In den vorangegangenen Untersuchungen zeigten die aSyn Tiere eine starke Beeinträchtigung der adulten Neurogenese bei gleichzeitig unveränderter Proliferation neuer Zellen im Vergleich mit gesunden Kontrolltieren. Hieraus ergab sich die Frage, welcher Zelltyp aus den proliferierenden Vorläuferzellen hervorgeht. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie ließ sich anhand spezifischer Marker der Anteil an Zellen mit neuronalem (BrdU+/NeuN+/GFAP-), glialem (BrdU+/NeuN-/GFAP+) oder nicht näher bestimmbarem Phänotyp (BrdU+/NeuN-/GFAP-) im DG von nicht-transgenen und aSyn Ratten abgrenzen.
Die Mehrheit der neuen Zellen entwickelte sich zu Zellen mit neuronalem Phänotyp, wobei sich zwischen beiden Versuchsgruppen kein signifikanter Unterschied zeigte. In transgenen Ratten ließen sich 88,7% der untersuchten Zellen als Neurone identifizieren, bei nicht-transgenen Tieren waren es 93,3%. Im Vergleich hierzu entstanden durchschnittlich 1,9%
neue Gliazellen, die zu gleichen Teilen in aSyn und Kontrolltieren verteilt waren. Zellen, die aufgrund der fehlenden Fluoreszenzmarkierung mit NeuN und GFAP weder dem glialen noch neuronalen Phänotyp angehörten, erhielten die Bezeichnung neue nicht-neurale Zellen. Sie waren vermehrt in transgenen Tieren zu finden.
Phänotyp nicht-tg aSyn p-Wert
BrdU+/NeuN+/GFAP- 93,33 ± 2,7 88,74 ± 5,96 0,084
BrdU+/NeuN-/GFAP+ 1,89 ± 2,14 1,91 ± 1,78 0,983
BrdU+/NeuN-/GFAP- 4,78 ± 2,27 9,34 ± 4,91 # 0,042
Tab. 8 Differenzierung neu entstandener Zellen im DG
Prozentualer Anteil der Zellen eines Phänotyps an neu entstandenen Neuronen, Gliazellen und nicht-neuraler BrdU+ Zellen. Hierbei wies die Zahl neuer Neurone und Gliazellen keinen signifikanten Unterschied zwischen
nicht-tg und aSyn Ratten auf, allerdings waren die nicht-neuralen Zellen in aSyn signifikant reduziert.
#: Zweiseitiger t-test, p < 0,05.
4 Ergebnisse
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-Abb. 9 Einfluss von aSyn auf die Differenzierung neu gebildeter Zellen im DG von nicht-tg und aSyn Ratten Unter Berücksichtigung der jeweiligen Zellmarkierung wurde der prozentuale Anteil eines Phänotyps neu entstandener Neurone (NeuN+/GFAP-), Gliazellen (NeuN-/GFAP+) und nicht-neuraler Zellen (NeuN-/GFAP-) in nicht-transgenen und aSyn Ratten ermittelt. #: One-way ANOVA, p < 0,05.
Mit Hilfe der absoluten BrdU-positiven Zellzahlen und der gemessenen Volumina konnte die Dichte an neuen Neuronen in der Granulärschicht berechnet werden (Abb. 10). Hier wurde der signifikante Unterschied aus dem Überlebensparadigma (s. Kapitel 4.1) zwischen der transgenen und der Kontrollkohorte bestätigt. Die Reduktion von 48,4% der neuen Neurone demonstrierte die signifikant eingeschränkte adulte hippokampale Neurogenese in den BAC aSyn Ratten. Bei der Analyse der neu entstandenen glialen Zellen war ebenfalls eine fast um die Hälfte verminderte Zelldichte in BAC aSyn Tieren im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe zu beobachten. Die Dichte an Zellen des nicht-neuralen Phänotyps zeigte sich zwischen beiden Untersuchungsgruppen unverändert.
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-Zelldichte an nicht-tg aSyn p-Wert
neuen Neuronen 3310 ± 668 1708 ± 424 # < 0,0001
neuen Gliazellen 67 ± 14 37 ± 9 # 0,0002
neuen nicht-neuralen Zellen 170 ± 34 180 ± 45 0,629
Abb. 10 Auswertung der Anzahl neuer Neurone, Gliazellen und nicht-neuraler Zellen im DG
Bei der Bestimmung von MW ± SD der Zelldichte (oben) sowie Quantifizierung der Dichte (unten, A-C) von neu gebildeten Neuronen und Gliazellen zeigte sich ein signifikanter Unterschied (A, B). In transgenen Tieren war die neuronale Dichte um 48% und die gliale Dichte um 45% vermindert. Die nicht-neuralen Zellen wiesen keinen signifikanten Unterschied auf. #: Anwendung jeweils eines zweiseitigen t-test, p < 0,05.
4 Ergebnisse
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-Abb. 11 Differenzierung der neu entstandenen Zellen im DG von nicht-tg und aSyn Ratten
A-H: Repräsentative Übersichtsaufnahmen einer Dreifach-Färbung des DG im Hippokampus bei nicht-tg und aSyn Tieren des Überlebensparadigmas. Sie zeigen markierte Zellen (Pfeil) in den immunfluoreszierenden Einfelfärbungen für BrdU - NeuN - GFAP. Maßstabsbalken: 20 µm
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-5 Diskussion
Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag in der Analyse des Einflusses von humanem aSyn auf die adulte Neurogenese im DG von 11 bzw. 16 Monate alten Tieren eines transgenen BAC Rattenmodells, in denen der gesamten aSyn Genlokus mitsamt seiner regulatorischen Kontrollelemente exprimiert wird. Die Auswahl der Spezies ist wichtig für die Erstellung realitätsbezogener Tiermodelle, die sich primär am pathophysiologischen Verlauf der humanen Erkrankung orientieren, da experimentelle Untersuchungen am Menschen nur unter sehr strikten Vorkehrungen zu verantworten sind. Rattenmodelle zeigen hierbei grundsätzliche Vorteile gegenüber Mausmodellen. Zu diesen gehören die größere körperliche Erscheinung und Masse, die Erleichterungen in Bildgebung, chirurgischen Eingriffen und Gewebeproben bedingen. Ihr komplexer Phänotyp und bestimmte physiologische Eigenschaften wie eine verlangsamte Atem- und Herzschlagfrequenz spiegeln im Vergleich mit Mäusen realitätsgetreuer die humane Konstitution wider (Frohlich, 2020). Die Lebensdauer einer Laborratte ist mit 2-4 Jahren ungefähr doppelt so lang wie die einer Maus, was für die modellhafte Abbildung der erst um die fünfte Lebensdekade auftretenden PD eine große Rolle spielt (Weiss et al., 2014). Grundlegend ist das Rattenhirn sehr ähnlich zum menschlichen Cerebrum organisiert (Whishaw and Kolb, 2005), zudem konnte bei Ratten mittels Low Frequency Fluctuation ein ausgeglichenes interkortikales Netzwerk im Gegensatz zu Mäusen beobachtet werden, die eine abgeschwächte Interaktivität zwischen beiden Hirnhemisphären aufwiesen (Jonckers et al., 2011). In der vorliegenden Arbeit stand die Untersuchung zur Überexpression von humanem aSyn in der frühen Überlebensphase neu entstandener Zellen im Fokus, da bekannt ist, dass es insbesondere in diesem Stadium durch Apoptose zu einem massiven Rückgang der neu gebildeten Zellen kommt. Anschließend wurde der Fragestellung nachgegangen, ob die Proliferationsrate adulter Vorläuferzellen in transgenen BAC Tieren verändert ist. Im letzten Schritt wurde überprüft, wie sich der Einfluss des überexprimierten aSyn auf die Differenzierung der neu gebildeten Zellen im DG zeigt.
Basierend auf der Studie von Nuber et al. wurde gezeigt, dass es in BAC transgenen Ratten zu einer neurotoxischen Konversion von aSyn kommt (Nuber et al., 2013). Die Überexpression von aSyn führte zu einer weit verbreiteten Aggregationspathologie und war mit einem altersabhängigen Dopaminverlust assoziiert. Im DG des Hippokampus war humanes aSyn sowohl in DCX+ Neuroblasten als auch in reifen Neuronen vorhanden, wobei es an Synapsen und im Zytoplasma von Neuronen akkumulierte (Kohl et al., 2016).
Untersuchungen der adulten Neurogenese in verschiedenen PD Tiermodellen zeigten ein deutlich reduziertes Überleben der neu gebildeten Neurone (Winner et al., 2011). In Tab. 9
5 Diskussion
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-wurden die Ergebnisse verschiedener aSyn PD Tiermodelle zur adulten Neurogenese im DG des Hippokampus, auf die sich die Diskussionsbeiträge immer wieder beziehen werden, zusammengefasst.
Diese Arbeit soll einen weiteren Baustein zum Verständnis der quantitativen und qualitativen Wirkung von neuronal exprimiertem aSyn auf die adulte hippokampale Neurogenese in einem Rattenmodell darstellen.
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-Referenz diese Arbeit / (Kohl et al., 2016) (Winner et al., 2004) (Nuber et al., 2008) (Kohl et al., 2012) (Marxreiter et al., 2013)
signifikanter Unterschied ja ja ja ja ja Tab. 9 Übersicht zu Proliferation vonaNSC und adulter Neurogenese im Hippokampus bei transgenen Tiermodellen der Parkinson Erkrankung Das Geschlecht der Tiere wurde bei Nuber et al. (gemischt), Marxreiter et al. (männlich) und unserer Studie (männlich) angegeben. A53T = A53T Punktmutation, A30P = A30P Punktmutation, * Verwendung eines tet-regulierbaren Systems, CaMKIIα = Ca2+ /Calmodulin abhängige Proteinkinase II, PCNA = proliferating cell nuclear antigen, PDGFβ = platelet-derivat growth factor
adulte Neurogenese nicht-tg Wt aSyn BrdU+ / NeuN+ Zellen 1708 ± 424 n.a. 252 ± 15 274 ± 20 266 ± 24
3310 ± 668 n.a. 496 ± 8 450 ± 46 496 ± 25
signifikanter Unterschied nein nein nein ja nein
PROL nicht-tg Wt aSyn BrdU+ Zellen 1134 ± 325 n.a. 254 ± 19 628 ± 51 315 ± 19
1390 ± 436 n.a. 293 ± 41 1033 ± 76 294 ± 10
verwendete Marker PROL ÜBER BrdU BrdU, NeuN PCNA BrdU, NeuN PCNA BrdU, NeuN PCNA BrdU, NeuN PCNA BrdU, NeuN
Alter 3 Mo 3 Mo 5 Mo 4-5 Mo 2-3 Mo
Promotor PDGFβ CaMKIIα PDGFβ CaMKIIα
Modell aSyn Ratte aSyn Maus aSyn Maus * A53T Maus A30P Maus
5 Diskussion
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