Frühe Beeinträchtigung der adulten hippokampalen Neurogenese in einem transgenen Rattenmodell der Parkinson-Erkrankung

Prof. Dr. med. Jürgen Winkler der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Frühe Beeinträchtigung der adulten hippokampalen Neurogenese in einem transgenen Rattenmodell der

Parkinson-Erkrankung

Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg zur Erlangung

des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Lucas Tillmann Tischer aus Leipzig

Erlangen, Dezember 2020

Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung:

14. Dezember 2021

Vorsitzender des Promotionsorgans:

Herr Prof. Dr. med. Markus F. Neurath

Gutachter/in:

Herr Prof. Dr. Jürgen Winkler

Herr Prof. Dieter Chichung Lie

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung / Summary

2 Einleitung

2.1Das Parkinson-Syndrom - 5 -

2.2 Lewy-Körperchen und α-Synuklein - 7 -

2.3Adulte Neurogenese im Hippokampus - 8 -

2.4Modelle zur Erforschung der Parkinson-Krankheit - 12 -

2.5BAC aSyn Rattenmodell - 14 -

2.6Hypothesen - 15 -

3 Material und Methoden

3.1Puffer, Lösungen und Eindeckmedien - 16 -

3.2Primär- und Sekundärantikörper - 17 -

3.3Technische Geräte - 18 -

3.4Software - 18 -

3.5Transgenes Rattenmodell - 18 -

3.6Immunhistochemie (IHC) - 20 -

3.7Immunfluoreszenz (IF) - 21 -

3.8Mikroskopie - 22 -

3.9Statistik - 23 -

4 Ergebnisse

4.1Stark reduzierte adulte Neurogenese im DG von BAC aSyn Ratten - 24 - 4.2Unveränderte Proliferation im DG von BAC aSyn Ratten - 25 - 4.3Differenzierung der überlebenden BrdU+ Zellen im DG von BAC aSyn Ratten - 27 -

5 Diskussion

5.1Überexpression von humanem aSyn beeinträchtigt erheblich die adulte

Neurogenese im Hippokampus - 34 -

5.2Humanes aSyn ohne Effekt auf die Proliferation neuer Zellen im DG - 40 - 5.3Humanes aSyn ohne Einfluss auf die neuronale Differenzierung - 42 - 5.4Verminderte gliale Expression in BAC aSyn Ratten - 44 -

6 Literaturverzeichnis

7 Abkürzungsverzeichnis

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

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1 Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele

Die Parkinson-Krankheit (Parkinson‘s disease, PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, bei der es durch den langsam fortschreitenden Verlust von Nervenzellen zur Störung mehrerer monoaminerger Neurotransmittersysteme kommt, die klinisch zu motorischen und nicht-motorischen Symptomen führen. Neuropathologische Kennzeichen sind der Untergang dopaminerger Neurone in der Substantia nigra sowie die Akkumulation von Lewy-Körperchen (LB) und Lewy Neuriten (LN), deren faserförmiger Hauptbestandteil α- Synuklein (aSyn) ist. Im Gehirn erwachsener Säugetiere sind zwei Regionen bekannt, in denen während des gesamten Lebens neue Nervenzellen gebildet werden. Hierzu gehört die subgranuläre Zone (SGZ) des Gyrus dentatus (DG) im Hippokampus und die subventri- kuläre Zone (SVZ), die sich in der Wand der lateralen Seitenventrikel befindet. Die kontinuierliche Bildung von Nervenzellen (adulte Neurogenese) in dieser Region basiert auf der Präsenz von adulten neuralen Stammzellen (aNSC), die sich durch ihre Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung sowie das Potential zur Differenzierung in gliale und neuronale Zelltypen auszeichnen. Verschiedene Tiermodelle der PD haben eine verminderte adulte Neurogenese gezeigt, die im Kontext mit einer Überexpression von aSyn steht. Da die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen noch nicht ausreichend bekannt sind, verwendeten wir ein transgenes bacterial artificial chromosome (BAC) aSyn Rattenmodell, um die Auswirkungen auf die zelluläre Plastizität des Hippokampus zu charakterisieren. Konkret wurde in der vorliegenden Arbeit die Fragestellung behandelt, ob die Akkumulation von humanem aSyn zu einer verminderten Proliferation, Neurogenese und Differenzierung der neuen Neuronen führt.

Material und Methoden

Für die experimentellen Untersuchungen erstellten wir ein Proliferationsparadigma (11 Wochen alte Tiere; Analyse 12 Stunden nach BrdU-Gabe) und ein Überlebensparadigma (16 Wochen alte Tiere; Analyse 5 Wochen nach BrdU-Gabe). Beiden Paradigmen wurde jeweils eine Gruppe transgener BAC aSyn Ratten mit dem gesamten Genlokus des humanen α- Synukleingens (SNCA) sowie eine Kontrollgruppe zugeordnet. Anhand immunhisto- chemischer wie immunfluoreszierender Methoden konnten die neu gebildeten Zellen im DG des Hippokampus mittels Durchlicht- und konfokaler Mikroskopie untersucht und differenziert werden. Zudem wurde die Fläche des DG durch ein Stereologie-System markiert, um die Zelldichte in dieser Region berechnen zu können.

1 Zusammenfassung

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Ergebnisse

Die Überexpression von aSyn beeinträchtigte signifikant das Überleben der neugeborenen Zellen um 46% im DG der vier Monate alten BAC aSyn Ratten. Zudem konnte eine Volumen- reduktion des DG bei den transgenen Tieren im Vergleich mit den Kontrolltieren nach- gewiesen werden. Im Proliferationsparadigma kam es dagegen zu keiner Verminderung des DG-Volumens. Weiterhin wurde in den aSyn Tieren auf Ebene der sich teilenden 5-Brom-2'- desoxy-Uridin-positiven (BrdU+) Zellen keine signifikante Veränderung gegenüber den nicht-transgenen Ratten beobachtet. In der Analyse der Zelldifferenzierung unterschied sich der prozentuale Anteil von neuen neuronalen Zellen zwischen beiden untersuchten Gruppen nicht, so dass sich in der Berechnung der Zelldichte der neuronale Verlust widerspiegelte und eine stark beeinträchtige adulte Neurogenese im Hippokampus von BAC aSyn Ratten demonstrierte. Die Betrachtung der neu entstandenen glialen Zellen zeigte ebenfalls eine signifikant verminderte Zelldichte in BAC aSyn Tieren.

Schlussfolgerungen

Die in der Zusammenschau dargestellte verminderte Neurogenese im adulten Hippokampus transgener Ratten bei unveränderter Zellproliferation könnte ein Hinweis darauf sein, dass der reduzierende Effekt von humanem aSyn erst zu einem späten Zeitpunkt in der Entstehung einer neuen Nervenzelle eine Rolle spielt. In einer vorangegangenen Studie mit BAC aSyn Ratten wurden dagegen in der neurogenen Region des Bulbus olfaktorius (OB) signifikant mehr neu gebildete BrdU+ Zellen im Vergleich mit nicht-transgenen Tieren beschrieben (Nuber et al., 2013). Die Beobachtung einer Volumenreduktion des DG zeigte sich in transgenen PD-Tiermodellen ebenso wie in Studien mit PD-Patienten. Darüber hinaus wurde neben dem hippokampalen Volumenverlust ein zunehmender kognitiver Rückgang bei PD-Patienten im zeitlichen Verlauf beobachtet (Xu et al., 2020), der mit dem Fortschreiten der Erkrankung zusammenhängen könnte. Allerdings besteht aktuell ein Dissens über die Bedeutung der humanen adulten Neurogenese (Boldrini et al., 2018, Sorrells et al., 2018).

Die Beobachtungen verweisen auf die dringende Notwendigkeit, weitere Studien zu unserer Fragestellung anzufertigen, um die Mechanismen, mit denen aSyn die adulte Neurogenese entweder direkt oder indirekt über unterschiedliche Signale beeinflusst, zu analysieren.

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Summary

Background

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by slow, progressive loss of neurons, which causes the disruption of several monoaminergic neurotransmitter systems. This leads to symptoms concerning motor and non-motor functions.

Neuropathological hallmarks are the destruction of dopaminergic neurons in the substantia nigra and the accumulation of Lewy bodies (LB) and Lewy neurites (LN). The major proteinaceous and filamentous component of LB and LN is α-synuclein (aSyn).

The continuous formation of nerve cells throughout life in adult mammals (adult neurogenesis) is spatially restricted under normal conditions to two specific neurogenic brain regions. These include the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) in the hippocampus and the subventricular zone (SVZ) located at the border of the lateral ventricles. The adult neurogenesis within these areas is based on the presence of adult neural stem cells (aNSC), characterized by their ability to undergo unlimited self-renewal through cell division and the potential for differentiation into glial and neuronal cell types.

Several animal models of PD presented a reduced adult neurogenesis, frequently observed in the context of aSyn overexpression. Since the underlying molecular mechanisms associated with proliferation, neuronal maturation and late neuronal survival are not well understood, we used a transgenic bacterial artificial chromosome (BAC) aSyn rat model to assess the effects of overexpressed aSyn on the cellular plasticity of the hippocampus.

The aim of this study was to investigate whether the accumulation of human aSyn in transgenic BAC rats leads to a reduced proliferation and differentiation of neural precursor cells into new neurons.

Material and Methods

For experimental investigations, we established a proliferation paradigm (11-week-old animals; analysis 12 hours after BrdU application) and survival paradigm (16-week-old animals; analysis 5 weeks after BrdU application). A group of transgenic BAC aSyn rats carrying the full-length human α-synuclein gene (SNCA) and a control group were assigned to both paradigms. By using immunohistochemistry and immunofluorescence, the newly formed cells in the DG of the hippocampus were examined and differentiated on the basis of optical and confocal microscopy. In addition, the area of the DG was marked by a stereology system to calculate the cell density in this region.

1 Zusammenfassung

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Results

The overexpression of human aSyn affected the survival of newborn cells significantly due to a reduction of 46% in the DG of four-month old BAC aSyn rats. In addition, a volume reduction of the DG could be demonstrated in the transgenic animals compared with healthy controls. On the other hand, the proliferation paradigm showed no decrease in DG volume. Furthermore, at the level of the dividing 5-Bromo-2'-deoxyuridine-positive (BrdU+) cells in aSyn animals, no significant change was observed compared with non-transgenic rats. In the analysis of cell differentiation, the percentage of new neuronal cells did not differ between the two groups examined, so that the calculation of the cell density reflected the neuronal loss and demonstrated a severely impaired adult neurogenesis in the hippocampus of BAC aSyn rats. The observation of the newly formed glial cells also presented a significantly disminished cell density in BAC aSyn animals.

Conclusions

The depicted reduced neurogenesis in the adult hippocampus of transgenic rats paralleled with an unchanged cell proliferation could be an indication that the decreasing effect of human aSyn only plays a role at the late maturation stage in the development of new neurons. In a previous study with BAC aSyn rats, however, significantly more newly formed BrdU+ cells were described in the neurogenic region of the olfactory bulb (OB) compared with non-transgenic animals (Nuber et al., 2013). The observation of a volume reduction of the DG has been shown in transgenic PD animal models as well as in studies with PD patients. In addition to the hippocampal volume loss, an increasing cognitive decline in PD patients has been observed over time (Xu et al., 2020), which may be related to PD progression. However, there is currently a dissent concerning the importance of human adult neurogenesis (Boldrini et al., 2018, Sorrells et al., 2018).

These observations illustrate the urgent need to conduct further studies in order to analyze the underlying pathways by which aSyn influences adult neurogenesis, either directly or indirectly via dysfunctional signaling.

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2 Einleitung

2.1 Das Parkinson-Syndrom

Zu Beginn des 19. Jahrhunderts veröffentlichte James Parkinson seinen Aufsatz über The Shaking Palsy, in dem er die klinischen Merkmale (Tremor, gebeugte Haltung und Festination) einer neuen Krankheit mit heimtückischem Ausbruch und fortschreitender Beeinträchtigung in Form einer Schüttellähmung ausführlich beschrieb. Er war inspiriert von der Beobachtung verschiedener Menschen, die er in den Straßen Londons beobachtete und die alle die gleichen physischen Merkmale teilten (Parkinson, 1817). Einige Jahrzehnte später verwendete Jean-Martin Charcot in Paris erstmals den Namen Parkinson-Krankheit (PD) für diese Störung, fügte den Beobachtungen umfangreiche Details hinzu und identifizierte Bradykinesie und Rigor als Kardinalsymptome der Krankheit, während der Ruhetremor als typisches, aber nicht obligatorisches Diagnosekriterium angesehen wurde (Obeso et al., 2017). Darüber hinaus wurden viele nicht-motorische Manifestationen, zu denen sensorische, vegetative, psychische und kognitive Symptome gehören und die häufig zu Beginn das klinische Erscheinungsbild der Krankheit dominieren, in die diagnostischen Kriterien aufgenommen (Postuma et al., 2015).

Die PD ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung, von der weltweit bis zu zehn Millionen Menschen betroffen sind (de Lau and Breteler, 2006). Gemäß der unterschiedlichen Ätiologie und Pathophysiologie wird sie in vier Gruppen klassifiziert, zu denen das (1) Idiopathische Parkinson-Syndrom (IPS) sowie (2) familiäre (genetische), (3) sog. atypische und (4) symptomatische (sekundäre) Parkinson-Syndrome gehören.

Letzteren liegt eine posttraumatische, inflammatorische, metabolische, medikamenten- oder toxininduzierte Genese zugrunde. Zu den atypischen Parkinson-Syndromen werden die Multisystematrophie, Lewy body Demenz (LBD), kortikobasale Degeneration und progressive supranukleäre Blickparese gezählt (Braak and Del Tredici, 2008). Mit einem Anteil von 75% ist das IPS, für das keine exogenen oder genetischen Erkrankungsauslöser bekannt sind, die am weitesten verbreitete Form des Parkinsonismus. Die langsam progrediente Degeneration dopaminerger Neurone in der Substantia nigra gilt als pathophysiologische Grundlage der motorischen Symptome (Damier et al., 1999). Durch die fehlenden Projektionen der dopaminergen Neurone ins Striatum wird die bewegungskoordinierende Funktion der Basalganglien gestört. Stereologische Analysen legen nahe, dass erste motorische Symptome nach dem Verlust von etwa 30% der melaninhaltigen Nervenzellen in der Substantia nigra auftreten (Ma et al., 1997, Grosch et

2 Einleitung

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al., 2016). Daneben zeigen neuropathologische Untersuchungen bei Patienten mit PD die Verminderung cholinerger, serotonerger und noradrenerger Neurotransmitter im Bereich des Nucleus basalis Meynert, Locus coeruleus, dorsalen Vaguskern sowie der Nuclei raphes und intermediolateralen Bahn (Lang and Lozano, 1998).

Da bis heute weder ein zuverlässiger und leicht anwendbarer Test noch ein labor- chemischer Marker für das IPS verfügbar ist, basiert die Diagnose eines wahrscheinlichen IPS in erster Linie auf klinischen Kriterien. Eine eindeutige Diagnose erfordert die postmortale neuropathologische Befundung des Patienten. Klinisch-pathologische Studien haben gezeigt, dass in 80-90% der Fälle die klinische Diagnose bei der Autopsie bestätigt wurde (Litvan et al., 2003).

Abb. 1 Postmortale Hauptpathologien bei Patienten mit klinischer Parkinson-Krankheit sowie pathologische Progression der PD (A) Transversaler Schnitt durch das Mittelhirn eines Kontrollpatienten (Control) und eines Patienten mit klinischer Parkinson-Krankheit (PD), wobei letzterer eine deutliche Verringerung des schwarzen Pigments in der Region der Substantia nigra zeigt.

(B-C) Mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Abschnitte der ventrolateralen Region in (A), die bei stärkerer Vergrößerung die pigmentierten Neurone der Substantia nigra der Kontrolle (B) im Vergleich mit einem klinischen PD-Patienten (C) zeigen.

(D-E) Intrazytoplasmatische Lewy bodies in den verbleibenden pigmentierten Neuronen der Substantia nigra eines Patienten mit PD, die den eosinophilen, dichten Kern und den blassen Halo in der Hämatoxylin und Eosin-Färbung (D) sowie die dunkle Aggregation von α-Synuklein unter Verwendung einer Immunperoxidase mit Cresylviolett-Gegenfärbung zeigen (E).

Aus (Obeso et al., 2017) mit freundlicher Genehmigung durch den Verlag John Wiley and Sons.

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2.2 Lewy-Körperchen und α-Synuklein

Der Verlust von Neuronen in der Substantia nigra tritt bei verschiedenen Erkrankungen auf, so dass für die Diagnosesicherung eines IPS zusätzlich der immunhistologische Nachweis von LB sowie der innerhalb der Zellfortsätze gelegenen LN notwendig ist (Cookson, 2009).

LB wurden erstmals 1912 bei Gehirnsektionen von Parkinsonpatienten beschrieben (Lewy, 1912) und später mit Hilfe der Elektromikroskopie als eosinophile, intrazytoplasmatische Einschlusskörperchen mit dichtem Kern und blassem Halo in Nervenzellen definiert. LN sind abnormale Neuriten in erkrankten Neuronen, die granuläres Material und abnormale aSyn- Filamente enthalten, die denen in LB stark ähneln und ebenso in der hippokampalen Gehirnregion von Patienten mit IPS vorkommen (Spillantini et al., 1998). Histopathologische Studien haben gezeigt, dass LB und LN zuerst in der Region CA2 und CA3 des Cornu ammonis (CA) im Hippokampus beobachtet wurden (Xu et al., 2020). Mittlerweile sind über 70 Moleküle in LB identifiziert worden (Wakabayashi et al., 2007). Als strukturelles Hauptelement der LB-Fibrillen kommt neben phosphorylierten Neurofilamenten das aus 140 Aminosäuren bestehende aSyn vor, das durch den Einsatz von Antikörpern gegen Amino- und Carboxyl-terminale Sequenzen des Proteins identifiziert wurde (Spillantini et al., 1998, Goldman et al., 1983). Im N-terminalen Bereich des α-Synukleingens (SNCA) liegen die bekannten Punktmutationen A30P, E46K, H50Q, G51D und A53T, die bei den hereditären Formen des Parkinson-Syndroms nachweisbar sind (Polymeropoulos et al., 1997, Kruger et al., 1998, Zarranz et al., 2004, Appel-Cresswell et al., 2013, Lesage et al., 2013). In humangenetischen Untersuchungen von Patienten mit A53T-Mutation zeigte sich eine autosomal dominant vererbte Form der Parkinsonerkrankung mit LB-Pathologie und einem frühen Beginn der Symptome sowie schnellen Krankheitsprogress (Polymeropoulos et al., 1997). Die A30P-Mutation dagegen verursachte eine mildere Symptomatik mit späterem Krankheitsbeginn (Kruger et al., 1998). Bei Familien mit vererbter SNCA- Triplikation wurden neben der ausgeprägten LB-Pathologie ein sehr früher Manifestationsbeginn und schwerwiegender Krankheitsverlauf mit Demenz und Halluzinationen festgestellt (Singleton et al., 2003, Farrer et al., 2004). Diese Daten legen nahe, dass der Schweregrad des Phänotyps und das Ausmaß der Neurodegeneration mit der Anzahl der Kopien des Gens zunehmen (Ibanez et al., 2004).

In seiner physiologischen Form ist aSyn in hoher Konzentration an präsynaptischen Nervenendigungen des gesamten zentralen Nervensystems (ZNS) lokalisiert (Kahle et al., 2000). Ebenso kommt es in zytosolischen Hirnbereichen vor, wo es bis zu 1% des gesamten zytosolischen Proteingehalts ausmacht und interagiert mit der Phosphorlipidmembran (Beyer, 2007). Derzeit ist wenig über die Wechselwirkung von aSyn mit Lipidmembranen,

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Membranzellfraktionen, synaptische Vesikel und intakten Zellen bekannt. Jedoch wird die Interaktion von aSyn bei der Freisetzung und dem Transport von synaptischen Vesikeln, der Fettsäurebindung und physiologischen Regulation bestimmter Enzyme, Transportmoleküle und Neurotransmitter vermutet (Breydo et al., 2012). Unter physiologischen Bedingungen wird angenommen, dass aSyn nativ entfaltet (‘non-sticky‘) ist, aber je nach subzellulärer Position oder synaptischer Aktivität teilweise gefaltete (‘sticky‘) Konformationen annehmen kann (Longhena et al., 2019). Diese Protein-Protein und Protein-Lipidmembran Wechselwirkungen sind bedeutend für die funktionelle Homöostase der Synapse.

Änderungen der synaptischen Umgebung oder eine posttranslationale Modifikation von aSyn können zu einer Fehlfaltung führen, die die Bildung von Oligomeren oder fibrillären Aggregaten begünstigt (Longhena et al., 2019). Die durch Fehlfaltung, Oligomerisierung und Fibrillenbildung hervorgerufene erhöhte Aggregationsneigung wird als Hauptfaktor für die neuronale Dysfunktion bei Synukleinopathien, insbesondere der PD angesehen (Outeiro et al., 2008). ASyn interagiert in oligomerer Form mit Lipiden in Biomembranen, wodurch die Funktion von Lysosomen, synaptischen Vesikeln, Mitochondrien und des Ubiquitin- Proteasom-Systems beeinträchtigt wird (Cookson, 2009).

2.3 Adulte Neurogenese im Hippokampus

Der allokortikale Hippokampus zählt zu den evolutionär ältesten Assoziationsfeldern des Gehirns und liegt eingerollt an der medialen Wand der Großhirnhemisphäre. Er besteht größtenteils aus dem Archicortex, der einen dreischichtigen Aufbau und eine strikte schichtenspezifische Lokalisation von Perikarya, Dendritenbäumen und Faserverläufen besitzt (Andersen et al., 2007). Der hippokampale Archicortex setzt sich aus DG und Cornu ammonis zusammen, das aufgrund einer unterschiedlichen Pyramidenzelldichte in die Segmente CA1, CA2 und CA3 unterteilt wird. Zudem wird das Subiculum dazu gezählt. Aus dem Neokortex erreichen Impulse über den entorhinalen Kortex das Stratum granulare des DG. Über sein unidirektionales Verschaltungsprinzip, das für intrahippokampale Verbindungen vereinfacht als trisynaptischer Neuronenkreis (EC → DG → CA3 → CA1 → EC) veranschaulicht wird, gelangen die Informationen zurück in die kognitiven Areale des Neokortex (Hsu, 2007). Über Faserprojektionen im Fornix ist der Hippokampus mit dem basalen Vorderhirn, dem Hypothalamus und verschiedenen Kerngebieten des Hirnstamms verbunden. Darüber hinaus bestehen multimodale Verbindungen zur Amygdala, zum Assoziationskortex und zu Arealen des mesolimbischen Systems (Andersen et al., 2007).

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Abb. 2 Illustration der neuronalen Schaltkreise im Hippokampus

Der exzitatorische trisynaptische Neuronenkreis beschreibt eine Schleife, beginnend in den Schichten II und III des entorhinalen Kortex (EC), von wo aus die Axone über den Tractus perforans (perforant path, PP) zu den Körnerzellen des Gyrus dentatus verlaufen. Dessen Axone projizieren als Moosfasern zu den Pyramidenzellen in die CA3-Region. Die dort lokalisierten Pyramidenneuronen bilden die Hauptafferenzen der CA1-Pyramidenzellen (Schaffer-Kollateralen). Die Pyramidenzellen der CA1-Region senden ihre Efferenzen schließlich entweder direkt oder über das Subiculum zurück zu den tiefen Schichten des EC.

Aus (Deng et al., 2010) mit freundlicher Genehmigung durch den Verlag Springer Nature.

Die Neubildung von Nervenzellen im erwachsenen Gehirn, die sog. adulte Neurogenese konnte erstmals durch die [³H]-Thymidin-Autoradiographie (Altman and Das, 1965) und später elektronenmikroskopisch (Kaplan and Hinds, 1977) belegt werden. In Säugetieren ist sie auf zwei spezifische Gehirnregionen, die SGZ des DG und die SVZ in der lateralen Wand der Seitenventrikel, limitiert. Die SGZ zwischen hippokampalem Hilus und Körnerzellschicht ist ein Bereich der aktiven Zellproliferation im adulten Hippokampus (Palmer et al., 2000).

Es existiert eine Population aNSC, deren Eigenschaften in vivo bislang nur unvollständig gezeigt werden konnten, so dass sie im adulten Organismus auch als neurale Vorläuferzellen bezeichnet werden (Zhao et al., 2008). Sie weisen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung auf, indem durch symmetrische Zellteilung zwei neue Stammzellen hervorgehen oder sie lassen mittels asymmetrischer Zellteilung eine Stamm- sowie eine Tochterzelle entstehen, die in andere Hirnregionen migrieren kann (Gage, 2000). Die sich teilenden Zellen befinden sich in dichten Clustern, die mit dem tangentialen Gefäßplexus in der SGZ assoziiert sind. Diese sog. neurogene Nische ist durch Endothel-, Ependymzellen, Mikroglia und Astrozyten gekennzeichnet (Palmer et al., 2000). Zu den molekularen Regulatoren der adulten Neurogenese gehören sezernierte Botenstoffe endothelialer Zellen, Signalproteine (z.B. VEGF, shh), Wachstumsfaktoren (z.B. BDNF) und Neurotransmitter (Han et al., 2008, Cao et al., 2004, Shen et al., 2004). Für letztere konnte gezeigt werden, dass lokal sezernierte γ-Aminobuttersäure (GABA) die neuronale Differenzierung der Vorläuferzellen unterstützt (Tozuka et al., 2005). Daneben gehören das Alter und Geschlecht, eine aktivitäts- und erfahrungsabhängige Regulation sowie

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pathologische Prozesse bei epileptischen Anfällen, Ischämien und Läsionen zu weiteren Regulatoren der adulten hippokampalen Neurogenese. Körperliche Aktivität und eine reizreiche Umgebung wirken sich positiv auf Proliferation und Überleben von neu gebildeten Nervenzellen aus (van Praag et al., 1999, Overall et al., 2016). Andererseits wurde gezeigt, dass es durch die Induktion von epileptischen Anfällen zur erhöhten Mitoseaktivität der aNSC in der SGZ und einer gesteigerten adulten Neurogenese kommt (Parent et al., 1997). Dagegen führen erhöhter oxidativer Stress, veränderte intrazelluläre Signalkaskaden und Genexpressionen, altersbedingt ansteigende Glukokortikoidspiegel und Neuroinflammation zu einer reduzierten Neurogenese (Bettio et al., 2017). Damit hat die neurogene Nische einen wichtigen regulierenden Einfluss auf die Entwicklungsstadien Proliferation, Überleben und Differenzierung der neuen Nervenzellen.

Phase Charakteristika Zellbezeichnung Markerexpression

Vorläuferzellphase

bis , Wochen Proliferation

Typ1 Zelle GFAP, Nestin, Sox-2, BLBP Typ2a Zelle (GFAP), Nestin, Sox-2, BLBP Typ2b Zelle Nestin, DCX, PSA-NCAM, NeuroD1, Prox1

Typ3 Zelle DCX, PSA-NCAM, NeuroD1, Prox1 frühe postmitotische

Reifungsphase 1,5 bis 4 Wochen

Überleben oder Apoptose Axon / Dendriten-

Wachstum

unreife Neurone DCX, PSA-NCAM, NeuroD1, Prox1 NeuN und Calretinin späte postmitotische

Reifungsphase bis 8 Wochen

synaptische Integration

integrierte

Neurone NeuroD1, Prox1, NeuN und Calbindin Tab. 1 Stadien der Entwicklung einer neuen Nervenzelle im erwachsenen Gehirn

GFAP = saures Gliafaserprotein, Sox2 = sex determing region Y-box 2, BLBP = brain lipid binding protein, DCX = doublecortin, PSA-NCAM = polysialylated-neural cell adhesion molecule, NeuroD1 = neurogenic differentiation 1, Prox1 = prospero-related homeobox 1, NeuN = neuronaler Nukleus

Modifiziert nach (Kempermann et al., 2015).

Vorläuferzellphase. Die adulten Stammzellen (Typ1 Zellen) werden aufgrund ihrer morpho- logischen Eigenschaften als radiale glia-ähnliche Zellen charakterisiert, die sich in der SGZ befinden, während ihre langen Fortsätze bis in die Molekularschicht des DG reichen (Seri et al., 2001, Filippov et al., 2003). Sie exprimieren an ihrer Oberfläche neben GFAP die Marker Nestin und Sox2 (Steiner et al., 2006). Aus den radialen glia-ähnlichen Zellen gehen intermediäre Vorläuferzellen (Typ2 Zellen) hervor, die in die Subgruppen Typ2a und Typ2b Zelle unterteilt werden. Typ2a Zellen zeigen eine hohe proliferative Aktivität, exprimieren weiter gliale Marker, aber ihnen fehlt die charakteristische Morphologie radialer Zellen.

Dagegen exprimieren Typ-2b Zellen erstmalig den frühen neuronalen Marker DCX, weisen kurze Dendriten auf und erhalten direkte neurale GABAerge Inputs aus dem hippokampalen Kreislauf. Diese depolarisieren die Zellen, lösen einen intrazellulären Ca²⁺ Anstieg und die

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Expression von NeuroD1 aus (Tozuka et al., 2005). Durch den Einfluss der Transkriptionsfaktoren NeuroD1 und Prox1 werden sie zum neuronal determinierten Zelltyp (Kempermann et al., 2015).

Frühe Überlebensphase. Nach dem Ende des Zellzyklus präsentieren die neuen Neurone postmitotische Marker wie NeuN und Calretinin (Brandt et al., 2003). Die Anzahl der neuen Neuronen ist zu diesem Zeitpunkt am höchsten, jedoch nimmt sie in der frühen postmitotischen Phase zwischen Tag 6 und 28 durch Apoptose um ca. 50% ab (Dayer et al., 2003). Daher ist die Mehrheit der Zellen eliminiert, bevor sie funktionelle Verbindungen in die CA3 Region hergestellt oder einen dendritischen Input vom entorhinalen Kortex erhalten haben (Kempermann et al., 2015).

Postmitotische Reifungsphase. Die sich entwickelnden Axone, sog. Moosfasern der über- lebenden Granulärzellen bilden erste synaptische Verbindungen mit hilären Interneuronen, Mooszellen und Pyramidenzellen der CA3 Region aus (Toni et al., 2008). Im DG von Mäusen erreichen axonale Projektionen der neuen Neurone die CA3 Region nach ca. zehn Tagen.

Die ersten dendritischen Fortsätze erscheinen knapp eine Woche später (Zhao et al., 2006).

Bevor die neuen Neurone synaptische Innervationen erhalten, erfolgt die initiale Aktivierung über eine lokale, GABA induzierte Depolarisation von umliegenden Interneuronen, die als Indikator für die dynamische Aktivität neuronaler Netzwerke dienen (Ge et al., 2006).

Späte Überlebensphase. Die neuen Zellen exprimieren Calretinin für drei bis vier Wochen, was dem Zeitraum der dendritischen Reifung entspricht. Daran anschließend exprimieren sie Calbindin (Kempermann et al., 2015). Die kritische Phase zur Integration der neu entstandenen Zellen umfasst ein Zeitintervall zwischen vier bis sechs Wochen (Ge et al., 2007). In diesem Stadium kommt es durch die GABAerge Depolarisierung zur Bildung von glutamatergen Synapsen, aufgrund derer die neuen Neuronen eine Phase erhöhter synaptischer Plastizität durchlaufen (Chancey et al., 2013). Sie unterscheiden sich in ihren aktiven als auch in den passiven Membraneigenschaften wesentlich von den reifen Granulärzellen des adulten Hippokampus. Aufgrund ihrer T-Typ-Calciumkanäle können sie isolierte Ca²⁺-Spikes erzeugen, die schnelle Natriumeinströme und die Erzeugung von Aktionspotentialen bei niederschwelligen Stromstimuli zulassen (Schmidt-Hieber et al., 2004). Die aktivitätsabhängige Induktion der synaptischen Übertragung fördert die effektive Integration der neuen Neurone und beeinflusst vermutlich Lernprozesse, affektives Verhalten sowie die räumliche und assoziative Gedächtniskapazität (Anacker and Hen, 2017).

2 Einleitung

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Abb. 3 Darstellung der Stadien der adulten Neurogenese im Hippokampus

Die radialen glia-ähnlichen Stammzellen (Typ 1; blau) behalten ihren Pool durch Selbsterneuerung bei und führen zu Vorläuferzellen (Typ 2a und 2b; grün), die ähnliche Marker exprimieren, aber eine unterschiedliche Morphologie aufweisen, sich schnell vermehren und Marker exprimieren, die für das neuronale Schicksal ihrer Nachkommen spezifisch sind. Typ 2b-Zellen erzeugen Neuroblasten (Typ 3; gelb). Die Neuroblasten treten in das frühe Überlebensstadium ein (orange) und bilden erste synaptische Verbindungen zur molekularen Schicht (ML) aus. Während der späten Überlebensphase bleibt von den neu generierten Neuronen nur der kleine Anteil übrig, der funktionelle Verbindungen gebildet hat und morphologisch gereift ist (rot). Der farbcodierte, obere Balken zeigt den allmählichen Übergang der Marker-Expression, während die Zellen die verschiedenen Stadien des neurogenen Prozesses durchlaufen. Der graue, untere Verlaufsbalken zeigt den Übergang von GABAergem zu glutamatergem Input der neuen Neurone.

Aus (Kozareva et al., 2019) mit freundlicher Genehmigung durch den Verlag John Wiley and Sons.

Beim erwachsenen Menschen wird das Vorkommen der adulten Neurogenese kontrovers diskutiert. In einer postmortalen Untersuchung wurde 1998 erstmals die Bildung von neuen Neuronen aus sich teilenden Vorläuferzellen im DG gezeigt (Eriksson et al., 1998).

Aktuellere Beobachtungen zeigten einerseits, dass die adulte Neurogenese beim Menschen mit zunehmendem Alter rasch abnimmt und im Erwachsenenalter unbedeutend ist (Dennis et al., 2016, Sorrells et al., 2018). Andere Studien beobachteten dagegen eine anhaltend hohe Neurogenese im Alter (Boldrini et al., 2018, Spalding et al., 2013).

2.4 Modelle zur Erforschung der Parkinson-Krankheit

Ein ideales PD Modell sollte folgende Eigenschaften aufweisen, um für eine direkte Übertragung auf die humane PD zu fungieren (Beal, 2001): (1) eine normale Zahl dopaminerger Neurone zum Zeitpunkt der Geburt mit selektivem Nervenzellverlust im

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Erwachsenenalter, (2) leicht erkennbare motorische Defizite, einschließlich Bradykinesie, Rigor und Ruhetremor sowie (3) die Entwicklung der charakteristischen LB und (4) einen relativ kurzen Krankheitsverlauf, der ein schnelles Screening von Therapeutika ermöglicht.

Zur Erforschung der Pathogenese der PD sind zahlreiche in vivo und in vitro Modelle entwickelt worden. Erste in vivo Modelle wurden unter Verwendung von Toxinen wie 6- Hydroxy-Dopamin (6-OHDA), 1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) oder Rotenon entwickelt, die zum spezifischen Verlust dopaminerger Neurone führen.

Einschränkungen des toxischen Tiermodells liegen in der Tatsache, dass es sich um eine akute Läsionierung handelt und weder die graduelle Degeneration der dopaminergen Neurone noch die LB/LN-Pathologie und der Zellverlust in anderen Gehirnregionen reproduziert wird (Chesselet et al., 2008).

Andererseits hat die Identifizierung von aSyn-Mutationen als seltene Ursache der PD zur Entwicklung von transgenen Tiermodellen geführt, die neben aSyn eine Mutation im Gen von LRRK2 (autosomal dominante PD), PINK1 / Parkin oder DJ-1 (autosomal rezessive PD) aufweisen können (Jackson-Lewis et al., 2012). Unter der Annahme, dass die fortschreitende intraneuronale Aggregation von aSyn eine zentrale Rolle in der Pathogenese von PD spielt, wurden transgene aSyn Modelle unter der Kontrolle neuronal spezifischer Promotoren generiert (Hashimoto et al., 2003). Die regionale, zellspezifische Überexpression von Wildtyp (Wt) aSyn unter der regulatorischen Kontrolle des PDGF- Promotors führte im Mausmodell zur graduellen Akkumulation von aSyn in Neokortex, Hippokampus und Substantia nigra. Diese Veränderungen waren mit dopaminergen Zellverlusten in den Basalganglien und motorischen Beeinträchtigungen verbunden (Masliah et al., 2000). Transgene Mäuse, die humanes Wt aSyn überexprimierten, zeigten ein signifikant reduziertes Überleben von Neuroblasten im Hippokampus ohne Veränderungen in der Proliferation der adulten Vorläuferzellen (Winner et al., 2004).

Dagegen war in transgenen Mäusen mit A53T Mutation im SNCA sowohl eine verminderte Zellproliferation als auch ein vermindertes Überleben neu entstandener Zellen im Hippokampus zu beobachten (Crews et al., 2008, Kohl et al., 2012). Eine deutliche Einschränkung der genetischen Modelle ist die Verwendung von unterschiedlichen Promotoren, die das endogene Expressionsmuster von aSyn im Gehirn nicht oder verändert reproduzieren. ASyn kann dadurch in Neuronen von Gehirnregionen überexprimiert sein, die nicht von der PD betroffen sind. Dieser Limitierung wurde durch die Erzeugung eines transgenen BAC aSyn Tiermodells begegnet, das das vollständige SNCA einschließlich seiner eigenen Promotoren enthält (Li et al., 2009). Die beobachteten pathologischen Veränderungen gingen mit einem schweren Verlust der dopaminergen Integrität einher, die mit der Pathologie bei PD-Patienten vergleichbar sind (Nuber et al., 2013).

2 Einleitung

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2.5 BAC aSyn Rattenmodell

In der vorliegenden Studie handelt es sich um transgene BAC Ratten, die den vollständigen humanen Wildtyp SNCA (112 kbp) einschließlich aller Introns und Exons tragen (Yamakado et al., 2012). Der Genlokus wird durch helixaufwärts lokalisierte, regulatorische Promotorsequenzen (30 kbp) und eine 50 kbp abwärtsliegende Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenz flankiert (Nuber et al., 2013). In der 3‘ Region befinden sich wichtige Einzelnukleotid-Polymorphismen mit Genenhancern bzw. -silencern, die vermutlich die Genexpression beeinflussen (Satake et al., 2009).

Abb. 4 Schematische Darstellung des 192 kbp humanen BAC aSyn Konstrukts

Darstellung der humanen aSyn Genstruktur, die zur Erzeugung von transgenen BAC aSyn Ratten verwendet wurde, einschließlich aller Introns (I1-I5) und Exons (E1-E6) sowie zusätzlicher 30 kbp stromaufwärts liegender Sequenzen ( ’ untranslantierte Region, UTR) und 0 kbp stromabwärts in 3‘ UTR.

Aus (Nuber et al., 2013) mit freundlicher Genehmigung durch den Verlag Oxford University Press.

In einer aktuellen Studie zur neurotoxischen Konversion von aSyn in transgenen BAC Ratten wurde die Strukturänderung von löslichem humanem aSyn in unlösliche Fibrillen untersucht (Nuber et al., 2013). Die Überexpression von aSyn führte zur C-terminalen Verkürzung des Proteins sowie Konversion in unlösliche Proteinase K resistente Fibrillen, die sich im nigrostriatalen System anreicherten. Dabei wurde die Akkumulation von unlöslichem aSyn um das 2-3fache in transgenen Tieren mit der stärksten Ausbreitung im Bulbus olfaktorius (OB), Striatum und Hippokampus nachgewiesen. Die transgenen BAC Ratten zeigten einen Rückgang des striatalen Dopaminspiegels, der mit der synaptischen Dysfunktion des nigro- striatalen Systems und strukturellen Störung der dopaminergen Integrität einherging. Durch den Nachweis eines altersbedingten Anstiegs von unlöslichem aSyn im Striatum lieferten Nuber et al. Hinweise darauf, dass die Umwandlung und Ablagerung von aSyn mit der Pathologie von Nervenendigungen in den transgenen Tieren zusammenhängt. Neben der starken Beeinträchtigung der dopaminergen Neuronen stellte die Studie ein reduziertes Überleben der BAC Ratten (70,5 Wochen) in einen engen zeitlichen Zusammenhang mit dem verstärkten Auftreten von aSyn Aggregationen und dem Fortschreiten des Krankheitsphänotyps (Nuber et al., 2013). Die BAC aSyn Tiere entwickelten im Alter zwischen 12 und 16 Monaten eine erhöhte Morbidität mit Gewichtsverlust, reduziertem Bewegungsradius und frühem Geruchsdefizit im Vergleich mit nicht-transgenen Ratten.

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2.6 Hypothesen

Die Hypothesen dieser Arbeit lauten:

(1) Transgene BAC Ratten mit humanem aSyn zeigen eine reduzierte Proliferation neu gebildeter Zellen im DG verglichen mit nicht-transgenen Kontrolltieren.

(2) Transgene BAC Ratten mit humanem aSyn zeigen eine reduzierte adulte Neurogenese in Form einer veränderten Dichte an überlebenden Zellen im DG verglichen mit nicht- transgenen Kontrolltieren.

(3) Transgene BAC Ratten mit humanem aSyn unterscheiden sich von nicht-transgenen Kontrolltieren in Hinsicht auf die Differenzierung der neu gebildeten Zellen im DG.

3 Material und Methoden

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3 Material und Methoden

3.1 Puffer, Lösungen und Eindeckmedien

Folgende Puffer, Lösungen und Eindeckmedien wurden für die experimentellen Ansätze verwendet:

Name Zusammensetzung / Eigenschaft Hersteller

ABC Standard Kit (Avidin-Biotin- Peroxidase Komplex)

Reagenz A (Avidin-Lösung): 2 ml Reagenz B (biotinyliertes Enzym): 2 ml

Vector Laboratories, USA

Blockierlösung

Borat Puffer (0,1 M, pH 8,5)

Citratpuffer

Cryoprotection solution, CPS

3,3-Diaminobenzidin (DAB) Peroxidase

Substrate Kit

NeoClear

NeoMount Paraformaldehyd, PFA

(4%)

ProLong Antifade Phosphat Puffer (0,2 M,

pH 7,4)

Saccharose Lösung (30%) Salzsäure, HCl (5 M)

3% Eselserum 0,1% TritonX-100

TBS 3,08 g Borsäure

5 M NaOH bis pH 8,5 eingestellt ist ad 500 ml dH2O

18 ml Zitronensäure 82 ml Natriumcitrat

ad 1 L dH2O 250 ml Glycerol (85%)

250 ml Ethylenglycol 250 ml PO₄ (0,1 M)

250 ml dH2O ad 10 ml dH₂O 4 Tropfen DAB 4 Tropfen H2O2

4 Tropfen TBS 4 Tropfen NiCl2

Lösung zur Entparaffinierung von histologischen Schnitten

Eindeckmedium 2.5 mM NaOH

0. mM CaCl₂ 50 mM Sucrose 0. M NaH₂PO₄ Eindeckmedium

6,35 g NaH2PO4

41,35 g Na₂HPO₄ ad 1 L dH2O 150 g Sucrose ad 500 ml PO4 (0,2 M)

570 ml dH₂O 430 ml HCl (32%)

PAN-Biotech

Merck

Applichem Merck

Merck

Vector Laboratories, USA

Merck

Merck Sigma-Aldrich

Invitrogen, USA Merck

Merck

Merck

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Salzsäure, HCl (2 M)

Tissue Tek Compound

Tris Buffered Saline, TBS pH 7,4 (10x)

TBS (1x)

Triton X-100 (10%)

Zusammensetzung / Eigenschaft 600 ml dH₂O

400 ml HCl (5 M) Einbettmedium

80 g NaCl 2 g KCl 30 g TrisBase

ad 1 L dH2O

100 ml TBS (10x) 900 ml dH2O 2 ml Triton X-100

18 ml dH2O

Hersteller Merck

Sakura, Niederlande

Merck Merck Sigma-Aldrich

siehe TBS (10x)

Sigma-Aldrich Tab. 2 Puffer, Lösungen und Eindeckmedien

dH2O = destilliertes Wasser, PO4 = Phosphat, H2O2 = Wasserstoffperoxid, NiCl2 = Nickel(II)-chlorid, NaOH = Natriumhydroxid, CaCl2 = Calciumchlorid, NaH2PO4 = Natriumdihydrogenphosphat, Na2HPO4 = Dinatrium- hydrogenphosphat, HCl = Salzsäure, NaCl = Natriumchlorid, KCl = Kaliumchlorid

3.2 Primär- und Sekundärantikörper

In Tab. 3 wurden die verwendeten Primär- und Sekundärantikörper für die Färbung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz dargestellt:

Primärantikörper verwendet in Hersteller

rat anti BrdU 1:500

BrdU-DAB

BrdU-NeuN-GFAP AbD Serotec Ltd, UK mouse anti NeuN

1:200 BrdU-NeuN-GFAP Millipore, USA

rabbit anti GFAP

1:1000 BrdU-NeuN-GFAP Dako, USA

Sekundärantikörper verwendet in Hersteller

donkey anti rat

= konjugiert mit Biotin 1:1000 (1:2 vorverdünnt)

BrdU-DAB Dianova GmbH, USA

donkey anti rat

= konjugiert mit Alexa Fluor® 488 1:1000

BrdU-NeuN-GFAP Invitrogen Molecular Probes, USA

donkey anti mouse

= konjugiert mit Alexa Fluor® 568 1:1000

BrdU-NeuN-GFAP Invitrogen Molecular Probes, USA

donkey anti rabbit

= konjugiert mit Cy™

1:500 (1:2 vorverdünnt)

BrdU-NeuN-GFAP Dianova GmbH, USA Tab. 3 Primär- und Sekundärantikörper. Cy5 = Carbocyanin 5

3 Material und Methoden

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3.3 Technische Geräte

Folgende technische Geräte wurden für die experimentellen Ansätze verwendet:

Durchlichtmikroskop Zeiss Axio Imager M2, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena Kamera-Adapter Zeiss 60N-C ‘’ .0, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena Konfokales Mikroskop Leica TCS SP2, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Plattformschüttler Unimax 2010, Heidolph Instruments GmbH, Schwabach Schlittenmikrotom Leica SM2010R, Leica Biosystems GmbH, Nussloch Schüttelwasserbad SW22, Julabo GmbH, Seelbach

3.4 Software

Folgende Software wurde für die experimentellen Ansätze verwendet:

Adobe Photoshop CS3 Adobe Systems Software Ireland Limited, Dublin, Irland AxioVision Rel. 4.8.1.0 Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena

Endnote X6 Clarivate Analytics, Boston, USA Graphpad Prism 5 Graphpad Software, San Diego, USA Leica Confocal Software Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Microsoft Office 2010 Microsoft Corperation, Redmond, USA StereoInvestigator Microbrightfield, Colchester, USA

3.5 Transgenes Rattenmodell

Die untersuchten Tiere wurden von Prof. Dr. med. Rieß des Instituts für Medizinische Genetik und Angewandte Genomik in Tübingen zur Verfügung gestellt. Sie hatten freien Zugang zu Wasser und Nahrung und wurden in einem normalen hell-dunkel Zeitzyklus (zwölf Stunden Lichtexposition, zwölf Stunden Dunkelheit) gehalten. Alle Behandlungsschritte richteten sich an den internationalen Leitlinien für die Haltung und Versorgung von Labortieren aus, deren Einhaltung das Ethikkomitee der Landeskommission Tübingen bestätigte (Kohl et al., 2016).

Proliferationsparadigma Überlebensparadigma

Geschlecht männlich männlich

Alter 11 Wochen 16 Wochen

Charakteristika nicht-tg aSyn nicht-tg aSyn

Anzahl der Tiere 10 14 7 8

Tab. 4 Übersicht zu Geschlecht, Alter, Genotyp und Tierzahl des Proliferations- und Überlebensparadigmas

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Behandlungsparadigmen

Proliferationsparadigma. Im Alter von 80 Tagen wurden nicht-transgenen wie aSyn Tieren zwei intraperitoneale Injektionen mit BrdU innerhalb von zwölf Stunden appliziert. Die Dosis betrug jeweils 100 mg/kg Körpergewicht (KG) des Thymidinanalogons. BrdU wird ausschließlich von Zellen aufgenommen, die sich in der Synthesephase des Mitosezyklus befinden. Es wird anstelle des Desoxythymidintriphosphats in die DNA Helix eingebautund dient als Färbemethode zum Nachweis proliferierender Zellen (Kuhn and Cooper-Kuhn, 2007). Zwölf Stunden nach der zweiten BrdU-Gabe wurden die Tiere anästhesiert.

Abb. 5 Design der Proliferationsstudie

Die Tiere erhielten zwei Injektionen BrdU innerhalb von 12 Stunden, bevor sie weitere 12 Stunden später analysiert wurden (24-Stunden Pulsparadigma).

Überlebensparadigma. Den Versuchstieren wurde zum gleichen Zeitpunkt wie in der Proliferationsstudie BrdU in einer Konzentration von 50 mg/kg KG an fünf einander folgenden Tagen intraperitoneal injiziert. Sie lebten weitere 32 Tage, bevor sie anästhesiert und analysiert wurden. Mit Hilfe dieser Versuchsanordnung ließen sich Nervenzellen identifizieren, die sich im Entwicklungsstadium der späten Überlebensphase befanden.

Abb. 6 Design des Überlebensparadigmas

Die Tiere erhielten je eine Injektion BrdU an fünf aufeinanderfolgenden Tagen, bevor sie knapp 5 Wochen später analysiert wurden.

3 Material und Methoden

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Perfusion, Gehirnfixierung und Gewebepräparation

Die Tiere beider Untersuchungsparadigmen erhielten eine intraperitoneale Injektion von 10%igem Ketamin (Ketanest; 25 mg/ml), 1%igem Acepromazin (Ventraquil; 0,25 mg/ml) und 2%igem Xylazin (Rompun; 1,25 mg/ml) in 0,9%iger Kochsalzlösung, die die Tiere in eine tiefe Narkose versetzte. Daraufhin wurden sie transkardial mit 0,9%igem NaCl und anschließend mit 4%igem eiskalten Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) perfundiert, um das Gewebe zu fixieren. Nach der sorgfältigen Entnahme wurden die präparierten Gehirne in eine 4%ige Paraformaldehydlösung überführt. Darin blieben sie zur weiteren Fixierung für 24 Stunden bei 4 °C, bevor sie in 30%iger Sucroselösung aufbewahrt wurden.

Zur weiteren histologischen und stereologischen Auswertung wurden die Gehirne mit Hilfe von Tissue Tek und 0,2 M Phosphatpuffer auf einem Gefrierschnittadapter unter Trockeneiskühlung gefroren und mit dem Schlittenmikrotom koronar zu 40 µm geschnitten.

Die einzelnen Gewebeschnitte kamen in vorbereitete Eppendorf Tubes, die 500 µl Cryoprotection solution (CPS) enthielten und wurde bei -20°C gelagert. Von den 40 µm Gewebeschnitten einer Hirnhemisphäre wurde jeder sechste Schnitt (240 µm Intervall) für die Färbeprotokolle verwendet (Kohl et al., 2016).

3.6 Immunhistochemie (IHC)

Alle Immunfärbungen wurden mit freischwimmenden Gewebeschnitten durchgeführt, die aus der CPS in kleine Siebe (sog. netwells) übertragen wurden. Diese netwells steckten in TBS befüllten Zellkulturplatten, die für die Gewebeschnitte als Waschvorrichtung benutzt wurden. Für jede Färbung wurde eine Negativkontrolle mitgeführt.

Nach dem Waschschritt in TBS wurden die Gewebeschnitte für 30 Minuten mit 0,6%

H202/TBS-Lösung versetzt, um endogen wirkende Peroxidasen zu blockieren. Danach schloss sich die Inkubation mit 2 M HCl in einem 37°C Wasserbad an. Es erfolgte die Auftrennung der DNA-Doppelhelixstruktur sowie die Bindung des anti BrdU-Antikörpers an das in die DNA inkorporierte BrdU. Zur Neutralisation der HCl-Behandlung wurde das Gewebe in eine 0,1 M Borat-Pufferlösung (pH 8,5) gebracht. Nach gründlichem Waschen in TBS wurden die Schnitte für die weitere Gewebebehandlung in eine Blockierlösung aus 3%

Eselserum, 0,1% TritonX-100 und TBS für eine Stunde überführt. Durch TritonX-100 wird die Phospholipidmembran der Zelle permeabilisiert, so dass eine Bindung zwischen intra- zellulären Epitop des Antigens und Antikörper zustande kommen kann. Das Eselserum verhindert unspezifische Antikörperbindungen, wodurch sich das Hintergrundsignal der Färbung reduziert. Nachfolgend wurde der spezifische rat anti BrdU Primärantikörper über Nacht bei 4°C in die Blockierlösung gegeben, um an BrdU zu binden (siehe 3.2). Am Folgetag

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konnte nach dem erneuten Waschschritt in TBS, durch den die Reste des Antikörpers entfernt wurden, die Inkubationslösung mit dem Sekundärantikörper (donkey anti rat biotin) für eine Stunde bei Raumtemperatur versetzt werden. Es schloss sich eine einstündige Einwirkphase mit Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC-Komplex) an, das als Signalverstärker fungiert. Avidin ist ein tetrameres Glykoprotein, das mit hoher Affinität vier Biotinmoleküle binden kann, so dass der ABC-Komplex an den biotinylierten Sekundärantikörper anhaftet. Mit dem Avidin-Biotin-Enzymkonjugat geht das Enzym HRP (horseradish-peroxidase) eine Bindung ein und katalysiert die Peroxidase-Reaktion. Unter Zugabe des farblosen Chromogens 3‘-3‘-Diaminobenzidin (DAB) zeigten die BrdU-positiven Zellkerne einen schwarz-braunen Farbniederschlag, da die an den ABC-Komplex gekoppelte Peroxidase das zugefügte DAB oxidierte. Nach 2 Minuten wurde die Reaktion durch Ausspülen in destilliertem Wasser gestoppt. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden auf beschichtete Objektträger aufgezogen, über einer Heizplatte getrocknet und mittels NeoClear® sowie dem wasserfreien Eindeckmedium NeoMount® eingebettet (Kohl et al., 2016).

3.7 Immunfluoreszenz (IF)

Für diese Färbung wurden die Gehirnschnitte zur Vorbereitung des Gewebes in einem 80°C heißen Wasserbad mit Citratpuffer behandelt. Hierdurch wurden die Epitope für die verwendeten Antikörper leichter zugänglich gemacht. Analog der immunhistochemischen Färbung folgten die Arbeitsschritte mit HCl, Borat Puffer sowie der Einsatz der Blockierlösung zur Permeabilisierung des Gewebes. Bei der indirekten IF bindet der mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugierte Sekundärantikörper an der konstanten Fc-Region des primären Antikörpers. Die verwendeten primären Antikörper waren gegen BrdU, NeuN und GFAP gerichtet und wurden in der Blockierlösung aus 3% Eselserum und 0,1% TritonX- 100 gelöst. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag wurde das Gewebe durch wiederholte Waschschritte von den Resten des Primärantikörpers befreit und anschließend die sekundären Antikörper in die Blockierlösung überführt (siehe 3.2). Die gewaschenen Gewebeschnitte wurden auf beschichtete Objektträger gezogen und mit ProLong Antifade eingedeckt, um den Effekt des Photobleaching zu unterdrücken und die Fluoreszenz zu erhalten. Bis zur mikroskopischen Auswertung wurden sie abgedunkelt aufbewahrt (Kohl et al., 2016, Kohl et al., 2012).

3 Material und Methoden

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3.8 Mikroskopie

Die quantitative Analyse der BrdU-DAB-Färbung wurde am Lichtmikroskop Zeiss Axio Imager M2 durchgeführt, an welchem die Software StereoInvestigator angeschlossen war.

Mit diesem halbautomatischen Stereologie-System konnte die Fläche des DG in der 20x Vergrößerung umfahren und markiert werden. Die Zählung der BrdU+ Zellen in der SGZ erfolgte durch die Methode nach Williams (Williams and Rakic, 1988). Hierbei wurden markierte Zellen eingeschlossen, die sich in der Schnittebene der unteren sowie eine der lateralen Ausschlussgrenzen des analysierten Bereichs (ROI, region of interest) befanden.

Alle immunpositiven Zellen des DG innerhalb der ROI wurden in der 40x Vergrößerung markiert, gezählt und mit sechs multipliziert ( 0 → 2 0 µm Intervall), um die absolute BrdU- Zellzahl zu erhalten. Ebenso wurde die Fläche des DG in allen Gewebeschnitten der nicht- transgenen und aSyn Tiere mit der Schnittdicke des Gewebes (40µm) multipliziert, um das Volumen (in mm³) des DG zu bestimmen. Durch die Division der absoluten Zellzahl der DG mit ihrem jeweiligen Volumen konnte die Dichte an neu gebildeten Zellen einer Hemisphäre berechnet werden.

Auf die ermittelten Zellzahlen wurden folgende Berechnungen angewandt:

• Gesamtzellanzahl = Summe gezählter Zellen aller Schnitte x Schnittserie

• Zelldichte = Gesamtzellanzahl / Volumen des DG

Alle morphologischen Analysen der Gewebeschnitte aus Proliferations- und Überlebens- gruppe wurden an blindkodierten Objektträgern ausgewertet. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten repräsentativen Bilder wurden mit einem am Lichtmikroskop befestigten Zeiss Kamera-Adapter 60N-C ‘’ ,0 in der 0x Vergrößerung (Abb. 7 A-B und Abb. 8 A-B) und 40x Vergrößerung (Abb. 8 C-D) erstellt.

Konfokalmikroskopie

Der Phänotyp markierter BrdU+ Zellen wurde mit Hilfe des konfokalen Mikroskops Leica TCS SP2 analysiert. Die zu beurteilenden Zellen wurden entlang der z-Achse in der Fokusebene untersucht, um die Koexpression zweier Marker zu bestätigen und falsch positive Ergebnisse (z.B. zwei dicht übereinanderliegende Zellen) auszuschließen. Für die Analyse der Differenzierung neu gebildeter Zellen wurden in einer 1-aus-12 Schnittserie pro Tier in jeder untersuchten Region 50 BrdU-positive Zellen randomisiert aufgesucht. Weiter- gehend wurden dreidimensionale Stapel erstellt, die in der z-Ebene auf einfach- (BrdU+) oder doppelt-positive Zellen (Koexpression mit NeuN / GFAP) untersucht wurden. Aufgrund der unterschiedlichen Gewebepenetranz der Antikörper wurden ausschließlich Bereiche der Probe beurteilt, in denen beide Marker mit gleicher Intensität vorhanden waren.

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Fluorochrom Antikörper charakteristisch für

AlexaFluor488 (grün) und AlexaFluor568 (rot) BrdU+ / NeuN+ neue Nervenzelle AlexaFluor488 (grün) und Cy5 (blau) BrdU+ / GFAP+ neue gliale Zelle

AlexaFluor488 (grün) BrdU+ neu nicht-neurale Zelle

Tab. 5 Verschiedene Fluoreszenzsignale zur Zelldifferenzierung

Mit Hilfe der Fluoreszenzsignale ließ sich der Anteil neuronal bzw. glial differenzierter Zellen an der Gesamtheit neu gebildeter Zellen bestimmen, indem folgende Berechnungen angewandt wurden:

• Prozentsatz differenzierter Zellen = Anzahl fluoreszenzmarkierter Zellen eines Phänotyps / Anzahl aller fluoreszenzmarkierter Zellen x 100%

• Gesamtzellanzahl differenzierter, neu gebildeter Zellen = Zelldichte x Prozentsatz differenzierter Zellen

3.9 Statistik

Für die statistische Auswertung der Rohdaten wurden Microsoft Excel 2010 und GraphPad Prism 5 verwendet. Die statistische Analyse erfolgte mit Hilfe des unpaired, two-tailed student t-Test und der one-way ANOVA (einfaktorielle Varianzanalyse). Als Signifikanzniveau wurde p < 0,05 angenommen. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (MW ± SD) bei der Analyse von relativen und absoluten Zellzahlen sowie der Zelldichte dargestellt.

4 Ergebnisse

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4 Ergebnisse

4.1 Stark reduzierte adulte Neurogenese im DG von BAC aSyn Ratten

Im Folgenden wurde die Hypothese, dass transgene BAC Ratten mit humanem aSyn eine reduzierte adulte Neurogenese im DG des Hippokampus aufweisen, experimentell überprüft. Hierfür wurde die Überlebensrate der neu entstandenen BrdU+ Zellen in 16 Wochen alten BAC aSyn Ratten ermittelt.

Abb. 7 Einfluss der Expression von aSyn auf das Überleben neu gebildeter Zellen im DG

A-B: Repräsentative Übersichtsaufnahme von BrdU+ Zellen des DG im Hippokampus. Maßstabsbalken: 100 µm.

C: Zelldichte von überlebenden BrdU+ Zellen im DG nicht-tg und aSyn Ratten. Es zeigte sich eine signifikant verminderte Zelldichte in aSyn Ratten gegenüber den Kontrolltieren. Sie war um 46% reduziert (p = 0,0002).

#: Zweiseitiger t-test, p < 0,05

In der Analyse der absoluten Zellzahl wiesen die BAC aSyn Tiere insgesamt 3197 ± 843 BrdU+ Zellen im DG einer Hirnhemisphäre auf. Dagegen wurden in der Kontrollgruppe 7701

± 1667 BrdU+ Zellen ermittelt. In der Gegenüberstellung der gemessenen Volumen des DG wurde zwischen nicht-transgenen und aSyn Tieren ein signifikanter Unterschied festgestellt (nicht-tg 2,18 ± 0,2 mm³ versus aSyn 1,67 ± 0,22 mm³), was für eine hippokampale Atrophie im zeitlichen Verlauf bei aSyn Ratten spricht. Die daraus berechnete BrdU+ Zelldichte zeigte

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einen signifikanten Unterschied zwischen beiden Untersuchungsgruppen (Tab. 6).

Insgesamt betrachtet wiesen BAC aSyn Ratten im Alter von 16 Wochen eine um 45,7%

reduzierte Zelldichte im Vergleich mit den Kontrolltieren auf, was auf eine stark beeinträchtigte adulte hippokampale Neurogenese deutet.

Tab. 6 Neu gebildete Zellen im DG des Überlebensparadigmas

MW ± SD der Zelldichte in der Granulärschicht des DG von 16 Wochen alten nicht-tg und aSyn Tieren. Es findet sich ein signifikanter Unterschied zwischen den untersuchten Gruppen. #: zweiseitiger t-test, p < 0,05.

4.2 Unveränderte Proliferation im DG von BAC aSyn Ratten

Im nächsten Schritt wurde überprüft, inwiefern das humane aSyn in elf Wochen alten transgenen BAC Ratten die Zellproliferation in der SGZ des DG beeinflusst. Die Untersuchungen in der Granulärschicht des Hippokampus zeigten in transgenen Tieren 1632 ± 254 im Gegensatz zu 2102 ± 569 BrdU+ Zellen in nicht-transgenen Ratten. Im Vergleich der Volumen des DG von nicht-transgenen und aSyn Ratten wurde kein signifikanter Unterschied nachgewiesen (nicht-tg 1,59 ± 0,42 mm³ versus aSyn 1,50 ± 0,26 mm³). Nach der statistischen Auswertung der Zelldichte konnte kein signifikanter Unterschied in der Proliferationsrate zwischen beiden Gruppen festgestellt werden.

Tab. 7 Zelldichte im DG des Proliferationsparadigmas

MW ± SD der Zelldichte von BrdU-positiven Zellen in der subgranulären Schicht des DG von 11 Wochen alten nicht-tg und aSyn Tieren. Anwendung eines zweiseitigen t-test, p > 0,05

nicht-tg aSyn p-Wert

Zelldichte im DG einer Hemisphäre

(BrdU+ Zellen/mm³) 3547 ± 716 1925 ± 478 ^# 0,0002

nicht-tg aSyn p-Wert

Zelldichte im DG einer Hemisphäre

(BrdU+ Zellen/mm³) 1390 ± 436 1134 ± 325 0,112

4 Ergebnisse

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Abb. 8 Einfluss von transgenem aSyn auf die Proliferation aNSC im DG

A-D: Repräsentative Übersichts- und Vergrößerungsaufnahmen der DAB-Färbung des DG im Hippokampus der Tiere des Proliferationsparadigmas. Die neu entstandenen BrdU+ Zellen waren in Zellclustern (weiße Umrandung) angeordnet. Maßstabsbalken bei A, B: 100 µm und C, D: 50 µm.

E: Quantifizierung proliferierender BrdU+ Zellen im DG nicht-tg und aSyn Ratten. Letztere wiesen eine Reduktion von 18,4% auf, aber es zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Zelldichte (p = 0,112).

Anwendung eines zweiseitigen t-test, p > 0,05.