Aus der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Identifikation von mTORC1 als neuen Wirtsfaktor für die Hepatitis C Virus RNA Replikation
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Stefanie Husnik, geb. Stöhr
aus Hannover
Hannover 2018
ii Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 26.11.2019
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Betreuer: Prof. Dr. med. Thomas von Hahn
1. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Pietschmann 2. Referent: PD Dr. med. Albert Hein
Tag der mündlichen Prüfung: 26.11.2019 Prüfungsausschuss:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Tobias Welte 1. Prüfer: Prof. Dr. med. Carlos Guzmán 2. Prüfer: PD Dr. med. Frank Gossé
iii
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... iv
Abbildungsverzeichnis ... vii
1. Einleitung ...1
1.1 Hepatitis C Virus - Überblick ...1
1.2 HCV im Detail - Molekularbiologie und viraler Replikationszyklus ...3
1.3 Krankheitsverlauf, Diagnostik und Therapie der HCV-Infektion ...6
1.4 Komplikationen nach Lebertransplantation und Immunsuppression ... 12
1.5 Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) ... 15
1.6 Rapamycin und Everolimus - mTOR-Inhibitoren und ihre Bedeutung ... 17
1.7 HCV und mTOR - Molekularbiologische und klinische Fragestellungen ... 20
1.8 Ziele der Arbeit... 23
2. Publikation... 25
3. Diskussion und Ausblick ... 45
4. Zusammenfassung ... 51
5. Literaturverzeichnis ... 53
6. Anhang ... 71
6.1 Publikation und Präsentationen ... 71
6.2 Curriculum vitae ... 72
6.3 Danksagung ... 73
6.4 Eidesstattliche Versicherung nach §2 Abs.2 Nrn.6 und 7 ... 74
iv Abb. Abbildung
AFP Alpha-1-Fetoprotein
AMPK AMP-activated-protein-kinase Anti-HCV Antikörper gegen HCV ATP Adenosintriphosphat Bsp. Beispiel
BOC Boceprevir
cc Cell culture (Zellkultur) CD81 Cluster of Differentiation 81 CLDN1 Claudin-1
C Core (Kapsid)
CMV Cytomegalievirus CNI Calcineurininhibitor CsA Ciclosporin A
CT Computertomographie
CYP A Cyclophilin A
DAA Directly acting antiviral drugs (direkt wirkende antivirale Medikamente) DEPTOR DEP domain-containing mTOR-interacting protein
DNA Desoxyribonukleinsäure
DGVS Deutsche Gesellschaft für Gastroenterologie, Verdauungs- und Stoff- wechselkrankheiten
DMSO Dimethylsulfoxid
E1 HCV-Hüllprotein 1
E2 HCV-Hüllprotein 2
EBV Ebstein-Barr-Virus
4E-BP1 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein-1 EIF4E Eukaryotic translation initiation factor 4E
EIF4F Eukaryotic translation initiation factor 4F EIF4G Eukaryotic translation initiation factor 4G EGFR Epidermal growth factor
EMA European Medicines Agency (Europäische Arzneimittelzulassungsbehörde) et al. Und andere
FKBP12 FK506 binding protein 12 FKBP38 FK506-binding protein 38
FRAP1 FK506-binding protein rapamycin-associated-protein 1
GC Glucocorticoide
GT Genotyp
H+ Wasserstoff
HBV Hepatitis B Virus
HCC Hepatocellular carcinoma (Hepatozelluläres Karzinom) HCV Hepatitis C Virus
v HDV Hepatitis D Virus
HIV Human Immunodeficiency Virus (Humanes Immundefizienzvirus) HLA Human leukocyte antigen (Humanes Leukozytenantigen)
HPV Humanes Papillomavirus Huh Humane Hepatomazellen
IC50 50% inhibitory concentration (50% inhibitorische Konzentration) IFN-α Interferon-alpha
IGF Insulin-like growth factor
IRES Interne ribosomale Eintrittsstelle J6 Genotyp 2a Isolat
Jc1 Japanese chimera 1
JFH Japanese fulminant Hepatitis 1 KDa Kilodalton
LD Lipid droplet
LDL Low density lipoprotein (Lipoprotein mit niedriger Dichte)
LDL-R Low density lipoprotein receptor (Lipoproteinrezeptor mit niedriger Dichte) LVP Virale Lipopartikel
m milli
MELD-Score Model for End-Stage Liver Disease-Score MLST8 Mammalian lethal with SEC13 protein 8 MRT Magnetresonanztomographie
µ mikro
mTOR mammalian Target of Rapamycin
mTORC1/2 mammalian Target of Rapamycin complex 1/2 MMF Mycophenolat-Mofetil
mRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)
mSin1 mammalian stress-activated protein kinase interacting protein 1
nm nanomolar
NPC1L1 Niemann-Pick C1-like protein 1 NS Nicht-Strukturprotein
NTR Nicht-translatierte Region OCLN Occludin
OLT Orthotope Lebertransplantation
ORF Open reading frame (offener Leserahmen) PAK1 P21-ativated kinase 1
PDGF Platelet-derived growth factor PEG-IFN-α Pegyliertes Interferon-alpha PHH Primäre humane Hepatozyten PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase PP Pseudopartikel
PRAS40 Proline-rich AKT1 substrate 1 P70S6K1 Protein70 S6 kinase 1
RAFT1 Rapamycin-and-FK506-binding-protein-target 1 RAPTOR Regulatory associated protein of mTOR
vi RER Raues endoplasmatisches Retikulum
RICTOR Rapamycin insensitivecompanion of mTOR RKI Robert Koch-Institut
RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RT-PCR Real time polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) S6K1 Ribosomal protein S6 kinase beta 1
SR-BI Scavenger Rezeptor Typ B Klasse I
SREBP1 Sterol-regulatory-element-binding-protein-1
SVR Sustained virological response (dauerhaftes virologisches Ansprechen) TVR Telaprevir
U. a. Unter anderem
VLDL Very low density lipoprotein (Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte) VEGF-R Vascular endothelial growth factor receptor
vii
Abbildungsverzeichnis
Seite
Abb.1 Globale Anti-HCV Prävalenz im Jahr 2013 1 Abb.2 Schematische Darstellung des HCV-Genoms und der viralen Proteine 4 Abb.3 Schematische Darstellung des HCV-Lebenszyklus 6 Abb.4 Substanzklassen zur Therapie der chronischen Hepatitis C 10 Abb.5 Zugelassene Therapie-und Kombinationsempfehlungen der DGVS 11 Abb.6 Der mTOR-Signalweg in Säugetierzellen 16
2 Die Variabilität des Hepatitis C Virus begründet sich auf einer hohen Mutationsrate mit einem ausgeprägten Polymorphismus. Insgesamt werden 7 Genotypen (GT) unterschieden [10][11].
Weltweit repräsentieren die HCV-Genotypen 1, 2 und 3 die häufigsten Varianten [12][13].
Genotyp 1 ist für 80% der HCV-Infektionen in Deutschland verantwortlich [14]. Die verschiedenen Genotypen lassen sich in weitere Subtypen unterteilen, wovon Typ 1a und 1b überdurchschnittlich häufig in Nord-/ Süd-und Osteuropa auftreten [15]. Der HCV-Genotyp 2 wird in Nordamerika, Südeuropa und West-Afrika beobachtet. Im Gegensatz zu Genotyp 3, welcher in Indien und Pakistan den Hauptteil aller Hepatitis C-Erkrankungen charakterisiert [13][16]. Vor allem bei Patienten mit regelmäßigem intravenösen Drogenkonsum konnte Genotyp 3 überdurchschnittlich häufig beobachtet werden [14]. Im nördlichen Afrika und mittleren Osten ist der HCV-Genotyp 4, im südlichen Afrika und in Südostasien sind die Genotypen 5 und 6 endemisch [17][18].
Der Übertragungsweg des Hepatitis C Virus findet parenteral über Blut-Blut-Kontakt überwiegend in sogenannten Risikogruppen statt [19]. Die intravenösen Drogenkonsumenten repräsentieren mit einer Seroprävalenz zwischen 15 und 82 % die Hauptrisikogruppe für die akute und chronische Hepatitis C. Dies entspricht im Mittel ca. 7,4 Millionen HCV- positiven intravenösen Drogenkonsumenten weltweit [20][21]. Hauptursächlich ist kollektiv benutztes infiziertes Injektionsbesteck [20][21][22].
Einen ebenfalls wesentlichen Übertragungsweg stellten bis zur Entdeckung des Hepatitis C Virus im Jahr 1989 kontaminierte Blutkonserven dar [23][24]. Erst im Jahr 1991 konnte die Einführung einer gesetzlich festgelegten Testung aller Blutprodukte auf Antikörper gegen HCV (Anti-HCV) und auf die virale Erbinformation, die HCV-Ribonukleinsäure (HCV- RNA), das Übertragungsrisiko des Virus erheblich vermindern [25]. In Ländern der Dritten Welt werden noch häufig Neuinfektionen durch inadäquat aufbereitete medizinische Geräte oder mehrmals benutztes Einmalmaterial beobachtet und gehören zu einem weiteren, nicht zu unterschätzenden Übertragungsweg [26][27]. Interessanterweise ist bei bis zu 25,4% der HCV-positiven Patienten in Deutschland der Übertragungsweg unklar. Bekannt ist jedoch, dass ein Zusammenhang zwischen einer unklaren HCV-Transmission und niedrigem Sozialstatus besteht [28].
3
1.2 HCV im Detail - Molekularbiologie und viraler Replikationszyklus
1989 glückte Michael Houghton und Kollegen die Isolierung und Charakterisierung des Hepatitis C Virus aus einer Plasmaprobe eines künstlich mit Non-A-non-B-Hepatitis
infizierten Schimpansen [29][30].
Die Sequenzierung des Virus ergab ein 9600 Nukleotid langes Genom bestehend aus einzelsträngiger RNA in Plus-Strang Orientierung [31]. Die Genom-Sequenz des, zur Familie der Flaviviridae gehörenden, 50 nm großen Hepatitis C Virus wird charakterisiert durch einen offenen Leserahmen (open reading frame, ORF), welcher für ein Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren kodiert [32][33]. Dieses Polyprotein wird posttranslational sowohl von zellulären, als auch von viralen Proteasen in 10 funktionsfähige Virusproteine gespalten [34].
Umgeben wird dieser kodierende Leserahmen von einer 5`- und einer 3`- nicht-translatierten- Region (NTR). Diese Regionen repräsentieren ein entscheidendes Erkennungsmerkmal für die Translation und Replikation des Virusgenoms. Die interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) ist im 5`-NTR lokalisiert, besteht aus vier Domänen und ist zuständig für eine Cap- unabhängige Translation der Proteine. Die 3`-NTR setzt sich zusammen aus drei verschiedenen Elementen und koordiniert die HCV-RNA-Replikation [32]. Wie Abbildung 2 zeigt können die kodierten Virusproteine in Strukturproteine und Nicht-Strukturproteine (NS) unterschieden werden. Zelluläre Signalpeptidasen spalten das Polyprotein in die Strukturproteine E1, E2 und Core (C) [35].
Diese Proteine regulieren die Viruspartikelherstellung. Virale Proteasen koordinieren die Spaltung der Nicht-Strukturproteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B. NS3-NS5B bilden einen sogenannten Replikasekomplex und induzieren die Replikation der HCV-RNA in der Wirtszelle [35][36]. Das Transmembranprotein NS2 und der aminoterminale Teil von NS3 bilden einen viralen Proteasekomplex. Diese NS2/3-Autoprotease koordiniert die Spaltung zwischen beiden Proteinen und ist somit, als eine von zwei viralen Proteasen, essentiell für die korrekte virale Proteinmodifizierung [37]. Zusätzlich leistet NS2 einen Beitrag zur Virusbildung und -freisetzung, jedoch hat es, im Gegensatz zu allen anderen Nicht-Strukturproteinen, keinen Einfluss auf die Replikation der RNA. Sobald sich NS3 abspaltet, fungiert es wiederum in Kombination mit NS4 als zweiter viraler Proteasekomplex.
Diese Interaktion ist wichtig, denn sie vermittelt alle folgenden viralen Spaltungen [37][38].
Mit Hilfe von NS4A wird NS3 am endoplasmatischen Retikulum (ER) verankert und korrekt gefaltet [39][40]. Aufgrund seiner Multifunktionalität besitzt NS3 zusätzlich die Aufgabe einer Helikase, sodass es RNA-Basenpaarungen auflösen kann [41]. Das integrale
5 Der HCV-Lebenszyklus wird in drei Abschnitte eingeteilt, den Viruseintritt, die Translation/
Replikation sowie der Zusammenbau/ die Freisetzung des Viruspartikels (Abbildung 3). Für den Eintritt in die Wirtszelle benötigt das Virus eine Reihe von Wirtsproteinen. Hierzu zählen der Scavenger Rezeptor Typ B Klasse I (SR-BI) [54], das Tetraspanin Cluster of Differentiation 81 (CD81) [55] sowie die Tight junction-Proteine Occludin (OCLN) und Claudin-1 (CLDN-1) [56][57]. Tight junctions sind dichte Proteinbänder, welche die Zellzwischenräume aneinandergrenzender Zellen abschließen [58]. An der Wirtsoberfläche des Hepatozyten stellt das Virus den Erstkontakt zu diesem zunächst über unspezifische Rezeptoren, wie den LDL-Rezeptor (low density lipoprotein receptor), her [59][60]. Dies fördert den Zelleintritt und vereinfacht die Bindung an die notwendigen HCV-Rezeptoren CD81, SR-BI, OCLN und CLDN-1 [57][61][62]. Die Einzelheiten der Interaktionen zwischen HCV und den Rezeptoren sind noch nicht vollständig geklärt, jedoch ist bekannt, dass eine Infektion nur dann erfolgen kann, wenn alle vier HCV-Rezeptoren vorhanden sind [56]. Das virale Hüllprotein E2 bindet zunächst an SR-BI und an CD81, um danach durch Occludin und Claudin-1 über rezeptor-vermittelte Endozytose in die Wirtszelle aufgenommen zu werden [57][63]. Die Ansäuerung des Endosoms über eine ATP-abhängige H+-Ionenpumpe bewirkt eine pH-Wert-Veränderung, sodass in Folge die Virusmembran mit der Membran des Endosoms verschmelzen kann und das HCV-Genom ins Zytoplasma eingeschleust werden kann. Dieser Schritt gewährleistet, dass die Fusion erst im Inneren der Wirtszelle stattfindet [64][65]. Die Translation der HCV-RNA erfolgt am rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) mit Hilfe der IRES, um dann mit den Untereinheiten der Ribosomen zu interagieren [66]. Aus dem entstandenen Polyprotein werden die einzelnen viralen Proteine gespalten, welche wiederum den Replikationskomplex bilden, um die virale RNA vervielfältigen zu können [67]. Einstülpungen des rER´s bilden das „membranous web“. Es gewährleistet als eigenes zelluläres Kompartiment einen geschützten Ort für die an der Amplifikation der viralen RNA beteiligten Virusproteine [68]. Im Gegensatz zu den vorherigen Abschnitten des viralen Replikationszyklus ist der letzte Schritt, welcher Verpackung und anschließende sekretorische Ausschleusung des neu synthetisierten Viruspartikels aus der Zelle darstellt, wenig erforscht. Man weiß mittlerweile, dass die Herstellung und Freilassung auf einer Abhängigkeit zwischen Lipidtröpfchen, sogenannten lipid droplets (LD) und dem viralen Core-Protein beruht [69]. Das Core Protein, welches in enger räumlicher Nähe zu der LD- Membran steht, besitzt die Fähigkeit, die viralen Nicht-Strukturproteine als Teil des Replikationskomplexes zu nutzen, um die noch unfertigen Viruspartikel mit der produzierten HCV-RNA auszustatten [70]. Durch eine Ausstülpung in das rER-Lumen erhält das Partikel
6 eine Hülle. In diese werden die Hüllproteine E1 und E2 eingefügt. Die Lipoproteinsynthese sowie verschiedene Apolipoproteine sind unentbehrlich und stark verknüpft mit der Reifung und Freilassung desViruspartikels [71][72].
Abbildung 3: Schematische Darstellung des HCV Lebenszyklus
Receptor binding and endocytosis: Das extrazelluläre Viruspartikel bindet an die Oberfläche der Wirtszelle mit Hilfe der vier essentiellen Rezeptoren SR-BI, CD81, Claudin-1 und Occludin. Über Clathrin-vermittelte Endozytose wird das Virus in die Zelle aufgenommen. Fusion and uncoating: Die Virusmembran verschmilzt mit der Membran des Endosoms, sodass das Kapsid mit dem Virusgenom ins Zytoplasma eingeschleust werden kann. Translation and polyprotein processing: Im rauen endoplasmatischen Retikulum startet die Translation.
Die RNA-Replikation folgt darauf im sogenannten „membranous web“. Virion assembly/transport and release:
Auf den Zusammenbau (assembly) folgt die Ausschleusung (release) der neu entstandenen viralen Partikel (mit freundlicher Genehmigung des Springer Nature Verlages [73]).
1.3 Krankheitsverlauf, Diagnostik und Therapie der HCV- Infektion
Die akute Hepatitis C ist in der Mehrzahl der Fälle (80%) klinisch unauffällig und somit für Patienten und Ärzte schwer diagnostizierbar [74]. Nach einer Inkubationszeit, welche zwischen HCV-Infektion und ersten Krankheitssymptomen 2-12 Wochen betragen kann, verlaufen die restlichen 20% der Fälle gewöhnlich mit unspezifischen Symptomen wie Fieber, abdominellen Beschwerden, Übelkeit, Unwohlsein, Muskel-, und Gelenkschmerzen, Leistungsknick und Müdigkeit [75][76]. Oft wird die akute HCV-Infektion dadurch mit einem grippalen Infekt verwechselt und nicht bzw. zu spät erkannt und therapiert. Selbst nach der
7 Inkubationszeit unterliegt der Anstieg der Transaminasen starken Schwankungen, sodass auch diese nicht immer ein verlässliches diagnostisches Kriterium für eine Infektion darstellen [76]
[77][78][79]. Bei nur einem Drittel aller symptomatischen akuten HCV-Erkrankungen lassen sich leberspezifische Beschwerden, wie z. B. ein ikterisches Hautbild, lehmfarbener Stuhl und/oder Dunkelfärbung des Urins diagnostizieren und nur ein Bruchteil der Patienten (weniger als 1%) weisen einen fulminanten akuten Verlauf auf [80]. Spontane Ausheilungen der akuten HCV-Infektion werden in 10-50% beschrieben [74][81]. Im Gegensatz dazu entwickeln laut Langzeitstudien ca. 50-85% der Patienten eine chronische HCV- Erkrankungen [82][83]. Eine Chronifizierung entspricht definitionsgemäß einer Viruspersistenz im Körper von länger als 6 Monaten [77]. Eine spontane Elimination des Virus tritt dann in der Regel nicht mehr auf. In der chronischen Phase kann die HCV- Infektion ebenfalls völlig asymptomatisch sein. Wenige der Betroffenen beschreiben klinische Zeichen, die auf eine Lebererkrankung hinweisen können [84][85].
Diesbezüglich demonstrierten Kiyosawa et al. eine mittlere Zeitspanne zwischen Virusinfektion und Diagnose von 13,6 Jahren und begründeten die zeitliche Verzögerung mit dem Fehlen jeglicher HCV-typischer Symptome [86]. Die Langzeitfolgen können jedoch fatal sein, denn 2-35% der Betroffenen entwickeln nach Jahren bis Jahrzehnten eine Leberzirrhose.
In 5% der Fälle entsteht bei diesen Patienten pro Jahr ein Hepatozelluläres Karzinom (HCC) [87]. Somit ist die chronische HCV-Infektion mit den Folgeerkrankungen eine häufige Indikation für eine orthotope Lebertransplantation (OLT) [88].
Bei jedem Patienten muss jedoch eine Individualprognose gestellt werden, da verschiedene Faktoren den Progress des Fibrosegrades der Leber beeinflussen. Mittlerweile ist bekannt, dass Co-Faktoren wie z.B. Alkohol- und Nikotin sowie Übergewicht, Diabetes mellitus, Medikamente und ein höheres Alter (> 50 Jahre) bei der Erstmanifestation der HCV-Infektion eine ebenso negative Auswirkung auf den Fibroseprogress der Leber haben wie Co- Infektionen mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV), Hepatitis A Virus (HAV), Hepatitis B Virus (HBV) und /oder Hepatitis D Virus (HDV) [78][89][90].
Besteht der Verdacht auf eine Infektion mit HCV sollten virologische Nachweise durchgeführt werden. Neben evtl. erhöhten Transaminasen dient der Anti-HCV-Immunoassay dem serologischen Nachweis von Anti-HCV-Antikörpern (Anti-HCV) [91]. Jedoch sind oft bei Symptombeginn lediglich nur 50-70% und erst nach drei Monaten 90% der HCV- Antikörper nach stattgefundener Infektion detektierbar. Da zunächst eine Reaktion des Immunsystems stattfinden muss, beträgt das „serodiagnostische Fenster“ durchschnittlich 7-8 Wochen [92][93][94]. Initial positive Ergebnisse und Patienten mit eingeschränktem
8 Immunsystem sollten durch die anschließende Bestimmung der HCV-RNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (real-time-polymerase chain reaction; RT-PCR) kontrolliert wer- den [95][96]. Bei akutem Verdacht einer Infektion empfiehlt sich primär die HCV-RNA- Bestimmung [94][96]. Da hiermit der Virusnachweis bereits einige Tage nach Infektionszeitpunkt gelingt, gilt diese Methode nach wie vor als Goldstandard und kann helfen, eine Erkrankung frühzeitig zu diagnostizieren und therapeutische Schritte einzuleiten.
Eine bestehende Infektion kann sowohl durch den Nachweis von Anti-HCV-Antikörpern als auch durch HCV-RNA diagnostiziert werden. Eine ausgeheilte Erkrankung zeichnet sich durch positive HCV-Antikörper aus [94][97].
Im Falle einer HCV-Erstdiagnose erfolgt die Bestimmung des HCV-Genotyps sowie der HCV-RNA-Konzentration für die Therapieplanung und die Überwachung. Diese Parameter sind ebenso unverzichtbar wie Anamnese (Risikofaktoren, Partner- und Familienanamnese), klinische Untersuchung und Diagnostik von Co-Infektionen wie HAV, HBV und/oder HIV.
Obligatorischer Bestandteil der frühzeitigen Erkennung und Bewertung einer Leberzirrhose stellt die Oberbauchsonographie sowie die laborchemische Untersuchung dar [94].
Obwohl es noch keine Impfung gegen das Hepatitis C Virus gibt, ist die Erkrankung dank neuer wirksamer Medikamente für mehr als 95% der Patienten heilbar [98][99].
Ziel der medikamentösen Therapie ist ein dauerhaftes virologisches Ansprechen (sustained virological response; SVR). Dies bedeutet, dass 3-6 Monate nach Therapieende keine HCV- RNA (<50 IU/ml) im Serum mehr detektierbar ist [100][101].
Das Hauptziel einer frühzeitigen Therapie besteht in der Vermeidung bzw. Minimierung der Folgeerkrankungen und deren Komplikationen, wie beispielsweise einer Leberzirrhose oder eines HCC`s bis hin zur Lebertransplantation. Je nach Genotyp und Krankheitsverlauf muss die Therapie speziell darauf angepasst werden [102]. So wurde seit 1990 Interferon-alpha (INF-α) als Einzelmedikament mit jedoch geringem Heilungserfolg eingesetzt. Ab 1997 erfolgte eine Kombinationstherapie, bestehend aus pegyliertem Interferon-alpha (PEG-INF-α) und dem Nukleosidanalagon Ribavirin [103][104][105]. PEG-IFN-α ist ein körpereigenes Zytokin mit antiviraler und immunmodulierender Wirkung. Es aktiviert die T-Lymphozyten und fördert so die Abwehrreaktion des Körpers [106]. In Abhängigkeit vom Genotyp lag die Dauer der Therapie zwischen 24 und 72 Wochen [107]. Erreichte man für die Genotypen 2 und 3 eine SVR von 70-80%, reduzierte sich diese auf nur noch 50% bei Genotyp 1 [108].
Auf Grund der geringen Erfolgsrate und der gravierenden Nebenwirkungen wie Depressionen, Schlafstörungen, Müdigkeit, Anämien, Haarausfall, Knochenmarkdepression
9 und starken Hautveränderungen, aber auch neuropsychiatrischen Nebenwirkungen (Psychosen und Manien), ist diese alleinige Kombination nicht mehr empfehlenswert [109][110].
Therapiealternativen waren bis zu diesem Zeitpunkt rar und die Nachfrage nach weiteren Therapieoptionen sorgte im Jahr 2011 für die Zulassung von Boceprevir (BOC) und Telaprevir (TVR) für Genotyp 1 [111][112]. Beide werden auch als NS3-4A- Proteaseinhibitoren bezeichnet und repräsentieren die erste Generation der sogenannten
„directly acting antiviral agents“ (DAA`s), da sie direkt in die Virusreplikation eingreifen können [113]. In Kombination mit Ribavirin und PEG-IFN-α erzielten sie bei einer Therapiedauer von 24-48 Wochen SVR-Raten von 65-75% [114]. Die rasche Resistenzbildung, welche durch die hohe Variabilität des Hepatitis C Virus erklärbar ist, erschwerte den Einsatz der DAA`s als Monotherapie, sodass trotz Wechselwirkungen auf Ribavirin und PEG-IFN-α noch nicht vollständig verzichtet werden konnte [112][115].
Alleine im Jahr 2014 konnten der NS5B-Inhibitor Sofosbuvir (01/14), der NS3/4A- Proteasehemmer Simeprevir (05/14) und die NS5A-Inhibitoren Daclatasvir (08/14) und Ledipasvir (11/14) in Europa zugelassen werden, sodass, je nach Genotyp, SVR-Raten von bis zu 98% bei geringem Nebenwirkungsprofil erreicht werden konnten [116][117][118][119][120]. Abhängig von Patient und Genotyp wurde in der Regel 12-24 Wochen interferonfrei mit den neuen DAA`s therapiert [116].
Mittlerweile existieren diverse Vertreter der drei Substanzklassen, welche, am jeweiligen Namen erkennbare Schritte des HCV-Zyklus hemmen können. NS3/4A Protease-Inhibitoren hemmen die Protease NS3/4A und stoppen somit die Polyproteinzersetzung. NS5A- Inhibitoren und NS5B-Polymerase-Inhibitoren greifen an der Polymerase an und reduzieren das Kopieren von Virus-RNA [100].
Abbildung 4 zeigt einen Überblick aller aktuell verfügbaren DAA´s, wobei Boceprevir und Telaprevir von den neueren DAA`s abgelöst wurden. Beide werden, laut aktuellen Leitlinien, aufgrund niedriger SVR-Raten und zu starken Nebenwirkungen in Deutschland nicht mehr empfohlen [94][121].
10 Abbildung 4: Substanzklassen zur Therapie der chronischen Hepatitis C
Die neu zugelassenen Substanzen inhibieren das Virus an unterschiedlichen Punkten des viralen Replikationszyklus. Medikamente mit der Endung „-previr“ zählen zu den NS3/4A-Protease-Inhibitoren. Die Endung “-asvir“ beschreibt die NS5A-Inhibitoren. Die NS5B-Inhibitoren enden auf „-buvir“. Die Kombination aus mehreren Substanzgruppen erhöht die SVR-Rate, sodass kein Interferon mehr nötig ist. Das jeweilige Therapieregime und die Therapiedauer sind u.a. abhängig vom Genotyp (adaptiert nach [94][122]).
Empfohlen wird eine Kombinationstherapie aus mehreren Substanzgruppen, da dies die Gefahr der Resistenzentwicklung und somit die Therapiedauer senken kann. Entscheidende Faktoren für die Auswahl einer optimal angepassten Therapie sind komplex und müssen sorgfältig abgewogen werden.
Relevant sind der jeweilige Genotyp, die Ausgangsviruslast, der Progress der Lebererkrankung, Co-Medikationen und /oder Co-Infektionen (HIV, HAV, HBV, HDV) sowie weitere relevante Stoffwechselvorerkrankungen. Ebenfalls bedeutsam ist eine bereits zurückliegende antivirale Therapie oder ein zuvor bereits beschriebenes Therapieversagen unter DAA`s. In diesen Fällen muss eine zeitliche Verlängerung der Medikationseinnahme erfolgen [94]. Eine kompensierte bzw. dekompensierte Leberzirrhose entscheidet über den, in diesen Fällen noch empfohlenen, Zusatz von Ribavirin [116].
Sollte ein deutlich reduzierter Allgemeinzustand des Patienten bei dekompensierter Leberzirrhose bestehen, muss sorgfältig abgewogen werden, ob eine Therapie generell stattfinden kann [123].
12
1.4 Komplikationen nach Lebertransplantation und Immunsuppression
Im Laufe der chronischen HCV-Infektion entsteht nach 20 Jahren bei geschätzt einem Drittel der Betroffenen eine Leberzirrhose. Hieraus entwickelt sich bei ca. 5% der Patienten in Folge ein HCC [87].
Somit ist die durch eine chronische Hepatitis C entstandene Leberzirrhose, gefolgt vom HCC, eine der häufigsten Indikationen zur Lebertransplantation [126]. Die Abschätzung der Prognose sowie die Notwendigkeit zur Transplantation müssen bei jedem Patienten individuell mit Hilfe des MELD-Scores (Model of End-Stage Liver Disease-Score) und der Child-Pugh-Klassifikation gestellt werden. Der MELD-Score bezieht zur prognostischen Aussagekraft das Bilirubin [mg/dl], den INR, das Kreatinin [mg/dl] sowie eine aktuelle Dialysebehandlung des Patienten mit ein [127]. Kurz nach Transplantation entwickelt sich durch das Hepatitis C Virus bei nahezu allen Patienten (97%) eine rekurrente Infektion der Leber [128]. Postoperativ konnte eine höhere HCV-RNA-Viruslast als vor der Transplantation beobachtet werden, sodass in 50-98% der Fälle eine erneute chronische Hepatitis, gefolgt von einer Zirrhose bei einem Drittel der Patienten nach 5 Jahren unvermeidbar ist [129][130][131]. Berenguer et al. konnten zeigen, dass der zeitliche Abstand zwischen Transplantation und erneuter Zirrhosemanifestation im Vergleich zu immunkompetenten Patienten stark verkürzt ist, sodass in vielen Fällen eine zeitnahe Re- Transplantation erfolgen muss [129].
Das Fehlen von potenten Medikamenten war stets Gegenstand vieler Studien. Bis vor einigen Jahren wurden, trotz vieler Nebenwirkungen, lediglich interferonbasierte Therapien mit mäßigem Erfolg eingesetzt [132].
Carrión et al. beschrieben in einer randomisierten kontrollierten Studie, die rechtzeitige antivirale Therapie als entscheidende positive Komponente bezüglich der Reinfektion und des Progresses der Erkrankung [133].
Auch Pelletier et al. vermuteten, dass die Höhe der Viruslast und der frühzeitige Therapiebeginn vor bzw. nach Transplantation für das Überleben des Patienten entscheidend sein könnten, sodass die Viruslast bevorzugt vor und in der frühen Phase nach Transplantation sowohl prognostisch als auch therapeutisch genutzt werden könnte [131].
In einer randomisierten kontrollierten Studie, beschrieben durch Everson et al., erfolgte eine antivirale präoperative 10-wöchige Therapie mit Ribavirin und Interferon bei HCV-positiven Patienten. Zum Transplantationszeitpunkt konnte kein HCV mehr nachgewiesen werden. Die höchsten post transplantationem gemessenen SVR-Raten zeigten sich bei den Patienten mit
13 der längsten präoperativen antiviralen Therapie (15 Wochen = 44%). Zeitgleich erhöhte sich mit der Dauer der Therapie die Gefahr von unerwünschten Arzneimittelreaktionen und Therapieabbrüchen. Die Wahrscheinlichkeit einer rekurrenten Infektion stieg nach kürzerer antiviraler Therapie (<15 Wochen) signifikant an [134].
Verschiedene potentielle Faktoren bezüglich des stark variierenden Verlaufs der HCV- Infektion nach Transplantation sind Gegenstand der Diskussion.
In diesem Zusammenhang konnten Féray et al. eine Korrelation zwischen einzelnen HCV- Genotypen, speziell Genotyp 1b, und der Schwere und Aggressivität der Erkrankung nach Transplantation demonstrieren [135]. Diese Beobachtungen konnten allerdings in nachfolgenden Studien nicht bestätigt werden [136][137].
Der wohl am besten erforschte Faktor des Verlaufs der Rezidivhepatitis und des Organüberlebens nach Lebertransplantation ist neben einer gut dosierten Immunsuppression und so wenig Komorbiditäten des Organs wie möglich, das Alter des Spenderorgans.
Mit steigendem Spenderorganalter (> 60 Jahre) vermindert sich die Prognose der Empfänger durch einen Progress der Leberfibrose [129][138]. Ein höheres Spenderalter verzeichnet zusätzlich oft eine Verfettung (Steatosis) des Spenderorgans mit Komorbiditäten (Stoffwechselstörungen etc.), welche nachweislich einen Effekt auf das Überleben haben können [139].
Die Bedeutung der Human leukocyte Antigen (HLA)-Übereinstimmung zwischen Donor und Empfänger zeigt sich in verminderten Abstoßungsreaktionen. Es konnte bei Nicht- Übereinstimmungen gleichzeitig ein leichter Progress der Erkrankung beobachtet werden [140].
Neben dem Spenderorganalter hat die immunsuppressive sowie oben erwähnte antivirale Therapie einen besonderen Stellenwert in Hinblick auf die HCV-Reinfektion der Leber.
Sie ist essentiell um einen Schutz für das neue Organ zu gewährleisten. Das Wissen einer exakt dosierten Therapie ist von besonderer Relevanz, um sowohl eine Abstoßung als auch eine erneute Infektion des Transplantates zu vermeiden [141].
Die Calcineurininhibitoren (CNI) Ciclosporin A (CsA) und Tacrolimus bilden wichtige Vertreter dieser Gruppe. CsA wird erfolgreich seit dem Jahr 1980 sowohl als Immunsuppressivum gegen Transplantatabstoßungen als auch gegen Autoimmun- erkrankungen wie z.B Colitis ulcerosa und Morbus Crohn genutzt [142][143].
Seit 2003 konnte ein antiviraler Effekt im Replikon-Modell beobachtet werden. Dieser lässt sich, unabhängig von der immunsuppressiven Wirkung, durch eine Bindung des CsA`s an Cyclophiline (Cyp`s) erklären [144]. Für die HCV-Replikation ist Cyclophilin A (Cyp A) als
14 Co-Faktor essentiell. Durch die CsA-Bindung wird sowohl Cyclophilin als auch folglich die HCV-RNA-Replikation inhibiert [145].
Im Gegensatz zu CsA besitzt Tacrolimus keine antivirale Wirkung, jedoch besteht ein supprimierender Effekt auf das Immunsystem. Vereinzelte Studien nach Nierentransplantation beschreiben, dass einer Therapie mit Tacrolimus im Gegensatz zu CsA, weniger Abstoßungsreaktionen mit zusätzlich kürzerer Therapiedauer und einem insgesamt längeren Transplantatüberleben folgen [144].
Weitere Vertreter der immunsuppressiven Therapie sind Glucocorticoide (GC), welche seit längerer Zeit Gegenstand vieler Diskussionen sind. Es konnte mittlerweile belegt werden, dass eine starke Assoziation zwischen Steroid-Bolus-Therapien nach Lebertransplantation und akuten Abstoßungsreaktionen sowie einer frühzeitigen HCV- Reinfektion des Transplantates besteht [146][147]. Auch werden Zusammenhänge zwischen hochdosierten GC-Gaben und einer beschleunigten Fibroseentwicklung des transplantierten Organs berichtet [148]. Ciesek et al. beschrieben eine direkte Korrelation zwischen GC-Gabe und einem gesteigertem Zelleintritt des Virus, gefolgt von einem schlechteren Krankheitsverlauf des Patienten [149]. Somit muss die Anwendung dieser Therapieoption sorgfältig abgewogen werden. Es wird eine langsame GC-Dosisreduktion empfohlen, um positive Effekte zu erzielen [150].
Antivirale Alternativen nach Transplantation stellen zusätzlich Mycophenolat-Mofetil (MMF) und Azathioprin sowie PEG-IFN-α und Ribavirin dar [151].
Mit den zwei letztgenannten Substanzen wird nur bei einem Drittel der Patienten ein virologisches Ansprechen erreicht [152].
Seit dem Jahr 2000 wird der mTOR-Inhibitor Everolimus im Rahmen von Herztransplantationen eingesetzt, da er sowohl eine immunsupprimierende als auch eine nephroprotektive Wirkung aufweist und somit auch bei Niereninsuffizienz bevorzugt eingesetzt werden kann. Seit 2012 ist Everolimus ebenfalls zur Immunsuppression nach Lebertransplantation zugelassen [153].
Im Zeitalter der DAA`s gibt es aktuell laut offizieller Leitlinien für postoperative HCV- positive Patienten bei noch ausstehenden Langzeitergebnissen keine einheitliche Leitlinie.
Sorgfältig soll individuell nach Interaktionen und Verträglichkeit entschieden werden. Bisher wird eine Anlehnung an die antivirale DAA-Therapie bei nicht transplantierten HCV- Patienten empfohlen, denn bisher konnten ähnliche SVR-Raten bei guter Lebensqualität beobachtet werden [94].
15 Interessante Ergebnisse im Hinblick auf den optimalen Beginn der antiviralen Therapie zeigte die ALLY-1-Studie, welche Patienten mit und ohne antivirale Vorbehandlung sowie mit fortgeschrittener Zirrhose oder bereits erfolgter Transplantation unabhängig vom Genotyp einschloss. Daclatasvir, Sofosbuvir und Ribavirin erzielten bei Patienten mit rekurrenter HCV-Infektion nach Lebertransplantation SVR12-Raten von 94% sowie von 83% bei fortgeschrittener Zirrhose. Eine SVR 12 bei Genotyp 1a (97%) und Genotyp 1b (90%) sowie Genotyp 6 (100%) nach Transplantation wurde ohne Modifizierung der immunsuppressiven Therapie erreicht [154].
Der optimale Zeitpunkt des antiviralen Therapiebeginns ist noch Grundlage für Diskussionen.
Postoperativ kann eine DAA-Therapie nach 12 Wochen begonnen werden, vorausgesetzt es erfolgte bereits zuvor eine Reduktion der Steroide. Bei SVR12-Raten von im Schnitt mehr als 90% aller Genotypen konnte somit bisher eine relativ gute Prognose auf das Patientenüberleben dokumentiert werden. Bei komplikationsbehafteten Verläufen kann im Zweifelsfall früher begonnen werden. Besteht jedoch ein Interaktionspotential zwischen Immunsuppressivum und DAA, muss zunächst eine konstante Immunsuppression bestehen, bevor die antivirale Therapie begonnen werden kann [94][122][155][156][157].
Der limitierende Faktor nahezu aller erwähnten antiviralen und immunsuppressiven Substanzen nach Transplantation sind die zahlreichen Nebenwirkungen. Opportunistische Infektionen mit der Gefahr des akuten Organversagens (CMV, EBV) stellen ein großes Problem dar [158]. Hämolytische Anämien (Ribavirin) [159], Nierenfunktionsstörungen (Tacrolimus, CsA) [160] und Depressionen (PEG-IFNa) [110] sind nur einige von vielen Nebenwirkungen, welche die Lebensqualität der Patienten beeinträchtigen können.
1.5 Mammalian Target of Rapamycin (mTOR)
MTOR („mammalian Target of Rapamycin”) ist ein, aus 2549 Aminosäuren bestehendes, 290 kDa schweres Protein, welches im Jahr 1994 durch Solomon Snyder und David M. Sabatini entdeckt wurde [161]. MTOR wird auch als RAFT1 (rapamycin-and-FK506-binding-protein- target 1) oder FRAP1 (FK506-binding-protein-rapamycin-associated-protein 1) bezeichnet.
Es ist eine, in jeder Säugetierzelle vorkommende, Serin-Threonin-Proteinkinase, welche durch das Immunsuppressivum Rapamycin gehemmt werden kann [162][163]. MTOR fungiert aufgrund der zentralen Position in Signalwegen der Zelle als anaboler Koordinator von essentiellen Regulationsmechanismen wie Zellproliferation und -wachstum, Energiehaus- halt und Zellzykluskontrolle [164].
17 (mammalian lethal with SEC13 protein 8), DEPTOR (DEP domain-containing mTOR- interacting protein), PRAS40 (Proline-rich AKT1 substrate 1) und weiteren Proteinen und ist sensitiv gegenüber dem Immunsuppressivum Rapamycin [170]. Das RAPTOR-Protein besitzt ein Molekulargewicht von 150 kDa und reguliert nährstoffabhängig u.a. das Wachstum der Zelle [171]. In Kombination mit mTOR initiiert RAPTOR die Phosphorylierung von zwei Zielenzymen, dem Translationsinhibitor 4E-BP1 (eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF-4E) binding protein-1) und der Kinase p70S6K1 (protein70 S6 kinase 1), wodurch sowohl die Translation von Proteinen als auch die Zellproliferation von Zellen der Immunabwehr (T-Zellen) stimuliert werden [171][172][173][174]. Da die aktive Zelle abhängig von regelmäßigen Energiequellen ist, wird bei Energiemangel AMPK aktiviert (AMP-activated-protein-kinase). Hierdurch wird der Verbrauch der Zelle vermindert, indem mTORC1 sowie die Phosphorylierung von p70S6K1 und 4E-BP1 inhibiert werden und somit Prozesse, wie z. B. die Proteinsynthese nur eingeschränkt stattfinden [175].
MTORC2 entsteht aus dem Zusammenschluss von mTOR, RICTOR (rapamycin-insensitive companion of mTOR) (200 kDa), mSin1 (mammalian stress-activated protein kinase interacting protein 1), mLST8, DEPTOR und weiteren Proteinen [176]. Rapamycin besitzt keinen bzw. nur einen geringen inhibierenden Effekt auf mTORC2 [177][178]. Der Aufbau und die Organisation des Aktin-Zytoskeletts sowie der AKT (Protein B Kinase) -abhängige Einfluss auf Wachstum und Apoptose werden durch mTORC2 organisiert [179][180].
Die Tatsache, dass eine gesteigerte Aktivität des PI3K/Akt/mTOR-Signalweges mit einer erhöhten Krebsrate assoziiert ist und somit häufig im Rahmen vieler Tumorentitäten beschrieben wird, lässt ihn zu einem elementaren Angriffspunkt für weitere therapeutische Studien werden. Verschiedene Inhibitoren gegen PI3K und mTOR sind Grundlage klinischer Studien [181][182].
Die mTOR-Inhibitoren Rapamycin und Everolimus werden seit Beginn der Jahrtausendwende u.a. in der Onkologie und der Transplantationsmedizin eingesetzt.
1.6 Rapamycin und Everolimus – mTOR-Inhibitoren und ihre Bedeutung
Rapamycin, auch Sirolimus genannt, und Everolimus bilden die erste Generation der mTOR- Inhibitoren und werden u.a. als Immunsuppressiva mit Makrolidstruktur eingesetzt, um Organabstoßungen nach Transplantationen zu vermeiden [183]. Rapamycin wurde erstmals in den 70er Jahren auf einer Insel namens Rapa Nui (Osterinsel) entdeckt, nachdem der Bakterienstamm Streptomyces hygroscopicus isoliert wurde [184]. Ursprünglich sollte
18 Rapamycin ein antimykotisches Wirkspektrum erzielen, doch seit den 90er Jahren wurde sowohl die immunsuppressive Aktivität durch Hemmung der T-Zell-Aktivität als auch die antikanzerogene Wirkung durch antiproliferative Effekte erkannt [185][186]. Rapamycin und Everolimus wirken, im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten Immunsuppressiva wie Tacrolimus und Cyclosporin A, nicht nephrotoxisch [187]. Sie finden dadurch bei Patienten nach Nierentransplantationen erfolgreich Verwendung, sodass die Rate der Abstoßungsreaktionen und der Transplantatnephropathien deutlich gesenkt werden konnte [188][189][190].
Im Jahr 1997 berichteten Schuler et al. von der Entwicklung eines Rapamycin-Derivates namens Everolimus, welches einen vergleichbaren Wirkmechanismus, jedoch verbesserte orale Bioverfügbarkeit besitzt [191][192].
Seit 2003 ist Everolimus in der Europäischen Union zusammen mit Cyclosporin A und Glucocorticoiden im Rahmen der Prophylaxe der Transplantatabstoßung nach Nieren- und Herztransplantation zugelassen [193][194]. Seit 2012 wird Everolimus auch in Kombination mit Tacrolimus für Patienten nach Lebertransplantation eingesetzt [153]. Die Kardiologie und die Onkologie erkannten neben der immunsuppressiven auch die antiproliferative Wirkung der mTOR-Inhibitoren [195][196]. Erstere verwenden mit Rapamycin beschichtete Stents (drug eluting stents), um eine Re-Stenose zu vermeiden [197][198]. Die Onkologie nutzt Everolimus u.a. zur Therapie des metastasierten Nierenzellkarzinoms, des fortgeschrittenen neuroendokrinen Tumors des Pankreas, der Lunge und des Gastrointestinaltraktes sowie des fortgeschrittenen hormonrezeptor-positiven Mammakarzinoms [199][200][201][202].
Molekularbiologisch betrachtet bilden Rapamycin und Everolimus einen Komplex mit dem FKBP12 (FK506 binding protein 12), welcher wiederum an den mTORC1 bindet und somit sowohl den PI3K/Akt/mTOR-Signalweg als auch die nachgeschalteten Phosphorylierungen der Proteine p70S6K1 und 4E-BP1 inhibiert [203]. Der Zellzyklus, die Zellproliferation und die Proteinbiosynthese können nach Bindung nicht mehr adäquat aufrecht erhalten werden und der Übergang der T-Zellen von der G1-Phase in die S-Phase unterbleibt. Dies führt unter anderem zum Effekt der Immunsuppression [204]. Die Wirkung beschränkt sich nicht nur auf die lymphatische Zellreihe. Auch die Proliferation der hämatopoetischen Zelllinie ist betroffen. Folglich lassen sich neben der gewünschten reduzierten Immunantwort mit Wundheilungsstörungen und Infektionen auch Anämien und weitere Störungen der Blutbildung beobachten. Weitere typische unerwünschte Arzneimittelwirkungen sind u.a.
Hyperlipidämie, Pneumonitis, Pleura- und Perikardergüsse, Hyperglykämien, Diabetes mellitus, Übelkeit und Stomatitis [205][206][207][208][209][210][211][212].
19 Aus onkologischer Sicht erzielt Everolimus eine erfolgreiche Wachstums- und Vaskulari- sationsinhibition von Tumoren durch Hemmung des VEGF [213][214][215].
Chronische Transplantatabstoßungen sind eine große Herausforderung für die bisherigen immunsuppressiven Substanzen. Viele transplantierte Patienten entwickeln nach 10-jähriger Therapie mit CNI´s gravierende Nierenschäden und sogar 7-21% der Herz-, Leber- und Lungentransplantierten enden nach 5 Jahren in einem chronischen Nierenversagen. Bei Patienten nach Lebertransplantation zeigte sich unter Therapie mit Cyclosporin A ein erhöhtes Risiko für Nierenfunktionsstörungen bis hin zum Nierenversagen, im Vegleich zu Patienten unter Tacrolimustherapie [216][217]. Nebenbefundlich erhöht sich ebenfalls das Risiko des Wiederauftretens eines HCC`s [218][219][220].
Aktuell ist in der Transplantationsmedizin die zeitnahe Kombinationstherapie mit Cyclosporin A oder Tacrolimus, Steroiden und mTOR-Inhibitor empfohlen [221].
Obwohl Rapamycin im Gegensatz zu Cyclosporin A nicht nephrotoxisch ist, konnten unter Kombinationstherapie additive Effekte beobachtet werden, sodass erhöhte Nieren- retentionsparameter mit Gefahr des Nierenversagens und der Organabstoßung resultieren können [222]. Hüsing et al. beschreiben den Vorteil der fehlenden Nephrotoxizität nach dem Wechsel von CNI`s auf eine Therapie mit u.a. einem mTOR-Inhibitor [223][224][225]. Im Rahmen weiterer positiver Studienergebnisse zeigte sich, dass der Wechsel von CNI`s auf mTOR-Inhibitoren nach Lebertransplantation eine sichere Alternative darstellt, da chronische Nierenfunktionsstörungen verringert und ein längeres postoperatives Überleben der Patienten beschrieben werden können [226].
Eisen et al. demonstrierten, dass Everolimus, als eines der ersten Substanzen, den Progress der Abstoßungsreaktion durch eine Transplantatvaskulopathie, speziell bei herztransplantierten Patienten, aktiv bremsen kann [227]. Zusätzlich besitzen mTOR- Inhibitoren, im Gegensatz zu CNI`s, einen negativen Einfluss auf das Wachstum von Tumorzellen, sodass das Risiko der Tumorentstehung nach Transplantation in Folge eines reduzierten Immunstatus gemindert werden kann [228][229][230].
In Tierversuchen konnte unter der Therapie mit mTOR-Inhibitoren sowohl eine kardioprotektive Wirkung, eine reduzierte CMV (Cytomegalievirus)-Inzidenz als auch eine geringere Inzidenz des Diabetes mellitus demonstriert werden [227][231].
Gegensätzlich dazu ergab sich in einer retrospektiven randomisierten Studie nach Nierentransplantation kein signifikanter Vorteil nach Addition von Rapamycin. Zwar zeigten sich niedrigere CMV-Infektionsraten, jedoch war die Anzahl der unerwünschten Nebenwirkungen wie u.a. Proteinurie und die Therapieabbruchrate erhöht [232].
20 Interessanterweise konnte neben dem immunmodulierenden auch ein antiviraler Effekt durch mTOR-Inhibitoren gesehen werden. In einer prospektiven Kohortenstudie konnte bei Patienten nach Lebertransplantation und HCV-Rekurrenz eine deutlich niedrigere Viruslast mit einem signifikant längeren Überleben dokumentiert werden [233].
Nach Nierentransplantation konnten Soliman et al. selbigen Effekt beobachten [234].
Da der Erfolg einer Organtransplantation maßgeblich von einer optimal kombinierten immunsuppressiven und antiviralen Therapie abhängig ist, werden in den nächsten Jahren weitere klinische Studien- und Langzeitdaten bezüglich der mTOR-Inhibitoren dringend erwartet.
1.7 HCV und mTOR - Molekularbiologische und klinische Fragestellungen
Aus immunologischer Sicht ist die Autophagie einer Wirtszelle durch körperliche Stresssituationen, wie Nahrungs- oder Wachstumsfaktormangel, Schädigung von Zellbestandteilen oder während viraler Infektionen für den gesamten Organismus als Schutzmechanismus besonders bedeutsam [235].
Im Falle einer Virusinfektion nutzt das Virus üblicherweise die Werkzeuge der Wirtszelle mittels verschiedener Mechanismen zur Virusproteintranslation, während die zelleigene Proteinsynthese unterbleibt [236].
Hier nutzt das Hepatitis C Virus ein ausgeklügeltes System, um die eigene Virusreplikation in der Wirtszelle gewährleisten zu können. Auf molekularbiologischer Ebene ist bis heute nicht vollständig geklärt, welcher Mechanismus verantwortlich ist.
Bekannt ist mittlerweile jedoch, dass das Virusprotein NS5A den zentralen PI3K/Akt/mTOR- Signalweg, speziell das mTOR-Protein, nutzt um die Viruspersistenz aufrecht zu erhalten, indem es die Apoptose der infizierten Wirtszelle hemmt [237].
NS5A knüpft parallel sowohl an FKBP38 (FK506-binding protein 38), welches ein Bindeprotein der FK506-Familie ist, als auch an p85, eine Untereinheit von PI3K [238].
FKBP38 agiert als Teil des mTOR-Signalweges, um Zellwachstum, Zellproliferation und Zelldifferenzierung zu gewährleisten, indem es eine nahrungs- und energieabhängige, antagonistische Bindung mit mTORC1, jedoch nicht mit mTORC2 eingeht [237][239][240][241]. Fu et al. beschreiben eine NS5A-abhängige Aktivierung des mTORC1- Proteins, indem FKBP38 aus dieser Bindung entlassen wird [242]. Sobald mTORC1 aktiviert ist, erhöht sich nachfolgend die Phosphorylierungsrate und die Expression von p70S6K1 und 4E-BP1. 4E-B-Proteine kontrollieren die mRNA-Translation, indem sie mit eIF4G (eukaryotic translation initiation factor 4G) um die Bindung an eIF4E (eukaryotic translation
21 initiation factor 4E) konkurrieren. Das phosphorylierte 4E-BP1 ist nicht mehr in der Lage, an eIF4E zu binden. Somit ist es eIF4E möglich, eine Verbindung mit eIF4G zu knüpfen. Beide bilden zusammen den Translationskomplex eIF4F (eukaryotic translation initiation factor 4F), welcher die Proteintranslation aktiviert und eine ungestörte Virusvermehrung ermöglicht [50][237][243].
Interessanterweise zeigen Ishida et al., dass die mTOR nachgeschaltete Serin/Threonin Kinase PAK1 (p21-ativated kinase 1) in der Steuerung der Virusreplikation mitbeteiligt ist. In etablierten Zellkulturmodellen führte die Phosphorylierung von PAK1 durch p70S6K zur Verminderung der viralen Replikation. Umgekehrt konnte ein Ausschalten („knock-down“) von p70S6K durch Rapamycin und/oder PI3K-Inhibitoren und eine folglich verminderte Phosphorylierung von PAK1 eine gesteigerte HCV-RNA-Rate dokumentieren [244].
Sahin et al. identifizierten p70S6K als möglichen prokanzerogenen Faktor für das HCC. In einer kleinen analytischen immunhistochemischen Studie konnte ein Zusammenhang zwischen HCC-Tumorgröße und -grad, mTOR-Aktivität und der Expression von p70S6K beschrieben werden [245]. Die durch NS5A vermittelte erhöhte Zellproliferation sowie die erhöhte eIF4F-Aktivität verstärkt vermutlich das Risiko für die Tumorentstehungen, insbesondere das des HCV-induzierten HCC`s [243].
Ein weiterer potentieller Angriffspunkt des Hepatitis C Virus ist der Lipidmetabolismus, speziell „lipid droplets“, da der HCV-Lebenszyklus maßgeblich darauf basiert [246].
Lipid droplets sind für den gesamten HCV-Stoffwechsel, inklusive Infektion, Replikation und Zusammenbau neuer Viruspartikel essentiell. Bereits der virale Eintritt in die Wirtszelle geschieht u.a. mittels Endozytose durch Knüpfung an den „Low Density Lipoprotein Receptor“ (LDL-R). Die hieraus entstehenden viralen Lipopartikel (LVP) sind sehr infektiös und unverzichtbar für das Überleben des Virus. Im rER erfolgt die Virustranslation und Replikation mittels Interaktion zwischen zelleigenen und viralen Proteinen sowie supportiv durch Lipide. Lipid droplets befinden sich stets in räumlicher Nähe und werden in das
„membranous web“ des rER eingeflochten, um ihre Lipidmembranen für die Virusreplikation zur Verfügung zu stellen [247]. Die ursächlichen Mechanismen sind noch nicht gänzlich verstanden. Bekannt ist allerdings, dass ein regelrechter Lipidtransport mit funktionsfähigen Transferproteinen und -lipiden die HCV-RNA-Replikation verstärken kann [248].
Nicht zufällig werden nach und während chronischer HCV-Infektionen extrahepatische Stoffwechselstörungen wie z. B. Insulinresistenzen, Diabetes mellitus oder Atherosklerose beschrieben [249].
22 Interessanterweise wird das fragile Gleichgewicht der Lipogenese der Leber maßgeblich durch mTORC1 reguliert. Bekannt ist, dass mTORC1 die Fettsynthese mittels „sterol regulatory element-binding protein“ (SREBP1)-Aktivierung verstärkt und die Lipolyse in lipid droplets beeinflusst. Als Transkriptionsfaktoren aktivieren SREBP`s die Expression von fast allen lipogenen Enzymen [250][251].
Dies bestätigt eine Studie von Wan et al., in welcher weniger SREBP1-Aktivierung nach RAPTOR und folglich mTORC1 „knockdown“ mit reduzierter Lipidsynthese und nachfolgend weniger Triglyceriden und freiem Cholesterol in Mäusen beschrieben werden konnte [252].
Insgesamt konnte nach mTORC1/RAPTOR-Inhibierung durch Rapamycin oder physiologisch durch fehlende Nahrungsaufnahme eine gesteigerte Lipolyse sowie eine Ausschüttung von freien Fettsäuren in den Blutkreislauf detektiert werden. Umgekehrt resultierte aus einer mTORC1-Aktivierung durch beispielsweise viralen Einfluss oder auch physiologisch durch Nahrungsaufnahme die Herstellung und Speicherung von Fetten [253][254][255].
Stoeck et al. beschreiben in infizierten Zellen eine, vermehrt um den Nucleus bestehende, Cholesterol-NS5A Co-lokalisation, welche für die Virusreplikation eine günstige Lipidbereit- stellung gewährleistet [256].
Das Bestreben des Virus ist, soweit bisher verstanden, der Aufbau eines funktionsfähigen Replikationskomplexes mittels des Wirtszellenmaterials, bevorzugt mit Lipidmembranen und deren Bestandteilen. Ein brauchbarer Lipidtransport wird durch verschiedene endosomale und lysosomale Transferproteine gewährleistet. Besteht eine nicht ausreichende Menge an Lipidmaterial, ist auch die Virusreplikation erniedrigt.
In selbiger Studie zeigte eine Inhibition des Steroltransporters Niemann-Pick C1-like Protein 1 (NPC1L1), einen verringerten Lipidtransport zum Virusreplikationsort und eine folglich kleinere Virusmenge [256].
Nicht nur mTORC1, sondern besonders RAPTOR konnte als wichtiges Schlüsselprotein für die Aufrechterhaltung des HCV-Lebenszyklus und des Lipidmetabolismus detektiert werden.
Lee et al. konnten in generierten „Raptor-knockout-Mäusen“ bereits nach 2 Wochen eine gestörte Lipidresorption sehen. Trotz fettreicher Diät erfolgte keine Gewichtszunahme, sondern eher ein Schwund des subcutanen Fettgewebes sowie eine Hepatomegalie, Steatosis hepatis und Insulinresistenz [257]. Das Zusammenspiel des HCV-Lebenszyklus und der Lipogenese könnte womöglich das fehlende Bindeglied zwischen HCV, Lipidmetabolismus und PI3K/Akt/mTOR-Signalweg sein.
23 Interessant könnten diese Beobachtungen auch für weitere virale Erreger, wie z.B. das Cytomegalievirus (CMV), das humane Papillomavirus (HPV), das Epstein-Barr-Virus (EBV) oder das Humane Herpesvirus-8 (HHV-8) sein, da diese ebenfalls über den mTOR-Signalweg agieren [258].
Klinische Studien werden erwartet, denn bereits aktuell zeigt der Einsatz von mTOR- Inhibitoren eine reduzierte Viruslast in HCV-infizierten Patienten und eine gewünschte Immunsuppression nach Lebertransplantation.
Beobachtete Nebenwirkungen wie Hyperlipoproteinämie müssen noch bestätigt werden.
Inwiefern die Lipidsynthese im Detail beeinflusst wird, muss in Langzeitstudien abgewartet werden.
1.8 Ziele der Arbeit
Die medikamentöse Therapie der rekurrenten chronischen HCV-Infektion nach orthotoper Lebertransplantation (OLT) ist noch immer eine große Herausforderung. Für Patienten sind die starken Nebenwirkungen und Medikamenteninteraktionen besonders belastend.
Mehrere klinische Studien beschreiben einen Vorteil bei Patienten nach Transplantation, wenn als immunsuppressives Regime ein mTOR-Inhibitor eingesetzt wird [228][229][230].
Ob mTOR-Inhibitoren neben dem immunsuppressiven auch einen direkten Einfluss auf den HCV-Replikationszyklus besitzen und ob ein antiviraler Effekt besteht, wurde bisher nur vermutet. Sollte ein antiviraler Effekt bestehen, soll diese Studie in Hinblick auf den molekularbiologischen Hintergrund helfen hierfür weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
HCV-infizierte Patienten zeigen nach einer Lebertransplantation in Bezug auf das Transplantatüberleben eine wesentlich schlechtere Prognose als Patienten, welche sich in Folge anderer Ursachen einer Lebertransplantation unterziehen lassen müssen [259].
Die HCV-Reinfektion, die nach Transplantation bei nahezu allen HCV-positiven Patienten auftritt, wird ebenso wie eine suboptimale immunsuppressive Therapie mit einer schlechteren Prognose assoziiert, sodass eine maßgeschneiderte Immunsuppression jedes einzelnen Patienten von großer Bedeutung ist [88].
Ziel dieser Arbeit ist es, den Effekt von mTOR-Inhibitoren auf das Hepatitis C Virus zu beleuchten. Sowohl in vivo als auch in vitro-Studien konnten den mTOR-Inhibitoren Rapamycin und Everolimus neben den immunsuppressiven zuvor noch nicht beobachtete, antivirale Effekte zuschreiben [234][260]
24 Beide Substanzen sollen in vitro mit Hilfe etablierter Zellkulturmodelle in verschiedenen Medikamentendosierungen in Bezug auf den HCV-Lebenszyklus betrachtet werden.
Mittels Pseudopartikeln und HCV-Viren der vollen Länge wird der Viruszelleintritt dokumentiert. Die Untersuchung der Virusreplikation und Partikelfreisetzung erfolgt mit Hilfe des HCV-Subgenoms.
Um einen antiviralen Effekt in vivo beschreiben zu können wird eine Patientenkohorte mit 42 Teilnehmern, welche nach Leber- oder Nierentransplantation auf eine immunsuppressive mTOR-Therapie wechselten hinsichtlich der HCV-RNA Level analysiert.
Bekannt ist, dass HCV das zelluläre Wirtsprotein mTOR für die Apoptoseinhibition aktiviert und somit die Aufrechterhaltung der chronischen Infektion verstärkt [237].
Molekularbiologisch gesehen ist jedoch noch unklar, ob und in welchem Ausmaß das mTOR- Protein einen direkten Einfluss auf den HCV-Replikationszyklus besitzt.
Einen vielversprechenden viralen und therapeutischen Angriffspunkt stellt der mTOR- Complex 1 und seine Untereinheit RAPTOR in Bezug auf die HCV-Replikation dar. Auch die Lipidhomöostase scheint einen nicht unerheblichen Einfluss auszuüben, sodass weitere Charakterisierungen und Analysen erfolgen, um die beobachteten Effekte einordnen und zukünftig neue effektivere Therapieregime für Patienten anbieten zu können.
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3. Diskussion und Ausblick
Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit demonstrieren erstmals die Identifikation der immunsuppressiven mTOR-Inhibitoren Rapamycin und Everolimus als Hemmer der HCV- RNA-Replikation mittels mTORC1-Inhibition in vitro und in vivo.
Aufgrund der antiproliferativen und immunsuppressiven Effekte werden Rapamycin und Everolimus bereits seit mehreren Jahren in der Onkologie und der Transplantationsmedizin eingesetzt.
Interessanterweise demonstrierten bereits Soliman et al. in nierentransplantierten Patienten eine Suppression der HCV-RNA-Replikation nach dem Wechsel des immunsuppressiven Regime von Ciclosporin A auf Rapamycin mit insgesamt weniger unerwünschten Nebenwirkungen [234].
Diese Ergebnisse konnten wir in einer Single-Center-Kohortenstudie mit 42 HCV-Genotyp 1 positiven Patienten nach Leber- oder Nierentransplantation bestätigen. Nachdem ein Wechsel der immunsuppressiven Therapie auf einen mTOR-Inhibitor erfolgte, konnte ein signifikanter Rückgang der HCV-RNA-Rate beobachtet werden. Es wurde ein insgesamt größerer antiviraler Effekt in der Gruppe der lebertransplantierten Patienten beschrieben. Hier dient als mögliche Erklärung die Tatsache, dass die hauseigenen Therapieleitlinien Glucocorticoide nach Nierentransplantation, jedoch nicht nach Lebertransplantation, empfehlen. Ciesek et al.
beschrieben in diesem Zusammenhang einen gesteigerten HCV-Zelleintritt nach hoch- dosierter Glucocorticoidtherapie [149].
Auch Kelly et al. bestätigten den Vorteil der Therapie mit mTOR-Inhibitoren nach orthotoper Lebertransplantation (OLT), indem das Voranschreiten der HCV-Reinfektion und seiner Folgen, wie Leberfibrose oder -zirrhose verlangsamt werden konnte [261].
Diese klinischen Ergebnisse erscheinen für HCV-infizierte, lebertransplantierte Patienten erfolgsversprechend, denn sie könnten von dem antiviralen als auch dem immunsuppressiven Effekt der mTOR-Inhibitoren profitieren. Das Ausmaß der Medikamenteninteraktionen zwischen antiviralen und immunsuppressiven Medikamenten nach Transplantation könnte minimiert und Abstoßungsreaktionen und Organverluste vermieden werden.
Zunächst jedoch ist die Vorrausetzung für die korrekte klinische Anwendung das Verständnis auf molekularbiologischer Ebene. Die einzelnen Wirkmechanismen sind bisher noch nicht
46 vollständig geklärt und weitere Studien werden erwartet. Unsere Ergebnisse konnten bereits wichtige Beiträge zum Verständnis leisten.
Eine besondere Rolle spielt der zelleigene mTOR Complex 1 in Kombination mit RAPTOR.
Beide sind universell in jeder Zelle vorhanden und unverzichtbar für diverse Signalwege des Zellwachstums, des Immunsystems und der Lipogenese. Sie bilden insgesamt eine Schnittstelle vieler weiterer komplexer Vorgänge des Stoffwechsels. Wir wissen, dass das Hepatitis C Virus diesen multifunktionellen Angriffspunkt nutzt, um eine effiziente HCV- RNA-Replikation zu erzielen [170][237].
In unseren Experimenten zeigten die viralen Strukturproteine E2, Core sowie die Nicht- Strukturproteine NS2 und NS5A eine dosisabhängige Reduktion nach Rapamycingaben, welche auch in gleicher Konzentration im Serum von transplantierten Patienten gemessen werden konnten. Interessanterweise beschränkte sich die Inhibition der HCV-RNA durch mTOR-Inhibitoren einzig auf die HCV-RNA-Replikation. Die restlichen Abschnitte, wie Viruseintritt, Translation und Bildung neuer Partikel blieben unbeeindruckt.
Den inhibitorischen Effekt konnten wir für Huh-7,5-Zellen sowie PHH-Zellen (Primäre Humane Hepatozyten) bestätigen und zeigte sich nicht nur für Genotyp 2, sondern ebenfalls für Genotyp 3 reproduzierbar. Antiproliferative und zytotoxische Effekte beider Substanzen wurden mittels DMSO (Dimethylsulfoxid)-differenzierter Huh-7,5-Zellen und PHH-Zellen ausgeschlossen.
Interessanterweise kristallisierte sich in unseren Ergebnissen speziell die mTORC1- Signaluntereinheit RAPTOR als besonderes Schlüsselelement für das Hepatitis C Virus heraus. Wir konnten erstmals zeigen, dass die RAPTOR-Inhibition durch „RAPTOR- knockdown“ zu einer signifikanten HCV-RNA-Reduktion führte sowie nach „RAPTOR- Überexpression“ ein deutlicher Anstieg selbiger zu verzeichnen war. Dies ergab sich nur für RAPTOR, jedoch nicht für mTORC2 und dessen Untereinheit RICTOR.
RAPTOR als, zuvor noch nicht beschriebener, zelleigener Wirtsfaktor erlaubt uns weitere Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Virus und Wirt zu erlangen.
Das Hepatitis C Virus, speziell das virale Protein NS5A, nutzt den PI3K/Akt/mTOR- Signalweg, um die chronische Infektion aufrecht zu erhalten, indem es mTORC1 und RAPTOR aktiviert und somit die Apoptosefunktion der Zelle inhibiert [237].
Die Aktivierung erfolgt über mehrere Bindungsproteine, sodass eine gesteigerte Phosphorylierungsrate der nachgeschalteten Proteine p70S6K und 4E-BP1 folgt. Die Translation und Expression der viralen Proteine wird somit eingeleitet [243].
47 Welche Rolle die räumliche Nähe zwischen Virus und benötigten Wirtsmaterialien spielt, war bisher unklar.
Hier konnten Mc Nulty et al. einen Zusammenhang zwischen der Virusreplikation des Andes- Virus (ANDV), welches zur Gattung der Hantaviren zählt, und dem mTORC1 beobachten.
Am ER infizierter Zellen wurde eine Co-lokalisation zwischen einem Glykoprotein des Andes-Virus und dem mTOR-Protein gesehen sowie eine Inhibition der Virusproteinexpression und -freisetzung nach Temsirolimus-Addition, einem Analogon des Rapamycins [262].
Obwohl mTORC1 durch HCV in unseren Studien ausschließlich zur Virusreplikation und nicht zur Proteinexpression oder -translation genutzt wird, sind beide Viren offenbar auf mTOR angewiesen.
Eine direkte Co-lokalisation zwischen mTORC1 und viralen Proteinen konnte in unseren Experimenten mittels Immunfloureszenz leider nicht gesehen werden, sodass eine indirekte Signalweitergabe durch weitere zwischengeschaltete Faktoren denkbar wäre. Eine Möglichkeit könnte der bereits beschriebene Zusammenhang zwischen HCV und dem Lipidmetabolismus darstellen.
Diese These bekräftigen Stoeck et al., indem sie eine perinucleäre Co-lokalisation von NS5A und Cholesterol beschreiben und vermuten, dass HCV eine ausreichende wirtseigene Lipidhomöostase in Form von lipid droplets benötigt, um die Virusreplikation gewährleisten zu können [256].
In der selben Studie wurde die Notwendigkeit der Wirtszellenlipide für einen funktionsfähigen viralen Replikationsapparat bekräftigt. War nicht genügend Wirtsmaterial vorhanden, schmälerte dies auch die Menge an viralen Produkten [256].
Eine ausreichende Lipidbereitstellung und ein Lipidtransfer sind somit anscheinend relevant für den HCV- Lebenszyklus. Diese Erkenntnisse sind nicht gänzlich neu, doch auch RAPTOR scheint einen bisher nicht erkannten Einfluss auf die Lipogenese zu besitzen.
So konnten Lee et al. in generierten „Raptor-knockout-Mäusen“ bereits nach zwei Wochen einen pathologischen Lipidstoffwechsel beobachten. Trotz fettreicher Diät wurde anstatt einer Gewichtszunahme eine Lipodystrophie mit Hepatomegalie, Steatosis hepatis und Insulinresistenz gesehen [257].
Ähnliches beschrieben Wan et al. im Rahmen der Identifikation der Rolle der SREBP1- Aktivierung durch mTORC1 [252]. SREBP`s sind Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von lipogenen Enzymen steuern [250][251]. Wan et al. sahen nach RAPTOR
