Konzentrationsbestimmung

2.1.2.1 Handhabung der Blutentnahme

Sowohl die Technik der Blutentnahme, als auch die Handhabung der Probe sind entscheidend für die Bestimmung der ACTH-Konzentration. Der Schmerz der Venenpunktion, ein Verweilkatheter oder die Gewöhnung an den Ort der Blutentnahme führen bei Versuchstieren zu keinem deutlichen Anstieg der Plasma-Cortisol-Konzentration (Knol et al. 1992). Nach Stouffer und Lipscomb (1963) kommt es zu einer reversiblen Bindung zwischen der Glasoberfläche und dem ACTH. Dieses Phänomen kommt bei Verwendung von Borosilikatglas aufgrund seines hohen Alkaligehaltes nicht vor (Ratcliff und Edwards 1971).

Hegstad et al. (1990) messen sogar höhere ACTH-Konzentrationen in Borosilikat-Probenröhrchen als in Polypropylen-und Polystyrolröhrchen. Im Gegensatz dazu beschreiben Kemppainen et al. (1994) nur geringste Unterschiede der zu messenden ACTH-Konzentrationen in Glas- uns Plastikröhrchen, ohne aber genauere Angaben zur Glasart zu machen. Der Zusatz des Gerinnungshemmers Ethylendiamintetraazetat (EDTA) hat laut Vague et al. (1971) keinen Einfluß auf die ACTH-Konzentration im Plasma. Der Gerinnungshemmer Heparin ist ein Kohlehydrat, dessen Wirkung an die negativen Ladungen, den Sulfatresten, gebunden ist (Mutschler 1991). Ehrlich und Styvala (1973) beschreiben die Bindung des Heparins an verschiedene Proteine sowie an ACTH, Insulin, Oxytocin und Vasopressin. Auch Dopouy et al. (1985) führen die Absorption von ACTH durch Heparin und die daraus resultierende Molekülaggregation an. Im Radioligandenassay bewirken derartig heparinvernetzte ACTH-Molekülaggregationen eine Herabsetzung der Antigen-Antikörper-Bindung woraus zu hoch berechnete ACTH-Konzentrationen resultieren (Hegstad et al.

1990). Proteolytische Enzyme bewirken eine Instabilität von ACTH in Blut und Plasma (Rees et al. 1976). Beim Zerfall des 39-Aminosäurenmoleküls entstehen ACTH-ähnliche Fragmente, die den Antikörper binden, oder solche die den Antikörper nicht binden. Dieses Geschehen ist eine weitere Ursache für falsch hohe oder falsch niedrige ACTH-Konzentrationen (Dopouy et al.1985). Der enzymatische Abbau des Polypeptids ACTH geschieht durch Proteasen, sog. Kallikreine (Mutschler 1991). Aprotinin ist ein Proteasenhemmer, der neben Kallikrein die enzymatische Aktivität von Trypsin,

Chymotrypsin und Plasmin hemmt. Es zeichnet sich durch extreme Stabilität gegenüber Siedetemperaturen und der Behandlung mit Trichloressigsäure aus (Gebhard et al. 1986).

Meakin und Nelson (1960), Besser et al. (1971) und Zynar (1981) beschreiben eine Verminderung des enzymatischen Abbaus von ACTH durch Anwesenheit des Proteasenhemmers Aprotinin. Auch Kempainen et al. (1994) sind der Meinung, dass native Blut- oder Plasmaproben im Vergleich zu Aprotininversetzten Proben, bei sonst gleicher Vorgehensweise, geringere ACTH-Konzentrationen aufweisen. Dahingegen finden Hegstad et al. (1990) in ihren Experimenten mit Heparin oder EDTA versetzten Probengefäßen durch Zusatz von Aprotinin keine signifikant höheren ACTH-Konzentrationen. Der enzymatische Abbau von ACTH in Blut und Plasma vollzieht sich bei niedrigen Temperaturen langsamer, so dass Hogan et al. (1976), Orth (1979), Peterson (1984), Lambert et al. (1985), Feldmann und Nelson (1996) die Entnahme in gekühlte Probengefäße, die Lagerung und Transport auf Eis und eine Zentrifugation bei 4°C für sinnvoll halten. Hegstad et al. (1990) und Kempainen et al. (1994) sind dahingegen der Auffassung, dass die Aufbewahrung einer Blutprobe für 90 Minuten bei Raumtemperatur keinen signifikanten Unterschied bezüglich der ACTH-Konzentration im Vergleich zu einer Blutprobe, die in einem gekühlten Röhrchen gewonnen und binnen 15 Minuten zentrifugiert wurde, aufweist. Einen Konzentrationsabfall beobachten Hegstad et al. (1990) nach 4-wöchiger Lagerung bei –20° C nicht. Laut Kempainen et al.

(1994) verringert sich die ACTH-Konzentration bei gleicher Lagerungstemperatur nach 6 Monaten deutlich, nach 4 Tagen bei –86°C und -20°C sind die Veränderungen jedoch unwesentlich. Gutkowska et al. (1982) beschreiben unveränderte ACTH-Konzentrationen nach 2-jähriger Lagerung bei -70°C. Kempainen et al. (1994) beobachten einen stabilisierenden Effekt von Aprotinin auf die ACTH-Konzentrationen bei verschiedenen Lagerungstemperaturen (-86°C, 4°C, 22°C, 37°C ) und unterschiedlicher Lagerungsdauer (1-4 Tage).

2.1.2.2 Nachweisverfahren des ACTH im Plasma

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit für Eiweißverbindungen im Piko- und Nanogrammbereich beschreiben zahlreiche Autoren Radioimmunoassays als Nachweisverfahren des ACTH im Plasma (Demura et al. 1996, Berson u. Yalow 1968, Orth

1979, Gutkowska et al. 1982). Radioimmunoassays gehören in die Familie der Immunoassays, welche als Meßverfahren die spezifische Bindungsreaktion zwischen Antikörpern und dem gesuchten Reagenz oder umgekehrt, nutzen. Immunoassays können in 4 Gruppen klassifiziert werden:

1. Label-free assays 2. Reagent-excess assays 3. Reagent-limited assays 4. Ambient analyte

Der typische Vertreter der 3. Gruppe ist der Radioimmunoassay (RIA), häufig auch als kompetetive Analyse aufgeführt. Das Grundprinzip besteht hier in der Konkurrenz zwischen radioaktiv markierter und unmarkierter Substanzmoleküle um die Bindungsstellen eines im Unterschuß vorliegenden Bindungsreagenz.

In die zweite Gruppe gehört der Immunoradiometrische Assay (IRMA). Charakteristisch für die 2. Gruppe ist der im Überschuß vorliegende, für die gesuchte Substanz spezifische, Antikörper. Binden zwei verschiedene Antikörper für jeweils verschiedene Bindungsstellen (Epitope) an die gesuchte Substanz, spricht man von einem „two-site“ Assay oder Sandwich-Assay (Gosling 2000), wobei der 2. Antikörper radioaktiv markiert ist. Hierbei nimmt die Radioaktivität im Gegensatz zum RIA mit steigender Antigenkonzentration zu. Nach einem Vergleich der ACTH-Bestimmung mittels der beiden beschrieben Methoden sehen Gibson et al. (1989) in der größeren Sensitivität und dem weiteren Meßbereich des IRMA deutliche Vorteile gegenüber dem RIA.

Babson (1991) beschreibt ein automatisiertes System des Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assays (CEA). Der CEA ist eine Sandwichmethode bei der der zweite Antikörper mit einem Enzym markiert ist, welches ein später zugefügtes Chemilumineszenzsubstrat zur Lichtemission katalysiert. Die Stärke der Lichtemission wiederum wird gemessen und entspricht der Konzentration des gesuchten Antigens in der Probe.

2.1.2.3 Normwerte von ACTH beim Pferd

McFarlane et al. (1998) finden keinen Unterschied zwischen Plasma-ACTH-Werten bei jungen und älteren (über 20 Jahre) gesunden Pferden. Moore et al. (1979) sehen eine Abhängigkeit der Werte von der Tageszeit. Wilson et al. (1982) haben die Plasma-ACTH-Werte bei 10 gesunden und einem Cushing-Pferd mittels zwei verschiedener Antikörper bestimmt, von denen einer Epitope des ACTH(11-24) und der andere Epitope des ACTH(25-39) erkannte (siehe Tabelle 1).

Autor Plasma-ACTH-Gehalt n- Pferde

Van der Kolk et al. (2001) < 55,0 pg/ml 7

Froin et al. (1997/1998) 17,6 +/- 1,6 pg/ml 41

Couёtil (1996) 18,68 +/- 6,79 pg/ml Pferd

8,35 +/- 2,92 pg/ml Pony

16 13

Orth et al. (1982) 32,0 +/- 5,0 pg/ml 10

Moore et al. (1979) 35,0 +/- 10 pg/ml 8.00

21,4 +/- 9,6 pg/ml 22.00 18

Wilson et al. (1982) 32,5 +/- 5,0 pg/ml ACTH(11-24)

60,0 +/- 4,0 pg/ml ACTH(25-39) 10

Brüns (2001) 20,7 +/- 11,3 pg/ml 21

Tab. 1: Normwerte ACTH beim Pferd in pg/ml Plasma