7.1 Beurteilung der Eizelle an Tag 0:
Bei der Punktion wird die gesamte Eizelle inklusive der umgebenden Kumuluszellen entnommen, das alles betitelt man als Kumulus-Eizell-Komplex (COC, Cumulus-Oocyte-Complex). Bei überreifen Eizellen können die Kumuluszellen nur spärlich vorhanden oder sehr schwierig zu finden sein. Hingegen bei unreifen Oozyten kann der COC sehr dunkel erscheinen. Das deutet auf sehr dicht gepackte Kumuluszellen hin.
Die unreife Eizelle, welche sich in der Prophase I befindet, zeichnet sich durch das Vorhandensein eines Germinalvesikels (GV, Zellkern) aus. und ist charakterisiert durch dicht gepackte Kumuluszellen und einem großen Nucleolus im GV aus.51
In der MI Phase ist die Eizelle von dicht anliegenden Corona- und Kumuluszellen umgeben und scheint keinen Polkörper zu haben. Der Germinalvesikel wird in diesem Entwicklungsstadium abgebaut. Auch in diesem Stadium sollte nicht versucht werden die Oozyte zu befruchten. In der Regel folgt eine Nachreifung in vitro innerhalb von 6-24 Stunden. 52
Als Metaphase II (MII) wird eine normal reife Oozyte bezeichnet. Eine solche Gamete zeigt folgende Merkmale auf: ein erster Polkörper, Ooplasma, gut erkennbarer perivitelliner Spalt, runde Form, gleichmäßige dicke und helle Zona pellucida, einen Durchmesser von ca. 110 Mikrometer (ohne Zona), homogenes Zytoplasma, frei von Einschlüssen (Vakuolen) 53 54. Zum Beispiel Vakuolen können zu Problemen in der Teilung führen und im weiteren Verlauf die Blastozystenrate negativ beeinflussen.55
Weiters kann mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie der „Spindelzustand“ festgestellt werden. Sofern der erste Polkörper nicht mehr über die Spindel mit der Eizelle in
51 Vgl. Elder/Dale/Ménézo et al. (2011): S.158.
52 Vgl. Elder/Dale/Ménézo et al. (2011): S.160.
53 Vgl. Rienzi/Balaban/Ebner et al. (2012): S.i2-21.
54 Vgl. Beyer/Diedrich (2013): S. 226.
55 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011)
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Verbindung steht, spricht man von reif., Besteht diese Verbindung noch, spricht man von Telophase I, also einem Stadium, das für die ICSI noch nicht geeignet ist. 56
7.2 Beurteilung der Zygote (Tag 1):
Zygoten entstehen durch die Penetration der Samenzelle gefolgt von der Samenzell-Eizell-Fusion und der Eizellaktivierung. Daran angeschlossen bilden sich der männliche und der weibliche Vorkern, welche die Nukleoli enthalten. Nach erfolgter Befruchtung wird die Meiose II abgeschlossen und der zweite Polkörper kommt zum Vorschein.
Die morphologische Beurteilung der Zygote erfolgt 16-18 Stunden nach der Befruchtung.
Eine Zygote, weist folgende Merkmale auf; 2 (zwei) annähernd gleich große nebeneinanderliegende Vorkerne welche zentral lokalisiert sind, klar abgrenzte Membranen der Vorkerne, 5-7 etwa gleich große Nucleoli je Vorkern, 2 Polkörper, Halo (=äußerer Bereich im Ooplasma der Zygote, welcher keine Granula enthält) und homogenes Zytoplasma. Nach der erfolgten Penetration der Samenzelle wandern die beiden entstandenen Vorkerne zueinander. In diesem Zeitraum verdoppeln diese ihre DNA, verschmelzen anschließend miteinander indem ihre Membranen sich auflösen.
Es kommt zum sogenannten „pronuclear membrane breakdown“ (auch „pronuclear fading“ genannt), welcher einige Stunden vor der ersten Teilung erfolgt.
Das Hauptaugenmerk bei der Beurteilung von Zygoten liegt jedoch bei der Anzahl an Vorkernen und bei der Anzahl an Polkörpern. Zusätzlich zur morphologischen Beurteilung der Zygote wird auch eine Beurteilung der Vorkerne eingesetzt.57 Das am häufigsten angewendete Beurteilungsschema richtet sich nach dem von Scott et al (2000).58 Dieses Schema wird in vier Gruppen unterteilt, wobei Z1 die ideale Formation der Vorkerne inklusive ihrer Pronuclei darstellt und Z4 die schlechteste.
Beurteilt wird in diesem Fall die Größe der Vorkerne, ihr Abstand zueinander, sowie die Anzahl, Größe und Verteilung der Pronuclei.
56 Vgl. Rienzi/Balaban/Ebner et al. (2012): S.i2-21.
57 Vgl. Papale/Fiorentino/Montag et al. (2012): S. I22-49.
58 Vgl. Scott/Alvero/Leondires et al. (2012): S.2394-2403.
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Abweichungen von der optimalen Konfiguration können Ausdruck von Chromosomenaberrationen (ICSI 80%, IVF 50%) sein, frühen Entwicklungs- und/oder Teilungsstopp kommen, aufgrund der nicht verbundenen 2 Pronuclei. 59 Die Bildung der Vorkerne stellt einen überaus dynamischen Prozess dar, weshalb der Zeitpunkt der Beurteilung sehr kritisch ist und die Beurteilung selbst immer in Kombination mit anderen Methoden erfolgen sollte.
7.3 Embryonen an Tag 2-3, Teilungsstadium:
Die erste Teilung findet etwa 24-26 Stunden nach einer ICSI statt. Diese Teilung kann aber auch eher erfolgen, dann spricht man von einer frühen Teilung („early cleavage“). Es wird als guter Prädiktor angesehen, weil es mit einer erhöhten Implantationsrate korreliert. 60 61
Weitere Aspekte wie Fragmente, Multinukleation/Mehrkernbildung, Anzahl und Symmetrie der Blastomere sind zu beachten, aufgrund ihrer Beeinflussung der Entwicklung.
Fragmente werden als kernlose, extrazelluläre zytoplasmatische, membrangebundene Strukturen bezeichnet. 62 Johansson et al. (2003) haben Fragmente so definiert, dass sie am Tag 2 lediglich einen Durchmesser von <45 μm und am Tag 3 einen Durchmesser von <40μm aufweisen.63 Mithilfe dieser Einteilung soll verhindert werden Fragmente mit Blastomeren zu verwechseln. Bei der weiteren Beschreibung wird der prozentuelle Anteil von ihnen auf die Größe der Blastomere bezogen. Das ergibt eine leichte Form der Fragmentierung bei <10%, bei 10-25%
von einer moderaten Form und bei >25% von einer schweren Form.
Embryonen im 2-, 4- und 8-Zellstadium müssen gleich große Blastomere beinhalten.
In allen anderen Zellstadien sind unterschiedlich große Blastomere zu erwarten.
Auch diese Beobachtung werden sorgfältig dokumentiert und helfen anschließend
59 Vgl Ebner (2018)
60 Vgl. Beyer/Diedrich (2013): S. 227
61 Vgl. Elder/Dale/Ménézo et al. (2011): S.170
62 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S. 637.
63 Vgl. Johansson/Hardarson/Lundin (2003): S.309-313.
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bei der Auswahl des kompetentesten Embryos. Da eine ungleiche Symmetrie der Blastomere auf Probleme hinweisen kann. Damit ist gemeint, dass in jedem Teilungsstadium eine bestimmte Anzahl an Blastomere erwartet wird. Wenn dies nicht der Fall ist, kann es auf ein zu schnelles oder zu langsames Teilen hinweisen oder aber auch auf metabolische bzw. chromosomale Defekte.6465
Sobald in einer Blastomere mehr als ein Interphase-Kern vorhanden ist, spricht man von einer Multinukleation. Das Auftreten so einer Abnormalität wird dokumentiert und weiter beobachtet. Gründe für so eine Entwicklung werden neben einer fehlerhaften Anaphase, unvollständige Chromosomen-Migration, suboptimale Temperaturbedingungen, Kulturmedien aber auch Karyokinese mit ausbleibender Zytokinese genannt/aufgelistet.66
Zusätzlich zu den bereits genannten morphologischen Erscheinungen eines Embryos, können noch die zytoplasmatische Granularität und Vakuolen in die Bewertung mit einfließen. 67
7.4 Beurteilung von Embryonen im Morula Stadium (Tag 4):
Bei der Beurteilung der Embryonen an Tag 4 bzw. 92 ± 2h nach Befruchtung werden Embryonen erwartet, welche aufgrund der Aktivierung des embryonalen Genoms entweder bereits am Kompaktieren oder zur Gänze kompaktiert sind. Der Embryo sollte die vierte Teilungsrunde abgeschlossen haben und kurz vor Beginn der Kompaktierung aus 8-16 Zellen bestehen. Ziel ist es alle Blastomere miteinander zu verbinden. Werden mehr als die Hälfte der Blastomere von dieser Kompaktierung ausgeschlossen, so geht dies mit einer schlechten Prognose einher. Gleich wie beim
64 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S.641.
65 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S.638.
66 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S.637.
67 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting (2011): S.642.
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Beurteilungsschema der „cleavage-stage“ Embryonen besteht auch dieses Schema aus drei Klassen, in welche die Embryonen eingeteilt werden.
Klasse I Embryonen befinden sich in der vierten Teilungsrunde und es sind alle Blastomere, soweit visuell erkennbar, in die Kompaktierung involviert.
Klasse II Embryonen befinden sich ebenfalls in der vierten Teilungsrunde und der Großteil der Blastomere kompaktieren.
Bei Klasse III Embryonen, verläuft die Kompaktierung nicht zufriedenstellend.
Lediglich etwa die Hälfte der Blastomere ist involviert, während einzelne Blastomere übrigbleiben.68 69
7.5 Blastozysten- Stadium (Tag 5):
Hierbei werden Trophektodermzellen (TE) und die innere Zellmasse (ICM) begutachtet. TE sind notwendig, um in die Gebärmutterschleimhaut einzudringen und daraus entsteht in weiterer Entwicklung die Plazenta. Hingegen entsteht aus ICM der eigentliche Fetus.
Sobald das Kompaktieren abgeschlossen ist, entwickelt sich eine Blastozyste, was sich in einer Kavitierung des Embryos widerspiegelt. Während dieses Prozesses erweitert sich diese als Blastocoel bezeichnete Kavität. Durch die weitere Expandierung der Blastozyste, beginnen sich TE und ICM zu differenzieren.
Folgende Merkmale sind für ein Blastozyste prognostisch gut; eine stark ausgedünnte Zona pellucida, ein kohäsives Epithel aus vielen TE-Zellen, eine große ICM, welche aus vielen dicht gepackten Zellen besteht. Das Endresultat dieses Stadiums ist das Schlüpfen des Embryos aus der Zona pellucida. 7071
68 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting 2011, S.642
69 Vgl. Prados/Debrock/Lemmen et al. (2012): S.i50-71.
70 Vgl. Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting 2011, S.642
71 Vgl Hardarson/van Landuyt/Jones (2012)
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