Hat die Dauer der verschiedenen Prozessabschnitte bei der ICSI einen Einfluss auf das weitere Outcome?

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Bernhard Panholzer

Hat die Dauer der verschiedenen Prozessabschnitte bei der ICSI einen

Einfluss auf das weitere Outcome?

Masterarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades eines Master of Science

im Rahmen des Universitätslehrganges Klinische Embryologie

Wissenschaftlicher Begutachter:

Univ.-Prof. Mag. Dr. Thomas Ebner Ao.Univ.-Prof. Mag. Dr. Dr. Erwin Petek

Karl-Franzens-Universität Graz und UNI for LIFE

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“Everthing is going to be fine in the end. If it´s not fine, it´s not the end.“

Fernando Sabino

Danksagung

Ich bedanke mich herzlich bei Univ.-Prof. Mag. Dr. Thomas Ebner für seine Unterstützung und seine Geduld während des gesamten Schreibprozesses. Des Weiteren möchte ich mich für die Möglichkeit im Labor umzuschauen bedanken und vor allem bei dem Team und deren Erklärungen Ihres Arbeitsplatzes und Beantwortungen meiner Fragen.

Besonders hebe ich Rebecca, Raphi, Raffi, Anna E., Anna S., Esthera und Mira hervor für jeweils ihre Unterstützung und deren offenes Ohr sowie deren Ratschläge während zum Teil langen Telefonaten. An sich bedanke ich mich bei all meinen Freunden sowie meiner Chefinnen meiner verschiedenen Nebenjobs, welche mir die Teilnahme des Studiums ermöglicht haben.

Bei meiner Familie möchte ich mich auch bedanken, welche mich durch das ganze Studium unterstützt haben. Besonders bei meinen Eltern welche mir das Studium erst ermöglicht haben durch ihre finanzielle Unterstützung. Vor allem möchte ich mich bei meinem Bruder bedanken, dass er immer ein offenes Ohr für mich hatte, auch wenn dies nicht sein Themengebiet war und ist.

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Zusammenfassung:

Das Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, ob die Zeiten der verschiedenen Prozessabschnitte in der ICSI-Behandlung einen Einfluss auf einen positiven Schwangerschaftsbescheid haben. Mit Hilfe des Witness^TM Programmes wurden die einzelnen Zeitabschnitte zwischen der Eizellentnahme (Punktion) über die Denudation bis hin zur ICSI genauestens erfasst. Mit diesen Daten könnten Rückschlüsse auf das Altern der Eizellen in vitro gezogen werden und eventuell notwendige Änderungen im Labor vorgenommen werden.

Die eingeschlossenen Frauen in dieser Studie unterzogen sich einer ovariellen Stimulation für ICSI, um einen Embryotransfer im besten Fall zu ermöglichen. Die Paare litten unter Endometriose, Tubuläre-Sterilität, PCO-Syndrom und/oder männlicher Subfertilität.

187 Patientinnen wurden bis zur Blastozyste am Tag 5 kultiviert. Daraus resultierend entstanden die „schwanger“ und „nicht schwanger“ Gruppen. Es wurden alle Daten der zwei Gruppen verglichen.

Keiner der kritischen Zeiträume zeigte einen signifikanten Einfluss auf das Eintreten einer Schwangerschaft. Hingegen waren das Alter sowie die Blastozystenbildung ein Indikator für das Eintreten einer Schwangerschaft. In der Gruppe „schwanger“ haben sich bei 60,4%, Blastozysten entwickelt (mittleres Alter 32,5 Jahre) hingegen in der

„nicht schwanger“ Gruppe waren es 42,1% (34,4 Jahre). Gründe können sein, fehlender ovariellen Reserve, niedrige Befruchtungsrate, Anstieg der Fehlgeburtenrate aber auch ein vorzeitiger Wechsel. Die Schwangerschaftsrate lag bei 38,5%, dieser Wert befindet sich im Normbereich der künstlichen Befruchtung.

Weitere Studien sind nötig, um den Einfluss der Zeit besser zu verstehen als Kofaktor und in Verbindung bei Alt versus Jung Clustern.

Abstract:

The aim of the Master thesis was to find out if the different parts of the ICSI treatment had an impact on pregnancy outcome. The Witness^TM program was used to evaluate the exact time between oocyte pick up, denudation and ICSI. Based on these data phenomena such as oocyte ageing in-vitro could be identified which would help to make adaptions to the schedule where appropriate.

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All women included in this study underwent controlled ovarian hyperstimulation and ICSI. They suffered from endometriosis, tubular sterility, PCO-syndrome and/or male subfertility. In total, the embryos of 187 patients were cultivated until blastocyst stage on day 5. Primary objective was the comparison between pregnant and non-pregnant patients. It turned out that none of the critical time periods showed an impact on pregnancy. Female age and blastocyst formation, however, where predictive of pregnancy. In detail, blastocyst rate was 60.4% (mean 32.5 years) in the “pregnant”

and 42.1% (mean 34.4 years) in the “non-pregnant” group

Possible explanations include reduced ovarian reserve, low fertilization rate, or an increased miscarriage rate. Clinical pregnancy-rate was 38.5% which appeared acceptable in ART. Further studies are necessary to better understand the effect of timing in an age-dependent manner.

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung: ... 3

2.Weibliche Faktoren: ... 6

2.1 PCO-Syndrom: ... 6

2.2 Endometriose: ... 6

2.3 Fehlende ovarielle Reserve: ... 7

2.4 Follikelreifestörung und Ovulationsstörung: ... 8

2.5 Uterine Faktoren: ... 9

2.6 Septen:... 10

2.7 Myome: ... 11

2.8 Aschermann Syndrom: ... 12

3. Männliche Faktoren: ... 13

3.1 Spermiogramm: ... 13

4. Kontrollierte ovarielle Hyperstimulation:... 18

4.1 Stimulationsprotokolle: ... 18

5. Gametenreifung: ... 21

5.1 Oogenese: ... 21

5.2 Spermatogenese: ... 22

6. Methoden: ... 23

6.1 Intrauterine Insemination (IUI): ... 23

6.2 In-vitro-Fertilisation (IVF): ... 23

Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI): ... 24

7. Eizell- und Embryoqualität: ... 26

7.1 Beurteilung der Eizelle an Tag 0: ... 26

7.2 Beurteilung der Zygote (Tag 1): ... 27

7.3 Embryonen an Tag 2-3, Teilungsstadium: ... 28

7.4 Beurteilung von Embryonen im Morula Stadium (Tag 4): ... 29

7.5 Blastozysten- Stadium (Tag 5): ... 30

8. Embryokultur und -transfer:... 31

9. Qualität der Gameten:... 33

9.1 Aneuploidie: ... 33

10. Material und Methoden: ... 36

10.1 Patienten: ... 36

10.2 Witness^TM Methode:... 36

10.3 Eizellsuche und Stimulation: ... 37

10.4 ICSI: ... 38

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10.5 Time-lapse: ... 39

11. Ergebnisse: ... 40

12. Diskussion: ... 45

Literaturverzeichnis ... 54

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Abbildungsverzeichnis:

Abbildung 1: Uterine Fehlbildungen 10

Abbildung 2: Myome 12

Abbildung 3: Schematische Darstellung einiger

abnormaler Formen menschlicher Spermien. 16

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Tabellenverzeichnis:

Tabelle 1: Zeit-, AMH- und Alter-messdaten von Tag 0 - Tag 5

von den verbleibenden 187 Frauen 39

Tabelle 1.a: Minimum und Maximum Werte der Tabelle 1 40 Tabelle 2: Gesammelte Eizellen der 187 Patientinnen und

deren Entwicklung. Werte in Klammern sind Prozente. 40 Tabelle 3: Tag 5 Messdaten von Zeit, AMH und Alter 41 Tabelle 3.a: Minimum und Maximum Werte der Tabelle 3 42 Tabelle 4: Tag 5 Entwicklung der gesammelten Eizellen.

Werte in Klammern sind Prozente. 42

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Abkürzungsverzeichnis:

ART künstliche Befruchtung/ assistierte Befruchtung

AMH Anti-Müller-Hormon

COC Kumulus-Eizell-Komplex

FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FSH follikelstimulierendes Hormon

GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormone

GV Germinalvesikels

hCG humanes Choriongonadotropin

HOS hypoosmotischen Schwelltest

ICM innere Zellmasse

ICSI intrazytoplasmatische Spermieninjektion

IM Immotilität

IMSI intracytoplasmic morphologically selected sperm injection

IUI intrauterine Insemination

IVF in-vitro-Fertilisation

LH luteinisierendes Hormon

MESA mikrochirurgischen epididymalen Spermienaspiration

MI Metaphase-I

MI Metaphase II

NP nicht progressiven Motalität

OHSS ovariellen Hyperstimulationssyndromes PCO-Syndrom Polyzystisches Ovar Syndrom

PDZ partial Zona Dissection

PESA perkutane epididymale Spermienaspiration pICSI physiological intracytoplasmic sperm injection

PR progressive Motalität

RFID Chip radio frequency identification Chip SUZI subzonalen Spermieninjektion

TE Trophektodermzellen

TFF totalen Fertilisationsversagen

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TESE testikuläre Spermienextraktion

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1. Einleitung:

Die Verschmelzung von männlichen und weiblichen Gameten während der Befruchtung führt zu einem neuen Individuum. Dieser neue Mensch trägt die genetische Variation der vorherigen Generation mit sich, welche der nächsten Generation in einer anderen Zusammensetzung weitergegeben werden kann. Diese genetischen Unterschiede können von Vorteil oder von Nachteil sein, je nachdem welchen evolutiven Sinn sie in einem Ökosystem ergeben.

Diese Verschmelzung der Gameten und die Entwicklung zum frühen Embryo wurde in verschiedenen Spezies Mitte des 19. Jahrhunderts erforscht. ¹² ³ Robert Edwards untersuchte in den frühen 1960igern in-vitro Reifung bei menschlichen Eizellen und erhielt 2010 den Nobelpreis (Physiologie oder Medizin). ⁴⁵ Seine Arbeit wurde in dieser Zeit als sehr problematisch betrachtet hinsichtlich religiöser, ethischer und moralischer Implikationen. Heutzutage hat sich die Sachlage geändert, da die Methode der IVF als sinnvolles Werkzeug angesehen ist, um kinderlosen Paaren eine Möglichkeit zu bieten, den Traum einer Familie erreichen zu können. ⁶

In den letzten Jahrzehnten besonders aber den letzten Jahren wurde die künstliche Befruchtung immer mehr in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt. Der Grund liegt darin, dass jedes 6te Paar (15%) ungewollt kinderlos bleibt, trotz regelmäßigem ungeschützten Geschlechtsverkehr.⁷ Frauen wollen sich beruflich weiterentwickeln und daher ihre Energie in den Job einfließen lassen, anderseits wollen sie auch eine Familie gründen. Dieses Dilemma resultiert in dem späteren Wunsch ein Kind zu bekommen. Jedoch, mit fortschreitendem Alter sehen sich Paare - vor allem Frauen - mit Problemen konfrontiert, welche eine mögliche Kinderlosigkeit als Folge haben könnte. Welche nicht nur altersbedingt auftreten, sondern auch genetische und hormonelle Ursachen haben können. Weitere Faktoren können auch Krankheiten

1 Vgl. Chang (1959): S.466-467.

2 Vgl. Yanagimachi/Chang (1964): S.361-375.

3 Vgl. Whittingham (1968): S.592-593.

4 Vgl. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2010/summary/

5 Vgl. Edwards (1965): S.926-929.

6 Vgl. Elder/Dale (2011): S.vii-viii.

7 Vgl. Müller (2012)

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(Tumoren, Chlamydien) sein. Männer beispielsweise können stark eingeschränkte Samenparameter aufweisen. Um solche Hürden zu überwinden und solchen Paaren zu helfen, wird unter anderem IVF genutzt.⁸⁹¹⁰

Abgesehen von den oben genannten Gründen, entscheiden sich Paare aufgrund wiederholter ungeklärter Aborte (habituelle Aborte) oder wegen Erbkrankheiten für eine künstliche Befruchtung und des Weiteren für eine genetische Untersuchung der Eizellen oder auch des Embryos während der Behandlung. ¹¹

Vorerst mussten jedoch Theorien zur Frage „Warum Frauen nicht schwanger werden“ erforscht werden. Die gängigste Erklärung war der Verschluss der Eileiter.

Aufgrund dessen hat sich die homologe Insemination entwickelt. Dabei hat der behandelnde Arzt das abgegebene Sperma in die Vagina der Frau injiziert. Dies wurde in der Viehzucht bereits geraume Zeit erfolgreich genutzt, beim Menschen hingegen blieb die Erfolgsrate sehr gering.

Mit der Hilfe der Hormonforschung konnte man die Frau stimulieren, um mehr Eizellen als im natürlichen Zyklus zu erhalten, welche in-vitro genutzt werden konnten. Dennoch bringt diese Manipulation Probleme mit sich, nämlich eines ovariellen Hyperstimulationssyndromes (OHSS). Dabei kommt es zu Pleuraergüssen und Aszites, welche durch eine Flüssigkeitsverschiebung aus dem intraversalen Raum in den dritten Raum herrührt. Je nach Schweregrad kann OHSS auch lebensbedrohlich sein.

Sobald die Probleme in der Stimulation überwunden waren, konnte man sich der nächsten Aufgabe widmen. Die Spermien und die Eizelle außerhalb des Körpers näher zusammen zu führen, via IVF, PZD, SUZI, ICSI. Bei der In-Vitro-Fertilisation (IVF) werden die Spermien in einem Reagenzschälchen mit der unbehandelten Eizelle zusammengebracht. Häufig wurde beobachtet, dass Samenzellen an der Zona pellucida gebunden waren, jedoch fand keine Befruchtung statt. Um bei schwerwiegenden Formen der männlichen Fertilität Abhilfe zu schaffen wurden die

8 Vgl. Painter (2018)

9 Vgl. Kincaid (2015)

10 Vgl WHO (2010)

11 Vgl. Diedrich/Ludwig/Griesinger (2013): S.2-6.

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Zona Drilling Methode und die Partielle Zona Dissection (PZD) entwickelt. Bei ersterer Methode wird unter Verwendung einer sauren Tyrode-Lösung oder eines Laserstrahls eine Öffnung in die Zona pellucida gemacht, um die Befruchtungsrate zu steigern. Da der erwünschte Erfolg gering ausfiel (viele polysperme Zygoten), wurde mit PZD mithilfe einer Mikronadel tangential die Zona durchbohrt und eingerissen, um somit eine großflächige Öffnung zu generieren.

Hingegen werden bei der subzonalen Spermieninjektion (SUZI) einzelne Spermien zwischen Zona pellucida und Oolemma injiziert. Ein Baby wurde erfolgreich mit der SUZI- Methode 1988 in Singapur auf die Welt gebracht. Durch einen Zufall entstand 1992 die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI), da ein Arzt/Palermo das Spermium direkt in die Eizelle injizierte, bis dahin ging man davon aus, dass die Eizelle eine solche Behandlung nicht standhalten könne. Dies führte dazu das SUZI obsolet wurde.

Die befruchteten Eizellen verbleiben dann in einer in vitro Embryokultur. Sie können einzeln oder in einer Gruppe im Kulturmedium platziert werden. Der Transfer, also die Rückgabe des Embryos/der Embryonen findet für gewöhnlich zwischen Tag 2 und Tag 5 statt. Früher wurde mehr als ein Embryo transferiert, um die Schwangerschaftsrate zu erhöhen. Das führte in westlichen Ländern bei der Anwendung einer assistierten Reproduktion (ART) zu Mehrlingsschwangerschaften.

Solche Schwangerschaften waren nicht nur für die Patientinnen riskant, sondern auch für die Embryonen, da es zu vermehrten Aborten, Nabelschnurkomplikationen, Frühgeburten, vorzeitige Plazentalösung, postpartale atonische Blutungen, Hypertonie oder Präeklampsie kommen kann. Aufgrund dessen ging man über zum

„Single Embryotransfer“, in dem man den Embryo mit dem vermeintlich besten Entwicklungspotenzial transferiert. Wenn mehr als ein geeigneter Embryo vorhanden ist, werden die überzähligen kryokonserviert.¹²¹³¹⁴

12 Vgl. Diedrich/Ludwig/Griesinger (2013): S. 13 - 15

13 Vgl. Diedrich/Ludwig/Griesinger (2013): S. 317 - 337

14 Vgl. Nieschlag/Behre/Nieschlag (2009): S. 480 - 487

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2.Weibliche Faktoren:

2.1 PCO-Syndrom:

Von einem polyzystisches Ovar Syndrom (PCOS) spricht man, wenn zwei oder drei der folgenden sogenannten Rotterdam Kriterien (2003) erfüllt sind: Oligo- oder Amenorrhoe, Hyperandrogenämie/Androgenisierung (Hirsutismus), Testosteron hoch und /oder DHEA-S hoch, mehr als 12 Antralfollikel pro Ovarien detektierbar werden und diese nicht größer sind als 9mm. ¹⁵ Das PCO-Syndrom ist eines der häufigsten Krankheitsbilder im Kinderwunschklientel und es beeinflusst sowohl ältere als auch jüngere Frauen. Es beinhaltet komplexe metabolische, reproduktive und psychologische Eigenschaften. ¹⁶ Die Unfruchtbarkeit ist eines der Hauptcharakteristika von PCOS, rund 75% der betroffenen Frauen leiden unter Anovulation. ¹⁷ Mögliche Behandlungen dieses Syndroms inkludieren pharmakologische Therapien, Veränderungen im Leben (Sport und Diät), Operationen (Laparoskopie) oder eben eine künstliche Befruchtung mittels IVF oder ICSI. ¹⁸

2.2 Endometriose:

Bei Patientinnen, die unter Endometriose leiden, finden sich dem Endometrium, - Ansiedelungen außerhalb des Uterus. Dieses Gewebe kann sich an den Eileitern, Bauchhöhle beziehungsweise Nierenbecken oder auch an den Bändern, die die Gebärmutter halten manifestieren. Diese Fehlplatzierung des Endometriums führt zu Schmerzen, welche unterschiedlich stark ausfallen können und auch zur Unfruchtbarkeit. Dieses Gewebe ist sehr empfindlich auf hormonelle Veränderung, welche in der Menstruation auftreten. Weiters kann es zu gastrointestinalen Störungen führen, wenn das Endometrium sich auf andere Organe übergreift, wie zum Beispiel Darm oder Harnblase Die Entstehende Unfruchtbarkeit wird durch den Verschluss der Eileiter, Bildung von endometrischen Eierstockzysten oder auch durch

15 Vgl. Giatgen/Fischli (2011): S. 91-93.

16 Vgl. Teede/Deeks/Moran (2010): S.41.

17 Vgl. Homburg (2004): S.773-788.

18 Vgl. Costello/Misso/Wong et al. (2012): S.400-403.

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Veränderungen im Nierenbecken hervorgerufen. Die Endometriose kann durch eine Ultraschalluntersuchung erkannt werden, sofern sogenannten „Schokoladenzysten“

(ovarielle Zyste) sichtbar werden, jedoch für eine präzise Diagnose verwendet man eine Laparoskopie. Wenn ein Raum mit homogener-echoarmen Binnenstruktur erkannt wird, spricht man von einer Schokoladenzyste. Diese Zysten sind Endometriome, welche sich an den Eierstöcken befinden, und diese sind mit verdicktem dunklen Blut gefüllte Gewebehohlräume. Frauen können in jedem Alter unter dieser Krankheit leiden, während ihrer reproduktiven Phase im Alter von 13 – 50. Es ist eine chronische Krankheit, welche nach einer OP wieder zurückkehren kann. Es ist die am zweitmeisten verbreitetste Krankheit, welche häufig Hand in Hand geht mit Unfruchtbarkeit. Die erkrankten Frauen haben entweder die aktive oder die inaktive Form der Endometriose. Es wird vermutet, dass aufgrund des Immunsystems Endometriose inaktiv bleibt. Bis heute ist unklar wie es zu einem Wachstum des Endometriums außerhalb des Uteruses kommt. Es gibt zwei Ideen dazu, Transplantationstheorie und die Metaplasie. Die Verschleppungs- oder Transplantationstheorie besagt, dass über den Blutkreislauf Endometrium Zellen in andere Areale des Körpers gelangen und dort anwachsen. Da es nicht bei allen Frauen auftritt, wird ein Zusammenspiel mit Hormonen oder dem Immunsystem angenommen. Hingegen geht man bei der Metaplasie davon aus, dass andere Körperzellen aus noch unbekannten Gründen sich zu Endometrium Zellen umwandeln. Weiters wird bei Familien in denen die Endometriose gehäuft vorkommt, die Frage der möglichen Vererbbarkeit ins Zentrum gerückt. ^{19 20 21}

2.3 Fehlende ovarielle Reserve:

Die ovarielle Reserve hängt von der Anzahl der Primordialfollikel im Kortex des Ovars ab. Bei der Geburt der Frau sind 1-2 Millionen vorhanden, die Anzahl sinkt rapide bis zum Zeitpunkt der Pubertät ab. Frauen im Alter von 35 Jahren haben einen Verlust der Follikel von 70%. Ab Erreichen der kritischen Anzahl von 25000, verdoppelt sich

19 Vgl. https://ivi-fruchtbarkeit.de/haufig-gestellte-fragen/grunde-fur-unfruchtbarkeit/

20 Vgl. https://www.amboss.com/de/wissen/Endometriose

21 Vgl. Abschlussbericht Expertise zum Thema Endometriose 2007

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der Follikelverlust (37,5 Jahre). ²² Für einen regulären Zyklus ist eine Mindestanzahl an Follikel notwendig, bei Mangel ist es ein Zeichen für fehlende ovarielle Reserven.

Die eingeschränkte ovarielle Reserve lässt sich basal am FSH und noch viel mehr am AMH-Spiegel ablesen. Prinzipiell geht eine beeinträchtigte Eierstockreserve einher mit einer niedrigeren Befruchtungsrate, einem Anstieg der Fehlgeburtenrate und ebenso einer Erhöhung der chromosomalen Aberrationsrate. ²³²⁴

2.4 Follikelreifestörung und Ovulationsstörung:

Die beiden Störungen treten sehr häufig auf. Man unterscheidet die milde-, mittelschwere- und die schwere Follikelreifestörung. Nur in der schweren Form findet keine Follikelreifung statt. In der milden Follikelreifungsstörung findet eine Ovulation statt. Ausschließlich die Progesteronbildung in der Lutealphase ist ungenügend. Die Folge ist eine Lutealinsuffizienz mit Vorblutungen.

In der mittelschweren Form ist die Follikelreifung intakt, aber es findet keine Ovulation statt. Das für die sekretorische Umwandlung des Endometriums in der Lutealphase notwendige Progesteron wird nicht gebildet. Durch den Progesteronmangel kann die lang andauernde Östrogenwirkung (relativer Östrogenüberschuss) zu einer überschießenden Proliferation des Endometriums führen. Unbehandelt ist langfristig das Risiko für Endometriumkarzinome erhöht.

Klinisch besteht typischerweise eine Oligomenorrhoe (verlängerte Zyklen von 36-90 Tagen), begleitet von teils massiven dysfunktionalen Blutungen oder eine normöstrogene Amenorrhoe.

Die schwere Form hat keine Follikelreifung, weder Östrogene noch Progesteron werden ausreichend gebildet, es liegt eine hypoöstrogene Amenorrhoe vor. ²⁵

22 Vgl. Faddy/Gosden/Gougeon et al. (1992): S. 1342-1346.

23 Vgl. Te Vede/Dorland/Broekmans (1998): S.119-125

24 Vgl. Shebl (2018)

25 Vgl. Giatgen/Fischli (2011): S. 91-93.

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9 2.5 Uterine Faktoren:

Anhand der Abbildung 1 kann man verschiedene Fehlbildungen des Uterus erkennen. Genauer wird jedoch die Abnormalität Septum in einem extra Punkt beschrieben.

Abbildung 1: Uterine Fehlbildungen

Römer T., Nawroth F. (2019) Uterine Fehlbildungen. In: Diedrich K., Ludwig M., Griesinger G. (eds) Reproduktionsmedizin. Springer Reference Medizin. Springer, Berlin, Heidelberg

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10 2.6 Septen:

Das Septum (Scheidewand) ist eine Trennwand innerhalb der Gebärmutter, die den Hohlraum in zwei Seiten unterteilt. Meist tritt eine unvollständige Trennung auf, selten kommt es zu einer vollständigen Trennung der Gebärmutter, da es bis in den Gebärmutterhals ragt. ²⁶

Uterus Septen stellt mit ca. 50% die häufigste Fehlbildung dar. Die Wand, die beide Bereiche der Gebärmutterhöhle unterteilt, hat oft einen nur sehr geringen Anteil von uterinem Muskelgewebe. Entsprechend ist die Blutversorgung dieses Septums nicht so gut wie an der eigentlichen Gebärmutterwand. Nistet sich jedoch ein Embryo auf dem Septum ein, dann kommt es daher oft zu einer Minderversorgung mit Nährstoffen und zu einem Abort. Andere Fehlbildungen führen seltener zu einer Fehlgeburt aufgrund eines dickwandigen Septums, welches wiederum gut durchblutet ist und aufgrund dessen eine Schwangerschaft wahrscheinlicher ist. ²⁷

26 Vgl. http://www.chirurgie-portal.de

27 Vgl. http://www.wunschkinder.net

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11 2.7 Myome:

Abbildung 2: Myome

https://www.gesundheitsinformation.de/myome-der-gebaermutter.2622.de.html

Weiters kann es auch zu Myombildungen kommen. Hierbei wird anhand der Lage unterschieden, intramurale, submuköse und subseröse Myome (Abb.2). Die subserösen Formen werden erst zu einem Problem, wenn sie zu groß werden, sie entweder außerhalb der Gebärmutter entstehen oder in jener Wand, aber auch in der Gebärmutterhalswand. Submuköse Formen können innerhalb der Gebärmutterhalswand entstehen und werden mit zunehmender Größe problematisch. Sobald es die Cavum uteri (Schleimhauthauskleidung des inneren Teils des Uterus) deformiert, beeinträchtigt es die Fertilität. Intramurale Myome werden besonders ab einer Größe von 5cm in der Uteruswand zum Problem.

Abhängig von ihrer Größe und aufgrund der räumlichen Beschränkungen im Uterus

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birgt jede Myomform das Risiko einer Infertilität. Spermien gelangen entweder nicht zur Eizelle, oder die Eizelle gelangt nicht in den Uterus, sondern nur in die Eileiter.²⁸

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2.8 Aschermann Syndrom:

Das Aschermann Syndrom bezeichnet Narben und Verwachsungen der Gebärmutterschleimhaut. Diese Schädigungen treten auf nach Kürettagen (Ausschabungen), welche durchgeführt werden bei einer Fehlgeburt oder auch bei einer Plazenta, die sich nicht gelöst hat. Aber auch durch einen Kaiserschnitt kann es zu Vernarbungen kommen. Es kann zur einer partiellen bis hin zur vollständigen Verwachsung führen, was zu einem Verschluss der Gebärmutter führt. Das führt wiederum zu verstärkten Schmerzen und einer nicht vorhandenen oder abgeschwächten Monatsblutung.³⁰

Weitere Gründe können Medikamenteneinnahme, Stress, vorzeitiger Wechsel, extreme Gewichtszustände, Schilddrüsenüber und -unterfunktion, Tumore, genetische Faktoren, Infektionen, zu viel Testosteron, zu viel Prolaktin, welches den Zyklus stört und zum Ausbleiben des Eisprungs führen kann.³¹ Tubare Sterilität kann durch Operationen hervorgerufen werden. Wie zum Beispiel; Myom-Operationen, Ovarien Zysten, Entzündungen an den Adnexen und Chlamydieninfektionen.

Chlamydien wiederum können zu Adhesionen oder auch zu Endometriose führen.

28 Vgl. Surrey/Lietz/Schoolcraft (2001): S 405-410.

29 Vgl. Kolankaya/Arici (2006): S. 145-152.

30 Vgl. http://www.primomedico.com

31 Vgl. http://www.ivf-gesellschaft.at/index.php?id=118

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3. Männliche Faktoren:

In rund 50% der Fälle von Kinderlosigkeit betrifft es einen kompromittierenden männlichen Faktor. Sofern dies nicht von der Furchtbarkeit der Partnerin ausgeglichen werden kann, kommt die künstliche Befruchtung ins Spiel. Hierfür wird ein Spermiogramm erstellt, um Anzahl, Motilität und Morphologie zu definieren laut WHO Kriterien.

3.1 Spermiogramm:

Das abgegebene Ejakulat besteht nicht nur aus Spermien, sondern auch aus Sekreten der Prostata und Samenbläschen mit einem kleinen Anteil aus dem bulbourethalen Drüsen (Cowper´schen) und den Nebenhoden. Diese Sekrete, welche das Flüssigkeitsvolumen darstellen, geben Auskunft über die sekretorische Aktivität der akzessorischen Geschlechtsdrüsen. Es sollten bei einem gesunden Mann nicht weniger als 1,5 ml sein. Aufgrund der Anzahl der Spermien kann eine Aussage bezüglich Produktion in den Tests und Durchgängigkeit des protestikulären Gangsystems getroffen werden. Bevor die Untersuchung des Ejakulats stattfinden kann, werden die Spermien, die in einem Koagolum eingeschlossen sind, liquifiziert werden. Die Liquifizierung findet mit Hilfe von prostatischen Proteasen statt.

Innerhalb von 30 Minuten spätestens 60 Minuten sollte die Begutachtung der abgegebenen Probe von statten gehen, da es sonst zu Dehydrierung, einem negativen Einfluss des pH-Wertes und zu einer Veränderung der Temperatur im Ejakulat kommen kann.

Um zur Anzahl der Spermien zu gelangen gibt es verschiedene Arten von Zählkammern auf dem Markt. Die sich anhand der Raster und der Fassvolumen unterscheiden und aufgrund dessen sind unterschiedliche Verdünnungsfaktoren zu beachten. Es werden für die Anwendung 100 μm tiefe Hämozytometer empfohlen.

Aber es gibt auch flache Kammern, die mittels Kapillarkraft befüllt werden. Die gesamte Spermienzahl (10⁶/Ejakulat) darf nicht unter 39 liegen (respektive bei 15x10⁶(ml), ansonsten spricht man von Oligozoospermie.

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Das Auftreten von Krypto-, Nekrozoospermie oder eine Azospermie sind Anzeichen dafür, dass es Probleme mit der Spermienqualität gibt. Kryptozoospermie bedeutet, dass keine Spermien im Präparat vorhanden sind, aber im Zentrifugat (3000g/15min). Hingegen bei einer Nekrozoospermie besteht das Ejakulat aus einem hohen Anteil von immotiler Spermien und sehr wenigen vitalen. Bei einer Azoospermie sind keine Spermien im Ejakulat zu finden. Aufgrund solcher Resultate wurden diverse Methoden entwickelt, um spezifische Lösungsansätze zu liefern.

Dabei kann eine Befruchtung mittels physiologischen und morphologischen Methoden gewährleistet werden.

Die Spermiengesamtzahl spiegelt nicht die testikuläre Spermienproduktivität bei Androgenmangel, langer Karenzzeit, retrograder Ejakulation und Elektrostimulierung (Wirbelsäulenverletzung) wider.

Die Motilität der Spermien wird in progressive, nicht progressive Motalität und Immotilität eingeteilt. Unter Progressiver Motalität (PR) versteht man Spermien, die sich aktiv vorwärtsbewegen. Diese Bewegung kann linear oder im großen Bogen stattfinden, wobei die Geschwindigkeit nicht berücksichtigt wird. Zur nicht progressiven Motalität (NP) werden alle anderen Bewegungsmuster gezählt, wie zum Beispiel, nur Schwanzbeweglichkeit, oder Schwimmen in kleinen Kreisen. Immotilität (IM) bedeutet es wird keine Bewegung festgestellt. Die unteren Grenzwerte für Ejakulatparameter laut WHO lauten für die Gesamtmotilität (PR+NP) 40%, Progressiver Motilität (PR) bei 32%, ist der Befund schlechter, handelt es sich um eine Asthenozoospermie.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung einiger abnormaler Formen menschlicher Spermien.

Modifiziert nach Krueger et al. 1993, reproduziert mit Erlaubnis von MQ Medical

Spermien können unterschiedliche morphologische Strukturen aufweisen siehe Abb.3, welche die Befruchtung verhindern. Spermien können folgende Anomalien aufweisen; Kopfdeformationen (amorphe Form, akrosomale Hypoplasie, Globozoospermie, Vakuolen). Abweichungen von der Norm (14-15 mitochondriale Gyri) des Mittelstücks, mehr als eine Geißel (primäre ziliare Dyskinesie, Dysplasie).

Aber auch die Größenverhältnisse der drei Abschnitte (Kopf-Mittelstück-Geißel) zueinander spielen eine wichtige Rolle. Laut WHO darf der Prozentsatz an Spermien

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mit normaler Morphologie nicht unter 4% liegen, da sonst eine Teratozoospermie vorliegt.

Weiters kann die Spermienvitalität gemessen werden, das ermöglicht die Identifikation von Zellen mit einer intakten Zellmembran (Grenzwert vitaler Zellen hier 58%). Dies wird durch Vitalfärbungen oder durch einen hypoosmotischen Schwelltest (HOS) durchgeführt. Die Färbung wird mittels Eosin-Nigrosin durchgeführt und es werden ausschließlich tote Spermien gefärbt, da der Farbstoffe aufgrund fehlender Membranfunktion in diese eindringen kann. Hingegen schwellen intakte Zellen beim HOS in einer hypoosmotischen Lösung an. Nach 5 Minuten schwellen die Spermienmembran bereits an und nach 30 Minuten sind alle Flagellumformen stabilisiert, werden als vital diagnostiziert und können nach Rückführung in eine isoosmotische Lösung weiterverwendet werden.

Der physiologische Ansatzpunkt bei den Methoden achtet darauf ob die Spermien die Akrosomreaktion ausführen können. Hingegen der morphologische Ansatz fokussiert sich auf erkennbare Anomalien. IMSI (Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) oder pICSI Technik (physiological intracytoplasmic sperm injection).

Wenn die oben genannten Ansatzpunkte fehlgeschlagen sind, aufgrund von zu schlechten, zu wenigen oder sogar gar keiner Spermien, dann folgen operative Methoden. Diese einschneidenden Methoden werden genutzt, da Spermien produziert werden aber nicht auf natürlichem Weg nach außen gelangen können. Bei der testikulären Spermienextraktion (TESE) entnimmt man die Spermien aus dem Hoden, hingegen bei der mikrochirurgischen epididymalen Spermienaspiration (MESA) aus den Epididymis/Nebenhoden.

PESA (perkutane epididymale Spermienaspiration) wird angewandt beim Verschluss der ableitenden Samenwege, wodurch keine Samenzellen im Ejakulat vorhanden sind. Samenzellen werden mit Hilfe einer Punktion aus dem Nebenhoden entnommen und für die ICSI bereitgestellt.

Weitere Gründe für eine Infertilität können eine erektile Dysfunktion, Ejakulationsstörungen (verzögerte oder ausbleibende Ejakulation, schmerzhafte Ejakulation, retrograde Ejakulation) Verschluss des Ductus ejaculatorius, Infektionen, Hormonstörungen (Testosteronmangel) sein. Andere Probleme können zystische Fibrose sein, welches sich mitunter durch einen bilateralen Verschluss der

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Samenleiter auszeichnet, Erbkrankheit (Klinefelter Syndrom, y-Chromosom Mikrodeletion), Tumore und immunologische Unfruchtbarkeit nachweisbar durch Antikörper. Immunologische Unfruchtbarkeit durch Antikörper bedeutet, dass sie auf Samenzellen reagieren, als wären sie fremde Zellen. Der Grund dafür ist ungeklärt.

Aber es tritt häufig nach einer Vasektomie auf mit einer anschließenden Refertilisierungsoperation.

Auch Hodenhochstand, genetische Ursachen, Varikozele, also Krampfadern am Hoden, Hodenverletzungen, Rauchen, Stress, Alkohol, intensive Hitze (Sauna), können zu Schwierigkeiten führen.³² ³³³⁴^{35 36}

33 Vgl. WHO (2010)

34 Vgl. Ebner (2018)

35 Vgl. Ebner (2019)

36 Vgl. https://www.porst-hamburg.de/spezielle-andrologie/stoerungen-der- ejakulation.html

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4. Kontrollierte ovarielle Hyperstimulation:

Durch das Zusammenspiel der abgegebenen Hormone von Hypothalamus und Hypophyse mit dem Ovar (Zwischenhirn-Hirnanhangsdrüse-Eierstock-Achse) wird der Menstruationszyklus geprägt.

Der Hypothalamus ist ein Teil des Diencephalons (Zwischenhirn) und steuert die vegetativen Körperfunktionen. Darunterfallen nicht nur Atmung, Nahrungsaufnahme, Kreislauf sondern auch das Sexualverhalten. Das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) des Hypothalamus wirkt direkt auf die Hypophyse welche wiederum ihrerseits luteinisierendes Hormon (LH) und follikelstimulierendes Hormon (FSH) absondert. Diese beiden Hormone bedingen im Ovar, dass aus Androgene Östrogene werden und Progesteron (Gestagene) Östrogene sezerniert werden.

Der Ovulationszyklus wird in Follikelphase, Ovulation und Lutelaphase unterteilt. In der ersten Phase des Ovarialzykluses führt die erhöhte Ausschüttung von FSH zum Wachstum der Kohortenfollikel, die ihrerseits Östrogen sezernieren. Des Weiteren führt es zur Reifung des dominanten Follikels, was in den anderen Follikeln atretisch werdende Oozyten zur Folge hat. Diese nicht dominanten Follikel werden umgewandelt zu Bindegewebe. Diese Veränderung wird durch den Anstieg von Östrogen und das Absinken der FSH Konzentration herbeigeführt.

Diese Situation führt zu einem Anstieg der LH Ausschüttung in der späten Follikelphase bzw. Ovulation, was zum Eisprung führt. In der Lutealphase wird Progesteron via Corpus luteum (Gelbkörper) verstärkt produziert um eine mögliche Nidation (Einnistung) zu begünstigen durch Unterstützung des Aufbaues der Uterusschleimhaut. ³⁷

4.1 Stimulationsprotokolle:

Die hormonelle Behandlung beginnt mit einer Ultraschalluntersuchung der Eierstöcke und der Gebärmutter. Diese Begutachtung findet meistens am Beginn der Menstruationsblutung statt Tag 1, oder an Tag 2 oder 3. Hierbei wird der Zustand der

37 Vgl. Lüllmann-Rauch (2015): S. 548-552.

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Gebärmutter und die Anzahl der Antralfollikel (Eibläschen) evaluiert. Zysten können ausgeschlossen werden bevor eine Stimulation gestartet wird. Sofern keine Kontraindikation vorliegt, kann mit der Behandlung gestartet werden. Bei Patientinnen mit unregelmäßigen Zyklen, werden hormonelle Kontrazeptiva oder Gestagenpräparate zur kurzfristigen Einnahmen empfohlen.

Die Behandlung zielt auf das Wachstum mehrerer Follikel in den Ovarien und zu der Reifung der darin befindlichen Oozyten hin. In der Regel wird follikelstimulierendes Hormon (FSH) verabreicht. Diese Medikamente können als tägliche Injektion zugeführt werden, dies kann zuhause selbstständig vorgenommen werden, nachdem eine Einweisung durch medizinisches Personal erhalten wurde. Während der Stimulationssphase, kontrolliert der Arzt per Ultraschall oder auch durch Hormonuntersuchungen die Entwicklung. Um Problemen, wie ein vorzeitiger Eisprung, zu vermeiden, werden je nach Fall GnRH - Antagonist en bzw. - Agonisten (Gonadotropine-releasing-hormone) verabreicht. Diese Medikamentengabe kann im Falle des Agonisten via Injektion oder Nasenspray vorgenommen werden. Die Punktion/Eientnahme wird ambulant und transvaginal unter Ultraschallsicht durchgeführt und dauert nur wenige Minuten. Dies kann unter Vollnarkose oder leichter Sedierung vonstattengehen.

Wie weiter oben angedeutet kann die Stimulation entweder mit Hilfe eines langen oder kurzen Agonisten Protokoll oder einem kurzen Antagonisten Protokoll durchgeführt werden.

Das lange Stimulationsprotokoll, beginnt in der mittleren Lutealphase, am Tag 21 des vorhergegangenen Zyklus. Auf der anderen Seite das kurze Agonisten- Protokoll startet mit dem ersten Zyklus Tag.

Der GnRH – Agonist wird subkutan injiziert, entweder als tägliche Einzeldosis oder als Depot. Der Agonist verhindert vorübergehend die Ausschüttung von LH und FSH, welche für die Eizellreifung und Hormonproduktion in der Eizelle zuständig sind. Im Zeitraum von Tag 1 bis Tag 3 beginnt FSH und/oder LH Gabe statt.

Die regelmäßige Ultraschallkontrolle soll Aufschluss geben über das Wachstum der Follikel. Max. 14 Tage dauert die reine Stimulation (FSH-Gabe) in der Regel. Die Ovulationsauslösung findet bei einem Follikeldurchmesser von 17-20 mm durch die

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Gabe von hCG (humanes Choriongonadotropin) statt. Die Follikelpunktion findet dann weitere 34-36 Stunden nach der hCG Gabe statt. Der Vorteil dieser Stimulation liegt in der besseren Steuerbarkeit, Synchronisation des Follikelwachstums und somit besseren Eizellreife- und -qualität.

Das kurze Antagonisten - Protokoll findet mit der Injektion von FSH und LH zwischen Tag 1 und Tag 3 statt. Die Gabe der Gonadotropine (FSH und LH) hängt einerseits von der Menge (ng/ml) des Anti-Müller-Hormon (AMH) und dem Körpergewicht der Patientin ab. In manchen Fällen wird die Einnahme von Östradiol empfohlen noch vor dem Beginn, um eine bessere Synchronisation des Follikelwachstums zu erhalten.

Während der Stimulationszeit werden 2-3 Ultraschallkontrollen durchgeführt, um die Entwicklung der Follikel zu beobachten. Der Antagonist wird ab dem Tag 5-7 eingesetzt, sofern ein Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 12-13 mm vorgefunden wird. Diese soll den vorzeitigen Eisprung größerer Follikel verhindern und dadurch erhalten kleinere Follikel mehr Zeit, um zu reifen. Am Tag 9 oder 10 findet eine erneute Kontrolle statt. Wenn mindestens 3 Follikel mit mehr als 17,5 mm Durchmesser vorhanden sind, findet die Ovulationsinduktion statt. Die Ovulation wird auch hier mit einer Gabe von 10 000 I.E. hCG ausgelöst.

Das kurze Protokoll wird nicht verwendet, sofern eine PCO - Syndrom vorliegt oder die Frau zu einer Überstimulation neigt (OHSS). ^{38 39 40}

38 Vgl. https://vivaneo-ivf.com/de/ablauf-kosten/therapie-ablauf/

39 Vgl. http://drkatharinaspieskinderwunsch-expertin.com/kinderwunschbehandlung- im-ausland/ivf-kurzes-oder-langes-protokoll/

40 Vgl. https://www.icsi.de/kinderwunsch-leistungen/fachliches/ovarielle-stimmulation/

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5. Gametenreifung:

5.1 Oogenese:

Die Oogonien durchlaufen in der embryonalen Gonadenanlage eine Phase der mitotischen Vermehrung. In der frühen Fetalzeit folgt eine Differenzierung zu primären Oozyten (Oozyte I) und der Start in die Meiose I. Jedoch wird diese 1.

Reifeteilung in der Prophase I im Diktyotän arretiert. Somit befindet sich die Eizelle im Ruhemodus. Dieses Stadium findet man in Primordialfollikeln. Diese sind umgeben von einer Lage aus flachen Follikelepithelzellen, sogenannten Granulosazellen). Nicht alle Oozyten überdauern diese Phase.

Mit Eintreten der Pubertät folgt eine Entwicklung von 15-20 Primordialfollikel in Primär-, Sekundär- und Tertiärfollikel mit jedem Ovarialzyklus. Jedoch reift nur ein Follikel bis zur Ovulation heran. Kurz vor der Ovulation beendet die Oozyte die Meiose I und schnürt ein Polkörperchen ab.

Nur bei erfolgter Befruchtung wird das zweite Polkörperchen ausgeschlossen womit die Meiose II abgeschlossen ist. Die Befruchtung erfolgt innerhalb von 6-12h und findet in vivo in der Ampulle des Eileiters statt. ⁴¹⁴²

41 Vgl. Sadler (2014): S.29-65

42 Vgl. Petek (2018)

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22 5.2 Spermatogenese:

Die Vermehrung der Spermatogonien (Keimzellen) erfolgt durch die Mitose, welche lebenslang durchgeführt wird. In der Pubertät entwickeln sich Samenkanälchen aus den Keimsträngen, in denen die Spermatogonien und somatische Sertoli-Zellen einen Verbund eingehen. Weiters setzt die differentielle mitotischen Vermehrung ein.

Es entstehen fortlaufend primäre Spermatozyten (Spermatozyt I), aus denen in der Meiose I zwei sekundäre Spermatozyten (Spermatozyten II) hervorgehen. In weiterer Folge entstehen daraus in der Meiose II 4 Spermatiden. In der Samenzellreifung (Spermiohistogenese) differenzieren sich die Spermatiden zu Spermien. Die Entwicklung von der Spermatogonie bis zum Spermium dauert beim Menschen ca.

74 Tage. ⁴³⁴⁴

43 Vgl. Sadler (2014): S.29-65

44 Vgl. Petek (2018)

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6. Methoden:

In der assistierten Reproduktionsmedizin gibt es neben der Insemination zwei weitere Möglichkeiten zur Befruchtung, in-vitro-Fertilisation (IVF) und intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI). Die Wahl der Methode ist abhängig von der Samenqualität des Mannes. Zum Beispiel, die Samenqualität des Partners ist so niedrig, dass mittels IVF keine Befruchtung eintreten würde, so würde die Entscheidung auf ICSI fallen.

6.1 Intrauterine Insemination (IUI):

Intrauterine Insemination wurde schon vor über 200 Jahren beschrieben. Hier wurden Patienten mit Hypospadie beschrieben sowie die heterologe Insemination.

Heutzutage findet eine IUI mit Spendersamen nur statt, sofern eine Azoospermie vorliegt oder durch eine Hodenbiopsie (TESE) keine Samen gefunden werden.⁴⁵ Wenn Antikörper gegen Spermien oder auch eine Zervikalschleiminsuffizenz vorliegt wird diese Technik ebenfalls genutzt. ⁴⁶

Eine Insemination dauert 10 Minuten, hierbei werden die Samen nach Aufbereitung mittels eines Katheters direkt in die Gebärmutterhöhle eingebracht. Dadurch gelangen die Spermien näher an die geplante Befruchtungsstelle. ⁴⁷

6.2 In-vitro-Fertilisation (IVF):

Unter dem Begriff in-vitro-Fertilisation versteht man die Befruchtung der Eizelle außerhalb des Körpers, jedoch unter möglichst nahen in-vivo Bedingungen. Die Eizellen werden mittels Follikelpunktion entnommen und mitsamt ihrem Cumulus Komplex, von dem sie umgeben sind, in ein Kulturschälchen überführt. Nach einer Wartezeit von ungefähr zwei Stunden wird pro Cumulus-Eizell-Komplex (COC) eine festgelegte Anzahl an aufbereiteten Spermien hinzugefügt. Die Inkubationsdauer

45 Vgl. http://www.Kinderwunschzentrum.org/dortmund/leistungen /donogene-insemination

47 Vgl. Diedrich/Ludwig/Griesinger (2013): S.13.

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variiert von Labor zu Labor sehr stark. Einige Labore denudieren nach zwei Stunden andere bevorzugen eine Inkubation über Nacht um erst danach zu denudieren. Nach der Denudation folgt die Kontrolle der beiden Vorkerne der Befruchtung.

In-vitro-Fertilisation wird durchgeführt mit dem Nachweis einer guten Samenqualität.⁴⁸ Aber auch in Kombination eines Tubenverschlusses oder anderen anatomischen Fehlbildungen bei der Frau. In seltenen Fällen (5-10%) kommt es zu einem totalen Fertilisationsversagen (TFF). In diesem Fall wäre im nächsten Zyklus eine ICSI-Behandlung anzustreben. ⁴⁹

Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI):

Intrazytoplasmatische Spermieninjektion ist eine Technik, die für Paare gedacht ist, welche mit einer schweren Form der Unfruchtbarkeit des Mannes zu kämpfen haben.

Diese Mikroinjektionstechnik ist komplett standardisiert. Nach der erfolgreichen Punktion folgt die Denudation der Eizelle. Hierbei werden die somatischen Zellen entfernt zuerst enzymatisch und dann mechanisch. Das Entfernen soll verhindern, das DNA dieser Zellen irrtümlich in die Eizelle gelangen und somit die Beurteilung des Reifestatus der Eizelle beeinflusst wird.

Die Spermienselektion ist ein weiterer wichtiger Schritt für eine erfolgreiche ICSI.

Hierbei sollte nach der Samenaufbereitung besonderes Augenmerk auf die Morphologie der einzelnen für die Injektion ausgewählten Samenzellen gelegt werden. Anschließend werden die Samenzellen immobilisiert, in die Pipette aufgesogen und in die Eizelle abgegeben. Dabei ist zu beachten, dass der 1.Polkörper sich auf der sechs oder zwölf Uhr Position befindet (er markiert die Position der Spindel im Ei) und bei drei Uhr eingestochen wird. ⁵⁰

Gründe für die Durchführung von ICSI sind schlechte Spermienqualität, TFF, genetische Faktoren, wobei die teilweise mit Hilfe von Polkörperchen-, Blastomer- oder Trophoektoderm -Biopsien abgeklärt werden können.

48 Vgl. WHO (2010)

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Es kristallisieren sich also bei einer ICSI mehrere verschiedene für die in vivo bzw. in vitro Reifung wesentliche Ereignisse heraus, Ovulationsinduktion, Follikelpunktion, Denudation der COCs und eigentliches ICSI. Die Zeiträume zwischen diesen Events sind theoretisch für Erfolg und Misserfolg einer ICSI ausschlaggebend. Einerseits kann eine Verkürzung dieser Zeiten zu einer vermehrten Unreife der Gameten führen, andererseits könnte jede Verzögerung zu einer Überreife dieser führen.

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7. Eizell- und Embryoqualität:

7.1 Beurteilung der Eizelle an Tag 0:

Bei der Punktion wird die gesamte Eizelle inklusive der umgebenden Kumuluszellen entnommen, das alles betitelt man als Kumulus-Eizell-Komplex (COC, Cumulus- Oocyte-Complex). Bei überreifen Eizellen können die Kumuluszellen nur spärlich vorhanden oder sehr schwierig zu finden sein. Hingegen bei unreifen Oozyten kann der COC sehr dunkel erscheinen. Das deutet auf sehr dicht gepackte Kumuluszellen hin.

Die unreife Eizelle, welche sich in der Prophase I befindet, zeichnet sich durch das Vorhandensein eines Germinalvesikels (GV, Zellkern) aus. und ist charakterisiert durch dicht gepackte Kumuluszellen und einem großen Nucleolus im GV aus.⁵¹

In der MI Phase ist die Eizelle von dicht anliegenden Corona- und Kumuluszellen umgeben und scheint keinen Polkörper zu haben. Der Germinalvesikel wird in diesem Entwicklungsstadium abgebaut. Auch in diesem Stadium sollte nicht versucht werden die Oozyte zu befruchten. In der Regel folgt eine Nachreifung in vitro innerhalb von 6-24 Stunden. ⁵²

Als Metaphase II (MII) wird eine normal reife Oozyte bezeichnet. Eine solche Gamete zeigt folgende Merkmale auf: ein erster Polkörper, Ooplasma, gut erkennbarer perivitelliner Spalt, runde Form, gleichmäßige dicke und helle Zona pellucida, einen Durchmesser von ca. 110 Mikrometer (ohne Zona), homogenes Zytoplasma, frei von Einschlüssen (Vakuolen) ⁵³ ⁵⁴. Zum Beispiel Vakuolen können zu Problemen in der Teilung führen und im weiteren Verlauf die Blastozystenrate negativ beeinflussen.⁵⁵

Weiters kann mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie der „Spindelzustand“ festgestellt werden. Sofern der erste Polkörper nicht mehr über die Spindel mit der Eizelle in

51 Vgl. Elder/Dale/Ménézo et al. (2011): S.158.

52 Vgl. Elder/Dale/Ménézo et al. (2011): S.160.

53 Vgl. Rienzi/Balaban/Ebner et al. (2012): S.i2-21.

54 Vgl. Beyer/Diedrich (2013): S. 226.

55 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011)

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Verbindung steht, spricht man von reif., Besteht diese Verbindung noch, spricht man von Telophase I, also einem Stadium, das für die ICSI noch nicht geeignet ist. ⁵⁶

7.2 Beurteilung der Zygote (Tag 1):

Zygoten entstehen durch die Penetration der Samenzelle gefolgt von der Samenzell- Eizell-Fusion und der Eizellaktivierung. Daran angeschlossen bilden sich der männliche und der weibliche Vorkern, welche die Nukleoli enthalten. Nach erfolgter Befruchtung wird die Meiose II abgeschlossen und der zweite Polkörper kommt zum Vorschein.

Die morphologische Beurteilung der Zygote erfolgt 16-18 Stunden nach der Befruchtung.

Eine Zygote, weist folgende Merkmale auf; 2 (zwei) annähernd gleich große nebeneinanderliegende Vorkerne welche zentral lokalisiert sind, klar abgrenzte Membranen der Vorkerne, 5-7 etwa gleich große Nucleoli je Vorkern, 2 Polkörper, Halo (=äußerer Bereich im Ooplasma der Zygote, welcher keine Granula enthält) und homogenes Zytoplasma. Nach der erfolgten Penetration der Samenzelle wandern die beiden entstandenen Vorkerne zueinander. In diesem Zeitraum verdoppeln diese ihre DNA, verschmelzen anschließend miteinander indem ihre Membranen sich auflösen.

Es kommt zum sogenannten „pronuclear membrane breakdown“ (auch „pronuclear fading“ genannt), welcher einige Stunden vor der ersten Teilung erfolgt.

Das Hauptaugenmerk bei der Beurteilung von Zygoten liegt jedoch bei der Anzahl an Vorkernen und bei der Anzahl an Polkörpern. Zusätzlich zur morphologischen Beurteilung der Zygote wird auch eine Beurteilung der Vorkerne eingesetzt.⁵⁷ Das am häufigsten angewendete Beurteilungsschema richtet sich nach dem von Scott et al (2000).⁵⁸ Dieses Schema wird in vier Gruppen unterteilt, wobei Z1 die ideale Formation der Vorkerne inklusive ihrer Pronuclei darstellt und Z4 die schlechteste.

Beurteilt wird in diesem Fall die Größe der Vorkerne, ihr Abstand zueinander, sowie die Anzahl, Größe und Verteilung der Pronuclei.

56 Vgl. Rienzi/Balaban/Ebner et al. (2012): S.i2-21.

57 Vgl. Papale/Fiorentino/Montag et al. (2012): S. I22-49.

58 Vgl. Scott/Alvero/Leondires et al. (2012): S.2394-2403.

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Abweichungen von der optimalen Konfiguration können Ausdruck von Chromosomenaberrationen (ICSI 80%, IVF 50%) sein, frühen Entwicklungs- und/oder Teilungsstopp kommen, aufgrund der nicht verbundenen 2 Pronuclei. ⁵⁹ Die Bildung der Vorkerne stellt einen überaus dynamischen Prozess dar, weshalb der Zeitpunkt der Beurteilung sehr kritisch ist und die Beurteilung selbst immer in Kombination mit anderen Methoden erfolgen sollte.

7.3 Embryonen an Tag 2-3, Teilungsstadium:

Die erste Teilung findet etwa 24-26 Stunden nach einer ICSI statt. Diese Teilung kann aber auch eher erfolgen, dann spricht man von einer frühen Teilung („early cleavage“). Es wird als guter Prädiktor angesehen, weil es mit einer erhöhten Implantationsrate korreliert. ⁶⁰ ⁶¹

Weitere Aspekte wie Fragmente, Multinukleation/Mehrkernbildung, Anzahl und Symmetrie der Blastomere sind zu beachten, aufgrund ihrer Beeinflussung der Entwicklung.

Fragmente werden als kernlose, extrazelluläre zytoplasmatische, membrangebundene Strukturen bezeichnet. ⁶² Johansson et al. (2003) haben Fragmente so definiert, dass sie am Tag 2 lediglich einen Durchmesser von <45 μm und am Tag 3 einen Durchmesser von <40μm aufweisen.⁶³ Mithilfe dieser Einteilung soll verhindert werden Fragmente mit Blastomeren zu verwechseln. Bei der weiteren Beschreibung wird der prozentuelle Anteil von ihnen auf die Größe der Blastomere bezogen. Das ergibt eine leichte Form der Fragmentierung bei <10%, bei 10-25%

von einer moderaten Form und bei >25% von einer schweren Form.

Embryonen im 2-, 4- und 8-Zellstadium müssen gleich große Blastomere beinhalten.

In allen anderen Zellstadien sind unterschiedlich große Blastomere zu erwarten.

Auch diese Beobachtung werden sorgfältig dokumentiert und helfen anschließend

59 Vgl Ebner (2018)

60 Vgl. Beyer/Diedrich (2013): S. 227

61 Vgl. Elder/Dale/Ménézo et al. (2011): S.170

62 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S. 637.

63 Vgl. Johansson/Hardarson/Lundin (2003): S.309-313.

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bei der Auswahl des kompetentesten Embryos. Da eine ungleiche Symmetrie der Blastomere auf Probleme hinweisen kann. Damit ist gemeint, dass in jedem Teilungsstadium eine bestimmte Anzahl an Blastomere erwartet wird. Wenn dies nicht der Fall ist, kann es auf ein zu schnelles oder zu langsames Teilen hinweisen oder aber auch auf metabolische bzw. chromosomale Defekte.⁶⁴⁶⁵

Sobald in einer Blastomere mehr als ein Interphase-Kern vorhanden ist, spricht man von einer Multinukleation. Das Auftreten so einer Abnormalität wird dokumentiert und weiter beobachtet. Gründe für so eine Entwicklung werden neben einer fehlerhaften Anaphase, unvollständige Chromosomen-Migration, suboptimale Temperaturbedingungen, Kulturmedien aber auch Karyokinese mit ausbleibender Zytokinese genannt/aufgelistet.⁶⁶

Zusätzlich zu den bereits genannten morphologischen Erscheinungen eines Embryos, können noch die zytoplasmatische Granularität und Vakuolen in die Bewertung mit einfließen. ⁶⁷

7.4 Beurteilung von Embryonen im Morula Stadium (Tag 4):

Bei der Beurteilung der Embryonen an Tag 4 bzw. 92 ± 2h nach Befruchtung werden Embryonen erwartet, welche aufgrund der Aktivierung des embryonalen Genoms entweder bereits am Kompaktieren oder zur Gänze kompaktiert sind. Der Embryo sollte die vierte Teilungsrunde abgeschlossen haben und kurz vor Beginn der Kompaktierung aus 8-16 Zellen bestehen. Ziel ist es alle Blastomere miteinander zu verbinden. Werden mehr als die Hälfte der Blastomere von dieser Kompaktierung ausgeschlossen, so geht dies mit einer schlechten Prognose einher. Gleich wie beim

64 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S.641.

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Beurteilungsschema der „cleavage-stage“ Embryonen besteht auch dieses Schema aus drei Klassen, in welche die Embryonen eingeteilt werden.

Klasse I Embryonen befinden sich in der vierten Teilungsrunde und es sind alle Blastomere, soweit visuell erkennbar, in die Kompaktierung involviert.

Klasse II Embryonen befinden sich ebenfalls in der vierten Teilungsrunde und der Großteil der Blastomere kompaktieren.

Bei Klasse III Embryonen, verläuft die Kompaktierung nicht zufriedenstellend.

Lediglich etwa die Hälfte der Blastomere ist involviert, während einzelne Blastomere übrigbleiben.⁶⁸ ⁶⁹

7.5 Blastozysten- Stadium (Tag 5):

Hierbei werden Trophektodermzellen (TE) und die innere Zellmasse (ICM) begutachtet. TE sind notwendig, um in die Gebärmutterschleimhaut einzudringen und daraus entsteht in weiterer Entwicklung die Plazenta. Hingegen entsteht aus ICM der eigentliche Fetus.

Sobald das Kompaktieren abgeschlossen ist, entwickelt sich eine Blastozyste, was sich in einer Kavitierung des Embryos widerspiegelt. Während dieses Prozesses erweitert sich diese als Blastocoel bezeichnete Kavität. Durch die weitere Expandierung der Blastozyste, beginnen sich TE und ICM zu differenzieren.

Folgende Merkmale sind für ein Blastozyste prognostisch gut; eine stark ausgedünnte Zona pellucida, ein kohäsives Epithel aus vielen TE-Zellen, eine große ICM, welche aus vielen dicht gepackten Zellen besteht. Das Endresultat dieses Stadiums ist das Schlüpfen des Embryos aus der Zona pellucida. ⁷⁰⁷¹

68 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting 2011, S.642

69 Vgl. Prados/Debrock/Lemmen et al. (2012): S.i50-71.

70 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting 2011, S.642

71 Vgl Hardarson/van Landuyt/Jones (2012)

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8. Embryokultur und -transfer:

Die Verwendung desrichtigen Kulturmediums ist essenziell für den Erfolg der Entwicklung des Embryos in vitro, welches zu einer besseren Schwangerschafts- und Implantationsrate führen kann. ⁷² ⁷³ ⁷⁴ Daher sind die von der Zygote bis hin zur Blastozyste unterschiedlichen physiologischen und metabolischen Anforderungen, in vitro bereit zu stellen. ⁷⁵ ⁷⁶⁷⁷⁷⁸

Es gibt globale und sequenzielle Medien auf dem Markt. Je nach Labor werden eine Kombination aus zwei (sequenziell) oder nur einem Medium (global, universell) verwendet. Diese zwei Kulturmedienarten unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung (Mikronährstoffen, Glukose und andere Substrate, wie EDTA).

Das globale unterscheidet sich vom sequenziellen Medium vor allem durch Verwendung von essenziellen und nicht-essenziellen Aminosäuren, wohin das sequenzielle aus non essenziellen Aminosäuren besteht. ⁷⁹⁸⁰

Das globale Medium stellt alle Nährstoffe sofort bereit, welche die befruchtete Eizelle im Laufe ihrer Entwicklung benötigt. Hingegen die sequenzielle Kultur wird anhand der veränderten Bedingungen zwischen Eileiter und Uterus ausgetauscht, damit die Anforderungen pro Entwicklungsstadium erfüllt werden.

Die Meinungen welche Medien mehr nützen, ist im ständigen Diskurs sowie die unterschiedliche Zusammensetzung mit Kohlenhydraten, Albumin, Aminosäuren, Proteine oder/und EDTA. ⁸¹ ⁸² ⁸³ ⁸⁴ ⁸⁵ ⁸⁶ Gardner und Lane (1998) beschrieben

72 Vgl. Bungum/Humaidan/Bungum (2002): S.56-57.

73 Vgl. Cooke/Quinn/Kime et al. (2002): S.1254-1260.

74 Vgl. Friedler/Schachter/Strassburger et al. (2007): S.2444-2448.

75 Vgl. Gardner/Lane (1998): S.148-159.

76 Vgl. Pool (2002): S.294-302.

77 Vgl. Pool (2005): S.309-318.

78 Vgl. Behr/Wang (2004): S. 72-76.

79 Vgl. Lane/Gardner (2007): S.83-100.

80 Vgl. Biggers/Summers (2008): S.473-483.

81 Vgl. Gardner (1994): S.

82 Vgl. Barnes/Crombie/Gardner et al. (1995): S. 3243-3247.

83 Vgl. Gardner/Lane (1997): S. 367-382.

84 Vgl. Eagle (1959): S. 432-437.

85 Vgl. Hardy/Hooper/Handyside et al. (1989): S. 188-191.

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weiters, dass Kohlenhydrate und Aminosäuren die Schlüssel-Nährstoffe für die Entwicklung sind und daher auch in den Medien Zusammensetzung eine große Rolle spielen.

Mitunter erfolgt der intrauterine Embryotransfer am Tag 2 oder 3. Aber es gibt Untersuchungen, welche empfehlen, den Transfer in Richtung Tag 5 (Blastozyststadium) zu verschieben. Der Grund liegt darin, dass bei einer natürlichen Schwangerschaft an Tag 2 bzw. Tag 3 der Embryo sich noch im Eileiter befindet.

Aufgrund dessen liegt es nahe, dass die befruchtete Eizelle zu diesem Zeitpunkt noch nicht so weit entwickelt ist, um eine erfolgreiche Einnistung zu gewähren.

Studien zeigten eine Implantationsrate von 10-15% an, welche bei anderen Mammalia noch weiter sank. ⁸⁷ ⁸⁸

Der Transfer wird mit Hilfe eines dünnen, weichen und biegsamen Katheters durchgeführt. Die Übertragung des Embryos durch die Scheide in den Uterus ist im Allgemeinen eine schmerzfreie Prozedur. ⁸⁹

88 Vgl. Bavister (1995): S. 91-148.

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9. Qualität der Gameten:

Die Spermienqualität wird nach den Richtlinien der WHO (2010) eingeteilt.

Spermienanzahl wird anhand einer Zählkammer ermöglicht. Mit diesem Hilfsmittel können Konzentration, Motilität und morphologische Charakteristika erkannt werden und dadurch ein Assessment getroffen werden. Das Resultat weist auf die zu verwendende Technik (IUI, IVF; ICSI) hin.

Die vollständige Entwicklung des Oozyts besteht aus zwei Teilen, der nukleären und der zytoplasmatischen Reifung. ⁹⁰ Die nukleäre Reifung bezieht sich –wie weiter oben beschrieben - auf die Entwicklung von Meiose bis hin zur Metaphase der zweiten meiotischen Teilung. Dies wird ersichtlich durch die Abgabe des ersten Polkörpers und des Fehlens des Germinalvesikels (GV). Auf der anderen Seite beinhaltet die zytoplasmatische Reifung die Umstrukturierung der intrazellulären Organellen. Bis zum heutigen Tag ist es unmöglich diesen Schritt verlässlich und nicht invasiv festzustellen. ⁹¹

9.1 Aneuploidie:

Aneuploidie betrifft u.a. die numerische Veränderung eines einzelnen Chromosoms.

Es ist relativ wenig bekannt über die Entstehungsmechanismen von Tri- und Monosomien (Aneuploidie), obwohl sie häufig auftreten. Aneuploidie ist der häufigste Grund für Schwangerschaftsverlust. ⁹²⁹³⁹⁴

Diesbezüglich haben sich schon viele Forschungsgruppen damit auseinandergesetzt, wie man diese chromosomale Abnormalität frühzeitig erkennen kann. Der Cumulus-Oozyte-Komplex (COC) und die Eizellmorphologie sind schlechte Marker, um diese Chromosomenaberrationen zu erkennen. ⁹⁵ ⁹⁶ ⁹⁷ Daher haben

90 Vgl. Eppig/ et al. (1994): S. 1-9.

91 Vgl. Gosden/Lee (2010): S. 973-983.

92 Vgl. Hassold/Hunt (2001): S. 280-291.

93 Vgl. Munné/Márquez/Reing et al. (1998): S. 904-908.

94 Vgl. Champion/Hawley (2002): S. 50-56.

95 Vgl. De Sutter/Dozortsev/Qian et al. (1996): S. 595-597.

96 Vgl. Rattanachaiyanont/Leader/Léveillé et al. (1999): S. 937-940.

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Munné et al (1998) mit FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) gearbeitet, um Aneuploidie zu erkennen. Seine Arbeitsgruppe sowie andere auch nehmen an, dass ein Defekt bei der meiotischen Spindelbildung mit ein Grund sein kann. ⁹⁸ ⁹⁹¹⁰⁰ ¹⁰¹¹⁰²

103 Wang et al (2001a, b, c) haben mit einem polarisierten Lichtmikroskop (CRI, Cambridge, MA, USA) gearbeitet, um eine nicht invasive Visualisierung der meiotischen Spindel zu ermöglichen und dadurch eine bessere Evaluierung der Situation zu gewähren. Cohen et al (2004) haben einen anderen Weg getestet, indem nicht voll ausgebildete Spindeln von Eizellen nicht transferiert wurden.

Der Alterungsprozess der Eizelle kann zu Spindel Instabilität, Verlust oder Zerstreuung der Chromosomen führen. .¹⁰⁴ ¹⁰⁵¹⁰⁶¹⁰⁷¹⁰⁸¹⁰⁹¹¹⁰¹¹¹ ¹¹²

Zahlreiche Untersuchungen haben sich mit der optimalen Eizellreifung und des möglichen Einflusses einer Inkubationszeit pre-Injektion beschäftigt. Dennoch sind die Forscher noch im Unklaren bezüglich eines möglichen Benefits hinsichtlich der Fertilisations- oder der Schwangerschaftsrate. ¹¹³ ¹¹⁴ ¹¹⁵ ¹¹⁶ Daher werden weitere Studien unternommen.

97 Vgl. Champion/Hawley (2002): S.50-56.

98 Vgl. Pickering/Johnson/Braude et al. (1988): S. 978-989.

99 Vgl. Battaglia/Goodwin/Klein et al. (1996): S. 2217-2222.

100Vgl. Champion/Hawley (2002): S. 50-56.

101Vgl. Eichenlaub-Ritter/Shen/Tinneberg (2002): S. 117-124.

102Vgl. Eichenlaub-Ritter/Peschke (2002): S. 21-41.

103Vgl. Hassold/Hunt (2001): S. 280-291.

104Vgl. Cohen/Malcov/Schwartz et al. (2004): S. 649-654.

105Vgl. Dozortsev/Nagy/Abdelmassih et al. (2004): S. 1492-1496.

106Vgl. Falcone/Gambera/Pisoni et al. (2008): S. 295-299.

107Vgl. Pujol/García/Obradors et al. (2018): S. 797-806.)

108Vgl. Van Wissen/Bomsel-Helmreich/Debey et al. (1991): S. 879-884.

109Vgl. Martini/Flaherty/Swann et al. (1997): S. 2011-2018.

110Vgl. Bianchi/Coticchio/Fava et al. (2005): S. 1078-1083.

111Vgl. Nagy/Liu/Joris et al. (1994): S. 1743-1748.

112Vgl. Nagy/Janssenswillen/Jansens et al. (1998): S. 1606-1612.

113Vgl. Van de Velde/De Vos/Joris et al. (1998): S. 3160-3164.

114Vgl. Yanagida/Yazawa/Katayose et al. (1998): S. 2223-2226.

115Vgl. Jacobs/Stolwijk/Wetzels (2001): S. 1708-1713.

116Vgl. Isiklar/Mercan/Balaban et al. (2004): S.683-686.