Repräsentative Differenzanalyse bei Mycobacterium paratuberculosis
THESE
zur Erlangung des Grades eines PHILOSOPHICAL DOCTOR
- Ph.D. -
im Fachgebiet Mikrobiologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Birgit Strommenger
aus Mönchengladbach
Hannover 2001
Prof. Dr. M. Singh Prof. Dr. L. Haas
1. Gutachten: Prof. Dr. G.-F. Gerlach
(Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen, Tierärztliche Hochschule Hannover)
Prof. Dr. M. Singh (GBF, Braunschweig) Prof. Dr. L. Haas (Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover)
2. Gutachten: Prof. Dr. M. Wittenbrink (Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Zürich)
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2001
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Sonderforschungsbereiches 280 („Gastrointestinale Barriere“).
meinen Eltern
Representational difference analysis in Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis 80th Conference of Research Workers in Animal Diseases (CRWAD),
7.-9. November 1999, Chicago, Illinois, USA STROMMENGER, B. und G.-F. GERLACH (2000)
Repräsentative Differenzanalyse bei Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Tagung der deutschen veterinärmedizinischen Gesellschaft
-Fachgruppe Bakteriologie und Mykologie-, 15.-17. Juni 2000, Leipzig STROMMENGER, B., K. STEVENSON und G.-F. GERLACH (2001)
Isolation and diagnostic potential of ISMav2, a novel insertion sequence-like element from Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis
FEMS Microbiology Letters 196, 31-37
STROMMENGER, B. und G.-F. GERLACH (2001)
Representational difference analysis in Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis 82th Conference of Research Workers in Animal Diseases (CRWAD),
11.-13. November 2001, St. Louis, Missouri, USA
A Einleitung... 13
B Schrifttum ... 15
B.1 Mykobakterien... 15
B.2 Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis (M. paratuberculosis)... 15
B.2.1 Vorkommen und Bedeutung ... 15
B.2.2 Taxonomie... 17
B.2.3 Charakterisierung des Erregers ... 18
B.2.3.1 Phänotypische Charakterisierung... 18
B.2.3.2 Molekularbiologische Charakterisierung... 19
B.2.4 Paratuberkulose... 24
B.2.4.1 Pathogenese und Krankheitsbild... 24
B.2.4.2 Aufnahme und intrazelluläres Überleben von M. paratuberculosis in Makrophagen... 25
B.2.4.3 Immunologie ... 28
B.2.4.4 Diagnostik ... 28
B.3 Transponierbare genetische Elemente ... 31
B.3.1 Insertionssequenzen... 31
B.3.2 Zusammengesetzte Transposons... 33
B.3.3 Insertionssequenzen bei Mykobakterien... 34
B.4 Bakterielle Transportproteine... 37
B.4.1 ABC-Transportersysteme ... 37
B.4.2 ABC-Transportersysteme bei Mykobakterien ... 40
B.5 Quorum Sensing ... 41
C Material und Methoden ... 43
C.1 Material ... 43
C.1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien ... 43
C.1.2 Lösungen und Puffer ... 43
C.1.3 Bakterienstämme... 43
C.1.4 Plasmide... 43
C.1.5 Primer ... 51
C.2.1.2 Kultivierung von Mykobakterien... 52
C.2.1.2.1 M. paratuberculosis... 53
C.2.1.2.2 M. avium... 53
C.2.1.2.3 M. smegmatis mc2155 ... 53
C.2.1.3 Ermittlung der Zelldichte ... 53
C.2.1.4 Kulturkonservierung... 54
C.2.2 Molekularbiologische Arbeiten an Mykobakterien... 54
C.2.2.1 Präparation chromosomaler DNA... 54
C.2.2.2 Pulsfeldgelelektrophorese ... 56
C.2.2.2.1 Präparation chromosomaler DNA von M. paratuberculosis und M. avium in Agaroseblöckchen ... 56
C.2.2.2.2 Restriktionsenzymverdau von DNA in Agaroseblöckchen... 58
C.2.2.2.3 Durchführung der Pulsfeldgelelektrophorese... 58
C.2.2.3 Transformation... 59
C.2.2.3.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen von M. smegmatis mc2155... 59
C.2.2.3.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen von M. avium DSM 44157... 59
C.2.2.3.3 Elektrotransformation ... 60
C.2.3 Klonierung M. paratuberculosis spezifischer Fragmente ... 61
C.2.3.1 Repräsentative Differenzanalyse... 61
C.2.3.2 Isolierung und Identifizierung der RDA-Fragmente ... 63
C.2.3.3 Überprüfung der Spezifität der RDA-Fragmente ... 63
C.2.3.4 DNA-Sequenzanalyse ... 64
C.2.3.4.1 Sequenzierung ... 64
C.2.3.4.2 Computeranalyse der Sequenzdaten... 64
C.2.4 Klonierung großer M. paratuberculosis spezifischer DNA- Abschnitte... 65
C.2.4.1 Identifizierung der DNA-Abschnitte ... 65
C.2.4.2 Klonierung der DNA-Abschnitte... 66
C.2.4.3 Identifizierung und Isolierung rekombinanter E. coli Klone ... 66
C.2.4.4 Kontrolle der M. paratuberculosis Spezifität in einer PCR mit internen Primern (IP-PCR)... 67
C.2.5 Phänotypische Untersuchungen ... 67
C.2.5.1 Proteinpräparationen ... 67
C.2.5.1.1 Präparation von Ganzzelllysaten aus Mykobakterien ... 67
C.2.5.1.2 Membranpräparationen aus Mykobakterien... 68
C.2.5.1.3 Proteinaggregatpräparation aus E. coli... 69
C.2.5.1.4 Messung der Proteinkonzentration mit dem Mikro BCA® Protein Assay ... 70
C.2.5.2 Identifizierung von Proteinen in der SDS-PAGE ... 70
C.2.5.2.1 Färberischer Nachweis... 70
C.2.5.3.3 Aufreinigung des Serums über Protein G-Sepharose... 73
C.2.5.3.4 Aufreinigung des Serums durch Absorption an E. coli Ganzzelllysate ... 74
C.2.5.4 Zellkulturversuche... 75
C.2.5.4.1 Aussaat der J774-Mausmakrophagen ... 75
C.2.5.4.2 Infektion der Makrophagen mit M. smegmatis... 76
C.2.5.4.3 Lyse der Makrophagen und Rückgewinnung der Mykobakterien ... 76
C.2.5.5 M. smegmatis Wachstumsversuche... 77
C.2.5.6 Bestimmung der Eisenreduktionsaktivität... 78
C.2.6 Molekularbiologische Standardmethoden... 78
C.2.6.1 Plasmidpräparation... 78
C.2.6.1.1 Plasmid-Minipräparation aus E.coli mittels Alkalischer Lyse ... 78
C.2.6.1.2 Plasmid-Midipräparation aus E. coli mittels Alkalischer Lyse und anschließender Aufreinigung durch Anionenaustauscherchroma- tographie... 79
C.2.6.2 Spektroskopische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA... 80
C.2.6.3 Klonierungen... 80
C.2.6.3.1 Restriktionsenzymverdau ... 80
C.2.6.3.2 Behandlung mit Alkalischer Phosphatase... 81
C.2.6.3.3 Behandlung mit Klenow-Fragment ... 81
C.2.6.3.4 Agarosegelelektrophorese ... 82
C.2.6.3.5 DNA-Aufreinigung aus TAE-Agarosegelen mittels Absorption an eine Silika-Matrix ... 83
C.2.6.3.6 Ligation ... 83
C.2.6.4 Transformation... 84
C.2.6.4.1 Herstellung chemokompetenter Zellen von E. coli... 84
C.2.6.4.2 Transformation chemokompetenter E. coli mit Plasmid-DNA... 85
C.2.6.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ... 86
C.2.6.6 Southern Blot ... 89
C.2.6.6.1 Southern Blotting ... 89
C.2.6.6.2 Präparation a-32P-markierter Gensonden nach der „Random priming“- Methode... 90
C.2.6.6.3 Southern Blot Hybridisierung... 91
C.2.6.6.4 Entfernung der Sonden von hybridisierten Membranen („Strippen“) ... 92
C.2.6.7 Kolonieblot ... 92
C.2.6.7.1 Kolonieblotting ... 92
C.2.6.7.2 Kolonieblot-Hybridisierung ... 93
C.2.7 Proteinchemische und immunologische Standardmethoden ... 94
C.2.7.1 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 94
C.2.7.2 Zweidimensionale SDS-PAGE ... 95
C.2.7.2.1 Probenaufbereitung ... 96
C.2.7.5 Western Blot ... 100
C.2.7.5.1 Proteintransfer im Tankblotting-Verfahren ... 100
C.2.7.5.2 Nachweis immunogener Proteine ... 101
D Ergebnisse... 103
D.1 Isolierung M. paratuberculosis spezifischer Fragmente mittels Repräsentativer Differenzanalyse ... 103
D.1.1 Repräsentative Differenzanalyse (RDA) ... 103
D.1.2 M. paratuberculosis spezifische Fragmente ... 107
D.1.3 Isolierung großer M. paratuberculosis spezifischer Fragmente ... 111
D.1.4 Erstellung von Restriktionskarten für fünf M. paratuberculosis spezifische Fragmente... 112
D.1.5 Auswahl von Fragmenten zur weiteren Charakterisierung ... 114
D.2 Isolierung von ISMav2, einer neuen potentiellen Insertionssequenz von M. paratuberculosis... 114
D.2.1 Ergebnisse der Sequenzanalyse von RDIII201 auf DNA- und Proteinebene ... 114
D.2.2 Pulsfeldgelelektrophorese ... 120
D.2.3 Untersuchungen zur Präsenz von ISMav2 bei Mykobakterien mittels IP-PCR ... 121
D.3 Isolierung von Mpts1, einem potentiellen ABC-Transporter-System von M. paratuberculosis... 123
D.3.1 Ergebnisse der Sequenzanalyse von RDIII300 und RDIII301 auf DNA- und Protein-Ebene ... 123
D.3.2 Untersuchungen zur Präsenz von Mpts1 bei Mykobakterien mittels IP-PCR ... 135
D.3.3 Expression potentieller Gene von Mpts1 in M. smegmatis mc2155 und M. avium DSM 44157 ... 137
D.3.3.1 Erstellung des mykobakteriellen Shuttlevektors pRDIII310... 137
D.3.3.2 Klonierung von RDIII300 in die mykobakteriellen Shuttlevektoren pMV261 und pMV361 ... 139
D.3.3.3 Erstellung von Deletionsmutanten... 142
Gelelektrophorese ... 149
D.3.3.8 Serologischer Nachweis der Proteinexpression... 149
D.3.3.8.1 Herstellung spezifischer Antiseren gegen die Proteine MptAB und MptC ... 149
D.3.3.8.2 Serologischer Nachweis der Proteine MptAB und MptC im Western Blot... 151
E Diskussion ... 155
E.1 Isolierung M. paratuberculosis spezifischer Fragmente mittels Repräsentativer Differenzanalyse ... 155
E.2 ISMav2, eine neue potentielle Insertionssequenz von M. paratuberculosis und ihre Eignung als diagnostischer Marker... 158
E.3 Mpts1, ein potentielles ABC-Transportersystem von M. paratuberculosis. 163 F Zusammenfassung... 175
G Summary... 177
H Literaturverzeichnis ... 179
I Anhang... 213
I.1 Stammlösungen ... 213
I.2 Verbrauchsmaterial... 213
I.3 Chemikalien ... 214
I.4 Enzyme und Enzympuffer... 217
I.5 Molekulargewichtstandards ... 218
I.6 Tabellenverzeichnis ... 219
I.7 Abbildungsverzeichnis ... 220
[v/v] volume per volume (Volumen pro Volumen) [w/v] weight per volume (Gewicht pro Volumen) A. bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser) A. dest. Aqua destillata (einfach destilliertes Wasser)
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
ca. circa (zirka)
Ci Curie
dATP 2‘-Desoxy-Adenosin-5‘-Triphosphat dCTP 2‘-Desoxy-Cytosin-5‘-Triphosphat dGTP 2‘-Desoxy-Guanosin-5‘-Triphosphat
DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2‘-Desoxy-Nucleotid-5‘-Triphosphat
dTTP 2‘-Desoxy-Thymidin-5‘-Triphosphat E. coli Escherichia coli
ERG Eppendorfreagenzgefäß
et al. et alii (und andere)
g Erdbeschleunigungskonstante
h hora (Stunde)
Ig Immunglobulin(e)
inkl. inklusive
IP Interne Primer
kb Kilobasenpaare (103 Basenpaare)
kDa Kilodalton
min Minute(n)
M. Mycobacterium
M Molarität (mol/l)
mM millimolar (mmol/l)
OD Optische Dichte
ORF open reading frame (offener Leserahmen)
PBS phosphat buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PFGE Pulsfeldgelelektrophorese
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion) RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RT Raumtemperatur
RDA Repräsentative Differenzanalyse s. siehe
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
sek Sekunde(n)
SSC standard saline citrate ssp. subspecies (Subspezies) t-RNA transfer RNA (Transfer-RNA)
U unit
UV Ultraviolett
Vol. Volumen
V Volt
A Einleitung
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (M. paratuberculosis) ist der Erreger der Paratuberkulose (Johne´sche Krankheit), einer chronisch granulomatösen Enteritis der Wiederkäuer. Die Erkrankung tritt weltweit auf und führt zu bedeutenden wirtschaftlichen Verlusten.
Taxonomisch stellt M. paratuberculosis, neben M. avium ssp. avium (M. avium) und M. avium ssp. silvaticum (M. silvaticum), eine dritte Subspezies der Spezies M. avium dar. Obwohl die drei Subspezies genetisch eng verwandt sind und untereinander eine über 99 %ige Identität auf DNA-Ebene aufweisen, zeichnen sie sich sowohl durch unterschiedliche phänotypische Merkmale, als auch durch unterschiedliche Wirtsspezifitäten aus. Dabei gilt nur M. paratuberculosis als obligat pathogen für Wiederkäuer, wohingegen M. avium und M. silvaticum als primär pathogen für Vögel angesehen werden.
Die enge genetische Verwandtschaft zwischen M. paratuberculosis und M. avium einerseits und die phänotypischen Unterschiede, sowie die Unterschiede in der Wirtsspezifität andererseits, begründeten die Hypothese, dass potentiell virulenzassoziierte Faktoren des Erregers, die einen Beitrag zur Pathogenese der Paratuberkulose leisten, auf M. paratuberculosis spezifischen DNA-Abschnitten kodiert sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, M. paratuberculosis spezifische DNA-Abschnitte zu isolieren und zu charakterisieren, um so potentiell virulenzassoziierte Faktoren auf molekularer Ebene zu identifizieren. Solche M. paratuberculosis spezifischen Fragmente sollten außerdem auf ihre Eignung als neue diagnostische Marker untersucht werden, da sich die bislang als Zielsequenz in der PCR-gestützten Diagnostik von M. paratuberculosis genutzte Insertionssequenz IS900 als nicht vollständig spezifisch erwiesen hat.
Zur Isolierung M. paratuberculosis spezifischer DNA-Sequenzen wurde eine Repräsentative Differenzanalyse durchgeführt. Zwei der dabei identifizierten M. paratuberculosis spezifischen Fragmente wurden im Folgenden zur weiteren Charakterisierung mittels molekularbiologischer und proteinbiochemischer Methoden ausgewählt.
B Schrifttum
B.1 Mykobakterien
Mykobakterien sind unbewegliche, schwach grampositive, säurefeste Stäbchen aus der Ordnung der Actinomyceten und nahe verwandt mit Nokardien, Corynebakterien und Streptomyceten. Charakteristisch für alle Mykobakterien ist ihr komplexer Zellwandaufbau (BRENNAN u. NIKAIDO 1995). Ihre Zellwand enthält einen hohen Anteil an Lipiden, darunter auch stark verzweigte Mykolsäuren. Dieser Aufbau verleiht den Bakterien eine besonders hohe Stabilität und ist verantwortlich für ihre Säurefestigkeit. Man unterscheidet zwischen langsam und schnell wachsenden Mykobakterien (STAHL u. URBANCE 1990). Dabei umfassen die langsam wachsenden Spezies die meisten pathogenen Mykobakterien, wie z. B.
M. tuberculosis, M. leprae, M. avium und M. paratuberculosis, wohingegen zu den schnell wachsenden Spezies die meisten apathogenen Mykobakterien, z. B.
M. smegmatis, gehören.
B.2 Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis (M. paratuberculosis)
B.2.1 Vorkommen und Bedeutung
M. paratuberculosis ist der Erreger der Paratuberkulose (Johnsche Krankheit), einer chronisch granulomatösen Enteritis der Wiederkäuer (KREEGER 1991). Die Erkrankung wurde erstmals im Jahre 1895 von JOHNE und FRONTINGHAM beschrieben. Damals hielt man die aus der Dünndarmschleimhaut eines erkrankten Tieres isolierten säurefesten Stäbchen für modifizierte Formen von M. tuberculosis oder M. avium und die Erkrankung für eine intestinale Form der Tuberkulose. Elf Jahre später differenzierte BANG (1906) die Erkrankung von der Tuberkulose und schlug die Bezeichnung „Enteritis chronica bovis pseudotuberculosa“ vor. Die erste
Isolierung des Erregers aus den Mesenteriallymphknoten infizierter Rinder beschrieben BUGGE und ALBIEN (1908), aber erst 1912 gelang es TWORT und INGRAM, das Bakterium, das sie Mycobacterium enteritidis chronicae pseudotuberculosis bovis johne nannten, gezielt anzuzüchten. Seither wurde der Erreger mehrfach umbenannt, und schließlich von THOREL et al. (1990) aufgrund seiner engen Verwandtschaft zu M. avium als M. avium subspezies (ssp.) paratuberculosis (M. paratuberculosis) klassifiziert.
Die Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete Erkrankung der Wiederkäuer (MERKAL 1984). Es sind nicht nur Hauswiederkäuer, sondern auch Wildwiederkäuer, sowie Wiederkäuer in zoologischen Gärten betroffen (CHIODINI u.
VAN KRUININGEN 1983; WEBER et al. 1992; CLARKE 1997; BUERGELT et al.
2000). Abweichend von dieser Wiederkäuerspezifität wurden Infektionen bei Wildkaninchen (GREIG et al. 1997), Schweinen (THOEN et al. 1975), Hunden (VOGEL 1977), Eseln (VAN ULSEN 1970) und Stummelschwanz-Makaken (MC CLURE et al. 1987) beschrieben. In Europa sind v. a. Norddeutschland (SCHLIESSER u. SCHAAL 1984), die Niederlande, Großbritannien (CETINKAYA et al. 1996) und Dänemark (JØRGENSEN 1977; NIELSEN et al. 2000) von der Paratuberkulose betroffen. Aufgrund der Merzung aller Paratuberkulose-infizierten Rinderbestände ist Schweden das einzige Paratuberkulose-freie Land in der Europäischen Gemeinschaft (VISKE et al. 1996). Außerhalb der Europäischen Gemeinschaft gibt es Untersuchungen zum Vorkommen der Paratuberkulose für die USA (CHIODINI u. VAN KRUININGEN 1986; MERKAL et al. 1987; BRAUN et al.
1990; COLLINS et al. 1994), Kanada (MC NAB et al. 1991), Australien (VANDEGRAFF et al. 1994) und Neuseeland (DE LISLE u. REICHEL 1997). Der Anteil infizierter Herden an den Gesamtrinderpopulationen wird mit 7% bis 55%
angegeben (MANNING u. COLLINS 2001). Angaben über Prävalenzen sind jedoch nur schwer zu vergleichen, da in vielen Staaten bisher keine flächendeckenden Untersuchungen durchgeführt wurden. Außerdem liegen den vorliegenden Untersuchungen in der Regel unterschiedliche diagnostische Systeme zugrunde.
COLLINS (1994) bezeichnete die Paratuberkulose als eine der bedeutendsten und kostenintensivsten Krankheiten der Milchrinder. Ökonomische Schäden entstehen einmal durch den Verlust der Tiere, die klinisch an Paratuberkulose erkrankt sind, aber auch subklinisch infizierte Tiere können durch geringere Milchleistung, Mastitiden und verminderte Fertilität wirtschaftliche Schäden verursachen (BENEDICTUS et al. 1987; HUTCHINSON 1996; HARRIS u. BARLETTA 2001).
Die Beziehung zwischen der bovinen Paratuberkulose und der Crohn´schen Erkrankung des Menschen ist noch nicht geklärt. Die Erkrankung (CROHN et al.
1932) weist in ihrem Krankheitsbild Ähnlichkeiten mit der Paratuberkulose auf. Aus den veränderten Darmbereichen von an Morbus Crohn erkrankten Patienten konnte ein M. paratuberculosis-ähnlicher Erreger kulturell isoliert oder mittels PCR die für den Erreger spezifische Insertionssequenz IS900 nachgewiesen werden (CHIODINI 1989; LISBY et al. 1994; SUENAGA et al. 1995). Ein ätiologischer Zusammenhang zwischen der Paratuberkulose des Rindes und dem Morbus Crohn des Menschen wird jedoch weiterhin sehr kontrovers diskutiert (HERMON-TAYLOR et al. 2000;
COOK 2000).
B.2.2 Taxonomie
Der Erreger wird heute innerhalb der Ordnung der Actinomycetales in die Familie der Mycobacteriaceae eingeordnet. THOREL et al. (1990) klassifizierten den Erreger anhand von biochemischen Charakteristika als eine weitere Subspezies (M. avium ssp. paratuberculosis) von Mycobacterium avium, neben M. avium ssp. avium (M. avium) und M. avium ssp. silvaticum (M. silvaticum).
Die drei M. avium Subspezies zeichnen sich durch unterschiedliche Wirtsspezifitäten aus. Nur M. paratuberculosis gilt als obligat pathogen für Wiederkäuer, wohingegen M. avium und M. silvaticum als primär pathogen für Vögel angesehen werden.
Dennoch wurden alle drei Subspezies aus Darmläsionen verschiedener
Monogastrier isoliert (GRANGE et al. 1990; THOREL et al. 1997). Ihre Beteiligung an der Entstehung dieser Veränderungen konnte jedoch nicht eindeutig geklärt werden.
B.2.3 Charakterisierung des Erregers
B.2.3.1 Phänotypische Charakterisierung
M. paratuberculosis ist ein unbewegliches, schwach grampositives, säurefestes Stäbchen von 0,3-0,5 µm Breite und 0,3-2 µm Länge (BISPING u. AMTSBERG 1988). Es wächst aerob und bildet bei einer Generationszeit von 1,3-4,4 Tagen erst nach 8-12 Wochen rauhe, nur selten pigmentierte (Bildung von gelb-orangem Pigment bei einigen Isolaten von Schafen) Kolonien auf festen Nährböden (LAMBRECHT et al. 1988). Der Erreger wächst ausschließlich auf komplexen Nährmedien, wobei das eidotterhaltige Medium nach Herrold (Herrold´s egg yolk medium, HEYM) mit Mycobactinzusatz als Medium der Wahl angesehen wird (MERKAL et al. 1968). Auch in flüssigen Nährmedien kann M. paratuberculosis kultiviert werden, neigt jedoch darin zur Klumpenbildung. Charakteristisch für M. paratuberculosis ist das Mycobactin-abhängige Wachstum in vitro. Mycobactin ist ein zellwandassoziierter Eisenchelatbildner, der von allen Mykobakterien -mit Ausnahme von M. leprae und M. paratuberculosis- in vitro synthetisiert wird (FRANCIS et al. 1953; BARCLAY et al. 1985; WHEELER u. RATLEDGE 1994).
Daher wird das langsame Wachstum auf mycobactinhaltigen komplexen Nährböden als einziges phänotypisches Merkmal zur Unterscheidung von M. paratuberculosis von anderen Mykobakterien herangezogen (LAMBRECHT u. COLLINS 1992).
Allerdings konnte eine Medienabhängigkeit dieser Mycobactinauxotrophie nachgewiesen werden (THOREL 1984; LAMBRECHT u. COLLINS 1992; AADURIZ et al. 1995), die möglicherweise auch die Ursache für Berichte über den Verlust der Mycobactinabhängigkeit von M. paratuberculosis nach wiederholter Passagierung in vitro sein könnte (GERLACH u. VALENTIN-WEIGAND 1998).
M. paratuberculosis zeichnet sich durch eine außergewöhnlich hohe Tenazität aus (LOVELL et al. 1944; LARSEN et al. 1956; SUNG u. COLLINS 1998), die u. a. durch
den besonderen Aufbau der Zellwand bedingt wird. Den formbestimmenden Anteil der Zellwand stellt eine Peptidoglycanschicht dar, deren chemische Zusammensetzung der anderer Bakterien ähnelt. Diese Peptidoglycanschicht ist über Phosphordiesterbindungen verbunden mit Arabinogalactan, einem verzweigten Polysaccharid, dessen distale Enden mit charakteristischen Mycolsäuren verestert sind. Peptidoglycan, Arabinogalactan und Mycolsäuren stellen gemeinsam das sogenannte „Zellwandskelett“ dar, an das verschiedene Lipide, Glycolipide und Proteine angelagert sind, deren Zusammensetzung in Abhängigkeit von der Mykobakterienspezies variiert (MINNIKIN 1991; BRENNAN u. DRAPER 1994).
Zusammen mit der Zytoplasmamembran ergibt sich bei den grampositiven Mykobakterien ein Membranaufbau, der dem von gramnegativen Bakterien sehr ähnlich ist.
Einen wichtigen Zellwandbestandteil bezüglich der Pathogenese von Mykobakterien stellt das Lipoarabinomannan (LAM) dar (STROHMEIER u. FENTON 1999), das vermutlich in der Zytoplasmamembran verankert ist und sich durch die Peptidoglykanschicht bis an die Zelloberfläche erstreckt (BRENNAN u. NIKAIDO 1995). LAM stellt eine lösliche immunmodulatorische Zellwandkomponente dar, die über Interaktion mit CD14 und Mannose-Rezeptoren der Makrophagen vermutlich auch an der Aufnahme der Erreger in die Zellen verantwortlich ist (STROHMEIER u.
FENTON 1999).
B.2.3.2 Molekularbiologische Charakterisierung
Das Genom von M. paratuberculosis ist 4,4 x 106 bp bis 4,7 x 106 bp groß, und damit etwas größer als die Genome nahe verwandter Mykobakterien (M. avium: ca.
3,5 x 106 bp; M. tuberculosis: 4,4 x 106 bp; M. leprae: 3,3 x 106 bp). Sein GC-Gehalt liegt bei 66 bis 67%; das entspricht in etwa dem GC-Gehalt anderer Mykobakterien, der zwischen 62 und 70% beträgt. Nur M. leprae hat mit 55 bis 58% einen deutlich geringeren GC-Anteil (BAESS u. MANSA 1978; IMAEDA et al. 1982; MC FADDEN et al. 1987; IMAEDA et al. 1988; ANTOINE et al. 1988; COCITO et al. 1994).
Das natürliche Vorkommen von extrachromosomaler Plasmid-DNA, das zunächst für M. fortuitum (LABIDI et al. 1992) und später auch für Isolate von M. avium, M. scrofulaceum und M. intracellulare (FALKINHAM u. CRAWFORD 1994) beschrieben wurde, konnte bei M. paratuberculosis bislang nicht nachgewiesen werden (HARRIS u. BARLETTA 2001).
Mit Hilfe von DNA-DNA-Hybridisierungsversuchen wurde die genetische Verwandtschaft zwischen M. paratuberculosis und anderen Mykobakterien untersucht. Dabei erwies sich die DNA von M. paratuberculosis als nahezu 100%
homolog zu DNA der meisten M. avium und M. silvaticum Stämme. Ausnahmen stellten die M. avium Stämme der Serovare 7 und 19 dar, die deutlich geringere Verwandtschaft zu M. paratuberculosis aufwiesen (IMAEDA et al. 1988; HURLEY et al. 1988; SAXEGAARD et al. 1988; YOSHIMURA u. GRAHAM 1988). Diese enge genetische Verwandtschaft und die gleichzeitig vorliegenden phänotypischen Unterschiede, sowie die Unterschiede in der Wirtsspezifität zwischen M. paratuberculosis und M. avium bestätigen die Klassifizierung nach THOREL et al.
(1990). Eine der wenigen genotypischen Differenzierungsmöglichkeiten stellt die Insertionssequenz IS900 dar, die 15 bis 20 mal im M. paratuberculosis Genom vorkommt (COLLINS et al. 1989; GREEN et al. 1989), jedoch nicht in den Genomen von M. avium und M. silvaticum. Ein zusätzlicher genotypischer Marker wurde mit der Insertionssequenz IS1311 identifiziert, die sowohl bei M. paratuberculosis als auch bei M. avium und M. intracellulare vorkommt, sich jedoch durch das Auftreten subspeziesspezifischer Punktmutationen einer Subspezies zuordnen lässt (WHITTINGTON et al. 1998).
Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Verwandtschaft von M. paratuberculosis zu anderen Mykobakterien und zwischen verschiedenen M. paratuberculosis Isolaten war die Analyse der hochkonservierten rRNA-Gensequenzen. Dabei fiel auf, dass die Kopienzahl der rRNA-Gene bei apathogenen Mykobakterien auf zwei und bei pathogenen auf eine einzelne Kopie reduziert ist, wohingegen E. coli sieben Kopien besitzt (BERCOVIER et al. 1986; STAHL u. URBANCE 1990; CHIODINI 1990;
KRAWIEC u. RILEY 1990). Die Autoren sehen einen Zusammenhang zwischen der Kopienzahl an rRNA-Genen und der Generationszeit der Erreger. Die Analyse der
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) der 5S rRNA-Gene zeigte ebenfalls die enge Verwandtschaft von M. paratuberculosis zu M. avium auf (CHIODINI 1990). Der Autor konnte außerdem nachweisen, dass M. paratuberculosis Isolate unterschiedlicher Tierarten -im Gegensatz zu verschiedenen M. avium Isolaten- identische RFLP-Muster mit einer 5S rRNA Gensonde aufwiesen. Als Grund hierfür sah er eine unidirektionale genetische Selektion an, die auf der Isolation des Erregers in seiner spezifischen biologischen Nische beruht. Ähnliche Ergebnisse bezüglich der engen Verwandtschaft von M. paratuberculosis und M. avium erzielten STAHL und URBANCE (1990) durch die Sequenzierung der 16S rRNA-Gene und VAN DER GIESSEN et al. (1994) durch den Vergleich der Sequenzdaten der 23S rRNA-Gene und der 16S-23S-Spacerregion.
Trotz der Isolierung und Sequenzierung verschiedenster Gene aus den Genomen von M. paratuberculosis, M. avium und M. silvaticum (HANCE et al. 1989; GREEN et al. 1989; STEVENSON et al. 1991; GILOT et al. 1993; EL-ZAATARI et al. 1994;
STEVENSON u. SHARP 1997) war es bislang kaum möglich, die Funktion der zugehörigen Genprodukte im Hinblick auf die Virulenz und das intrazelluläre Überleben von Mykobakterien zu ermitteln. Diese Schwierigkeiten beruhten zum einen auf der wenig effizienten Expression mykobakterieller Gene in E. coli, zum anderen auf der mangelhaften genetischen Manipulierbarkeit von Mykobakterien, die u. a. auf ihr langsames Wachstum und ihren komplexen Zellwandaufbau zurückzuführen sind. In den letzten Jahren wurden zunächst Systeme zur genetischen Manipulation von M. smegmatis, M. tuberculosis und M. bovis BCG entwickelt (JACOBS et al. 1991; HATFULL 1993; BURLEIN et al. 1994; JACOBS u.
BLOOM 1994). Die Einführung von Fremd-DNA in Mykobakterien erfolgte zum einen durch Infektion mit Mykobakteriophagen (HATFULL u. JACOBS 1994), zum anderen mittels Elektroporation. Dabei werden Plasmide in die Bakterienzellen verbracht, die entweder extrachromosomal verbleiben und selbstständig replizieren oder in das Bakterienchromosom integrieren und mit diesem repliziert werden (FALKINHAM u.
CRAWFORD 1994). Auch die Elektroporation mit Transposon-tragenden Plasmiden wurde beschrieben, bei denen das Transposon nach der Einführung in die
Bakterienzelle vom Plasmid an seine Zielstelle im Bakterienchromosom „springt“
(MC ADAM et al. 1994). Systeme zur homologen Rekombination konnten für M. smegmatis (HUSSON et al. 1990), M. bovis BCG (NORMAN et al. 1995), M. tuberculosis (BALASUBRAMANIAN et al. 1996) und M. intracellulare (MARKLUND et al. 1995; HINDS et al. 1999) etabliert werden. Als Methode der Wahl zur Transformation von Mykobakterien erwies sich die Elektroporation, bei der die Bakterienzellen einem kurzen elektrischen Impuls unterworfen werden (JACOBS et al. 1991). Mit Hilfe dieser Methode konnten die höchsten Transformationsraten erzielt werden. Zur Transformation von M. smegmatis, der aufgrund seines schnellen Wachstums und seiner Apathogenität den optimalen Ersatzwirt für die Einschleusung mykobakterieller DNA darstellt, konnten außerdem Mutanten hergestellt werden, die mit einer Transformationsrate von mehr als 105 Transformanden je µg Plasmid-DNA etwa 105 mal effizienter transformierbar waren als der Wildtypstamm (SNAPPER et al. 1990). Weitere Untersuchungen zeigten eine Temperaturabhängigkeit der beobachteten Transformationserfolge. Während bei schnell wachsenden Mykobakterien bei 0°C die besten Transformationsergebnisse erzielt wurden, wurde die Effizienz der Transformation bei langsam wachsenden Mykobakterien mit steigender Temperatur erhöht und war bei 37°C optimal. Auch eine Vorbehandlung der zu transformierenden Bakterien mit Glycin verbesserte die Effizienz der Transformation, was auf eine Störung der Zellwandintegrität zurückgeführt wurde (WARDS u. COLLINS 1996). FOLEY-THOMAS et al. (1995) konnten zeigen, dass auch M. avium und M. paratuberculosis mit den bereits beschriebenen Methoden transfiziert und transformiert werden konnten. Die Transfektions- und Transformationseffizienzen waren jedoch sehr gering und stark abhängig von dem verwendeten Stamm. Basierend auf den Untersuchungen zur Transfektion von M. paratuberculosis entwickelten HARRIS et al. (1999) ein Transposon-Mutagenesis System für M. paratuberculosis. Mit Hilfe dieses Systems gelang es CAVAIGNAC et al. (2000), etwa 2000 Mutanten herzustellen.
Zur Expression mykobakterieller Gene sind Kenntnisse über die Genexpression erforderlich. Hierzu zählen die Charakterisierung des Promotors, der Ribosomen-
bindungsstelle (RBS), des Startkodons und des Kodongebrauchs. Die Analyse verschiedener potentieller mykobakterieller Promotoren erlaubte den Schluss, dass diese den in E. coli bekannten Regulatorsequenzen sehr ähnlich sind (DALE u.
PATKI 1990). In einer ausführlichen Studie konnten BASHYAM et al. (1996) eine große Ähnlichkeit in den -10-Regionen der von ihnen untersuchten mykobakteriellen Promotoren mit E. coli-Promotoren nachweisen; allerdings unterschieden sich die -35-Regionen der Promotoren sehr deutlich voneinander. In einer weiteren Studie untersuchten BASHYAM und TYAGI (1998) außerdem die Rolle eines TGN-Motivs stromaufwärts der -10-Region, das offensichtlich Einfluss auf die Stärke des Promotors nehmen kann. Im Gegensatz zu den Promotorstudien von BASHYAM et al. (1996) stehen die Untersuchungen von BANNANTINE et al. (1997), die potentielle Promotorsequenzen aus M. paratuberculosis analysierten. Die Analyse ergab -10- und -35-Konsensussequenzen, die nicht mit den Konsensussequenzen von E. coli korrespondierten und auch keine Ähnlichkeiten mit bekannten mykobakteriellen Promotoren aufwiesen. MURRAY et al. (1992) beschrieben die Nutzung eines Promotors aus M. paratuberculosis zur Konstruktion eines Expressionsvektors für Mykobakterien.
Der ribosomalen Bindungsstelle (RBS, Shine-Dalgarno-Sequenz), einer A/G-reichen Sequenz von ca. 7 bp Länge, folgt nach 4 bis 7 bp das Startkodon. Diese Organisation entspricht den Verhältnissen bei E.coli. Als Startkodon kommen bei Mykobakterien AUG oder GUG etwa in gleicher Häufigkeit vor, was den hohen GC- Gehalt der Mykobakterien reflektiert (DALE u. PATKI 1990; BURLEIN et al. 1994).
Mykobakterien weisen eine deutliche Kodonbias auf. Diese zeigt sich in der Dominanz von Kodons mit einem G oder C an der dritten Kodonposition. Ursache hierfür ist vermutlich der hohe GC-Gehalt der Bakterien (DALE u. PATKI 1990).
B.2.4 Paratuberkulose
B.2.4.1 Pathogenese und Krankheitsbild
Die Infektion erfolgt meist oral, über die Aufnahme von kontaminiertem Futter oder Kolostrum. Auch intrauterine Infektionen sind beschrieben (SEITZ et al. 1989;
SWEENEY et al. 1992b) und spielen v. a. bei Foeten klinisch erkrankter Kühe eine bedeutsame Rolle.
Die Erreger gelangen in den Darm, wo sie durch die M-Zellen im Domepithel der Peyer´schen Platten die Darmschleimhaut überwinden und nachfolgend von sub- und intraepithelialen Makrophagen aufgenommen werden (CHIODINI et al. 1984;
MOMOTANI et al. 1988). M. paratuberculosis hat die Fähigkeit, in Makrophagen und Monozyten zu persistieren und sich in ihnen zu vermehren. Das intrazelluläre Bakterienwachstum führt schließlich zum Absterben der Makrophagen. Die Erreger werden freigesetzt und entweder ausgeschieden oder erneut phagozytiert. Die Infektion breitet sich im Dünndarm aus, und es kommt zur lymphogenen und hämatogenen Disseminierung in Leber, Niere und Milz (CLARKE 1997). Die größer werdenden granulomatösen Läsionen in der Darmschleimhaut führen -zusammen mit anderen Faktoren- zu einer Enteropathie mit Proteinverlust und schließlich zur Hypoproteinämie.
Klinisch werden drei Stadien der Erkrankung unterschieden. Im ersten, subklinischen Stadium zeigen die Tiere keinerlei Symptome und scheiden den Erreger nicht aus.
Im nächsten Stadium wird der Erreger intermittierend mit dem Kot und der Milch ausgeschieden (TAYLOR et al. 1981; SWEENEY et al. 1992a). Erst im dritten Stadium sind die Tiere schließlich klinisch erkrankt. Die Erkrankung äußert sich in zunächst intermittierendem, später anhaltendem therapieresistentem Durchfall mit fortschreitender Abmagerung bei ungestörtem Allgemeinbefinden und erhaltener Fresslust.
Die Empfänglichkeit der Wirtstiere für eine Erkrankung ist altersabhängig. Kälber unter 30 Tagen zeigen die höchste Empfänglichkeit. Klinische Erkrankungen treten jedoch erst nach einer sehr langen Inkubationszeit im Alter von 2 bis 5 Jahren -oft im Zusammenhang mit Stressfaktoren, wie der Abkalbung (MERKAL 1973)- auf. Nur bei sehr hohen Infektionsdosen erkranken auch Kälber unter 12 Monaten klinisch (CLARKE 1997). Über 2 Jahre alte Rinder gelten als resistent gegenüber einer Infektion (LARSEN et al. 1975).
B.2.4.2 Aufnahme und intrazelluläres Überleben von M. paratuberculosis in Makrophagen
Der entscheidende Prozess in der Etablierung und dem Fortschreiten der Erkrankung scheint die Persistenz des Erregers im Makrophagen zu sein. Allerdings kann zur Zeit über die Mechanismen des Eintritts und des intrazellulären Überlebens nur spekuliert werden (VALENTIN-WEIGAND u. GOETHE 1999).
Für M. avium und M. tuberculosis konnte gezeigt werden, dass LAM spezifisch Makrophagenrezeptoren, wie CD14 und den Mannoserezeptor, erkennt und so die Phagozytose der Bakterien fördert (CHAN u. KAUFMANN 1994; STROHMEIER u.
FENTON 1999). SCHOREY et al. (1997) wiesen nach, dass pathogene Mykobakterien in der Lage sind, das Komplementfragment C2a in eine C3- Konvertase umzuwandeln. Diese Umwandlung resultiert in einer C3b Opsonierung der Mykobakterien, die dann durch Makrophagen erkannt und phagozytiert werden können.
ZURBRICK und CZUPRYNSKI (1987) stellten fest, dass die Zugabe von 10%
Immunserum hochgradig fördernd auf die Phagozytose von M. paratuberculosis durch bovine Makrophagen wirkte. Hierdurch erfolgt vermutlich eine Opsonierung, die eine rezeptorvermittelte Aufnahme begünstigt. Außerdem ist M. paratuberculosis in der Lage, Fibronektin zu binden, das ebenfalls als Ligand dienen könnte, um die Internalisierung der Bakterien zu ermöglichen (VALENTIN-WEIGAND u. MORIARTY 1992).
M. paratuberculosis ist innerhalb der Makrophagen intraphagosomal lokalisiert. Dies konnte sowohl in Studien an Geweben infizierter Tiere als auch an in vitro infizierten bovinen und murinen Makrophagen gezeigt werden (BENDIXEN et al. 1981;
KUEHNEL et al. 2001). Dabei konnten noch nach über vier Wochen intakte Bakterien licht- und elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden (ZURBRICK u.
CZUPRYNSKI 1987). Eine Abtötung oder Lyse der Bakterien wurde weder in Makrophagen von infizierten Tieren noch von nicht infizierten Tieren beobachtet (BENDIXEN et al. 1981; KUEHNEL et al. 2001). In einer Studie an murinen J774- Makrophagen konnte gezeigt werden, dass sowohl lebende als auch hitzeabgetötete pathogene Mykobakterien (M. paratuberculosis und M. avium) bis zu 15 Tage intrazellulär nachgewiesen werden konnten. Während die pathogenen Spezies in den Phagosomen überleben konnten, waren apathogene Mykobakterien (M. smegmatis und M. gordonae) nach etwa 24 Stunden abgetötet worden (KUEHNEL et al. 2001).
Die Pathogenität intrazellulärer Erreger ist oft abhängig von ihrer Fähigkeit, Wirtszellfunktionen zu manipulieren. GUERIN und DE CHASTELLIER (2000) demonstrierten z. B., dass pathogene Mykobakterien in der Lage sind, das Aktinfilament-Netzwerk von Makrophagen zu zerstören. Auch die Bildung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffradikalen in Makrophagen kann von einigen Mykobakterien beeinflusst werden (HARRIS u. BARLETTA 2001). Eine Thioredoxin- Reduktase von M. leprae kann z. B. den sauerstoffabhängigen Eliminierungs- mechanismus der Wirtszelle ausschalten, indem dieses Enzym die freiwerdenden Sauerstoffradikale sehr effektiv bindet (WIELES et al. 1997). Zudem besitzt M. leprae eine sehr effektive Superoxiddismutase, die O2-Radikale in das für Bakterien weniger toxische H2O2 überführt (LYGREN et al. 1986). Bei M. paratuberculosis wurde ein solches Enzym von LIU et al. (2001) nachgewiesen.
VALENTIN-WEIGAND und GOETHE (1999) stellten die Hypothese auf, dass eine von HOMUTH et al. (1998) bei M. paratuberculosis identifizierte Eisenreduktase mit der Reduktion von Fe3+ die Bildung toxischer Hydroxylverbindungen verhindern kann.
Damit würde dieses Enzym zum einem die Bildung von toxischen Radikalen durch
die Wirtszelle verhindern, zum anderen aber auch zur Eisenaufnahme des Bakteriums innerhalb der Wirtszelle beitragen.
Die Fähigkeit zur Eisenaufnahme unter den Eisenmangelbedingungen im Wirtsorganismus stellt einen wichtigen Virulenzfaktor von Bakterien dar. Bei Mykobakterien galten bisher die Mycobactine als verantwortlich für die Eisenaufnahme der Bakterien innerhalb der Wirtszelle; allerdings zeigten LAMBRECHT und COLLINS (1993), dass diese Siderophore innerhalb des Wirtsorganismus nicht synthetisiert werden, so dass bei diesen Organismen ein anderer Eisenaufnahmemechanismus existieren muss. Hierbei könnte eine andere Klasse von Eisenchelatbildnern, die sezernierten Exocheline, eine wichtige Rolle spielen. Bei M. paratuberculosis konnten bislang keine Siderophoren nachgewiesen werden (DE VOSS et al. 1999). Die von HOMUTH et al. (1998) charakterisierte Eisenreduktase repräsentiert vermutlich eine alternative Strategie der Eisenmobilisierung innerhalb des Makrophagen bei M. paratuberculosis.
M. tuberculosis und M. avium sind in der Lage, die Ansäuerung der Phagosomen zu verhindern (CHICUREL et al. 1988; CROWLE et al. 1991; STURGILL-KOSZYCKI et al. 1994). Da hitzeabgetötete Bakterien hierzu nicht mehr in der Lage waren, wird vermutet, dass eine oder mehrere hitzelabile Proteinfraktionen für diese Hemmung verantwortlich sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass M. tuberculosis die Phagosomen-Lysosomen-Fusion stören kann (CLEMENS u. HORWITZ 1995;
BARKER et al. 1997; DERETIC et al. 1997). Auf diese Weise wird verhindert, dass große, saure hydrolasereiche Bezirke entstehen, die den Erreger zerstören (MC DONOUGH et al. 1993). Dieses Phänomen scheint durch das Fehlen einer Protonen-ATPase in der die Mykobakterien umgebenden Vakuolenmembran bedingt zu sein (STURGILL-KOSZYCKI et al. 1994).
Untersuchungen an M. paratuberculosis infizierten Mausmakrophagen zeigten, dass lebende Erreger ebenfalls in der Lage waren, die Phagosomenansäuerung, sowie die Phagosomenreifung und die Phagosomen-Lysosomen-Fusion zur stören. Im Gegensatz dazu konnten apathogene Mykobakterien die Ansäuerung nur verzögern, aber nicht vollständig verhindern (KUEHNEL et al. 2001).
B.2.4.3 Immunologie
In der subklinischen Phase der Erkrankung überwiegt die zelluläre Immunantwort, die zunächst die Proliferation der Erreger limitieren kann. Dieses Stadium ist charakterisiert durch die Proliferation von T-Helfer (TH) 1 Zellen und die Produktion von Interferon g, Interleukin 2 (IL2) und Tumornekrosefaktor a. Mit einem Wechsel von der TH-1 zur TH-2 Antwort verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung einer humoralen Immunantwort (CHIODINI et al. 1984; CLARKE 1997). Die hierbei gebildeten Immunglobuline und Cytokine sind jedoch nicht protektiv, so dass die Erkrankung fortschreiten kann. Im Finalstadium kann schließlich der Zustand der Anergie eintreten.
B.2.4.4 Diagnostik
Der direkte Nachweis des Erregers erfolgt u. a. durch die mikroskopische Untersuchung von Kot, Rektumbioptaten, Darmschleimhaut oder Mesenterial- lymphknoten verdächtiger Tiere nach Ziehl-Neelsen-Färbung. Eine sichere Differenzierung von M. paratuberculosis von anderen säurefesten Stäbchen ist dabei jedoch nicht möglich (MERKAL 1973).
Durch kulturelle Untersuchung der genannten Proben lässt sich M. paratuberculosis nach frühestens acht Wochen in Form sichtbarer Kolonien säurefester Stäbchen auf speziellen mycobactinhaltigen Nährböden nachweisen. Das Untersuchungsmaterial muss dazu dekontaminiert werden, um während der langen Bebrütungszeit ein Überwuchern der Mykobakterien zu verhindern (COLLINS 1996). Die Sensitivität des kulturellen Kotnachweises wird auf etwa 50% geschätzt (SOCKETT et al. 1992).
Eine Alternative zum kulturellen Nachweis des Erregers stellen molekularbiologische Nachweismethoden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR;
polymerase chain reaction) und spezifischer Gensonden dar, mit deren Hilfe der Nachweis mykobakterieller DNA aus klinischen Proben innerhalb von drei bis vier Tagen erfolgen kann (THOEN u. HAAGSMA 1996). Die PCR-Technik wurde zur
Diagnose verschiedener mykobakterieller Infektionen eingesetzt (SOINI u.
VILJANEN 1997), wobei unterschiedliche spezies- oder subspeziesspezifische Gene als Zielsequenzen genutzt wurden. Die spezifische Detektion von M. paratuberculosis basierte jedoch meist auf der Sequenz der M. paratuberculosis spezifischen Insertionssequenz IS900. Die Verwendung einer Insertionssequenz als Zielsequenz verleiht dem Test eine höhere Sensitivität, da Insertionssequenzen meist in mehreren Kopien im Genom vorhanden sind. IS900 wurde von GREEN et al.
(1989) und COLLINS et al. (1989) unabhängig voneinander als M. paratuberculosis spezifischer repetitiver DNA-Abschnitt beschrieben. VARY et al. (1990) benutzten eine IS900-Gensonde, die ein durch eine vorangegangene PCR amplifiziertes IS900- Fragment von 229 bp in M. paratuberculosis Isolaten nachwies. MILLAR et al. (1995) wählten zur Amplifikation eines 402 bp langen Fragmentes aus IS900 Primer aus, die das von VARY et al. (1990) amplifizierte Fragment umfassten. MOSS et al. (1991) beschrieben eine 278 bp lange DNA-Sonde vom 5´-Ende der Insertionssequenz IS900, die M. paratuberculosis eindeutig identifizieren konnte. COLLINS et al. (1993) konstruierten zur Diagnose von M. paratuberculosis zwei geschachtelte Primerpaare, von denen das erste ein 217 bp Fragment aus IS900 vervielfältigte. In der zweiten PCR wurde ein in diesem Fragment lokalisiertes 167 bp Fragment vervielfältigt.
Diese Methode war im Vergleich zu einem kommerziell erhältlichen PCR-Test der IDEXX Corporation deutlich sensitiver beim Nachweis des Erregers in Kotproben.
Der Nachweis mykobakterieller DNA mittels IS900-PCR ist aus Kot (VARY et al.
1990; WHIPPLE et al. 1992), Milch (MILLAR et al. 1996; HERMAN et al. 1999;
WINTERHOFF 2000), Blut (KOENIG et al. 1993) und Lymphknoten (CHALLANS et al. 1994) beschrieben. Die Sensitivität der PCR-Reaktion ist jedoch an klinischen Proben deutlich reduziert. Dies wird zum einen auf eine ineffiziente Extraktion und Lyse von Mykobakterien aus dem Untersuchungsmaterial, zum anderen auf das Vorhandensein von Inhibitoren der Polymerase in der PCR-Reaktion zurückgeführt (VARY et al. 1990; VAN DER GIESSEN et al. 1992; CHALLANS et al. 1994).
COUSINS et al. (1999) zeigten, dass die IS900-PCR falsch positive Ergebnisse an Kotproben ergab, aus denen andere Mykobakterienspezies kultiviert werden konnten und empfahlen einen nachfolgenden Restriktionsenzymverdau der PCR-Produkte,
um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Auch HARRIS u. BARLETTA (2001) beschrieben, dass IS900 Primer nicht vollständig spezifisch für M. paratuberculosis sind, da IS900-ähnliche Strukturen auch in anderen Mykobakterien nachgewiesen werden konnten. BULL et al. (2000) beschrieben eine Variante der IS900-PCR, bei der auf der Basis der flankierenden DNA-Sequenzen an 14 verschiedenen IS900- Insertionsstellen eine Multiplex-PCR entwickelt wurde, um die Anzahl falsch positiver Ergebnisse zu verringern.
Andere genetische Zielsequenzen zur Detektion von M. paratuberculosis wurden von AMBROSIO et al. (1991), POUPART et al. (1993) und ELLINGSON et al. (1998) beschrieben. Das von ELLINGSON et al. (1998) beschriebene M. paratuberculosis spezifische hspX-Gen wurde zusammen mit dem 16S rRNA-Gen und den Insertionssequenzen IS900, IS901 und IS1245 zur Entwicklung eines PCR- gestützten Tests zur Unterscheidung von M. paratuberculosis und M. avium herangezogen (ELLINGSON et al. 2000). COETSIER et al. (2000) entwickelten eine Duplex-PCR zur Differenzierung von M. bovis, M. avium und M. paratuberculosis auf der Basis der M. paratuberculosis spezifischen Sequenz F57 (POUPART et al. 1993) und einer variablen Sequenzregion stromaufwärts des für ein 34 kDa-Protein kodierenden p34 Gens. VAN DER GIESSEN et al. (1992) entwickelten eine M. paratuberculosis spezifische Sonde auf Grundlage spezifischer Sequenz- abschnitte des Gens für die 16S rRNA. WHITTINGTON et al. (1998) wiesen eine weitere Insertionssequenz, IS1311, bei M. paratuberculosis, M. avium und M. intracellulare nach und untersuchten diese auf ihre Eignung als diagnostischer Marker.
Beim indirekten Erregernachweis wird die humorale bzw. zelluläre Immunreaktion des Wirtes zur Diagnostik der Erkrankung herangezogen. Zum Antikörpernachweis stehen verschiedene Testsysteme zur Verfügung, die sich zum Teil in der subklinischen Phase der Erkrankung als wenig sensitiv erwiesen haben (STABEL 1998). Ein Vergleich von Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Komplement-bindungsreaktion (KBR) und Agargelimmunodiffusionstest (AGIDT) zeigte, dass der ELISA den sensitivsten Test zur Diagnostik der Paratuberkulose
darstellt (COLGROVE et al. 1989; COLLINS et al. 1991; SOCKETT et al. 1992;
JARK et al. 1997). Dabei ist die Sensitivität v. a. abhängig von dem im ELISA verwendeten Antigen (SWEENEY et al. 1995; JARK et al. 1997).
B.3 Transponierbare genetische Elemente
B.3.1 Insertionssequenzen
Insertionssequenzen (IS) sind die einfachsten Formen transponierbarer Elemente und Bestandteile aller bakteriellen Chromosome und Plasmide, wobei sie in Kopienzahlen von einer bis hundert pro Genom vorkommen können (MAHILLON u.
CHANDLER 1998). Sie stellen meist unter 2,5 kb große selbstständige genomische Einheiten dar, die jeweils nur die für ihre eigene Transposition benötigten Proteine kodieren und so in ihr Zielmolekül integrieren können. Dabei ist die Spezifität der Zielstelle abhängig von der jeweiligen Insertionssequenz. Nur wenige Insertions- sequenzen, wie IS91, inserieren spezifisch in nur eine ausgewählte Insertionsstelle (MENDIOLA u. DE LA CRUZ 1989). Die meisten anderen Insertionssequenzen zeigen zwar Präferenzen für bestimmte Zielsequenzen, sind jedoch nicht auf spezifische Zielstellen zur Integration angewiesen. Durch ihre Transposition spielen Insertionssequenzen eine wichtige Rolle bei der Plasmidintegration und bei DNA- Umordnungen (HAACK u. ROTH 1995; GORDON et al. 1999). Bei solchen Umordnungen können neue Sequenzen entstehen oder die Funktionen der bestehenden Gene können verändert werden. Auch Veränderungen in der Genexpression durch Transpositionsereignisse sind nachgewiesen. So ist z. B.
beschrieben, dass Insertionssequenzen durch Einführung zusätzlicher Promotorsequenzen die benachbarten Gene aktivieren können (DALRYMPLE 1987;
REIMMANN et al. 1989; TON-HOANG et al. 1997; MAHILLON u. CHANDLER 1998).
In Untersuchungen an verschiedenen pathogenen Bakterien konnte auch der Einfluss von Insertionssequenzen auf die Entwicklung bakterieller Virulenzfaktoren demonstriert werden (MAHILLON u. CHANDLER 1998).
In einigen Fällen ist die Lokalisation von speziesspezifischen Insertionssequenzen an definierten Orten im Chromosom so stabil, dass diese als Marker in RFLP-Analysen zur Typisierung und für epidemiologische Untersuchungen herangezogen werden können (STANLEY u. SAUNDERS 1996; MAHILLON u. CHANDLER 1998).
Jede Insertionssequenz weist zwar eine andere Sequenz auf, es gibt aber einige gemeinsame Organisationsprinzipien.
So besitzen die meisten Insertionssequenzen an ihren Enden kurze invertierte terminale Wiederholungssequenzen (inverted terminal repeats) von 10 bis 40 bp Länge, die sich in zwei funktionelle Domänen unterteilen lassen. Die eine ist die Bindungsstelle für die Transposase, die zweite umfasst die terminalen 2 bis 3 bp und ist involviert in das Ausschneiden der Insertionssequenz und die nachfolgende Transposition. Die invertierten terminalen Wiederholungssequenzen flankieren einen zentralen Bereich, der einen oder zwei offene Leserahmen (open reading frame, ORF) enthält. Diese ORFs kodieren für eine Transposase, die für das Ausschneiden und die Transposition der Insertionssequenz verantwortlich ist. Bei Insertions- sequenzen mit zwei ORFs (Insertionssequenzen der Familien IS1 und IS3) entsteht die Transposase durch eine Leserasterverschiebung bei der Translation. Diese Leserasterverschiebung ist unerlässlich für die Expression einer funktionsfähigen Transposase und damit für die Transposition der Insertionssequenz (CHANDLER u.
FAYET 1993).
Bei der Transposition einer Insertionssequenz kommt es an der Insertionsstelle meist zu einer Sequenzverdopplung der Wirts-DNA. So entstehen die sogenannten direkten Wiederholungssequenzen (direct repeats), die zwischen 2 und 14 bp lang sind. Die Basenfolge der direkten Wiederholungssequenzen unterscheidet sich bei verschiedenen Transpositionsereignissen einer Insertionssequenz, während die Länge für jede Insertionssequenz charakteristisch ist (MAHILLON u. CHANDLER 1998). Die Transposition kann sowohl replikativ als auch nicht replikativ erfolgen. Bei der replikativen Transposition wird die Sequenz bei der Transposition verdoppelt, wohingegen sie bei der nicht replikativen Form als physikalische Einheit von einer Stelle an eine andere „springt“. Die Transpositionshäufigkeit unterscheidet sich bei den verschiedenen Insertionssequenzen und wird mit 10-4 bis 10-7 Transpositionen
pro Sequenz und Generation angegeben (LEWIN 1998b). WALL et al. (1999) konnten zeigen, dass die Transpositionshäufigkeit auch durch die Lokalisation der Insertionssequenz beeinflusst werden kann („Kontext-sensitive Transposition“).
MAHILLON u. CHANDLER (1998) ordneten die bekannten Insertionssequenzen anhand ihrer Struktur, Organisation sowie Nukleotid- und Proteinsequenz siebzehn verschiedenen Familien zu.
B.3.2 Zusammengesetzte Transposons
Viele Insertionssequenzen sind integrale Anteile von zusammengesetzten Transposons, in denen zwei Insertionssequenzen ein DNA-Segment flankieren, das selbst nicht transponierbar ist (BERG u. HOWE 1989). Dabei können die Insertions- sequenzen in derselben oder in entgegengesetzter Richtung orientiert sein. In einigen Fällen sind die Insertionssequenzen identisch, in anderen sind sie eng verwandt, aber nicht gleich. Solche Insertionssequenzen unterscheiden sich auch oft in ihrer Funktionsfähigkeit, wobei das Vorhandensein einer funktionierenden Insertionssequenz für die Transposition des zusammengesetzten Transposons ausreicht (LEWIN 1998b). Die eingebetteten Sequenzen stellen oft Antibiotika- resistenzdeterminanten dar (STANLEY u. SAUNDERS 1996). Die Kombination von Insertionssequenzen und Resistenzdeterminanten resultierte in der Entstehung von mobilen übertragbaren Antibiotikaresistenzen, auf die durch den verbreiteten Gebrauch von Antibiotika in der Medizin selektiert wurde. Darüberhinaus sind auch virulenzassoziierte Determinanten bekannt, die in Form von zusammengesetzten Transposons Mobilität erlangen. Ein Beispiel hierfür ist der für ein Adhäsin kodierende afa-3 Gencluster von E. coli, der von zwei IS1 Elementen flankiert wird, die seine Translokation verursachen (GARCIA et al. 1994).
B.3.3 Insertionssequenzen bei Mykobakterien
Verschiedene mykobakterielle Insertionssequenzen, die oft ein sehr enges Wirtsspektrum aufweisen, sind identifiziert und charakterisiert worden (DALE 1995).
Nach MAHILLON u. CHANDLER (1998) wurden sie in verschiedene IS-Familien eingeordnet, wobei alle bei der Spezies M. avium vorkommenden Insertions- sequenzen den Familien IS110 und IS256 angehören. Hierzu zählen auch die Insertionssequenzen IS900 (M. paratuberculosis), IS901 (M. avium), IS902 (M. silvaticum), IS1100 (M. avium) und IS1626 (M. avium und M. intracellulare) die zur IS110-Familie gehören. Mit Ausnahme von IS901 und IS902, die auf DNA-Ebene 98% Identität zueinander aufweisen und daher als dasselbe Element betrachtet werden, zeigen die Insertionssequenzen untereinander große Variationen (KUNZE et al. 1991; HERNANDEZ-PEREZ et al. 1994) und weisen -mit Ausnahme von IS900 und IS1626, die sehr eng verwandt sind (82% Sequenzhomologie)- Ähnlichkeiten von maximal 60% zueinander auf der DNA-Ebene auf (DALE 1995). Diese Gruppe von Insertionssequenzen zeichnet sich durch das Fehlen von direkten und invertierten terminalen Sequenzwiederholungen aus, wie es auch für die Insertionssequenz IS116 von Streptomyces clavuligerus (LESKIW et al. 1990) beschrieben ist. IS900 war die erste Insertionssequenz, die bei Mykobakterien beschrieben wurde. Sie ist 1451 bp lang, hat einen GC-Gehalt von 66% und befindet sich in 15 bis 20 Kopien an konservierten Stellen im Genom von M. paratuberculosis, wohingegen sie in den Genomen der nahe verwandten M. avium Subspezies nicht nachgewiesen werden konnte. Invertierte terminale Sequenzwiederholungen, sowie direkte Wiederholungssequenzen konnten nicht identifiziert werden, allerdings zeigt das Element eine gewisse Zielsequenz-Spezifität (GREEN et al. 1989). Diese Spezifität bezüglich des Zielortes, sowie der Richtung der Integration konnte auch von BULL et al. (2000) nachgewiesen werden. Einer von zwei offenen Leserahmen kodiert für eine potentielle Transposase von 399 Aminosäuren, p43, die von TIZARD et al. (1992) näher charakterisiert wurde. Nukleotid- und Aminosäuresequenz zeigen deutliche Homologien zur Transposase von IS110, einer Insertionssequenz von Streptomyces coelicolor A3(2) (BRUTON u. CHATER 1987). Der zweite offene
Leserahmen und die Expression des darin kodierten Hed (host expression dependent)-Proteins wurden von DORAN et al. (1994, 1997) beschrieben.
Aufgrund seiner Spezifität für M. paratuberculosis und seiner stabilen Integration im Genom wurde IS900 als Sonde in der Typisierung von M. paratuberculosis Isolaten mittels RFLP-Analyse (COLLINS et al. 1990; WHIPPLE et al. 1990; PAVLIK et al.
1995), aber auch als Zielsequenz für die Entwicklung PCR-gestützter diagnostischer Verfahren herangezogen (s. B.2.4.4). ENGLAND et al. (1991) gelang es, mit Hilfe von zwei Kopien von IS900 ein künstliches zusammengesetztes Transposon zu konstruieren, das stabil in das Chromosom anderer Mykobakterien integriert wurde.
In M. avium bzw. in M. silvaticum wurden in ihrer Struktur ähnliche Insertionssequenzen identifiziert, die als IS901 und IS902 bezeichnet wurden (KUNZE et al. 1991; MOSS et al. 1992), die aber vermutlich dasselbe Element darstellen. IS901 konnte bislang nur in pathogenen Isolaten aus Tieren, nicht jedoch in M. avium Isolaten von AIDS-Patienten oder aus der Umwelt nachgewiesen werden. KUNZE et al. (1992) postulierten daher, dass das Vorhandensein von IS901 mit der Virulenz des jeweiligen Isolates assoziiert ist und schlugen die Unterscheidung von zwei Biotypen in Abhängigkeit vom Nachweis von IS901 vor.
IS1110 wurde ebenfalls aus M. avium isoliert, kommt jedoch nur in einzelnen Isolaten vor. Diese Insertionssequenz zeichnet sich durch einen außergewöhnlich hohen Grad an Mobilität aus (HERNANDEZ-PEREZ et al. 1994), was vermutlich durch eine Mutation im Regulationsapparat der Transposition verursacht wird (DALE 1995).
PUYANG et al. (1999) identifizierten drei Kopien einer weiteren Insertionssequenz (IS1626) mit großer Ähnlichkeit zu IS900 in einem einzelnen M. avium Isolat. Eine weitere Insertionssequenz (IS1547) mit struktureller Ähnlichkeit zu IS900 wurde von FANG et al. (1999) bei M. tuberculosis beschrieben.
Andere Insertionssequenzen der Spezies M. avium wurden der IS256-Familie zugeordnet. Dazu gehören die Insertionssequenzen IS1245 und IS1311 (GUERRERO et al. 1995; WHITTINGTON et al. 1998), die untereinander 85% DNA- Sequenzhomologie aufweisen. IS1245 zeigt große Ähnlichkeit zu IS1081, einer Insertionssequenz von M. bovis und anderen Mitgliedern des M. tuberculosis Komplexes (COLLINS u. STEPHENS 1991), und liegt in 3 bis 27 Kopien im Genom
vor. RFLP-Analysen mit IS1245 als Sonde spiegelten bei humanen und porcinen Isolaten eine hohe Kopienzahl des Elementes und eine hohe Diversität an RFLP- Mustern wieder, wohingegen Isolate von Vögeln sich durch sehr niedrige Kopienzahlen und sehr ähnliche RFLP-Muster auszeichneten (GUERRERO et al.
1995). IS1311 kommt sowohl bei M. avium und M. intracellulare als auch bei M. paratuberculosis vor. Allerdings unterscheiden sich die Insertionssequenzen der Subspezies durch fünf Punktmutationen voneinander, was eine Unterscheidung auf dem Subspezieslevel mittels Restriktionsanalyse ermöglicht. Zur Unterscheidung einzelner M. paratuberculosis Isolate kann ein weiterer Polymorphismus an einer Stelle in IS1311 herangezogen werden (WHITTINGTON et al. 1998).
Auch für andere Mykobakterienspezies sind Insertionssequenzen identifiziert und charakterisiert worden. So wurde bei M. tuberculosis die Insertionssequenz IS6110 (auch bekannt als IS986), ein Mitglied der IS3-Familie identifiziert (MC ADAM et al.
1990; THIERRY et al. 1990), die bei allen Spezies des M. tuberculosis Komplexes vorkommt (HERMANS et al. 1991) und die als Zielsequenz in der PCR-gestützten Diagnostik von M. tuberculosis dient. Aufgrund eines ausgeprägten Polymorphismus in den RFLP-Mustern wird IS6110 auch zur Typisierung von M. tuberculosis Isolaten herangezogen (HERMANS et al. 1990; ROMANO et al. 1996; STANLEY u.
SAUNDERS 1996; COUSINS et al. 1998). Weitere Insertionssequenzen des M. tuberculosis Komplexes stellen IS1081 (COLLINS u. STEPHENS 1991), und eine von LEFEVRE et al. (1999) beschriebene Insertionssequenz der IS21-Familie dar.
Auch in M. smegmatis (CIRILLO et al. 1991; GUILHOT et al. 1992; GARCIA et al.
1994), M. kansasii (YANG et al. 1993), M. fortuitum (MARTIN et al. 1990; WASKAR et al. 2000), M. xenopi (PICARDEAU et al. 1996), M. intracellulare und M. ulcerans (STINEAR et al. 1999) konnten Insertionssequenzen identifiziert werden. Dabei stellt die von MARTIN et al. (1990) in M. fortuitum identifizierte Insertionssequenz IS6100 einen Teil des Transposons Tn610 dar. Tn610 war das erste zusammengesetzte Transposon, das für Mykobakterien beschrieben wurde.
B.4 Bakterielle Transportproteine
Das Überleben von Bakterien erfordert einen selektiven und regulierten Transport von Molekülen über die Zytoplasmamembran. Diese Transportvorgänge werden durch spezifische membranassoziierte Proteine vermittelt, die anhand ihrer Struktur und Funktionsweise in verschiedene Familien eingeteilt werden können. Mitglieder einer Familie sind eng verwandt und haben einen gemeinsamen evolutionären Ursprung. Eine der größten und variantenreichsten Familien stellt die Superfamilie der ABC-Transportersysteme dar (HIGGINS 1992).
B.4.1 ABC-Transportersysteme
ABC (ATP-binding cassette)-Transportersysteme kommen als Transportmoleküle bei Pro- und Eukaryonten vor. Die Bezeichnung ABC-Transporter beruht auf dem Vorhandensein einer hochkonservierten ATP-Bindungsdomäne (ABC = ATP-binding cassette). Diese Systeme nutzen die aus der Hydrolyse von ATP gewonnene Energie, um verschiedenste Substrate entgegen eines Konzentrationsgradienten durch eine biologische Membran zu transportieren. Obwohl diese Transporterfamilie ein weites Substratspektrum aufweist, zeichnen sich die einzelnen Transporter durch eine relativ strikte Substratspezifität aus (HIGGINS 1992).
Ein typischer ABC-Transporter setzt sich aus vier membranassoziierten Domänen zusammen. Zwei dieser Domänen sind stark hydrophob und bestehen im Allgemeinen aus vier bis acht transmembranalen a-helikalen Segmenten („Transmembrandomänen“). Die beiden anderen Domänen befinden sich an der zytoplasmatischen Seite der Membran, binden ATP und sind für die Kopplung von ATP-Hydrolyse und Transport verantwortlich („ATP-bindende Domänen“). Obwohl die für die einzelnen Domänen kodierenden Gene bei Prokaryonten meist in einer DNA-Region geclustert oder sogar in einem gemeinsamen Operon organisiert sind, werden die Polypeptide meist getrennt voneinander exprimiert. Allerdings sind Fusionen von Domänen zu größeren multifunktionellen Polypeptiden beschrieben.
Solche Fusionen können sowohl zwischen zwei gleichen Domänen als auch
zwischen Transmembrandomäne und ATP-bindender Domäne auftreten (HIGGINS 1992; LINTON u. HIGGINS 1998; SCHNEIDER u. HUNKE 1998; YOUNG u.
HOLLAND 1999). Eukaryotische ABC-Transporter hingegen stellen große Moleküle mit verschiedenen Domänen dar, die von einem einzelnen Gen kodiert werden.
ABC-Transporter werden in Abhängigkeit von der Richtung des Substrattransportes in Importer und Exporter unterteilt. Importer kommen nur bei Prokaryonten vor und dienen hier der Aufnahme von extrazellulären Molekülen. Beispiele hierfür sind die Maltose Permease von E. coli (EHRMANN et al. 1998) und das Oligopeptid- transportersystem von Streptococcus pneumoniae (ALLOING et al. 1994). Importer besitzen zusätzlich zu den oben beschriebenen Anteilen ein extrazytoplasmatisches Substratbindungsprotein, das entweder im Periplasma gramnegativer Bakterien lokalisiert ist oder über einen Lipidanker an der Zytoplasmamembran grampositiver Bakterien befestigt ist. Zusätzlich zu den bisher genannten Anteilen besitzen einige bakterielle ABC-Transporter akzessorische Proteinkomponenten in der äußeren Membran, die für den Transport von Substanzen durch dieselbe verantwortlich sind (HIGGINS 1992).
Während die Transmembrandomänen und die substratbindenden Proteine verschiedener Transporter nur geringe Ähnlichkeiten erkennen lassen, weisen die ca. 200 Aminosäuren langen ATP-bindenden Domänen verschiedener Transporter Sequenzähnlichkeiten zwischen 30 und 50% auf. Zu den hochkonservierten Sequenzbereichen zählen das Walker A und das Walker B Motiv (WALKER et al.
1982), die gemeinsam die ATP-Bindungsstelle bilden und die auch bei anderen ATP- bindenden Proteinen vorkommen, sowie die spezifische ABC-Transporter-Familien- Signatur (LINTON u. HIGGINS 1998). Diese stellt ein ebenfalls hochkonserviertes Motiv aus sechs Aminosäuren dar, das zwischen den beiden Walker Motiven zu finden ist und das essentiell für den Transportprozess zu sein scheint. LINTON und HIGGINS (1998) beschrieben außerdem ein viertes konserviertes Motiv stromabwärts des Walker B Motivs. Dabei handelt es sich um einen Histidinrest, dem vier hydrophobe Reste vorangehen und dem eine geladene Aminosäure folgt.
Einen konservierten Bereich in den Transmembrandomänen stellt die EAA-Schleife dar, die vermutlich an der Interaktion zwischen Transmembrandomäne und ATP-
bindender Domäne beteiligt ist. Dieses Motiv ist jedoch nicht bei allen Transportern anzutreffen.
Hauptaufgabe der ABC-Transportersysteme ist der Transport gelöster Stoffe durch die Zytoplasmamembran. Hierzu zählt sowohl der Import von Nährstoffen als auch die signalpeptidunabhängige Ausschleusung von Proteinen, sowie die Ausschleusung von toxischen Komponenten und Antibiotika. Durch den Transport von spezifischen regulatorischen Molekülen können ABC-Transporter auch in bakterielle Regulationsmechanismen involviert sein. Ein Beispiel hierfür stellt der SpoOk Lokus von Bacillus subtilis dar. Dieser kodiert für einen ABC-Transporter, der vermutlich die Aufnahme eines regulatorischen Peptids vermittelt, das die Sporulation initiiert (HIGGINS 1992). Auch die Beteiligung an Quorum Sensing- Mechanismen (s. B.5) durch den Transport von Kompetenzfaktoren und Peptidpheromonen unter Abspaltung spezifischer glycinhaltiger Signalsequenzen konnte nachgewiesen werden (YOUNG u. HOLLAND 1999). So zeigten z. B.
KLEEREBEZEM et al. (1997), dass die Peptidpheromone, die als Signalmoleküle in Quorum Sensing-Systemen grampositiver Bakterien (z. B. in der Kompetenz- entwicklung von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae) dienen, von spezifischen ATP-Transportern sezerniert werden. MICHIELS et al. (2001) postulierten die Existenz ähnlicher Systeme bei gramnegativen Bakterien.
Im Rahmen von systematischen Genomanalysen an E. coli (LINTON u. HIGGINS 1998) und Bacillus subtilis (QUENTIN et al. 1999) konnten 57 bzw. 78 potentielle ABC-Transporter identifiziert werden. Bei E. coli nehmen die Gene für diese Transportersysteme beinahe 5% des Genoms ein (LINTON u. HIGGINS 1998). Dies verdeutlicht, dass die ABC-Transportersysteme bei Prokaryonten eine der größten Proteinsuperfamilien darstellen.
B.4.2 ABC-Transportersysteme bei Mykobakterien
Nach Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis analysierten BRAIBANT et al.
(2000) diese Sequenzdaten auf das Vorhandensein von ABC-Transporter- Untereinheiten. Diese Untereinheiten wurden anhand ihrer charakteristischen konservierten Strukturen identifiziert. Nach Sequenzvergleich mit DNA-Sequenzen anderer Organismen postulierten die Autoren die Existenz von mindestens 26 kompletten und 11 inkompletten ABC-Transportersystemen für M. tuberculosis, die in 16 Importer und 21 Exporter unterteilt wurden. Anhand von Homologieuntersuchungen mit ABC-Transportern anderer Organismen wurden diesen Transportern potentielle Substrate zugewiesen und sie wurden in Abhängigkeit ihrer Transporteigenschaften in neun Subklassen eingeteilt. Viele dieser Transporter stellen potentielle Exporter für Antibiotika dar, was zur intrinsischen Resistenz von M. tuberculosis gegenüber verschiedenen Antibiotika beitragen könnte. Die Gene, die für die identifizierten Transporter kodieren, nehmen etwa 2,5% des Genoms von M. tuberculosis ein.
Unabhängig von dieser Arbeit wurden andere ABC-Transportersysteme bei Mykobakterien identifiziert. So beschrieben BARSOM und HATFULL (1997) die Existenz eines ABC-Transporter Operons bei M. smegmatis. ZHU et al. (1998) beschrieben ein weiteres ABC-Transportersystem bei M. smegmatis, das vermutlich eine Rolle bei der Sekretion von Exochelinen spielt. CHAKRABORTI et al. (1999) und BANERJEE et al. (1998, 2000) konnten das Vorhandensein eines Phosphat- spezifischen Importers der ABC-Transporterfamilie für M. smegmatis nachweisen und postulierten, dass derselbe Transporter auch den Efflux von Ciprofloxazin vermittelt. BRAIBANT et al. (1996) beschrieben einen Gencluster der für die Proteine eines Phosphattransportsystems bei M. tuberculosis kodiert, das Homologien zum Pst-System (Pst: Phosphate specific transporter) von E. coli aufweist.
