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Diagnose und Therapieverlauf des equinen Cushing-Syndroms
- Rolle des endogenen ACTH -
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Christina Brüns
aus Bremen
Hannover 2001
1. Gutachter: Prof. Dr. H.-O. Hoppen 2. Gutachter: Prof. Dr. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.01
1 Einleitung ...9
2 Literatur...10
2.1 Adrenokortikotropes Hormon ... 10
2.1.1 Stellung in der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren Achse ... 13
2.1.2 Konzentrationsbestimmung... 14
2.1.2.1 Handhabung der Blutentnahme... 14
2.1.2.2 Nachweisverfahren des ACTH im Plasma ... 15
2.1.2.3 Normwerte von ACTH beim Pferd ... 17
2.2 Equines Cushing-Syndrom... 18
2.2.1 Einleitung ... 18
2.2.2 Klinik ... 19
2.2.3 Pathophysiologie... 19
2.2.4 Diagnose... 23
2.2.4.1 Radiologische Methoden... 23
2.2.4.2 Endokrinologische Funktionsteste... 24
2.2.5 Therapie... 28
3 Material und Methoden...32
3.1 Tiere ... 32
3.2 Versuchsplan ... 32
3.2.1 Experimentelle Studien ... 33
3.2.1.1 Stabilitätsstudie ... 33
3.3 Blutprobenentnahme und –aufbereitung ... 34
3.3.1 Experimentelle Studien ... 35
3.3.1.1 Stabilitätsstudie ... 35
3.3.2 Klinische Studien... 36
3.4 Endokrinologische Untersuchungen... 37
4 Ergebnisse ...39
4.1 Experimentelle Studien ... 39
4.1.1 Stabilität von Plasma-ACTH... 39
4.2 Klinische Studien... 43
4.2.1 Altersgruppenverteilung und Inzidenz ... 43
4.2.2 Symptomatik ... 44
4.2.3 Therapieverlauf ... 45
5 Diskussion ...51
5.1 Experimentelle Studie ... 51
5.1.1 Stabilitätsstudie ... 51
5.2 Klinische Studie... 55
5.2.1 Inzidenz... 55
5.2.2 Altersgruppenverteilung ... 55
5.2.3 Symptomatik ... 56
5.2.4 Therapieverlauf ... 58
6 Zusammenfassung ...61
Tabellenanhang...79
Abbildungsverzeichnis...82
Tabellenverzeichnis ...83
Abkürzungsverzeichnis
ACTH Adrenokortikotropes Hormon AVP Arginin-Vasopressin
CEA Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assay CRH Corticotropin-Releasing-Hormon
DPI Dysfunktion der Pars Intermedia ECS Equines Cushing-Syndrom EDTA Ethylendiamintetraazetat IRMA Immunoradiometrischer Assay i.m. intramuskulär
NNR Nebennierenrinde PI Pars intermedia PD Pars distalis
Pro-OLMC Pro-Opiolipomelanocortin RIA Radioimmunoassay
1 Einleitung
Während das equine Cushing-Syndrom (Equiner Hyperadrenokortizismus, Dysfunktion der Pars intermedia) früher als eine seltene, bei älteren Pferden vorkommende Krankheit galt, hat sich das Bild im Laufe der Zeit gewandelt. In den letzten Jahren haben neugewonnene Erkenntnisse und eine verbesserte Aufklärung die Tierärzteschaft für diese Thematik sensibilisiert, so dass immer häufiger die Diagnose des equinen Cushing-Syndroms gestellt wird. Abzugrenzen ist der iatrogene Cushing, der durch die Applikation einmalig überhöhter oder wiederholt verabreichter geringerer Dosierungen von Glukokortikoiden hervorgerufen wird.
Für die Diagnose des ECS stehen eine Vielzahl endokrinologischer Funktionsteste zur Verfügung, die in der Literatur zum Teil kontrovers diskutiert werden. Die bei unseren Untersuchungen gestellten Diagnosen beruhen auf der klinischen Symptomatik, dem Dexamethason-Suppressionstest und der Plasma-ACTH-Bestimmung.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Plasma-ACTH-Bestimmung für die Diagnostik zu verbessern und zu untersuchen inwieweit sie bei der Kontrolle des Therapieverlaufs hilfreich ist.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen folgende Aufgaben erarbeitet werden:
· Beurteilung der Therapieverläufe von Cushing-Pferden, die mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat behandelt wurden, hinsichtlich ihrer klinischen Entwicklung und den Ergebnissen von wiederholt durchgeführten Dexamethason-Suppressionstesten und ACTH-Bestimmungen.
· Stabilisierung des instabilen Plasma-ACTHs für den Probentransport bei Raumtemperatur.
2 Literatur
2.1 Adrenokortikotropes Hormon
Struktur
ACTH ist ein Polypeptid von 39 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 4540 Da (Müller 1978). Die ersten 24 Aminosäuren sind für alle Spezies identisch, während die ersten 18 Aminosäuren Träger der vollen biologischen Aktivität sind (Thorner et al. 1998, Wilson et al. 1982).
Bei der Halbwertszeit des im Blut zirkulierenden ACTHs wird die biologische und die immunologische Halbwertszeit bzw. die Immunoreaktivität unterschieden. Besser et al.
(1971) geben die biologische Halbwertszeit mit 4-8 Minuten an. Die immunologische Halbwertszeit wird im Gegensatz dazu durch die Aminosäuresequenz bestimmt, die der im Testverfahren verwendete Antikörper erkennt. Nach Lilly et al. (1995) ist die biologische Halbwertszeit kürzer als die Immunoreaktivität.
Biosynthese
Die Synthese des ACTHs findet in den corticotropen Zellen der Pars distalis und den melanotropen Zellen der Pars intermedia der Adenohypophyse statt. Das ACTH wird in den corticotropen Zellen der PD und den melanotropen Zellen der PI aus einem gemeinsamen Precursor, dem 33 kDa pro-Opiolipomelanocortin (pro-OLMC) durch enzymatische Spaltung gebildet. Aus der enzymatischen Spaltung dieses Glykoproteins gehen viele verschiedene Peptide hervor (Wilson et al. 1982).
In der Pars distalis (Abb. 1) gibt es bei der Biosynthese des ACTHs einen Hauptsyntheseweg und weitere Nebenwege mit unterschiedlichen Intermediärprodukten. Die Hauptprodukte dieser Synthese sind neben ACTH 1-39 (Adrenocorticotropes Hormon) das γ3-MSH (γ3-
Melanozytenstimulierendes Hormon), das b-END (b-Endorphin) und das b-LPH (b- Lipotropin) (Wilson et al. 1982).
Letzteres wird in der PD teilweise weiter gespalten in g-LPH (g-Lipotropin) und b-END.
Nach Liotta et al. (1978) liegen am Ende der enzymatischen Spaltung weitere folgende Peptide vor: a-MSH (ACTH 1-13, a-Melanozyten Stimulierendes Hormon), γ3-MSH, b- MSH, CLIP (Corticotropin like intermediate lobe peptide, ACTH 18-39) und b-END. Sie liegen in Konzentrationen vor, die ungefähr 26, 19, 23, 25 und 54 % der Mengen entsprechen, die von den genannten Peptiden in der Pars intermedia gefunden werden.
Abb. 1: Pro-OLMC-Peptidsynthese in der Pars distalis gesunder Pferde (nach Froin et al.
1998)
In der Pars intermedia verläuft die Biosynthese des ACTH in leicht abgewandelter Form (Abb. 2). Das ACTH entsteht hier aus dem 24,5 kDa pro γMSH und dem 14,7 kDa C- terminalen Fragment. Es wird dann zu 98% weiter gespalten in aMSH und CLIP und führt somit zu keiner Stimulation der Nebennierenrinde (Wilson et al. 1982).
Abb. 2: Pro-OLMC-Peptidsynthese in der Pars intermedia gesunder Pferde (nach Froin et al.
1998)
ACTH wird in Pulsen sezerniert (Livesey 1988). Die Frequenz dieser pulsatilen ACTH- Ausschüttung liegt bei 2-4 / Stunde (Froin 1998). In der Jugularvene sind die meisten ACTH- Pulse als solche nicht mehr meßbar, da sich das ACTH nach Ausschüttung in den Blutkreislauf dort gleichmäßig verteilt. Folglich bleibt in gesunden Tieren nur eine diurnale Rythmik feststellbar, die ihrerseits durch Licht und andere Faktoren reguliert wird (Thorner et al. 1998, Orth et al. 1982 ), aber eine einzige Probe reflektiert ausreichend genau die sekretorische Aktivität der Hypophyse (Froin 1998).
Physiologischer und psychologischer Streß lösen via CRH sowohl eine ACTH als auch Cortisol-Sekretion aus (Thorner et al. 1998).
2.1.1 Stellung in der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren Achse
Die Regulation der ACTH-Sekretion basiert auf verschiedenen physiologischen Vorgängen, an denen im wesentlichen CRH (Corticotropin-Releasing-Hormon), AVP (Arginin- Vasopressin), eine Reihe weiterer Neurotransmitter und verschiedene Rückkopplungsmechanismen beteiligt sind (Alexander et al. 1994). Die ACTH-Freisetzung aus den corticotropen Zellen der Pars distalis wird durch CRH und AVP stimuliert, wobei AVP allein nur schwach stimulierend auf die ACTH-Ausschüttung wirkt (Thorner et al.
1998). Im Hypothalamus wird die Sekretion von CRH und AVP durch verschiedene Neurotransmitter moduliert. Beide Hormone erreichen den Hypophysen-Vorderlappen über das hypothalamisch-hypophysäre Portalsystem. Dort binden sie an spezifischen Rezeptoren der corticotropen Zellen der Pars distalis, wodurch die Adenylatzyklase und der Proteinkinase A aktiviert werden und innerhalb weniger Sekunden ACTH und andere pro-OPLMC- Peptidabkömmlinge in den systemischen Blutkreislauf freigesetzt werden. Weiterhin kommt es zu einer erhöhten pro-OLMC-Gen Transkription und Biosynthese (Thorner et al. 1994;
Watanabe u. Orth 1987). In der Nebennierenrinde wird unter dem Einfluß von ACTH das Glucocorticoid Cortisol gebildet und sezerniert, welches seinerseits über Rückkopplungsmechanismen zum einen mittels Glucocorticoidrezeptoren auf den corticotropen Zellen in der Pars distalis der Hypophyse zu einer Verminderung der ACTH- Sekretion führt, und zum anderen auf hypothalamischer Ebene die Synthese und die Sekretion von CRH und AVP senkt (Herrtage 1996). Aufgrund der fehlenden Glukortikoid-Rezeptoren gibt es diesen Rückkopplungsmechanismus bei den melanotropen Zellen der pars intermedia nicht. Sie unterliegen einer tonisch inhibitorischen Kontrolle des hypothalamischen Dopamins (Orth u. Kovacs 1998, Millington et al. 1988, Antakly u. Eisen 1984).
2.1.2 Konzentrationsbestimmung
2.1.2.1 Handhabung der Blutentnahme
Sowohl die Technik der Blutentnahme, als auch die Handhabung der Probe sind entscheidend für die Bestimmung der ACTH-Konzentration. Der Schmerz der Venenpunktion, ein Verweilkatheter oder die Gewöhnung an den Ort der Blutentnahme führen bei Versuchstieren zu keinem deutlichen Anstieg der Plasma-Cortisol-Konzentration (Knol et al. 1992). Nach Stouffer und Lipscomb (1963) kommt es zu einer reversiblen Bindung zwischen der Glasoberfläche und dem ACTH. Dieses Phänomen kommt bei Verwendung von Borosilikatglas aufgrund seines hohen Alkaligehaltes nicht vor (Ratcliff und Edwards 1971).
Hegstad et al. (1990) messen sogar höhere ACTH-Konzentrationen in Borosilikat- Probenröhrchen als in Polypropylen-und Polystyrolröhrchen. Im Gegensatz dazu beschreiben Kemppainen et al. (1994) nur geringste Unterschiede der zu messenden ACTH- Konzentrationen in Glas- uns Plastikröhrchen, ohne aber genauere Angaben zur Glasart zu machen. Der Zusatz des Gerinnungshemmers Ethylendiamintetraazetat (EDTA) hat laut Vague et al. (1971) keinen Einfluß auf die ACTH-Konzentration im Plasma. Der Gerinnungshemmer Heparin ist ein Kohlehydrat, dessen Wirkung an die negativen Ladungen, den Sulfatresten, gebunden ist (Mutschler 1991). Ehrlich und Styvala (1973) beschreiben die Bindung des Heparins an verschiedene Proteine sowie an ACTH, Insulin, Oxytocin und Vasopressin. Auch Dopouy et al. (1985) führen die Absorption von ACTH durch Heparin und die daraus resultierende Molekülaggregation an. Im Radioligandenassay bewirken derartig heparinvernetzte ACTH-Molekülaggregationen eine Herabsetzung der Antigen-Antikörper- Bindung woraus zu hoch berechnete ACTH-Konzentrationen resultieren (Hegstad et al.
1990). Proteolytische Enzyme bewirken eine Instabilität von ACTH in Blut und Plasma (Rees et al. 1976). Beim Zerfall des 39-Aminosäurenmoleküls entstehen ACTH-ähnliche Fragmente, die den Antikörper binden, oder solche die den Antikörper nicht binden. Dieses Geschehen ist eine weitere Ursache für falsch hohe oder falsch niedrige ACTH- Konzentrationen (Dopouy et al.1985). Der enzymatische Abbau des Polypeptids ACTH geschieht durch Proteasen, sog. Kallikreine (Mutschler 1991). Aprotinin ist ein Proteasenhemmer, der neben Kallikrein die enzymatische Aktivität von Trypsin,
Chymotrypsin und Plasmin hemmt. Es zeichnet sich durch extreme Stabilität gegenüber Siedetemperaturen und der Behandlung mit Trichloressigsäure aus (Gebhard et al. 1986).
Meakin und Nelson (1960), Besser et al. (1971) und Zynar (1981) beschreiben eine Verminderung des enzymatischen Abbaus von ACTH durch Anwesenheit des Proteasenhemmers Aprotinin. Auch Kempainen et al. (1994) sind der Meinung, dass native Blut- oder Plasmaproben im Vergleich zu Aprotininversetzten Proben, bei sonst gleicher Vorgehensweise, geringere ACTH-Konzentrationen aufweisen. Dahingegen finden Hegstad et al. (1990) in ihren Experimenten mit Heparin oder EDTA versetzten Probengefäßen durch Zusatz von Aprotinin keine signifikant höheren ACTH-Konzentrationen. Der enzymatische Abbau von ACTH in Blut und Plasma vollzieht sich bei niedrigen Temperaturen langsamer, so dass Hogan et al. (1976), Orth (1979), Peterson (1984), Lambert et al. (1985), Feldmann und Nelson (1996) die Entnahme in gekühlte Probengefäße, die Lagerung und Transport auf Eis und eine Zentrifugation bei 4°C für sinnvoll halten. Hegstad et al. (1990) und Kempainen et al. (1994) sind dahingegen der Auffassung, dass die Aufbewahrung einer Blutprobe für 90 Minuten bei Raumtemperatur keinen signifikanten Unterschied bezüglich der ACTH- Konzentration im Vergleich zu einer Blutprobe, die in einem gekühlten Röhrchen gewonnen und binnen 15 Minuten zentrifugiert wurde, aufweist. Einen Konzentrationsabfall beobachten Hegstad et al. (1990) nach 4-wöchiger Lagerung bei –20° C nicht. Laut Kempainen et al.
(1994) verringert sich die ACTH-Konzentration bei gleicher Lagerungstemperatur nach 6 Monaten deutlich, nach 4 Tagen bei –86°C und -20°C sind die Veränderungen jedoch unwesentlich. Gutkowska et al. (1982) beschreiben unveränderte ACTH-Konzentrationen nach 2-jähriger Lagerung bei -70°C. Kempainen et al. (1994) beobachten einen stabilisierenden Effekt von Aprotinin auf die ACTH-Konzentrationen bei verschiedenen Lagerungstemperaturen (-86°C, 4°C, 22°C, 37°C ) und unterschiedlicher Lagerungsdauer (1-4 Tage).
2.1.2.2 Nachweisverfahren des ACTH im Plasma
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit für Eiweißverbindungen im Piko- und Nanogrammbereich beschreiben zahlreiche Autoren Radioimmunoassays als Nachweisverfahren des ACTH im Plasma (Demura et al. 1996, Berson u. Yalow 1968, Orth
1979, Gutkowska et al. 1982). Radioimmunoassays gehören in die Familie der Immunoassays, welche als Meßverfahren die spezifische Bindungsreaktion zwischen Antikörpern und dem gesuchten Reagenz oder umgekehrt, nutzen. Immunoassays können in 4 Gruppen klassifiziert werden:
1. Label-free assays 2. Reagent-excess assays 3. Reagent-limited assays 4. Ambient analyte
Der typische Vertreter der 3. Gruppe ist der Radioimmunoassay (RIA), häufig auch als kompetetive Analyse aufgeführt. Das Grundprinzip besteht hier in der Konkurrenz zwischen radioaktiv markierter und unmarkierter Substanzmoleküle um die Bindungsstellen eines im Unterschuß vorliegenden Bindungsreagenz.
In die zweite Gruppe gehört der Immunoradiometrische Assay (IRMA). Charakteristisch für die 2. Gruppe ist der im Überschuß vorliegende, für die gesuchte Substanz spezifische, Antikörper. Binden zwei verschiedene Antikörper für jeweils verschiedene Bindungsstellen (Epitope) an die gesuchte Substanz, spricht man von einem „two-site“ Assay oder Sandwich- Assay (Gosling 2000), wobei der 2. Antikörper radioaktiv markiert ist. Hierbei nimmt die Radioaktivität im Gegensatz zum RIA mit steigender Antigenkonzentration zu. Nach einem Vergleich der ACTH-Bestimmung mittels der beiden beschrieben Methoden sehen Gibson et al. (1989) in der größeren Sensitivität und dem weiteren Meßbereich des IRMA deutliche Vorteile gegenüber dem RIA.
Babson (1991) beschreibt ein automatisiertes System des Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assays (CEA). Der CEA ist eine Sandwichmethode bei der der zweite Antikörper mit einem Enzym markiert ist, welches ein später zugefügtes Chemilumineszenzsubstrat zur Lichtemission katalysiert. Die Stärke der Lichtemission wiederum wird gemessen und entspricht der Konzentration des gesuchten Antigens in der Probe.
2.1.2.3 Normwerte von ACTH beim Pferd
McFarlane et al. (1998) finden keinen Unterschied zwischen Plasma-ACTH-Werten bei jungen und älteren (über 20 Jahre) gesunden Pferden. Moore et al. (1979) sehen eine Abhängigkeit der Werte von der Tageszeit. Wilson et al. (1982) haben die Plasma-ACTH- Werte bei 10 gesunden und einem Cushing-Pferd mittels zwei verschiedener Antikörper bestimmt, von denen einer Epitope des ACTH(11-24) und der andere Epitope des ACTH(25- 39) erkannte (siehe Tabelle 1).
Autor Plasma-ACTH-Gehalt n- Pferde
Van der Kolk et al. (2001) < 55,0 pg/ml 7
Froin et al. (1997/1998) 17,6 +/- 1,6 pg/ml 41
Couёtil (1996) 18,68 +/- 6,79 pg/ml Pferd
8,35 +/- 2,92 pg/ml Pony
16 13
Orth et al. (1982) 32,0 +/- 5,0 pg/ml 10
Moore et al. (1979) 35,0 +/- 10 pg/ml 8.00
21,4 +/- 9,6 pg/ml 22.00 18
Wilson et al. (1982) 32,5 +/- 5,0 pg/ml ACTH(11-24)
60,0 +/- 4,0 pg/ml ACTH(25-39) 10
Brüns (2001) 20,7 +/- 11,3 pg/ml 21
Tab. 1: Normwerte ACTH beim Pferd in pg/ml Plasma
2.2 Equines Cushing-Syndrom
2.2.1 Einleitung
Erstmalig berichtete Pallaske 1932 über das ECS in Form eines Adenomes der Pars intermedia. Während das equine Cushing-Syndrom früher mit einer geringen Inzidenz beschrieben wurde (Loeb et al. 1966, Evans 1972), berichten Veröffentlichungen der jüngeren Vergangenheit über ein höheres Vorkommen dieser Krankheit (Orth und Nicholson 1982, Allen et al. 1988, Horvath et al. 1988, Froin 1997, Assmann et al. 1997). Heinrichs et al.
(1990) führen histologische und immunzytologische Untersuchungen an Adenomen der Pars intermedia von 19 Pferden durch. 1993 weisen van der Kolk et al. 21 Fälle in 2 Jahren vor.
Feige et al. berichteten über 13 Cushing-Pferde (2000). In einer Studie von Schott et al.
(2001) wird bei 67 Pferden das equine Cushing-Syndrom diagnostiziert.
Nach Beech (1999), Mair et al. (1998) und Freestone et al. (1995) erkranken hauptsächlich ältere Pferde an dem equinen Cushing-Syndrom. Ein durchschnittliches Alter von 20 Jahren, der am Cushing-Syndrom erkrankten Pferde, beschreibt van der Kolk (1995). Die Altersstruktur der Patienten zeigt eine deutliche Häufung der Erkrankung ab dem 18.
Lebensjahr. In einigen Fällen tritt die Erkrankung jedoch auch in einem frühen Alter von 8-12 Jahren auf (Assmann et al. 1997). Mair et al. (1998) schreiben, dass über equines Cushing bei jüngeren Pferden keine Berichte vorliegen. Heinrichs et al. (1990) hingegen finden bei ihren Untersuchungen ein siebenjähriges Pferd mit Mikroadenomen in der Pars intermedia der Hypophyse.
Beech (1987 b) berichtet, dass das equine Cushing-Syndrom vorwiegend bei Stuten vorkommt. Nach der Meinung Heinrichs et al. (1990) ist eine Prädisposition für das equine Cushing-Syndrom bei Stuten ungeklärt. Hillyer et al. (1992) halten hingegen männliche Pferde und Ponies für prädisponiert. Dybdal et al. (1994) beschreiben die DPI als eine langsam progressiv verlaufende Krankheit, die bei Pferden aller Rassen vorkommt.
2.2.2 Klinik
Die klinische Symptomatik ist breit gefächert. Das auffälligste Symptom der hypophysären Dysfunktion der Pars intermedia ist der Hirsutismus. Er wird gemeinhin als das Kardinalsymptom dieser Erkrankung betrachtet, tritt nach Beobachtung von Assmann et al.
(1997) aber nicht immer in seiner klassischen Form auf, so dass sich unter Umständen nur ein unvollständiger oder verzögerter Fellwechsel zeigt, der aber auch gänzlich fehlen kann.
Neben der DPI ist keine andere Erkrankung bekannt, die einen Hirsutismus auslöst (Bevier 1991). Des weiteren zeigen sich Hufrehe, Hyperhidrosis, Apathie, Leistungsinsuffizienz, allgemeine Muskelatrophie mit disproportionalen Fettablagerungen, ausgeprägte supraorbitale Fettpolster, Epiphora, Mineralisierungsprobleme (Spontanfrakturen, Zahnverluste), sekundäre Infektionen (Nasennebenhöhlenvereiterung, Hautinfektionen, Pneumonie), Haut- und Haarveränderungen, Kreislaufkollaps, Krämpfe, Polydipsie, Polyurie, visuelle Störungen und Fertilitätsstörungen (Feige et al. 2000, Assmann et al. 1997, Munoz et al. 1996, Bevier 1990).
Über Veränderungen der Laborwerte berichtet Munoz (1996) in Form einer Neutrophilie und einer Lymphopenie. Hyperglykämie, Hyperlipämie, Elektrolytveränderungen und Anämie beobachten Peters et al. (1995). Nach Beech (1999) sind die Serum-Elektrolyte gewöhnlich unverändert. Obwohl die Blutglukose-Spiegel stark erhöht sein können und eine Hyperglykämie „schon fast pathognomisch“ ist, berichtet sie über viele Cushing- Pferde mit normalen Blutzuckerwerten. Der Cortisol-Basalwert kann stark variieren bei Pferden, die an einer Dysfunktion der Pars intermedia leiden. Er kann erniedrigt, normal oder erhöht sein (Beech 1999, Beech 1987, Kolk et al. 1995, Dybdal et al. 1994). Van der Kolk et al. (1993) beobachten in ihrer Studie, dass das spezifische Gewicht des Urins normal ist und in einigen Fällen eine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphortase im Serum. Die einmalige Cortisolbestimmung ergab keine signifikanten Unterschiede bei gesunden und kranken Tieren und das weiße und rote Blutbild sowie die Immunglogulinverteilung lagen im Normbereich.
2.2.3 Pathophysiologie
Die Hypophyse bestehend aus der Adenohypophyse (Lobus anterior) und der Neurohypophyse (Lobus posterior), liegt ventral des Hypothalamus in der Sella turcica des os
sphenoidale. Dabei bildet der Hypothalamus eine Brücke zwischen dem zentralen Nervensystem und dem endokrinen System. Die aus drei Anteilen bestehende Adenohypophyse ist beim Pferd gegenüber der Neurohypophyse stärker ausgebildet. Die Pars distalis (PD) stellt dabei eine den vorderen, größten Abschnitt des Hypophysenvorderlappens dar. Die Pars tuberalis zieht aufwärts und umgreift das Infundibulum. Die Pars intermedia (PI) befindet sich zwischen dem Lobus posterior und der PD (Nickel et al. 1992).
Das equine Cushing-Syndrom ist fast ausnahmslos auf Neoplasien der Pars intermedia der Hypophyse zurückzuführen (Heinrichs et 1990). Ein Hyperadrenokortizismus, basierend auf adrenocorticalen Neoplasien, wie er bei anderen Spezies häufig vorkommt, ist beim Pferd in der Literatur nur fünfmal beschrieben worden (Evans et al. 1968, Fix et al. 1987, Raker et al.1965, van der Kolk et al. 1994, Froin 1998). Während in allen 4 Fällen kein funktioneller Tumor nachgewiesen werden konnte, beschreiben van der Kolk et al. (2001) eine funktionelle adrenocorticale Neubildung beim Pferd, die die Symptome des equinen Cushing-Syndroms hervorruft. Über eine Entartung der ACTH (Adrenocorticotropes Hormon, ACTH 1-39) bildenden corticotropen Zellen der Pars distalis ( PD) beim Pferd liegen in der Literatur keine Berichte vor.
Die Processierung der proOLMC-Peptide in der adenomatösen Pars intermedia ähnelt der einer gesunden PI, dennoch gibt es qualitative und quantitative Unterschiede (Abb. 3). Das ACTH geht aus drei verschiedenen Vorläufern hervor: 24,5 kDa-gMSH, 16 bzw. 18 kDa C-terminales Fragment. Es wird ein größerer Anteil des 24,5 kDa pro-gMSH gebildet, bei dem möglicherweise weniger - abgespalten wird. Die bei einer DPI entstehenden Peptide (g3 MSH), a-MSH, CLIP, -LPH, ß-MSH und ß-END sind vergleichbar mit denen einer gesunden PI. Jedoch liegen im Plasma von Cushing-Pferden unproportional erhöhte Konzentrationen der proOLMC-Peptide vor allem aber des ACTHs vor (Wilson et al. 1982).
Drei immunreaktive Peptide, die deutlich länger waren als die Komponenten in der gesunden Pars intermedia fanden Wilson et al. (1982). Alle drei besaßen eine ACTH 11-24, ACTH und ß-END, ß-LPH Immunreaktivität. Ihr Gewicht betrug 38,5; 47,0 und 63 kDa. Das ACTH der adenomatösen PI ist verantwortlich für die Hyperplasie der Nebennierenrinde (Orth et al.
1982, Cappen 1990). Die Sekretion von ACTH kann bei einer DPI bis zu 600-fach höher gegenüber gesunden Pferden sein und zu einer Erhöhung der Cortisol-Produktion und -
Sekretion führen (Orth et al. 1982, Orth u. Nicholson 1982, Moore et al. 1979, Wilson et al.
1982, Kolk et al. 1993). Die Ursache für den nicht gleichermaßen hohen Anstieg der Cortisolproduktion liegt nach Orth u. Nicholson (1982) möglicherweise in dem Unterschied zwischen der biologischen und immunologischen Aktivität des ACTHs begründet.
Durch das Fehlen von Glukokortikoid-Rezeptoren auf den melanotropen Zellen ist keine negative Rückkopplung möglich und es kommt zum Verlust der diurnalen Rhytmik der Cortisol-Sekretion (Orth et al. 1982, Cappen 1990). Weiterhin können die Peptide aMSH und ß-END die Wirkung von ACTH potenzieren und damit einen weiteren Anstieg der Cortisol- Produktion bewirken (Shanker et al. 1979, Vinson et al. 1985).
Abb. 3: Schematische Darstellung der pro-OLMC-Peptidsynthese bei einer Dysfunktion der Pars intermedia (nach Froin et al. 1998).
Für die klinischen Erscheinungen werden zwei Mechanismen diskutiert. Ein Teil der Symptome ist auf das Tumorwachstum selbst zurückzuführen. Die in der Sella turcica befindliche, tumorös entartete PI drückt bei entsprechender Expansion auf den Hypothalamus sowie auf die kappillären und neuralen Verbindungen zwischen Hypophyse und Hypothalamus. Letzterer steuert den Fellwechsel, die Temperatur und den Appetit, so dass
Druck durch die neoplastische PI zu einer Entgleisung dieser Funktionen führen kann (Thompson et al. 1995, Heinrichs et al. 1990). Weiterhin können durch Druckatrophie und Demyelinisierung der Sehnerven am Chiasma opticum visuelle Störungen hervorgerufen werden (Froin et al. 1997).
Der andere Teil der Symptome ist durch die endokrine Wirkung der vom pro-OLMC abstammenden Peptide und des Cortisols bedingt, obwohl die Pathogenese nicht für alle klinischen Erscheinungen geklärt ist (Thompson et al. 1995, Heinrichs et al. 1990). Nicht die Höhe des Cortisol-Spiegels, der gewöhnlich im Normbereich liegt, ist verantwortlich für die Wirkung, sondern der Verlust der diurnalen Sekretionsrhythmik (Orth et al. 1982, Cappen 1990). Van der Kolk et al. (2001) berichten in einem Fall eines hypophysenunabhängigen Cushing-Syndroms über die gleichen Symptome wie bei einer DPI. Sie sind deshalb der Auffassung, daß sich die klinischen Symptome beim ECS generell eher durch die Wirkung des Cortisols der NNR als durch die Peptide der Hypophyse oder das Tumorwachstum entwickeln. Erhöhte Konzentrationen des zirkulierenden Cortisols wirken immunsupressiv und bedingen eine erhöhte Anfälligkeit für chronische und wiederkehrende Infektionen v.a.
der Haut und des Atmungstraktes. Als Ursache für die Hufrehe bei Pferden mit einem Hyperadrenokortizismus werden die adrenerge Stimulation der Blutgefäße einerseits, und der zu einer Vasokonstriktion führende erhöhte Cortisolspiegel andererseits, angesehen. Durch den antagonistische Effekt des Cortisol auf das Insulin bildet sich nicht selten ein Steroiddiabetes aus. Der Polyurie und Polydipsie liegt ein multifaktorielles Geschehen zu Grunde: Die Hyperglykämie führt zur Glucosurie und osmotischer Diurese, Cortisol stimulierter Anstieg der glomerulären Filtrationsrate und eine verminderte Sekretion des ADH aus dem Hypophysenhinterlappen. Bei Stuten führt ein erhöhter Cortisolspiegel zu Zyklusstörungen und einer Anfälligkeit für Genitalinfektionen (Freestone et al. 1995). Die allgemeine Muskelatrophie und disproportionale Fettablagerungen sind durch den vorwiegend katabolen Stoffwechsel erklärbar. Als Ursache für die Apathie werden ein erhöhtes Auftreten von Zwischenmetaboliten z.B. Endorphinen diskutiert (Assmann et al. 1997).
Abb. 4: Circulus vitiosus nach Field (1988)
2.2.4 Diagnose
Neben eindeutigen klinischen Symptomen (vgl. 2.2.1. Klinik) werden für die Diagnostik des equinen Cushing-Syndroms in der Literatur radiologische Methoden sowie eine Reihe endokrinologischer Funktionsteste beschrieben. Die diagnostische Aussagekraft der einzelnen Verfahren wird kontrovers diskutiert.
2.2.4.1 Radiologische Methoden
Allen et al. (1988) beschreiben die Computer-Tomographie als sicheres diagnostisches Verfahren in vivo für das equine Cushing-Syndrom. Für nachteilig halten Heinrichs et al.
(1990) hier die Notwendigkeit einer Vollnarkose bei diesem Verfahren.
Levy et al. (1993) demonstrieren erfolgreich an 2 Pferden und 2 Ponys eine ventrodorsaler Röntgenaufnahme der Hypophyse unter Narkose mit vorheriger Kontrastmitteleingabe ins Blutgefäßsystem. Somit kommt es zu einer künstlichen Steigerung des Kontrastunterschiedes von der Hypophyse zum umliegenden Gewebe.
2.2.4.2 Endokrinologische Funktionsteste
ACTH-Stimulationstest
Beech (1987a) und Eustace (1991) sehen in dem ACTH-Stimulationstest einen geeigneten Test für die Diagnose des equinen Cushing-Syndroms. Eine adrenocorticale Hypertrophie läßt sich ihrer Meinung nach durch den starken Anstieg des Cortisols infolge einer intravenösen ACTH-Injektion demonstrieren. Nach Eiler et al. (1979) zeigen „Cushing-Pferde“ 2 Stunden nach ACTH-Injektion 100 IU (iv.) einen 80 % igen Anstieg des Cortisols. Hillyer et al. (1992) finden in ihren Versuchsserien 6 Cushing-Pferde, die den oben beschriebenen Cortisolanstieg zeigen, während bei 2 der pathologisch bewiesenen erkrankten Pferde der Anstieg unter 60 % liegt und damit kein Unterschied im Vergleich mit gesunden Pferden erkennbar ist. Dybdal et al. (1994) finden nach Applikation von 1 IU ACTH Gel /kg KGW einen zwei- dreifachen Anstieg der Plasma-Cortisol-Werte sowohl bei den Kontrolltieren als auch bei den erkrankten Pferden, so daß ihnen dieser Test zur Diagnose von Pferden mit einer Pars intermedia Dysfunktion ungeeignet erscheint. Van der Kolk et al. (1993) applizieren 25 IU ACTH iv. um 9 Uhr. Es zeigt sich kein signifikant höherer Anstieg der Cortisolwerte bei den erkrankten Tieren. Die Werte betrugen 2 Stunden post injectionem bei den gesunden 302+/- 21 und bei den erkrankten Tieren 478 +/- 58 nmol/l.
Dexamethason-Suppressionstest
Bei gesunden Tieren führt parenteral verabreichtes Dexamethason über einen negativen Feedback-Mechanismus zu verminderter ACTH-Freisetzung und in Folge auch zu verminderter endogener Cortisol-Sekretion (Livesey et al. 1988). Der Low-dose- Dexamethason-Suppressionstest (0,01 mg/kg KGW i.m.) führt nach Angaben von Dybdal et
al. (1994) zu keinen eindeutigen Ergebnissen hinsichtlich der Unterscheidung zwischen gesunden und Cushing-Pferden. Sie entwickeln folgendes Protokoll für einen Dexamethason- Suppressionstest, bei dem auch der bei gesunden Pferden bestehende diurnale Rhythmus des endogenen Cortisolspiegels berücksichtigt wird. Um verläßliche Ergebnisse zu erhalten ist Dexamethason in einer Dosis von mindestens 0,04 mg/kg KGW zu injizieren (i.m.). Die Autoren empfehlen die Dexamethason-Injektion um 17.00 Uhr vorzunehmen, sowie unmittelbar vorher eine Blutprobe für den Basal-Cortisolwert zu entnehmen. Eine zweite und dritte Blutprobe werden dann 15 bzw. 19 Stunden, also um 8.00 und 12.00 Uhr des folgenden Tages entnommen. Bei klinisch gesunden Pferden wurden die Cortisolwerte 16-20 h post injectionem unter 1,0 µg/dl supprimiert, während die Cortisolwerte aller 52 klinisch diagnostizierter und mittels Sektion nachgewiesenen Pferde mit Hypophysenadenom deutlich über 1.0 µg/dl lagen. Dieses Schema, auch als „Über-Nacht“-Dexamethason-Suppressionstest bezeichnet gilt heute als das Verfahren der Wahl in der Diagnostik des ECS (Dybdal et al.
1997, Freestone et al. 1995, Froin et al. 1997,1998, Feige et al. 2000). Es gibt in der Literatur Hinweise nach denen durch die Gabe von Kortikosteroiden eine Hufrehe ausgelöst wird (Eyre, et al. 1979). Nach Meinung von Eustace (1991) steigt das Risiko einer Hufrehe durch hohe Dosen von Kortikosteroiden. Andere Autoren sehen für die Dosierung von 0,04 mg Dexamethason/ kg KGW kein Risiko im Bezug auf das Auslösen einer Hufrehe - auch nicht bei Cushing-Pferden (Dybdal et al. 1994, Freestone et al. 1995, Froin et al. 1997, 1998) Der kombinierte Dexamethason-Suppressionstest und ACTH-Stimulationstest nach Eiler et al.
(1980) erwies sich als nicht aussagekräftig (Dybdal et al. 1994).
Cortisol-Basalwert-Bestimmung
Die Einzelwertbestimmung des Cortisol-Basalwertes kann bei Pferden mit einer Dysfunktion der Pars intermedia sehr variabel sein und ist für die Diagnose nicht zuverlässig . So werden niedrige, normale und sehr hohe Werte gefunden (Beech 1987, Couëtil et al. 1996, van der Kolk et al. 1993, 1995, Dybdal et al. 1994). Nach Froin et al. (1998) ist der Cortisol- Basalwert bei Tieren mit einer DPI mit (68,3 +/- 8,2 ng/ml) gegenüber gesunden Tieren (39,1
+/- 2,4 ng/ml) zwar signifikant erhöht (p< 0,001), aber nur wenige Tiere wiesen einen massiv erhöhten Cortisol-Basalwert auf, der auch als Einzelwert auffällig war.
Cortisol-Konzentration im Speichel
Der von Lebelt et al. (1996) beschriebene diurnale Rhythmus der Speichel-Cortisol- Konzentration kann von van der Kolk et al. (2001) nicht bestätigt werden. Letztere testen die Speichel-Cortisol-Konzentrationen unter dem Dexamethason-Suppressionstest. Jedoch sind die Ergebnisse noch nicht eindeutig und bedürfen weiterer Bestätigung.
Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration
Die Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration hat sich hinsichtlich der Aussage über die Funktion der Pars intermedia als eindeutig erwiesen (Wilson et al. 1982, Couëtil 1996, Froin et al. 1997,1998, van der Kolk 1993, Orth u. Nicholson 1982). Die ACTH-Konzentrationen sind je nach Autor bis zu 600-fach gegenüber gesunden Tieren erhöht. Nach Thompson et al.
(1995) ist die Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration anhand einer einzelnen Blutprobe das sinnvollste Verfahren zur Diagnostik des equinen Cushing-Syndroms. Nach Froin et al. (1998) ermöglicht die parallele Untersuchung mittels der Plasma-ACTH- Konzentration und des Dexamethason-Suppressionstestes eine Differenzierung zwischen einem „hypophysären“ und dem sehr seltenen „adrenalen Cushing“.
TRH-Stimulationstest
Beech und Garcia (1985) berichten über den Cortisolanstieg bei Cushing-Pferden als Antwort auf die Applikation von 1mg TRH iv.. Blutproben wurden 0; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 3; 4; 5 und 6 Stunden post injectionem entnommen. Dabei zeigten die gesunden Pferde keinen signifikanten Anstieg der Cortisolwerte, während die Pferde mit klinischen Anzeichen des equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus einen durchschnittlichen Anstieg des Cortisols von 120 % 30 min. post injectionem zeigten. Sie bewerten den TRH- Stimulationstest als nützliches diagnostisches Hilfsmittel bei Pferden mit einer hypophysären Dysfunktion, vor allem wenn ein zusätzlicher Dexamethason-Suppressionstest und eine
Insulinbestimmung vorgenommen werden. Thompson et al. (1995) stellen fest, dass sowohl klinisch gesunde als auch Pferde mit Hypophysenadenom einen auffallenden Anstieg der Cortisolkonzentrationen nach TRH-Stimulation zeigen. Das Testsystem scheint ihrer Meinung nach nicht geeignet für eine Diagnose von hypophysären Adenomen. Weiterhin führen sie kritisch an, dass in der Arbeit von Beech und Garcia (1985) die Standardabweichungen in beiden Gruppen so groß waren, dass es zu einer Überlappung der Werte der Kontolltiere und der Pferde mit einer Dysfunktion der Pars intermedia kommt.
Daher sei dieses Testsystem ohne weitere Kontrollstudien nicht zu empfehlen.
Entgegengesetzt der Meinung von Beech und Garcia (1985) berichten Hillyer et al. (1992) über die Abhängigkeit des Cortisolanstiegs von dem Cortisol-Basalwert. So beobachten sie einen offensichtlich geringeren Cortisolanstieg wenn der Ausgangswert des Cortisols hoch ist und umgekehrt. Der Mechanismus des Cortisolanstiegs nach TRH-Applikation ist ungeklärt (Matsurka et al. 1977).
Intravenöser Glukose-Toleranztest
Beech und Garcia (1986) werten diesen Test als weitere Möglichkeit für die Dysfunktion der Pars intermedia. Sie injizieren nüchternen Pferden 0,5 g Dextrose /kg KGW in einer 50%igen Lösung und nehmen Blutproben 0 (Basalwert); 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 und 6 Stunden post injectionem. Nach 15 Minuten zeigen gesunde Pferde einen Anstieg ihres Blutzuckers um mehr als 300% des Ausgangswertes. Der Blutzuckerspiegel normalisiert sich anschließend rasch. Bei Cushing-Pferden, deren Blutzucker vor der Glukosegabe häufig schon erhörte Werte aufweist, ist ein geringerer prozentualer Anstieg meßbar, und der Abfall zum Ausgangswert hin benötigt deutlich mehr Zeit. Die Plasma-Insulin-Konzentrationen der gesunden Pferde zeigten Parallelität zu den Glukose-Konzentrationen. Bei den Tieren mit einem Hypophysenadenom bestand eine andauernde Hyperinsulinämie. Die Autoren geben Die Basal-Glukosewerte für gesunde Pferde mit 80 +/- 7 und für Tiere mit DPI mit 121 +/- 64 mg/dl an. Nach Moore et al. (1979) haben letztere einen Basal-Glukosewert von 189 mg/dl.
Van der Kolk et al. (1993) geben für gesunde Tiere einen durchschnittlichen Wert von 140 +/- 16,2 mg/dl und bei kranken einen Wert von 162 mg/dl an.
Insulin-Toleranztest
Der equine hypophysäre Hyperadrenokortizismus wird häufig begleitet durch einen sekundären Diabetes mellitus und ist meist durch erhöhte Insulinspiegel gekennzeichnet. Bei gesunden Pferden sinkt der Blutglukosewert 2 Stunden nach Gabe 0,4 IE/kg KGW Insulin i.m. um ca. 75% ab. Nach i.v. Injektion von 0,05 IE/ kg KGW kristallinen Insulins ist nach 30 Minuten ein Abfall des Glukosewertes um 60% zu erwarten. Zwei Stunden später sollte der Ausgangswert wieder erreicht sein (Beech und Garcia 1986). Die oft erhöhten Blutzuckerspiegel von Pferden mit dem equinen Cushing-Syndrom erweisen sich gegenüber den oben angegebenen Dosierungen meist als insulinresistent. Die Höhe der zur Blutzuckersenkung erforderlichen Insulindosis in solchen Fällen scheint prognostische Anhaltspunkte geben zu können (Love 1993).
Bestimmung des Cortisol-Creatinin-Quotienten im Urin
Die Bestimmung des Cortisol-Creatinin-Quotienten nach Webb (1994) führt zu Überlappung der Werte zwischen gesunden und am Cushing-Syndrom erkrankten Pferden (van der Kolk et al. 1994).
2.2.5 Therapie
Therapieansätze bei der Cushing Erkrankung beinhalten Chirurgie, Bestrahlung und medikamentelle Behandlung, wobei für den equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus in der Literatur keine Berichte über eine chirurgische Behandlung oder eine Bestrahlungstherapie vorliegen.
Zur medikamentellen Behandlung stehen drei Kategorien von Pharmaka zur Verfügung:
§ Selektiv adrenolytische Substanzen (z.B. o,p‘-DDD)
§ Serotoninantagonisten
§ Dopaminagonisten (z.B. Bromocriptin und Pergolidmesilat)
Das Mittel der Wahl beim caninen Cushing ist das selektiv adrenolytisch wirkende o,p‘-DDD (o,p-Dichlordiphenyldichlorethan, Lysodren). Es bewirkt an der Nebenniere eine selektive Atrophie der Zona fasciculata und reticularis während die Zona glomerulosa und damit die Aldosteron Sekretion unberührt bleiben. Die Behandlung des equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus mit o,p‘-DDD wäre prinzipiell denkbar, ist aber nach Erfahrung von Mair et al. (1998), Freestone und Melrose (1995) nicht wirkungsvoll.
Serotonin ist ein Neurotransmitter, der im Hypothalamus zu einer Freisetzung des Corticotropin Releasing Hormons (CRH) führt, welches seinerseits an den corticotropen Zellen der Pars distalis eine ACTH-Produktion bewirkt (Orth and Kovacs 1998).
Cyproheptadine (PeriactinolR, ein 5-HAT (5-Hydroxytryptamin, Serotonin) -Antagonist wird in der Humanmedizin beim hypophysären Hyperadrenokortizismus eingesetzt.
Serotoninantagonisten führen zu einer Verminderung der CRH-Ausschüttung im Hypothalamus und bewirken in vitro eine direkte Inhibition der ACTH-Sekretion humaner Hypophysentumorzellen (Aronin und Krieger 1989, Suda et al. 1983). Beim Menschen liegen meist Mikroadenome der corticotropen Zellen der Pars distalis vor, während es sich beim Pferd um Makroadenome der melanotropen Zellen der Pars intermedia handelt (Heinrichs et al. 1990). Die autonome ACTH-Produktion des Pars-intermedia-Tumors beim Pferd bleibt somit durch die 5-Hydroxytryptamin-Antagonisten wahrscheinlich unberührt (Froin et al.
1998). Der Einsatz von Cyproheptadine beim equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus wird in der Literatur mehrfach und mit unterschiedlichen Behandlungserfolgen beschrieben.
Traver und Bottom (1981) verwendeten eine initiale orale Dosis von 0,1 mg/kg KGW /Tag und erhöhten die Dosis jeden zweiten Tag um 0,08 mg, um schließlich eine Dosis von 0.26 mg /kg KGW/Tag zu erreichen. Beech (1983) verabreichte eine initiale Dosis von 0,6 mg/kg KGW7Tag, die über mehrere Wochen bis auf 1,2 mg/kg KGW/Tag erhöht wurde.
Couëtil (1996) behandelte insgesamt 29 Pferde mit Cyproheptadine (0,25 +/- 0,05 mg/kg täglich). Davon zeigten 20 Pferde (69 %) eine Verbesserung der klinischen Symptomatik. Die Kontrolle der Plasma-ACTH-Konzentration 4-20 Wochen nach Behandlungsbeginn ergab bei 9 dieser 20 Pferde niedrigere ACTH-Werte als vor Behandlungsbeginn. Drei Pferde zeigten trotz klinischer Verbesserung höhere ACTH-Werte.
Dopaminagonisten bewirken bei den unter einer tonisch inhibitorischen dopaminergen Kontrolle stehenden melanotropen und adenomatösen Zellen der Pars intermedia eine dosisabhängige Verminderung der pro-OLMC-Peptid-Sekretion (Love 1993, Willemse und Mol 1994).
Die Mutterkornalkaloide Bromocriptin- und Pergolidmesilat sind Dopaminagonisten. Die erfolgreiche Behandlung des equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus ist sowohl mit Bromocriptin- (Beck 1992, Orth et al. 1982), als auch mit Pergolidmesilat (Froin et al. 1998, Munoz et al. 1996, Beech 1999) beschrieben worden. Orth et al. (1982) beobachten einen Abfall der erhöhten pro-OLMC-Peptid-Spiegel und des Cortisols im Serum. Die Bioverfügbarkeit von oral verabreichtem Bromocriptinmesilat ist nur gering, so dass bei Verwendung von höheren Dosen die Nebenwirkungen deutlich zunehmen. Die Behandlung mit dem Injektionspräparat Parlodel LAR (Sandoz, Nürnberg) zeigte nur sehr geringe Nebenwirkungen am Tag der i.m. Applikation. Das Präparat hatte den Vorteil, dass es nur alle 4-6 Wochen verabreicht werden mußte, ist aber nicht mehr im Handel (Froin et al.1998).
Pergolidmesilat besitzt gegenüber Bromocriptinmesilat eine bessere Verträglichkeit und eine höhere gastrointestinale Resorption, so dass geringere Dosen verwendet werden können (Froin et al. 1998). Obwohl das Medikament potentiell auf die Gefäße wirkt, konnte Beech (1999) auch bei sehr hohen Dosen keine auf das Medikament zurückzuführenden Effekte wie z.B. Hufrehe beobachten. Normalerweise verursacht Pergolidmesilat keine Nebenwirkungen (Munoz et al. 1996). Lediglich bei einer zu hohen Einstiegsdosis 3 mg Pergolidmesilat p.o./
Tag berichtet er über Nebenwirkungen wie Schwitzen, Dyspnoe, Schwindelanfälle und Austrocknen der Maulschleimhaut. Daraufhin verringerte er die tägliche Dosis auf 0,5 mg erhöhte diese Dosis alle drei Tage um 0,5 mg bis 3 mg. Klinische Symptome (Gewichtsabnahme, Polyurie, supraorbitalen Fettpolster, Änderung der Fellfarbe) und Blutwerte (Neutrophilie, Lymphopenie und Hyperglykämie) verbesserten sich innerhalb der folgenden 6 Monate. Nach 7 Monaten verringerte er die Dosis auf 2 mg /Tag und der Zustand des Pferdes blieb weiterhin konstant. Aufgrund von Anorexie und anderen Nebenwirkungen empfiehlt Beech (1999) eine Initialdosis von 0,5 mg /Tag p.o.. Danach wird die Dosis alle 3 Tage um 0,5 mg gesteigert bis zu einer Menge von 2-3 mg / 400-500kg KGW. Diese Dosis wird für einige Wochen beibehalten und je nach Bedarf weiter heraufgesetzt bis zu 5 mg / 500
kg KGW täglich. Einige Ponies behandelte Beech (1999) erfolgreich mit einer Dosis von 0,5- 1,0 mg /Tag.
Peters et al. (1995) berichten über eine „Low-dose“ (0,75 mg täglich) -Behandlung mit Pergolidmesilat. Acht von neun Pferden sprachen gut auf die Therapie an. Eine Besserung der klinischen Symptomatik ohne Nebenwirkungen wurde mit einer täglichen Dosis von 0,5-1,0 mg erzielt. Beech (1999) hingegen beobachtet bei einigen Pferden eine Verschlechterung des Zustandes beim Herabsetzen der täglichen Dosis unter 2 mg.
Die Zeit bis sich eine Besserung der klinischen Symptome einstellt ist nach Erfahrung von Beech (1999) von Pferd zu Pferd sehr unterschiedlich. Eine Abnahme der Apathie und Trägheit zeigt sich ihrer Beobachtung nach schon nach einigen Wochen. Eigene Erfahrungen bestätigen dies.
3 Material und Methoden
3.1 Tiere
Die Stabilitätsstudie wurde bei insgesamt 29 Pferden, die unabhängig von Rasse, Geschlecht und Alter zusammengestellt wurden, durchgeführt. Im Rahmen der klinischen Studie wurden 63 Pferdepatienten der Klinik für Pferde G. Assmann, Opfenbach untersucht. Es handelte sich dabei um Pferde, bei denen der Verdacht auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms bestand. Davon wurden im Rahmen einer Verlaufskontrolle 13 Pferde untersucht, bei denen das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms sicher diagnostiziert war, und die derzeit mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat behandelt wurden. Als sicher diagnostiziert galten Pferde:
· Mit klinischer Symptomatik des equinen Cushing-Syndroms.
· Mit einer mangelhaften Suppression des Cortisols im Dexamethason-Suppressionstest (d.h. Plasma-Cortisolwerte die 15 Stunden nach i.m. Applikation von Dexamethason (40 µg/ kg KGW) über 4,3 +/- 0,4 ng/ml liegen und im 19 h-Wert ansteigen).
· Mit einem ACTH-Wert über 60 pg/ml.
3.2 Versuchsplan
Der Versuchszeitraum verlief über 5 Jahre, von Juli 1996 bis August 2001.
3.2.1 Experimentelle Studien
3.2.1.1 Stabilitätsstudie
Zur Auswahl kamen ausschließlich Pferde, die nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren. Die Tiere wurden in 2 Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe enthielt 21 Pferde aus dem Patientengut der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover, welche im Bezug auf das equine Cushing-Syndrom klinisch unauffällig waren. Die zweite Gruppe bestand aus 8 Pferden, bei denen das equine Cushing-Syndrom eindeutig diagnostiziert war.
3.2.2 Klinische Studien
Bei dem Verdacht auf das Vorliegen eines Hyperadrenokortizismus wurde ein Dexamethason-Suppressionstest durchgeführt. Bei 13 Pferden wurde im Rahmen einer Verlaufskontrolle der Therapie des equinen Cushing-Syndroms neben dem Dexamethason- Suppressionstest und der Bestimmung des Plasma-ACTH Spiegels zusätzlich eine Beobachtung der klinischen Symptomatik vorgenommen. Der Therapieplan sah die tägliche Verabreichung von 0,01 mg Pergolidmesilat/ kg KGW per os vor. Die Medikamenteneingabe erfolgte täglich, in 24 stündigem Abstand morgens oder abends.
3.2.2.1 Dexamethason-Suppressionstest
Der Dexamethason-Suppressionstest wurde nach dem von Dybdal et al. (1994) beschriebenen Protokoll durchgeführt. Hierfür sind Dexamethasonpräparate (9a-Fluor-16a- methylprednisolon) ohne Depoteffekt in wäßriger Lösung oder Suspension zu verwenden.
Protokoll des Dexamethason-Suppressionstest:
1. Blutprobe (Basalwert) 17.00 Uhr unmittelbar danach
i.m. Injektion von
40 µg Dexamethason /kg KGW 2. Blutprobe nach 15 Stunden 8.00 Uhr 3. Blutprobe nach 19 Stunden 12.00 Uhr
3.2.2.2 Klinische Symptome
Zur Diagnostik sowie im Rahmen des Therapieverlaufes standen folgende Symptome zur Beobachtung:
§ Hirsutismus, bzw. verzögerter oder unvollständiger Fellwechsel
§ Hufrehe
§ Apathie
§ Leistungsinsuffizienz
§ Allg. Muskelatrophie
§ Gewichtsabnahme
§ Progressive Debilitation
§ Disproportionale Fettablagerungen, v.a. an den supraorbitalen
Fettpolstern
§ Epiphora
§ Hyperhidrosis
§ Polydipsie
§ Polyurie
§ Kreislaufkollaps
§ Krämpfe
§ Visuelle Störungen
§ Fertilitätsstörungen
§ Hyperglykämie
§ Sekundäre Infektionen
3.3 Blutprobenentnahme und –aufbereitung
Für alle Studien wurden Röhrchen aus Polypropylen der Firma Sarstedt AG & Co., Nümbrecht verwendet. Sowohl für die Bestimmung von ACTH, als auch für die Bestimmung von Cortisol, waren die Röhrchen mit 1,2-2,0 mg EDTA/ ml Probenvolumen versetzt. Für die Stabilitätsstudie wurde in die Hälfte aller Probenröhrchen Aprotinin (500 KIE/ml Blut TrasylolR -Injektionslösung, Bayer Leverkusen) vorgelegt. In den klinischen Studien wurden alle zur Plasma-ACTH Bestimmung verwendeten Röhrchen mit Aprotinin versehen.
3.3.1.1 Stabilitätsstudie
Die Stabilitätsstudie wurde bei zwei Gruppen von Tieren (Gruppe 1: Tiere ohne Verdacht auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms; Gruppe 2: Tiere mit deutlicher klinischer Symptomatik des equinen Cushing-Syndroms) nach derselben folgenden Vorgehensweise durchgeführt: Die Blutproben wurden nach Reinigung und Desinfektion der Punktionsstelle aus der Vena jugularis externa entnommen. Hierzu wurden EDTA-beschichtete Monovetten (10 ml) der Firma Sarstedt verwendet. Nach der Blutentnahme wurde die Probe behutsam geschwenkt und zur Hälfte in ein mit Aprotinin vorgelegtes Röhrchen überführt und ein weiteres Mal geschwenkt. Die andere Hälfte der Probe wurde in ein zusatzfreies Röhrchen verbracht und ebenso geschwenkt. Anschließend wurden beide Proben innerhalb der folgenden zwanzig bis dreißig Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde abpipettiert und jeweils auf drei Röhrchen verteilt. Die daraus resultierenden 3 nativen und 3 aprotininhaltigen Plasmaproben wurden bis zur endokrinologischen Untersuchung 24 Stunden bei jeweils -22°C, + 6°C und + 20°C gelagert (siehe Abb. 5).
Abb. 5: Vorgehensweise bei der Stabilitätsstudie (Modifiziert nach Rotermund)
3.3.2 Klinische Studien
Die Blutentnahme für die Dexamethason-Suppressionsteste wurde, nach Reinigung und Desinfektion der Punktionsstelle, aus der Vena jugularis externa mittels einer EDTA- beschichteten Monovette (10 ml) vorgenommen. Nach dem vorsichtigen Schwenken und Zentrifugieren der Probe wurde der Plasmaüberstand abpipettiert und bis zur Untersuchung bei –22°C gelagert. Proben der Klinik für Pferde G. Assmann, Opfenbach wurden dann in gekühltem Zustand mit der Post an das Endokrinologische Untersuchungslabor der Tierärztlichen Hochschule Hannover geschickt.
Bei der Blutprobenentnahme für die Plasma-ACTH Bestimmung wurde genauso verfahren, jedoch wurde die Blutprobe nach dem Schwenken in der Monovette in ein mit Aprotinin vorgelegtes Röhrchen überführt und ein weiteres Mal geschwenkt.
3.4 Endokrinologische Untersuchungen
Die Auswertung der Plasmaproben wurde in der Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften durchgeführt. Es wurden folgende Hormone (Tab. 2) in einem Analyseautomaten (IMMULITE, DPC Biermann, Bad Nauheim ) untersucht. Der Immulite-Test für ACTH und für Thyroxin (Canine Total T4) ist ein Festphasen-Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung dieser Hormone im EDTA-Plasma. Der Cortisol-Immulite-Test ist ein Festphasen- Chemilumineszenz-Immunoassay.
Nachweisgrenze Variationskoeffizient ( %) Hormon Katalog N°
untere obere Intraassay- Interassay-
ACTH LAC1 5,00 pg/ml 1250,0 pg/ml 3,1-9,6 5,1-9,4
Cortisol LKCO1 2,00 pg/ml 500,0 pg/ml 6,8-9,0 9,9-10,3
Tab. 2: Nachweiskriterien der verwendeten Hormonassays
Das ACTH-Antiserum für ACTH zeigt nach Angaben der Firma DPC Biermann (Diagnostic Product Corporation, Los Angeles) nur eine geringe Kreuzreaktivität (Tab. 3) zu ACTH-Fragmenten, die unter Umständen im Plasma vorliegen. Das IMMULITE- System wurde für die Messung von equinem ACTH validiert (Froin 1998). Dabei ergibt sich ein Intraassayvariationskoeffizient, der zwischen 3,9-13,5 % liegt.
ACTH-Fragmente Zusatz (pg/ml) Konzentration pg/ml Kreuzreaktivität (%)
500 - -
5000 - -
50000 - -
ACTH1-13 (α-MSH)
500000 - -
500 - -
5000 - -
50000 - -
ACTH1-18
500000 15 0,003
500 5000
50000 27 0,050
ACTH1-24
500000 70 0,010
500 66 13
ACTH18-39 (CLIP)
5000 752 15
500 - -
5000 - -
50000 - -
ACTH22-39
500000 - -
Tab. 3: Spezifität des Antiserums zu ACTH-Fragmenten (Froin 1998)
4 Ergebnisse
4.1 Experimentelle Studien
4.1.1 Stabilität von Plasma-ACTH
Die ACTH-Konzentration wird durch den Zusatz von Aprotinin und durch die Lagerungstemperatur deutlich beeinflußt. Sowohl bei den Blutproben der gesunden Pferde, als auch bei den Blutproben der Cushing-Pferde liegen die Plasma-ACTH-Konzentrationen der Aprotinin versetzten Proben 24 Stunden nach Blutentnahme bei allen drei Lagerungstemperaturen über denen der Proben ohne Zusatz (siehe Abb. 6 und 7, Tab. 8 und Tab. 9 im Anhang).
Abb. 6: ACTH-Verlauf bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen - Messwerte bei gesunden Pferden
Abb. 7: ACTH-Verlauf bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen - Messwerte bei Cushing-Pferden
In der Gruppe der gesunden Pferde beträgt der Abbau des ACTHs im Nativblut gegenüber den Aprotininproben bei –22 °C, +6 °C und +20 °C durchschnittlich 7,21%, 8,45 % und 5,62
%. In der Gruppe der Cushing-Pferde liegt der durchschnittliche Abbau des ACTHs bei 12,88
%; 11,73 % und 10,75 % (siehe dazu Tab. 4, 5 und Abb. 8).
Die Lagerungstemperatur wirkt sich folgendermaßen auf die Plasma-ACTH- Konzentrationen. Innerhalb der Testreihen liegen die Plasma-ACTH-Konzentrationen bei den Nativ-Proben und bei den Aprotinin versetzten Proben nach 24 Stunden Lagerung bei –22 °C deutlich höher als bei 20 °C. Die nativen Blutproben und die Aprotinin versetzten Blutproben der gesunden Pferde weisen bei 20 °C gegenüber –22 °C einen Abbau des ACTHs von 5,62 % und 7,24 % auf. In der Gruppe der Cushing-Pferde liegt der Abbau des ACTHs bei 8,35 % und 9,34 % (siehe dazu Tab. 4, 5 und Abb. 9).
-22° C 6° C 20° C Differenz
Nativproben
pg/ml Mittelwert 19,2 17,76 18,12 1,08
Abbau des ACTH im Nativblut bei 20° C gegenüber –22° C
5,62 %
Aprotininproben pg/ml Mittelwert (korrigiert um 5%)
20,7 19,4 19,2 1,5 Abbau des ACTH in Aprotininproben bei 20°
C gegenüber –22° C 7,24 %
Differenz 1,5 1,64 1,08
Abbau des ACTH im Nativblut gegenüber den Aprotininproben
7,25 % 8,45 % 5,62 %
Tab. 4: Durchschnittliche Plasma-ACTH Konzentration in Nativ- und Aprotinin-Blutproben Gruppe 1: Gesunde Pferde
-22° C 6° C 20° C Differenz
Nativproben
pg/ml Mittelwert 225,75 210,25 206,88 18,87 Abbau des ACTH im Nativblut bei 20° C
gegenüber –22° C 8,35 % Aprotininproben
pg/ml Mittelwert (korrigiert um 5%)
255,7 238,2 231,8 23,9
Abbau des ACTH in Aprotininproben bei 20°
C gegenüber –22° C
9,34 %
Differenz 32,95 27,95 24,92
Abbau des ACTH im Nativblut gegenüber den
Aprotininproben 12,88 % 11,73 % 10,75
%
Tab. 5: Durchschnittliche Plasma-ACTH Konzentration in Nativ- und Aprotinin-Blutproben Gruppe 2: Cushing-Pferde
Abb. 8: Vergleich des prozentualen Abbaus von ACTH bei 20°C gegenüber –22°C in Nativ- und Aprotinin-Proben
Abb. 9: Prozentualer Abbau von ACTH in Nativ- gegenüber Aprotin-Proben bei unterschiedlicher Lagerungstemperatur
4.2 Klinische Studien
4.2.1 Altersgruppenverteilung und Inzidenz
Bei 63 Pferden konnte der Verdacht auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms durch einen positiven Dexamethason-Suppressionstest oder durch erhöhte Plasma-ACTH-Spiegel bestätigt werden. Es wurden insgesamt 56 positive Dexamethason-Suppressionsteste durchgeführt und 7 erhöhte Plasma-ACTH-Spiegel bestimmt (siehe dazu Tab. 7 und 8). Diese 63 „Cushing-Pferde“ wiesen folgende Altersgruppenverteilung auf:
Alter Pferde in %
-10 Jahre 5 7,93
10-20 Jahre 21 33,33
20-40 Jahre 37 58,73
insgesamt 63 100
Tab. 6: Altersgruppenverteilung
Pferd Nr. ACTH in pg/ml
1 396
2 240
3 149
4 156
5 418
6 307
7 150
Tab. 7: Basale Plasma-ACTH-Werte
Pferd Nr. 17.00 8.00 12.00 Pferd Nr. 17.00 8.00 12.00
1 54 14 14 29 269 57 32
2 63 7,9 19 30 66 90 89
3 61 8,5 18 31 20 30 31
4 39 36 8,7 32 74 8,9 14
5 36 10 20 33 212 12 87
6 67 72 66 34 169 55 60
7 87 30 24 35 65 58 50
8 77 7,5 10 36 97 9 11
9 35 37 31 37 71 11 11
10 42 4,9 10 38 61 26 18
11 58 57 54 39 51 21 12
12 108 90 107 40 233 12 89
13 88 7,9 27 41 94 16 23
14 30 9,7 9,5 42 111 15 18
15 33 24 44 43 68 10 8,1
16 98 14 18 44 36 18 23
17 58 56 83 45 45 11 17
18 65 97 75 46 55 17 22
19 117 23 45 47 76 71 66
20 33 35 35 48 36 36 42
21 91 98 69 49 63 72 71
22 118 24 19 50 35 6,5 11
23 50 22 17 51 86 41 39
24 16 10 17 52 74 88 113
25 89 32 41 53 62 22 23
26 92 37 39 54 29 24,8 25,1
27 34 30 65 55 247 14 8,4
28 92 11 14 56 54 24 19
Tab. 8: Dexamethason-Suppresionsteste
4.2.2 Symptomatik
Die Tab. 9 zeigt die zahlenmäßige Häufigkeit der einzelnen Symptome bei 63 Cushing- Pferden. Der Hirsutismus und die Hufrehe sind mit n=40 bzw. 38 die häufigsten Symptome des equinen Cushing-Syndroms. Eine Kombination der beiden Symptome lag in 22 Fällen vor, während 4 Pferde weder einen Hirsutismus noch eine Hufrehe zeigten. In diesem Zusammenhang ist eine Besonderheit in der Gruppe der „jungen“ Pferde (-10 Jährigen)
herauszustellen. Keines dieser Pferde zeigte einen Hirsutismus, bzw. einen unvollständigen oder verzögerten Fellwechsel. Die Verdachtsdiagnose wurde allein aufgrund einer unergründlichen Lahmheit bzw. aufgrund von Hufrehe gestellt.
Symptome Hirsutismus
bzw. verzögerter / unvollständiger Fellwechsel 40
Hufrehe 38
Apathie 11
Leistungsinsuffizienz 22
Allg. Muskelatrophie 17
Gewichtsabnahme 16
Zunehmende Schwäche 9
disproportionale Fettablagerungen vor allem
an den supraorbitalen Fettpolstern 14
Epiphora 5
Hyperhidrosis 17
Polydipsie 16
Polyurie 15
Kreislaufkollaps 3
Krämpfe 1
visuelle Störungen 2
Fertilitätsstörungen 5
Sekundäre Infektionen 4
Hyperglykämie 10
Tab. 9: Vorkommen bzw. Häufigkeit der einzelnen Symptome in einer Zusammenstellung von 63 Cushing-Pferden
4.2.3 Therapieverlauf
Die Ergebnisse der Therapie-Verlaufskontrolle (Siehe Tab. 10, Seite 47) zeigen bei allen 13 Pferden eine deutliche Besserung der klinischen Symptomatik. Die bei 9 Pferden vorliegende
Hufrehe heilte in allen Fällen ab, und es kam zu keinen neuen Reheschüben. Alle Pferde zeigten einen Hirsutismus, der sich unter Therapie ausnahmslos bei allen Pferden zurückbildete und sich bei 11 Pferden zu einem normalen Fellwachstum wandelte.
Leistungsinsuffiziente und apathische Pferde waren unter Therapie munterer und agiler.
Symptome wie Hyperhidrosis, Epiphora, Polydipsie, Polyurie und supraorbitale Fettpolster verschwanden ebenfalls. Symptome, die den Körperbau betreffen, wie allg. Muskelatrophie, Gewichtsabnahme, disproportionale Fettablagerungen veränderten sich langsamer (6-12 Monate), bei einem Teil der Pferde unvollständig und bei einem anderen Teil sehr gut.
Bei 9 der 13 unter Therapie stehenden Pferden (Tab. 10, Pferd Nr.5-13) wurde jeweils ein wiederholter Dexamethason-Suppressionstest und / oder eine Bestimmung des Plasma- ACTH-Spiegels vorgenommen. Die Pferde Nr. 5, 6 und 13 zeigten sowohl eine im Normbereich liegende Suppression der Cortisolwerte als auch normale ACTH-Werte.
Bei den anderen 6 Pferden (Nr. 7-12) lag eine ungenügende Suppression der Cortisolwerte und ein erhöhter ACTH-Spiegel vor, die jedoch im Vergleich mit Werten vor Therapiebeginn besser sind. Darunter befand sich ein Pferd (Nr. 12), das zum Zeitpunkt des Wiederholungstestes erst seit 6 Wochen unter Therapie stand.
Bei den Pferden Nr. 7-11 wurde der Wiederholungstest nach 1,5-4 Jahren durchgeführt. Im Verlauf des Falles Nr. 9 kommt es zunächst zu einer gänzlichen Normalisierung des ACTH- Wertes (53,2 pg/ml) innerhalb vier Monate nach Therapiebeginn und einem erneuten Anstieg des ACTH-Wertes auf 251 pg/ml nach 4-jähriger Behandlungszeit. Anzumerken ist, dass alle 13 Pferde unabhängig von ihren Laborwerten eine deutliche Besserung der klinischen Symptomatik aufweisen.
Bei den Pferden Nr. 1-4 liegen weder aus der Zeit vor Therapiebeginn noch aus der Zeit während der Behandlung Labordiagnostische Werte vor. Hier stützt sich die Beurteilung des Therapieerfolges einzig auf die hervorragende Besserung der klinischen Symptomatik, die zum Teil in Bildmaterial dokumentiert worden ist (s. Abb. 10 und 11).
In keinem der aufgeführten Fälle wurden Nebenwirkungen aufgrund der Parkotil-Behandlung (0,01 mg Pergolidmesilat /kg KGW) beobachtet.
Tab. 10: Therapie-Verlaufskontrolle
tsetzung Tab. 11: Therapie-Verlaufskontrolle
Fortsetzung Tab. 11: Therapie-Verlaufskontrolle
Abb. 10: Patient vor Therapiebeginn
Abb. 11: Patient nach viermonatiger Behandlung
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit ist es, den Vorgang der Plasma-ACTH-Bestimmung so zu verbessern, dass er unter Feldbedingungen für die Diagnostik und Therapiekontrolle des equinen Cushing- Syndroms leicht und zuverlässig angewendet werden kann. Im Weiteren soll im Rahmen einer klinischen Studie der Verlauf dieser Krankheit bei Pferden, die mit dem Dopaminagonisten ParkotilR behandelt werden, anhand der ACTH-Plasma-Konzentration, des Dexamethason-Suppressionstestes und klinischen Symptomen beobachtet werden.
5.1 Experimentelle Studie
5.1.1 Stabilitätsstudie
Der experimentelle Teil dieser Arbeit besteht aus einer Stabilitätsstudie mit welcher der enzymatische Abbau des ACTHs im Vollblut bzw. im Plasma von Pferden untersucht wurde.
Ziel ist es, dass instabile Plasma-ACTH für den Probentransport bei Raumtemperatur zu stabilisieren. Zur Untersuchung standen Proben mit Normwerten und stark erhöhten ACTH- Werten. Mit den Proben beider Gruppen wurde gleichermaßen verfahren (Abb. 5, Seite 36).
Die vierundzwanzigstündige Lagerung entspricht dem Postweg der Proben bei Zusendung durch den Tierarzt ins Untersuchungslabor. Die Ergebnisse beider Gruppen weisen die gleichen Tendenzen auf und lassen die gleichen folgend dargestellten Aussagen und Schlussfolgerungen zu:
Nach Hegstad et al. (1990) hat eine vierwöchige und nach Kemppainen et al. (1994) eine viertägige Lagerung keine bedeutende Auswirkung auf die Immunoreaktivität des ACTHs, so dass die Konzentrationen der bei –22 °C gelagerten Proben als Ausgangswerte angesehen werden können. Danach müssen die voneinander abweichenden durchschnittlichen ACTH- Konzentrationen der bei –22 °C gelagerten Aprotinin versetzen Proben und der zusatzfreien Proben in beiden Gruppen auf den Versuchsaufbau zurückgeführt werden. Es ist davon auszugehen, dass die Zeitspanne von der Blutentnahme bis zum Einfrieren den enzymatischen
Abbau des ACTHs in den nativen Blutproben ermöglicht, was in den unmittelbar nach der Entnahme mit Aprotinin versetzten Proben in sehr viel geringerem Umfang möglich ist.
Die durchschnittliche ACTH-Konzentration liegt in beiden Gruppen in den Aprotinin versetzten Proben bei allen drei Lagerungstemperaturen höher als in den zusatzfreien Proben.
Daraus wird ersichtlich, dass der Proteasenhemmer Aprotinin den enzymatischen Abbau des ACTHs verringert. In der Gruppe der gesunden Pferde ergeben sich bei den Lagerungstemperaturen –22 °C, +6 °C und +22 °C durchschnittliche Abbauraten des ACTHs von 7,21 %; 8,45 % und 5,62 %. Der durchschnittliche Abbau liegt hier bei allen drei Lagerungstemperaturen unter 10 %. In den Proben der Cushing-Pferde liegt der durchschnittliche Abbau des ACTHs bei 12,88 %; 11,73 % und 10,75 % und bleibt somit unter 15 %.
Eine geringe Lagerungstemperatur wirkt sich ähnlich stabilisierend auf die ACTH- Konzentration in den Proben aus wie der Zusatz von Aprotinin. In beiden Gruppen liegen die ACTH-Konzentrationen sowohl in den Aprotinin- als auch in den zusatzfreien Proben nach 24 Lagerung bei –22 °C höher als bei Raumtemperatur. Die Abbauraten liegen hier unter 10
% (Tab. 4 und Tab. 5, Seite 41).
Die Normwerte für equines ACTH (Tab. 1, Seite 17) werden je nach Untersuchungsmethode verschieden hoch angegeben, liegen aber insgesamt betrachtet in einem Rahmen zwischen 17,6 und 55,0 pg/ml. Der in dieser Studie ermittelte durchschnittliche ACTH-Wert in der Gruppe der gesunden Pferde (n= 21) liegt bei 20,7 pg/ml. Für Cushing-Pferde reichen die Angaben über durchschnittliche ACTH-Werte in der Literatur von 314 bis hin zu 13000 pg/ml. Die Cushing-Pferde dieser Studie zeigten im Durchschnitt ACTH-Werte von 255,7 pg/ml.
Weder für die Gruppe der eindeutig gesunden Pferde noch für die Cushing-Pferde würde der oben beschriebene Abbau von 10 % bzw. von 15 % die Diagnosestellung beeinflussen.
Jedoch würde sich ein Problem in der Diagnostik der Grenzfälle, bei Pferden mit ACTH- Werten zwischen 50,0 und 60.0 pg/ml, ergeben. Hier würde ein 10- 15% Abbau des ACTH unter Umständen das Bild verfälschen. Ein solcher Fall wäre zum Beispiel das Pferd Nr. 13 der Tab. 10, S.47. Hier lag neben den eindeutigen klinischen Symptomen und einem positiven Dexamethason-Suppressionstest ein mit 61,8 pg/ml nur ggr. erhöhter ACTH-Wert vor!
