Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit demonstrieren erstmals die Identifikation der immunsuppressiven mTOR-Inhibitoren Rapamycin und Everolimus als Hemmer der HCV- RNA-Replikation mittels mTORC1-Inhibition in vitro und in vivo.
Aufgrund der antiproliferativen und immunsuppressiven Effekte werden Rapamycin und Everolimus bereits seit mehreren Jahren in der Onkologie und der Transplantationsmedizin eingesetzt.
Interessanterweise demonstrierten bereits Soliman et al. in nierentransplantierten Patienten eine Suppression der HCV-RNA-Replikation nach dem Wechsel des immunsuppressiven Regime von Ciclosporin A auf Rapamycin mit insgesamt weniger unerwünschten Nebenwirkungen [234].
Diese Ergebnisse konnten wir in einer Single-Center-Kohortenstudie mit 42 HCV-Genotyp 1 positiven Patienten nach Leber- oder Nierentransplantation bestätigen. Nachdem ein Wechsel der immunsuppressiven Therapie auf einen mTOR-Inhibitor erfolgte, konnte ein signifikanter Rückgang der HCV-RNA-Rate beobachtet werden. Es wurde ein insgesamt größerer antiviraler Effekt in der Gruppe der lebertransplantierten Patienten beschrieben. Hier dient als mögliche Erklärung die Tatsache, dass die hauseigenen Therapieleitlinien Glucocorticoide nach Nierentransplantation, jedoch nicht nach Lebertransplantation, empfehlen. Ciesek et al.
beschrieben in diesem Zusammenhang einen gesteigerten HCV-Zelleintritt nach hoch- dosierter Glucocorticoidtherapie [149].
Auch Kelly et al. bestätigten den Vorteil der Therapie mit mTOR-Inhibitoren nach orthotoper Lebertransplantation (OLT), indem das Voranschreiten der HCV-Reinfektion und seiner Folgen, wie Leberfibrose oder -zirrhose verlangsamt werden konnte [261].
Diese klinischen Ergebnisse erscheinen für HCV-infizierte, lebertransplantierte Patienten erfolgsversprechend, denn sie könnten von dem antiviralen als auch dem immunsuppressiven Effekt der mTOR-Inhibitoren profitieren. Das Ausmaß der Medikamenteninteraktionen zwischen antiviralen und immunsuppressiven Medikamenten nach Transplantation könnte minimiert und Abstoßungsreaktionen und Organverluste vermieden werden.
Zunächst jedoch ist die Vorrausetzung für die korrekte klinische Anwendung das Verständnis auf molekularbiologischer Ebene. Die einzelnen Wirkmechanismen sind bisher noch nicht
46 vollständig geklärt und weitere Studien werden erwartet. Unsere Ergebnisse konnten bereits wichtige Beiträge zum Verständnis leisten.
Eine besondere Rolle spielt der zelleigene mTOR Complex 1 in Kombination mit RAPTOR.
Beide sind universell in jeder Zelle vorhanden und unverzichtbar für diverse Signalwege des Zellwachstums, des Immunsystems und der Lipogenese. Sie bilden insgesamt eine Schnittstelle vieler weiterer komplexer Vorgänge des Stoffwechsels. Wir wissen, dass das Hepatitis C Virus diesen multifunktionellen Angriffspunkt nutzt, um eine effiziente HCV- RNA-Replikation zu erzielen [170][237].
In unseren Experimenten zeigten die viralen Strukturproteine E2, Core sowie die Nicht-Strukturproteine NS2 und NS5A eine dosisabhängige Reduktion nach Rapamycingaben, welche auch in gleicher Konzentration im Serum von transplantierten Patienten gemessen werden konnten. Interessanterweise beschränkte sich die Inhibition der HCV-RNA durch mTOR-Inhibitoren einzig auf die HCV-RNA-Replikation. Die restlichen Abschnitte, wie Viruseintritt, Translation und Bildung neuer Partikel blieben unbeeindruckt.
Den inhibitorischen Effekt konnten wir für Huh-7,5-Zellen sowie PHH-Zellen (Primäre Humane Hepatozyten) bestätigen und zeigte sich nicht nur für Genotyp 2, sondern ebenfalls für Genotyp 3 reproduzierbar. Antiproliferative und zytotoxische Effekte beider Substanzen wurden mittels DMSO (Dimethylsulfoxid)-differenzierter Huh-7,5-Zellen und PHH-Zellen ausgeschlossen.
Interessanterweise kristallisierte sich in unseren Ergebnissen speziell die mTORC1-Signaluntereinheit RAPTOR als besonderes Schlüsselelement für das Hepatitis C Virus heraus. Wir konnten erstmals zeigen, dass die RAPTOR-Inhibition durch „RAPTOR-knockdown“ zu einer signifikanten HCV-RNA-Reduktion führte sowie nach „RAPTOR-Überexpression“ ein deutlicher Anstieg selbiger zu verzeichnen war. Dies ergab sich nur für RAPTOR, jedoch nicht für mTORC2 und dessen Untereinheit RICTOR.
RAPTOR als, zuvor noch nicht beschriebener, zelleigener Wirtsfaktor erlaubt uns weitere Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Virus und Wirt zu erlangen.
Das Hepatitis C Virus, speziell das virale Protein NS5A, nutzt den PI3K/Akt/mTOR-Signalweg, um die chronische Infektion aufrecht zu erhalten, indem es mTORC1 und RAPTOR aktiviert und somit die Apoptosefunktion der Zelle inhibiert [237].
Die Aktivierung erfolgt über mehrere Bindungsproteine, sodass eine gesteigerte Phosphorylierungsrate der nachgeschalteten Proteine p70S6K und 4E-BP1 folgt. Die Translation und Expression der viralen Proteine wird somit eingeleitet [243].
47 Welche Rolle die räumliche Nähe zwischen Virus und benötigten Wirtsmaterialien spielt, war bisher unklar.
Hier konnten Mc Nulty et al. einen Zusammenhang zwischen der Virusreplikation des Andes- Virus (ANDV), welches zur Gattung der Hantaviren zählt, und dem mTORC1 beobachten.
Am ER infizierter Zellen wurde eine Co-lokalisation zwischen einem Glykoprotein des Andes-Virus und dem mTOR-Protein gesehen sowie eine Inhibition der Virusproteinexpression und -freisetzung nach Temsirolimus-Addition, einem Analogon des Rapamycins [262].
Obwohl mTORC1 durch HCV in unseren Studien ausschließlich zur Virusreplikation und nicht zur Proteinexpression oder -translation genutzt wird, sind beide Viren offenbar auf mTOR angewiesen.
Eine direkte Co-lokalisation zwischen mTORC1 und viralen Proteinen konnte in unseren Experimenten mittels Immunfloureszenz leider nicht gesehen werden, sodass eine indirekte Signalweitergabe durch weitere zwischengeschaltete Faktoren denkbar wäre. Eine Möglichkeit könnte der bereits beschriebene Zusammenhang zwischen HCV und dem Lipidmetabolismus darstellen.
Diese These bekräftigen Stoeck et al., indem sie eine perinucleäre Co-lokalisation von NS5A und Cholesterol beschreiben und vermuten, dass HCV eine ausreichende wirtseigene Lipidhomöostase in Form von lipid droplets benötigt, um die Virusreplikation gewährleisten zu können [256].
In der selben Studie wurde die Notwendigkeit der Wirtszellenlipide für einen funktionsfähigen viralen Replikationsapparat bekräftigt. War nicht genügend Wirtsmaterial vorhanden, schmälerte dies auch die Menge an viralen Produkten [256].
Eine ausreichende Lipidbereitstellung und ein Lipidtransfer sind somit anscheinend relevant für den HCV- Lebenszyklus. Diese Erkenntnisse sind nicht gänzlich neu, doch auch RAPTOR scheint einen bisher nicht erkannten Einfluss auf die Lipogenese zu besitzen.
So konnten Lee et al. in generierten „Raptor-knockout-Mäusen“ bereits nach zwei Wochen einen pathologischen Lipidstoffwechsel beobachten. Trotz fettreicher Diät wurde anstatt einer Gewichtszunahme eine Lipodystrophie mit Hepatomegalie, Steatosis hepatis und Insulinresistenz gesehen [257].
Ähnliches beschrieben Wan et al. im Rahmen der Identifikation der Rolle der SREBP1-Aktivierung durch mTORC1 [252]. SREBP`s sind Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von lipogenen Enzymen steuern [250][251]. Wan et al. sahen nach RAPTOR
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„knockdown“ eine reduzierte SREBP1-Aktivität und eine folglich verminderte Lipidsynthese [252].
Eine Inhibierung von mTORC1/RAPTOR durch Rapamycin bzw. physiologisch durch mangelnde Nahrungsaufnahme führte zu einer vermehrten Lipolyse mit Ausschüttung der freien Fettsäuren in das Blut. Eine mTORC1/RAPTOR-Aktivierung durch HCV oder physiologisch durch Nahrung führte zur Fettsynthese und -speicherung [263][264][265].
Da HCV auf einen regelrechten Lipidmetabolismus und einen funktionsfähigen PI3/Akt/mTOR Signalweg sowie die Untereinheit RAPTOR angewiesen ist, könnte aus einer RAPTOR-Reduktion eine verminderte Lipidbereitstellung mit niedriger HCV-RNA- Replikation resultieren.
Eine Rapamycin-Gabe würde folglich mTORC1 und RAPTOR hemmen und im zweiten Schritt HCV und die Liponeogenese reduzieren.
Um diesen Zusammenhang weiter beleuchten zu können, erfolgte eine Analyse mittels verschiedener Dichtegradienten in infizierten Zellen. Nach Gabe von Rapamycin konnte eine erwartete Virusreduktion beobachtet werden, jedoch unabhängig vom Dichtegradienten, sodass diese Ergebnisse unsere Annahmen nicht bestätigen konnten.
Aufgrund vergleichbarer Vermutungen beschrieben Anderson et al. in HCV-infizierten Zellen nach Addition von NIM811, einem Cyclophilin-Inhibitor, einen eingeschränkten Lipid- und Proteintransport im VLDL-Signalweg sowie einen Rückgang der ApoB-Sekretion. Weiterhin zeigten sich die lipid droplets vermindert, jedoch insgesamt vergrößert [263].
Ähnlich wie Anderson et al. konnten auch wir nach Rapamycin-Addition eine Größenzunahme der lipid droplets in infizierten Zellen sehen, jedoch keine signifikanten strukturellen Veränderungen der Lipidzusammensetzung in Viruspartikeln.
Insgesamt scheint die Notwendigkeit einer regelrechten Liponeogenese für den HCV-Lebenszyklus essentiell zu sein, sodass dies womöglich das fehlende Bindeglied zwischen Virus und PI3K/Akt/mTOR-Signalweg ist. Auf welchem Wege HCV die wirtseigenen Lipide nutzt und welchen Beitrag mTORC1 und RAPTOR im Detail dazu leisten, ist aufgrund des komplexen Gefüges des mTOR-Signalweges und der vielen parallelen Schaltwege noch nicht vollständig erklärbar.
Zusammenfassend lässt sich jedoch sagen, dass mTOR-Inhibitoren die HCV-RNA- Replikation erfreulicherweise nicht nur in vitro sondern auch in vivo reduzieren.
Diese Tatsache eröffnet neue Therapieoptionen im Kampf gegen das Hepatitis C Virus, denn obwohl sich im Zeitalter der DAA`s immer mehr erfolgreich therapierte Patienten als geheilt bezeichnen können, besteht eine besonders herausfordernde Aufgabe in der Therapie der
49 Reinfektion des transplantierten Organs. In nahezu allen HCV-induzierten lebertransplantierten Patienten wurde postoperativ eine HCV-Reinfektion des Organs beschrieben [134]. Insgesamt wird in der Mehrzahl der Fälle nach Operation eine höhere Viruslast als zuvor beobachtet, sodass eine rekurrente Infektion des neuen Organs gefolgt von einer Zirrhose oder einem HCC bis hin zur Re-Transplantation bei vielen Patienten vorprogrammiert ist [135][138].
Seit der Einführung der DAA`s im Jahr 2011 erscheinen regelmäßig neue Kombinationsmöglichkeiten mit hohen SVR-Raten. Rupp et al. beschreiben SVR-Raten mit bis zu 100% bei Patienten nach Transplantation und rekurrenter Infektion. Besonders vielversprechend zeigten sich NS5A- und NS5B-Inhibitoren ohne gravierende unerwünschte Wirkungen oder Therapieabbrüche. Auch die Dosen der Immunsuppressiva bedurften keiner Anpassung [264]. Somit können transplantierte Patienten mittlerweile gleichwertige SVR-Raten im Vergleich zu nicht transplantierten Patienten erreichen.
Trotz all dieser positiven Studienergebnisse sind die Kombinationstherapien aus immunsuppressiven und antiviralen Medikamenten im Hinblick auf das Nebenwirkungsprofil und die Medikamenteninteraktionen für das neue Organ und den Empfängerorganismus eine große Herausforderung.
Lebertransplantierte Patienten sind auf eine lebenslange Immunsuppression angewiesen, sodass die Wahl der „passenden“ Immunsuppression gut abgewogen werden muss.
Speziell für Lebertransplantation zugelassene immunmodulierende Medikamente sind Tacrolimus und CsA sowie seit 2012 der mTOR-Inhibitor Everolimus [153].
Im Gegensatz zu CNI`s besitzen mTOR-Inhibitoren eine kombinierte antivirale und immunsuppressive Wirkung mit dem großen Vorteil der fehlenden Nephrotoxizität, sodass diese Fähigkeiten eine wichtige therapeutische Lücke füllen könnten.
De Simone et al. betitelten den Wechsel von CNI`s auf eine Monotherapie mit mTOR-Inhibitoren mit unbeeinträchtigter Nierenfunktion als gelungen. In dieser Studie zeigte sich nach Therapiewechsel ein längeres mittleres postoperatives Überleben bei Patienten mit zusätzlich bestehenden extrahepatischen Erkrankungen [265]. Ob auch eine HCC-Rekurrenz beeinflusst wird muss durch Langzeitstudien noch beobachtet werden.
Frey et al. thematisierten die Idee der Kombination aus DAA und mTOR-Inhibitor.
Interessanterweise beschreiben die Kollegen die Kombination in einer in vitro Studie als genotypabhängig. So zeigte sich ein verstärkter antiviraler Effekt für die Genotypen 2a, 3a und 4a nach Kombination eines mTOR-Inhibitors mit Sofosbuvir oder Ledipasvir im
50 Vergleich zu alleiniger antiviraler Therapie mit DAA. Die Kombination von Daclatasvir und mTOR-Inhibitor bei GT1b-Patienten wies allerdings verstärkte Medikamenteninteraktionen und eine höhere Gefahr des Therapieversagens auf [266].
Interessant erscheint hier das Interaktionspotential zwischen DAA´s und mTOR-Inhibitoren und möglichen additiven, antiviralen Effekten.
Insgesamt besteht noch viel Bedarf an in vivo und in vitro Langzeitstudien. Doch nicht nur die richtige Kombination der antiviralen und immunsuppressiven Therapie ist bedeutsam, sondern auch der richtige Zeitpunkt.
Carrión et al. dokumentierten in einer randomisierten kontrollierten Studie den Vorteil einer frühzeitigen präoperativen antiviralen Therapie [133][267].
Auch Pelletier et al. konnten in einer klinischen Studie den prognostischen Vorteil einer niedrigen Viruslast mittels Ribavirin vor Transplantation bestätigen [131].
Ob ein präoperatives Regime zukünftig DAA`s beinhalten wird und ob mTOR-Inhibitoren eine Rolle spielen werden, wird sich in den nächsten Jahren zeigen.
Zwar können Rapamycin und Everolimus als besonderen Vorteil mit fehlender Nephrotoxizität überzeugen, jedoch zeigen sich unter aktuell empfohlener Kombinationstherapie mit CsA mit steigender Therapiedauer sich addierende medikamenten- induzierte Nebenwirkungen, wie Nephrotoxizität [216][217].
Somit müssen regelmäßige Talspiegelbestimmungen des jeweiligen Immunsuppressivums sowie eine schrittweise Reduktion des CsA zugunsten des mTOR-Inhibitors erfolgen.
Doch auch unter mTOR-Inhibitor-Monotherapie war die Anzahl der unerwünschten Nebenwirkungen, wie z.B. die Proteinurie erhöht [232].
Der Vorteil der mTOR-Inhibitoren wird besonders im Hinblick auf die, nicht nur auf HCV beschränkte, antivirale Wirkung deutlich, denn auch andere virale kanzerogene Pathogene stellen ein großes Problem nach Transplantationen jeglicher Art dar. Aufgrund der Immunsuppression wirken opportunistische Infektionen, verursacht durch das Cytomegalievirus (CMV), das humane Papillomavirus (HPV), das Epstein-Barr-Virus (EBV) oder das Humane Herpesvirus -8 (HHV-8) potentiell kanzerogen und agieren ebenfalls über den mTOR-Signalweg. Die neu gewonnene Organfunktion und das Überleben nach Transplantation können durch diese Pathogene reduziert werden [258]. Hier konnte unter Everolimus-Therapie eine Reduktion der CMV-Inzidenz bei lungentransplantierten Patienten gesehen werden [268]. Auch eine Reduktion der HPV-Inzidenz mittels mTOR-Inhibition durch Rapamycin bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Halsbereiches wurde beschrieben [269].
51 In EBV-assoziierten T-Zell-Lymphomen zeigte sich eine signifikante Inhibition des Tumorwachstums und eine weitere Studie erzielte nach Rapamycin-Therapie im Rahmen eines kutanen Kaposi-Sarkoms (HHV-8) klinisch und histologisch nach 16-wöchiger Behandlung eine Heilung [270][271].
Insgesamt zeigen sich nach Gabe von mTOR-Inhibitoren in transplantierten Patienten geringere Inzidenzen in Bezug auf Infektionen mit HPV, HHV-8, CMV, EBV und HCV [258]. Weitere Studien sind abzuwarten, jedoch sollten Rapamycin und Everolimus durchaus als zukünftige Therapieoptionen betrachtet werden.
Die kombinierte DAA/mTOR-Inhibitor-Therapie ist ebenfalls eine Überlegung wert, doch aufgrund der, im Verhältnis, noch nicht lange bestehenden DAA`s auf dem derzeitigen Markt und des mannigfaltigen Einflusses des mTOR-Proteins im Organismus, werden weitere Langzeitstudien erwartet.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mTOR-Inhibitoren einen Einfluss auf das Hepatitis C Virus haben und wichtige Abschnitte des Replikationszyklus hemmen können.