (SCHWARZENBERGER et al., 1996) gemessen. Bei Hunden und Katzen gibt es weder Geschlechtsunterschiede in der Menge der ausgeschiedenen Hormone noch in der Route der Ausscheidung. Die ausgeschiedenen Hormone sind hauptsächlich konjugiert oder polar und unkonjugiert, wobei der Hauptmetabolit der GK-Ausscheidung Kortisol ist (SCHATZ et al., 2001).
2.6.3 Validierung von Enzymimmunassays
Beim EIA besteht stets die Möglichkeit einer Kreuzreaktion mit strukturell eng verwandten Metaboliten (SCHATZ et al., 2001 u GANSWINDT et al., 2003). Eine sorgfältige Validierung mit einer längerfristigen Probensammlung ist daher stets angezeigt. Auch auf Grund großer Schwankungen zwischen den Hormonkonzentrationen der verschieden Tierarten und innerhalb einer Tierart, sollte sorgfältig validiert werden, sodass jedes Tier
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durch langfristige Probenentnahme als seine eigene Kontrolle dienen kann (PALME et al., 2001 u PALME, 2005 u TOUMA et al., 2005 u HEISTERMANN et al., 2006 u SCHWARZENBERGER, 2007 u HODGES et al., 2010). Um einen Zusammenhang zwischen physiologischen Ereignissen und Hormonkonzentrationen zu beweisen, was der Sinn jeder Validierung sein soll, ist sowohl das Überprüfen von physiologischen Ereignissen zur biologischen Validierung als auch die Applikation verschiedener Medikamente wie ACTH und GnRH zu empfehlen (KEAY et al., 2006 u HODGES et al., 2010). So haben DLONIAK et al. (2004) beispielsweise LHRH injiziert, um eine Ausschüttung von Testosteron bei Tüpfelhyänen zu bewirken und dadurch sicherzustellen, dass der Test geeignet ist, um Testosteron im Kot der Hyänen zu detektieren.
2.7 ACTH-Test
2.7.1 Funktion ACTH-Test
Zur Validierung eines GK-Assays ist es möglich einen ACTH-Test durchzuführen (MONFORT et al., 1998 u PALME, 2005 u HULSMAN, 2009 u LEPSCHY et al., 2010 u BENHAIEM, 2012). Adrenocorticotropes Hormon (ACTH) oder ein synthetisches Analogon wird injiziert, um eine Aktivierung der HPA-Achse nachzustellen. Der darauffolgende Anstieg des Kortisols und anderer Glukokortikoide und der hierauf folgende Abfall, spiegelt sich in den GK-Metaboliten im Kot wieder und beweist die Funktionalität des Testsystems, eine Aktivierung des HPA-Systems detektieren zu können (KEAY et al., 2006).
Auch eine biologische Validierung ist möglich, wobei man Kotproben einige Tage vor und einige Tage nach bekannten, mit Stress einhergehenden Situationen wie Transport, Narkose oder Impfung sammelt und diese auf einen Anstieg und Wiederabfall von GK- Konzentrationen untersucht. So zeigten Hunde und Katzen bei der jährlichen Routineimpfung einen deutlichen Anstieg ihrer GK-Konzentration, was als Beweis dafür angesehen wurde, dass das Testsystem adrenokortikale Funktionen wiedergeben kann. Selbiges ist auch nach einer tierärztlichen Behandlung bei Gürteltieren zu beobachten gewesen (PALME et al., 2001 u HOWELL-STEPHENS et al., 2012). Nichtsdestotrotz sollte, wenn möglich, auch ein ACTH-Test durchgeführt werden (PALME et al., 2001).
30
Die durchschnittliche Zeitverzögerung von der Injektion bis zur Ausscheidung des ACTH mit dem Kot betrug bei nordamerikanischen Wölfen 16-20 Stunden, sodass eventuell auftauchende Stresssituationen erst mit einer zeitlichen Verzögerung von ca. einem Tag im Kot nachzuvollziehen waren (SANDS et al., 2004).
SCHATZ et al. (2001) befanden einen Kortisol-Assay als bestgeeignetsten, um GKs beim Hund zu messen. Der Hund verstoffwechselt 23 +/- 4 % des Kortisols aus dem Blut über den Darm und scheidet diese mit dem Kot aus.
2.7.2 Testdurchführung
Für die Testdurchführung sollten genügend Tiere verschiedenen Geschlechts verwendet werden, um interindividuelle und intersexuelle Schwankungen so gering wie möglich zu halten (PALME, 2005). Bei Hunden wurden Geschlechtsunterschiede in der Hormonausschüttung nach ACTH-Stimulation berichtet, sodass auf den Faktor „Geschlecht“
besonderes Augenmerk gelegt werden muss (PESSINA et al., 2009).
Für einen ACTH-Test ist es essentiell, dass jede abgesetzte Kotprobe gesammelt wird und diese zudem individuell zuzuordnen ist, da die Aktivierung der HPA-Achse in einem sehr kleinen Zeitfenster von ca. 24 Stunden abläuft. Sollte es in dieser Zeit nicht gelingen Kotproben der Tiere zu bekommen, sieht man eventuell keinen Anstieg und Abfall der GK- Konzentration. Daher gestaltet sich ein Test mit Wölfen, die in sehr weitläufigen Gehegen gehalten werden, als sehr schwierig durchführbar. Auf Grund seiner Abstammung vom Wolf (PANG et al., 2009 u WAYNE et al., 2012) kann davon ausgegangen werden, dass sich der Hormonmetabolismus und die Ausscheidung zwischen Haushund (Canis lupus familiaris) und seinem Vorfahren nicht wesentlich unterscheidet, sodass eine Probensammlung vom Haushund, anstelle des Wolfs denkbar wäre.
31 2.8 Probenkonservierung
Um eine gute Aussagekraft über den individuellen Hormonstatus zu erlangen, ist es von Nöten, Kotproben individuell zuordnen zu können und dass diese zur Zeit der Untersuchung möglichst frisch sind (KEAY et al., 2006 u HODGES et al., 2010).
Laut BARJA et al. (2008b) kann frischer Kot anhand von folgenden Merkmalen erkannt werden: Schleimschicht auf der Oberfläche, starker Geruch und fehlende Anzeichen einer Dehydrierung.
Kot, welcher mittels EIA untersucht werden soll, sollte laut PALME (2005) schnellstmöglich nach der Defäkation gesammelt werden. Da bakterieller Metabolismus den größten Einfluss auf die Abbaurate der Hormonmetaboliten hat, sollte der Probe schnellstmöglich Wasser entzogen werden, indem sie lyophilisiert, getrocknet, erhitzt oder mit Alkohol vermengt wird.
Andere Autoren beschreiben jedoch auch das Einfrieren und Lagern der Proben bei -20°C bis zur Auswertung als eine weitere gute Möglichkeit der Probenkonservierung (BARJA et al., 2008a). ISHIKAWA et al. (2002) fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen Lyophilisation und Hitzetrocknung. Auch ergaben sich in ihrer Studie keine Unterschiede beim Vergleich der Extraktionsmethoden mit Ethanol oder Diethylether.
Die Proben sollten vor dem Einsammeln homogenisiert werden, um der Gefahr einer fraktionierten Ausscheidung der Hormone im Kot zu entgehen (MILLSPAUGH et al., 2003).
Besonderes Augenmerk muss auch auf eine eventuelle Kontamination mit Regen oder Urin gerichtet werden, welche die Ergebnisse verfälschen könnte (PALME, 2005 u KEAY et al., 2006).
In 95 prozentigem Ethanol fixierte Kotproben von Pavianen, Grizzlybären und Elefanten zeigten eine Veränderung der Hormonkonzentrationen sowohl bei Zimmertemperatur (WASSER et al., 2003), als auch bei -20°C im Verlauf der Lagerungszeit (KHAN et al., 2002).
Das Einfrieren der Proben bei -20°C direkt nach dem Einsammeln stellte daher die beste Lagerungsmethode dar und sollte einer Konservierung in Alkohol vorgezogen werden (KHAN et al., 2002 u KEAY et al., 2006 u HODGES et al., 2010). WASSER et al. (2003) beschreiben sogar Lagerungszeiten von zwei Jahren bei -20°C ohne signifikanten Einfluss auf die Hormonquantität im Kot von Grizzlybären und Elefanten.
32 2.9 Lagerungsexperiment
Bakterielle Enzyme beeinflussen die Hormonkonzentrationen im Kot und können zu falschen Ergebnissen führen (KHAN et al., 2002 u MÖSTL et al., 2002 u PALME, 2005). Das sofortige Einsammeln der Proben ist jedoch unter Feldbedingungen nicht immer möglich, daher scheint es sinnvoll zu überprüfen, welche Veränderungen bei einer längeren Verweildauer der Proben bei verschiedenen Bedingungen auftreten können.
In einem Lagerungsexperiment haben SANDS et al. (2004) keinen signifikanten Einfluss des Zeitintervalls zwischen Defäkation und Sammeln bzw. Sammeln und Einfrieren gefunden, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Hormonkonzentrationen in den Proben der Wölfe bei Temperaturen um den Gefrierpunkt konstant blieben. Auch beim iberischen Luchs blieben die Hormonkonzentrationen (Progesteron-, Östrogen- und Testosteron-Metaboliten) bei einem durchgeführten Lagerungsexperiment eine Woche lang stabil, wobei Proben, die im Herbst und Winter gesammelt wurden am wenigsten Variation zeigten. Regen kann die Hormone ausschwemmen und es sollten daher keine Proben verwendet werden, die Regen ausgesetzt waren (ABÁIGAR et al., 2010).
Bei einem Lagerungsexperiment sollten immer Tiere verschiedenen Geschlechts verwendet werden, da eine Variabilität der qualitativen und quantitativen Hormonkonzentration bestehen kann, sodass auch der bakterielle Abbau individuell variiert (PALME, 2005)
33 3 Material und Methode
3.1 Probanden
Insgesamt wurden in dieser Studie Kotproben von 39 europäischen Wölfen aus sechs Haltungen gesammelt (27m/12w) (siehe Tab. 1). Diese ungleiche Geschlechterverteilung hat mit dem Vorkommen weiblicher Wölfe in den Parks zu tun, da es sich als schwieriger gestaltet, mehrere Weibchen zusammen zu halten als Männchen. Zusätzlich waren viele der Wölfe kastriert, sodass es zu einer Verkleinerung der Probandenzahl bei der Untersuchung der Sexualhormone kam.
Für den ACTH-Test wurden, neben drei Wölfen der oben genannten Tiere aus dem Wolfcenter Dörverden, deutsche Schäferhunde aus einer privaten Zwingerhaltung verwendet.
Die 4,4 Hunde wurden separat gehalten, bekamen Trockenfutter, Pansen und Muskelfleisch zu fressen, waren alle ausgewachsen (> zwei Jahre alt) und wiesen einen intakten Gonadenstatus auf (vgl. Tab. 2).
34 Tabelle 1:Haltung aller Probanden
Ort Größe
Anzahl
Wölfe Lage Vegetation
Schutz -hütte
Ver-
gesellschaftung
Fastentag (1x wöchtl.)
Sicht- kontakt zu Menschen
Osnabrück 0,8 ha 5,0
benachbart mit Rentieren und
Sikahirschen
viele große Bäume kaum Boden-
gewächs ja nein nein ja
Osnabrück, Absperr-
gehege 0,001 ha 0,2
benachbart
mit Rentieren keine nein nein nein ja
Dörverden 1,1 ha 5,1
benachbart mit Wölfen, Hunden und Schafen
viele Bäume, viel Boden-
gewächs nein nein ja ja
Sababurg 0,7 ha 8,1 separat wenig ja nein nein ja
Springe 1,2 ha 3,3
benachbart mit Wisenten
viel Boden- gewächs ja
ja, mit 2
Braunbären ja nein
Wingst 0,65 ha 6,4
benachbart mit Wölfen und Braunbären
viele Bäume, kaum Boden-
gewächs nein nein ja ja
Wingst, Absperr-
gehege 0,001 ha 0,1
geschloßener
Raum keine ja nein ja ja
Einbeck 0,04 ha 2,0 benachbart mit Wölfen
wenig Boden-
gewächs ja nein ja ja
Einbeck 0,04 ha 2,1 benachbart mit Wölfen
wenig Boden-
gewächs ja nein ja ja
Einbeck 0,02 ha 1,0
benachbart mit Wölfen
wenig Boden-
gewächs ja nein ja ja
Tabelle 2: Schäferhunde aus Privathaltung, die im Rahmen des ACTH-Tests und der NaCl- Blindstudie verwendet wurden
Hund Rasse Geschlecht
Alter in
Jahren Gonadenstatus Probenzeitraum
Yankee dt. Schäferhund m 2 intakt Apr.- Juni 2013
Schwarzer dt. Schäferhund m 2 intakt Jun 13
Ben dt. Schäferhund m 3 intakt Apr 13
Olli dt. Schäferhund m 4 intakt Apr.- Juni 2013
Graue dt. Schäferhund w 3 intakt Apr.- Juni 2013
Kleine dt. Schäferhund w 2 intakt Jun 13
Ulla dt. Schäferhund w 4 intakt Apr.- Juni 2013
Hündin dt. Schäferhund w 3 intakt Apr 13
35 3.1.1 Zoo Osnabrück
Die Gruppe der Wölfe aus dem Zoo Osnabrück bestand aus fünf männlichen adulten Wölfen:
„Welpi“, „Nr.2“, „Nr.3“, „Mopsi“ und „Zett“. Die Rangordnung war unter den Alphatieren nicht ganz klar. Zwar dominierte der Wolf „Welpi“ alle anderen durch typische Unterwerfungssignale, teilte sich aber oft seinen Rang mit dem Wolf „Nr.2“, da beide Wölfe Dominanzverhalten gegenüber dem anderen zeigten, wobei „Welpi“ jedoch den größeren Anteil zeigte.
Wolf „Zett“ war offensichtlich der Rangniedrigste, der besonders von Wolf „Nr.2“ immer wieder verfolgt und so in seiner Bewegungsfreiheit stark eingeschränkt wurde.
Im Verlauf der Studie starb „Nr.3“ und es wurden zwei adulte Weibchen in das Gehege zugesetzt („Alphaweibchen“ und „Omegaweibchen“). Nur das Alphaweibchen konnte im Rudel verbleiben; das andere, niederrangige Weibchen wurde verstoßen und musste aufgrund seiner Verletzungen separiert werden.
3.1.2 Wolfcenter Dörverden
Im Wolfcenter Dörverden wurden 5,1 europäische Wölfe gehalten. Das Rudel bestand aus drei älteren männlichen Wölfen „Oblomow“, „Gontscharow“ und „Piotre“, einer adulten Fähe, „Anatoschka“ und zwei männlichen Welpen „Mietja“ und „Levi“, die mit den anderen Wölfen nicht verwandt waren. Zur Zeit der Untersuchung waren „Oblomow“ und
„Anatoschka“ das Alphapaar dieses Rudels, „Gontscharow“ war der Rangniedrigste.
Besonders zu den Fütterungszeiten gab es vermehrt Aggressionen zwischen „Oblomow“ und
„Gontscharow“, wobei „Oblomow“ seine Alphaposition stets verteidigte.
3.1.3 Sababurg
In Sababurg befanden sich 8,1 Wölfe in einem dreigeteilten Gehege, wobei die Fähe mit acht ihrer eigenen adulten Söhne zusammen lebte. Die Fähe und einer ihrer Söhne („Nr.2“) nahmen zusammen die Alphapositionen ein. „Nr.9“ war der Rangniedrigste und hielt sich
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zumeist abseits des Rudels auf. Mehrmals am Tag wurde er von den höherrangigen Wölfen
„Fähe“, „Nr.2“ und „Nr.1“ attackiert, was oft zu blutigen Verletzungen bei „Nr.9“ führte.
3.1.4 Springe
Das Rudel bestand aus 3,3 Wölfen. „Mara“ war die Alphawölfin und zeigte klares Dominanzverhalten gegenüber „Panja“ und „Nikita“. Letztere befand sich oft abseits des Rudels und war die Rangniedrigste. Bei den Männchen nahm „Raul“ die Alphaposition ein, wobei „Paul“ auch teilweise Dominanzverhalten zeigte. „Nestor“ zeigte deutliches Unterwerfungsverhalten den anderen beiden Männchen gegenüber, sodass er der Rangniedrigste war.
3.1.5 Wingst
Zwei Fähen, vier Rüden und 2,2 Jungtiere wurden zusammen in einem Gehege in Wingst gehalten. Die Jungtiere waren Welpen der Alphawölfin „Weißpo“ und des Alpharüden
„Alpha“, die 2011 in Wingst geboren wurden. Alle Rüden, bis auf den Alpharüden, wurden kurz vor Beginn der Studie kastriert. Der Omegarüde „Black Mopsi“ wurde oft von „Weißpo“
und anderen Rudelmitgliedern attackiert und hielt sich abseits des Rudels auf. Das Gehege befand sich nahe eines weiteren Wolfsgeheges, in dem zwei weiteren Fähen lebten. Es gelang zusätzlich Kotproben der niederrangigen („Omegafähe 2“) Fähe zu sammeln.
3.1.6 Einbeck
Die Wölfe aus Einbeck waren handaufgezogene europäische Wölfe, die den Umgang mit Menschen regelmäßig erfuhren und gewohnt waren.
Sie lebten in drei getrennten Gehegen. Ein männlicher Wolf, „Lupahn“ wurde auf Grund seiner Epilepsie-Erkrankung solitär gehalten. Er hatte direkten Sichtkontakt zu dem Rudel von „Buran“ (männlich), „Cochise“ (männlich) und „Taruk“ (weiblich) und konnte diese durch den Zaun riechen und mit ihnen kommunizieren. Da des Öfteren Kontakt zwischen
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diesen Tieren bestand und „Lupahn“ vor seiner Erkrankung mit in dem Rudel gelebt hat, kann man „Lupahn“ auch als eingeschränktes Mitglied dieses Rudels betrachten.
„Buran“ und „Taruk“ nahmen die Alphapositionen ein und dominierten „Cochise“, welcher als Omegatier deutliche Unterwerfungssignale gegenüber „Buran“ und „Taruk“ zeigte.
In einem anderen Gehege lebten „Topah“ und „Cloudy“. Bei den beiden Rüden war es schwierig eine klare Rangordnung festzulegen, da keinerlei aggressives oder demütiges Verhalten gezeigt worden ist. Auf Grund von den Erläuterungen des Besitzers kann jedoch davon ausgegangen werden, dass „Cloudy“ als sehr dominanter und wesensstarker Wolf eine Art Alphaposition innehatte.
Tabelle 3 zeigt alle Probanden der verschiedenen Gehege/Standorte, ihr Geschlecht, den Rang, den Gonadenstatus, Altersgruppe, Herkunft und den Zeitraum in dem die Proben gesammelt wurden.
