10.1 Patienten:
Diese Untersuchung wurde am „Kinderwunsch Zentrum“, des Kepler Universitätsklinikums Linz, Med Campus IV durchgeführt. Die Daten wurden über einen Zeitraum von sechs Monaten (Januar - Juni 2019) gesammelt. Alle Patienten haben ihr Einverständnis für diese Studie gegeben. Alle 216 teilnehmenden Frauen unterzogen sich einer ovariellen Stimulation für ICSI und Embryotransfer. Die Paare litten unter Endometriose, Tubuläre- Sterilität, PCO-Syndrom und/oder männlicher Subfertilität.
10.2 WitnessTM Methode:
Die Daten dieser Studie wurden mittels eines automatischen Radiofrequenz- basierenden Systems automatisch generiert. Durch diese Technik konnten alle Schritte der ART im Labor genauestens zeitlich erfasst werden, mit Ausnahme der die Ovulation auslösenden Injektion („Reifungsspritze“). Mit der Verwendung dieser Technik ist eine umfassende Zeitachse der einzelnen Schritte herstellbar und in einer Datenbank sammelbar. Die gesammelten Zeiten umfassen das Sammeln der Eizellen (Follikelpunktion der Ovarien), die Denudation, sowie den Beginn der Befruchtung/Insemination. Weiters ist zu beachten, dass das System im Arbeitsplatz integriert und unabhängig vom Anwender ist. Der RI WitnessTM Manager hat unter anderem die Funktion Patienteninformation zu sammeln und zu speichern. Wie zum Beispiel die einzelnen Entwicklungsstadien plus Bilder des Embryos, verwendetes Material, gesundheitlicher Background des Paares. Somit kann der gesamte Befruchtungsprozess dokumentiert werden. Dadurch kann bei Befruchtungsversagen die Suche nach der Ursache gestartet werden. Diese Rückverfolgbarkeit wird durch den RFID Chip (radio frequency identification) gewährleistet. Es gibt verschiedene Formen dieses Chips, rechteckig, kreisförmig und quadratisch, je nach zu benützender Kulturschale. Alles ist markiert/gelabelled, somit soll eine Verwechslungsgefahr ausgeschlossen werden. Falls aber etwas falsch markiert wurde, der Chip sich löst oder eine falsche Probe verwendet wurde, wird eine Fehlermeldung gesendet und ein Signal ertönt, sodass man jederzeit rechtzeitig
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reagieren kann. Weiters ist noch hinzuzufügen, dass eine Kamera mit dem Arbeitsplatz verbunden ist, dadurch können auch jederzeit Bilder der Entwicklungsstadien produziert und in den Ordner der Patienten angehängt werden.
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10.3 Eizellsuche und Stimulation:
Eine kontrollierte Ovarien Hyperstimulation wurde entweder mittels langem Antagonistenprotokoll oder dem kurzen Antagonistenprotokoll durchgeführt. Jede Frau wurde stimuliert unter Verwendung eines “standarddown-regulation protocol” bei Nutzung eines “urinary medicamentation” (Menogon®, Ferring, Vienna, Austria) oder eines rekombinanten Produktes (Gonal F®, Serono, Vienna, Austria). Am Tag der Ultraschalluntersuchung wurden Patientinnen mit <60kg geraten zwei Ampullen (150 IU) von FSH täglich zu spritzen und bei >60kg drei Ampullen (225 IU) davon.
Nachdem ein (Leit-) Follikel 20 mm und ein damit verbundene adequater E2 Level erreicht wurde, wurde die Ovulation durch die Gabe von 10,000 IU hCG eingeleitet.
Die Ovaripunktion wurde 36 Stunden nach hCG-Gabe via Ultraschall kontrolliert durchgeführt. Die gesammelten COC wurden dann für ca. 2-3 Stunden in GM501 Wash Medium (Gynemed, Lensahn, Deutschland) kultiviert, bevor diese für 15 Sekunden mit 80 IU/mL Hyaluronidase (Origio, Måløv, Dänemark) behandelt wurden.
Damit wird die mechanische Entfernung der Kumuluszellen erst ermöglicht (Denudation).
Mit dieser 2-3 stündigen Ruhephase soll einem möglichen Reifeunterschied der entnommenen Eizellen entgegengewirkt werden, sodass ein etwaiges Nachreifen von unreifen Eizellen möglich ist. Nach der Eizellpunktion und nach der Denudation wurden die Eizellen aufgrund ihrer morphologischen Charakteristika untersucht.
Durch diesen Schritt können unpassende Eizellen vor der Insemination aussortiert werden.
Samenpräparation:
Nach einer 3-5 tägigen Phase der Enthaltsamkeit wurde das Ejakulat in einem sterilen Behälter gesammelt und für die Evaluierung aufbewahrt. Dies wurde in der
117Vgl. RI-Witness, Research Instrument, UK
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Makler Zählkammer gemacht, dafür wurden 10µl des Ejakulats verwendet.
Anschließend folgte die morphologische Untersuchung, in der man den verbliebenen Rest des entnommenen Ejakulats verwendete. Die Analyse wurde durchgeführt nach den Richtlinien der WHO (2010). Die Spermien wurden gewaschen und zentrifugiert mit einem Nährmedium (GM501 Air, Gynemed). Nach einer Aufschwimmphase wurden die so separierten Spermien inkubiert und anschließend für die ICSI in einem Injektionsschälchen (Falcon type 1006) geladen.
Zwei kleine Tropfen der PVP Lösung (Origio, Måløv, Dänemark) wurden ebenso vorbereitet. Die Mischung verlangsamt die Beweglichkeit der Spermien, erlaubt deren Manipulation.
10.4 ICSI:
Die Mikromanipulation wurde unter der Verwendung eines speziellen Mikroskops durchgeführt. Durch die Vergrößerung von x400, ist es möglich, Spermatozoen zu erkennen und ein passendes auszuwählen. Nach dem Fangen des Spermiums wurde es im PVP-Tropfen immobilisiert. Dies erfolgte durch die mechanische Verletzung der Geißel via Pipette (Außendurchmesser: 7µm; Eppendorf, Hamburg, Germany). Um die ICSI durchzuführen, wurde die Eizelle mithilfe einer Pipette an der 9 Uhr Position gehalten (Außendurchmesser: 100µm; Eppendorf, Hamburg, Germany), sodass sich das erste Polkörperchen auf der 6 Uhr Position befand.
Durch das Eindringen der ICSI-Pipette mit dem unbeweglichen Spermium durch die Zona pellucida entstand der charakteristische Einstichtrichter an der 3 Uhr Position.
Während dieser Penetration durch die Zona und das Oolemma wurde ein kleine Menge/ kleines Volumen des Zytoplasmas mit aufgesogen umso die Eizelle zu aktivieren. Das Herausziehen der Injektionsnadeln wurde vorsichtig durchgeführt, um Schädigungen zu vermeiden.
Nach erfolgreicher Injektion in die Eizelle erfolgt eine Übertragung in das erste sequenzielle Medium (OS Cleave, Origio). Hier wurden die Oozyten in Gruppen von 2-5 in 30 μL Kulturmedium (unter 5%igen Sauerstoffgehalt) gehalten. Die befruchtete Eizelle wurde 16-20 Stunden nach ICSI begutachtet und bewertet, das fand täglich statt bis zum Blastozysten Stadium am Tag 5. Nicht transferierte Blastozysten wurden bei entsprechender Qualität kryokonserviert.
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Zygoten, Embryonen (Tag 2–4) und Blastozysten (Tag 5) wurden nach internationalen Richtlinien (Alpha und ESHRE, 2011) bewertet. Es wurden nur MII Eizellen für die Befruchtung und die dadurch entstehenden Embryos für den Transfer in Betracht gezogen.118 119 120 121
10.5 Time-lapse:
Time-lapse Inkubation ist eine neue bildgebende Technik, die als ein wichtiges Werkzeug in der in-vitro Fertilisation genutzt werden kann. Wir verwendeten hierfür einen MIRI® TL6 Inkubator.
Hierbei werden 6 Kammern, für die Beobachtung der Entwicklung hin zu Blastozyste der befruchteten Oozyten verwendet.
Bei dieser Technik werden im Abstand von 5 Minuten Bilder erzeugt und gespeichert und aneinandergereiht, dies führt zu einem guten Einblick in die morphokinetische Entwicklung der befruchteten Eizellen. Dieses geschlossene System besteht aus einer Nikon Diaphot 300 Mikroskop mit einer Kamera. In diesem System können die Temperatur, Lichtverhältnisse, Luftfeuchtigkeit, der CO2, O2 sowie N2 Gehalt kontrolliert werden. Die Vorteile liegen in den verbesserten Embryoselektion und Bewertung/Einteilung, was einen direkten Einfluss auf die Implantationsrate und Schwangerschaftsrate haben kann. Mit dieser Technik kann man jeden Entwicklungsschritt zurückverfolgen.122123124125126
118Yaman/Sommergruber/Ebner et al. (1999): S.2604-2608.
119Krause/Pohler/Grosse et al. (2016): S.1101-1106.
120Ebner/Yaman/Moser et al. (2001): S.623-628.
121Lai/Zhang/Zhu et al. (2013): S1903-19010.
122Vgl. Meseguer/Herrero/Tejera et al. (2011): S.2658-2671.
123Vgl. Montag/Liebenthron/Köster (2011): S.252-256.
124Vgl. Lemmen/Agerholm/Ziebe (2008): S.385-391.
125Vgl. Cruz/Gadea/Nicolás et al. (2011): S.569-573.
126 Vgl.https://www.vivaneo.at/de/kinderwunschbehandlung/unterstuetzende-behandlungen/time-lapse/
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